Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

Białka są niezbędnymi biomolekułami w praktycznie każdym procesie fizjologicznym. Różnorodność funkcji pełnionych przez białka jest możliwa ze względu na struktury, które przyjmują, oraz interakcje, jakie mają z innymi biomolekułami. Aby zrozumieć funkcję białek na głębszym poziomie, potrzebne są narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które wyjaśnią te ważne cechy strukturalne i interakcje. Tradycyjnie, krystalografia rentgenowska, kriogeniczna mikroskopia elektronowa i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) dostarczyły pożądanych szczegółów na poziomie atomowym, aby ujawnić strukturę białka. Jednak wiele układów białkowych nie może być zbadanych za pomocą tych technik ze względu na słabe zachowanie krystalizacji, ograniczoną dostępność białek, nadmierną niejednorodność próbki lub ograniczenia masy cząsteczkowej. W związku z tym pojawiły się nowsze metody analizy, które przezwyciężają te ograniczenia. Jedną z pojawiających się technik, które mogą dostarczyć informacji o strukturze białek, jest spektrometria mas.

Spektrometria mas (MS) mierzy stosunek masy do ładunku cząsteczki (m/z), więc informacje strukturalne wyższego rzędu białka muszą być uzyskane poprzez zakodowanie pożądanej informacji strukturalnej w masie białka. Opracowano kilka podejść do kodowania tych informacji, w tym wymianę wodorowo-deuterową (HDX)^1,2,3,4, chemiczne sieciowanie (XL)5^,6, oraz etykietowanie kowalencyjne (CL)^7,8^{,9, 10}. W HDX wodory amidowe w szkielecie są wymieniane przez nieco masywniejsze deutery w tempie zależnym od dostępności rozpuszczalnika i stopnia wiązania H. Zakres HDX można zlokalizować poprzez szybkie trawienie białka na fragmenty peptydu przed oddzieleniem i pomiarem tych fragmentów za pomocą spektrometru mas lub przez dysocjację białka w eksperymencie odgórnym. Określenie kursu wymiany dostarcza dalszych informacji na temat dynamiki białek. HDX okazał się cennym narzędziem do charakteryzowania struktury białek pomimo wyzwań związanych z wymianą wsteczną i potrzebą specjalistycznego sprzętu w celu maksymalizacji odtwarzalności. W XL-MS białka reagują z odczynnikami dwufunkcyjnymi, które kowalencyjnie łączą sąsiednie łańcuchy boczne reszt w danym białku lub między dwoma białkami. W ten sposób XL-MS może zapewnić ograniczenia odległości, które można wykorzystać do scharakteryzowania struktury białka. Regiony białka, które są usieciowane, można zidentyfikować za pomocą trawienia proteolitycznego, a następnie analizy metodą chromatografii cieczowej (LC)-MS. Chociaż XL-MS jest wszechstronnym narzędziem, które było używane do badania różnych kompleksów białkowych, w tym wewnątrz komórek, identyfikacja produktów XL jest trudna i wymaga specjalistycznego oprogramowania.

CL-MS pojawił się ostatnio jako komplementarne, a czasem alternatywne narzędzie oparte na MS do badania struktury i interakcji białek. W CL-MS białko lub kompleks białkowy jest kowalencyjnie modyfikowany za pomocą odczynnika jednofunkcyjnego, który może reagować z łańcuchami bocznymi wystawionymi na działanie rozpuszczalnika (Rysunek 1). Porównując zakresy modyfikacji białka lub kompleksu białkowego w różnych warunkach, można ujawnić zmiany konformacji, miejsca wiązania i interfejsy białko-białko. Po reakcji CL informacje specyficzne dla miejsca, często na poziomie pojedynczego aminokwasu, można uzyskać za pomocą typowych procesów proteomiki typu bottom-up, w których białka są trawione proteolitycznie, fragmenty peptydowe są rozdzielane przez LC, a zmodyfikowane miejsca są identyfikowane za pomocą tandem MS (MS/MS). Bogata historia chemii biokoniugatów sprawiła, że dostępnych jest wiele odczynników do eksperymentów CL-MS. Odczynniki CL dzielą się na dwie ogólne kategorie: (i) specyficzne i (ii) niespecyficzne. Określone odczynniki reagują z pojedynczą grupą funkcyjną (np. wolne aminy)^8,10 i są łatwe do wdrożenia, ale zwykle dostarczają ograniczonych informacji strukturalnych. Odczynniki niespecyficzne reagują z szeroką gamą łańcuchów bocznych, ale często wymagają specjalistycznego sprzętu, takiego jak lasery lub źródła synchrotronowe, do wytworzenia tych wysoce reaktywnych gatunków. Rodniki hydroksylowe są najczęściej stosowanym odczynnikiem niespecyficznym, który został zastosowany w eksperymentach z śladem rodników hydroksylowych (HRF)^7,11,12,13 eksperymentach w celu zbadania szerokiego zakresu białek i kompleksów białkowych w różnych warunkach.

Nasza grupa badawcza z powodzeniem wykorzystała inny stosunkowo niespecyficzny odczynnik o nazwie dietylopirowęglan (DEPC) do badania struktury i interakcji białek w kontekście eksperymentów CL-MS^{14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25}. DEPC oferuje prostotę specyficznych odczynników do znakowania (tj. do przeprowadzenia reakcji nie jest potrzebny specjalistyczny sprzęt), jednocześnie reagując z maksymalnie 30% aminokwasów w przeciętnym białku. Jako wysoce elektrofilowy odczynnik, DEPC jest zdolny do reagowania z N-końcem i nukleofilowymi łańcuchami bocznymi reszt cysteiny, histydyny, lizyny, tyrozyny, seryny i treoniny. Zazwyczaj generowany jest pojedynczy produkt tych reakcji, co powoduje wzrost masy o 72,02 Da. Ten pojedynczy rodzaj produktu kontrastuje z nawet 55 różnymi produktami, które mogą być wytwarzane, gdy białka reagują z rodnikami hydroksylowymi⁷. Tak prosta chemia ułatwia identyfikację oznakowanych miejsc.

Tutaj udostępniamy protokoły do badania struktury i interakcji białek opartych na DEPC. Opisano szczegóły związane z przygotowaniem odczynników, reakcjami z białkiem DEPC, warunkami trawienia białek, parametrami LC-MS i MS/MS oraz analizą danych. Pokazujemy również użyteczność znakowania DEPC, podając przykładowe wyniki interakcji białko-metal, białko-ligand i białko-białko, a także białek ulegających zmianom strukturalnym po podgrzaniu.

1. Przygotowanie białek i odczynników

UWAGA: Ten protokół zawiera przykładowy przebieg pracy do znakowania białka za pomocą DEPC. Niektóre warunki i stężenia odczynników mogą się różnić w zależności od wybranego białka.

1. Przygotuj wszystkie roztwory odczynników w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
2. Przygotować roztwór białkowy o pożądanym stężeniu, zwykle w zakresie kilkudziesięciu μM, w 10 mM buforze kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS) o pH 7,4. Alternatywnie, należy przygotować istniejący roztwór białkowy do wymiany buforowej w 10 mM pH 7,4 MOPS, jeśli próbka zawiera bufor nukleofilowy, który byłby reaktywny z DEPC. Można również stosować inne (np. sól fizjologiczną buforowaną fosforanami), o ile nie zawierają one nukleofilowych grup funkcyjnych.
3. Przygotować 100 mM roztwór DEPC w suchym acetonitrylu (ACN), pipetując 1,45 μl podstawowego roztworu 6,9 M DEPC do 98,55 μl ACN.
   UWAGA: Nie ma jednego zestawu stężeń, który będzie działał z każdym białkiem, chociaż optymalne stężenia można oszacować na podstawie liczby reszt His i Lys²³. Na przykład z 50 μl 50 μM roztworu β2-mikroglobuliny, należy zareagować białko z 0,2 μl 100 mM DEPC, aby uzyskać końcowe stężenie DEPC 200 μM (równe 4x stężeniu białka), aby zapewnić pożądany stosunek molowy przy użyciu tego ogólnego przykładu (Tabela 1). Znakowanie DEPC jest reakcją 2. rzędu, więc zmiana stężenia białka lub DEPC w mieszaninie reakcyjnej zmieni szybkość znakowania.
4. Przygotować 1 M roztwór imidazolu, odważając 10 mg imidazolu i rozpuszczając w 146,9 μl wody o czystości HPLC.

2. Kowalencyjne znakowanie nienaruszonego białka

1. Ustaw temperaturę łaźni wodnej na 37 °C i poczekaj, aż kąpiel osiągnie stabilną temperaturę.
   UWAGA: Stężenia i objętości odczynników dla przykładowego protokołu etykietowania można znaleźć w Tabeli 1.
2. W nowej probówce do mikrowirówek wymieszać bufor MOPS i roztwór białkowy w objętościach podanych w tabeli 1.
3. Do białka i buforu dodać 0,2 μl roztworu DEPC, upewniając się, że otrzymany roztwór został prawidłowo wymieszany, a następnie umieścić probówkę zawierającą mieszaninę reakcyjną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 minutę.
   UWAGA: Objętość dodanego ACN nie powinna przekraczać 1% całkowitej objętości reakcji, aby uniknąć zaburzeń struktury białka podczas reakcji znakowania. Czas reakcji zależy od użytkownika, chociaż 1-minutowa reakcja w przykładowych warunkach minimalizuje nadmierne etykietowanie i potencjalną hydrolizę DEPC¹⁴.
4. Po upływie 1 minuty wyjąć probówkę z mieszaniną reakcyjną z łaźni wodnej i zahartować reakcję 1 μl 1 M roztworu imidazolu w celu usunięcia pozostałej nieprzereagowanej DEPC.
   UWAGA: Końcowe stężenie imidazolu w mieszaninie reakcyjnej powinno być równe 50-krotnemu stężeniu DEPC w mieszaninie reakcyjnej. Zapewni to, że pozostały niezareagowany DEPC zostanie oczyszczony.

3. Przygotowanie trawienia białka do LC-MS od dołu

UWAGA: Wybierz warunki trawienia, które są odpowiednie dla interesującego nas białka. Typowe kroki obejmują rozwijanie białka oraz redukcję i alkilowanie wszelkich wiązań dwusiarczkowych.

1. Rozwiń białko, dodając odpowiedni odczynnik do rozwijania do mieszaniny reakcyjnej.
   UWAGA: Typowe środki rozwijające to ACN, mocznik i chlorowodorek guanidyny (GuHCl).
2. Przygotować roztwory tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) i jodoacetamidu (IAM), odważając po 5 mg każdego z nich i rozpuszczając je w nowych probówkach do mikrowirówek odpowiednio w 174,4 i 270,3 μl 10 mM buforze MOPS o pH 7,4 dla etapów redukcji i alkilacji.
3. Zredukować wiązania dwusiarczkowe poprzez dodanie 2 μl 100 mM roztworu TCEP (końcowe stężenie 2 mM w mieszaninie reakcyjnej) do mieszaniny reakcyjnej i reakcję przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Końcowe stężenie TCEP powinno być równe 40-krotności stężenia białka na wiązanie dwusiarczkowe obecne w roztworze.
4. Alkilatowe zredukowane cysteiny za pomocą 4 μl 100 mM roztworu IAM (końcowe stężenie 4 mM w mieszaninie reakcyjnej) przez 30 minut w ciemności. IAM jest światłoczuły i rozkłada się w bezpośrednim świetle.
   UWAGA: Końcowe stężenie IAM w roztworze powinno być dwukrotnie większe niż stężenie stosowane dla TCEP lub 80-krotność stężenia białka na wiązanie dwusiarczkowe.
5. Trawić białko za pomocą odpowiedniego enzymu, takiego jak trypsyna lub chymotrypsyna. Stosunek białka do enzymu 10:1 dla 3-godzinnego trawienia w temperaturze 37 °C z unieruchomionym enzymem z szybkością wstrząsania 300 uderzeń/min jest zwykle wystarczający dla białek znakowanych DEPC. Zobacz Dyskusja.
6. Po roztrawieniu oddzielić unieruchomiony enzym od strawionych peptydów przez odwirowanie z prędkością 12 000 obr./min przez 5 minut.
7. Próbkę należy natychmiast przeanalizować za pomocą LC-MS/MS lub błyskawicznie zamrozić próbkę ciekłym azotem, aby zminimalizować degradację próbki i utratę etykiety. Próbki zamrożone w temperaturze < -20 °C należy przechowywać do momentu, gdy będą gotowe do analizy LC-MS/MS.

4. Analiza LC-MS/MS

UWAGA: Standardowe parametry LC-MS/MS dla proteomiki bottom-up mogą być używane do identyfikacji znakowanych miejsc na fragmentach peptydu proteolitycznego. Ogólny przykład przedstawiono poniżej.

1. Oddziel peptydy znakowane DEPC za pomocą fazy stacjonarnej C18 z odwróconą fazą. Użyj typowej fazy ruchomej LC składającej się z dwóch rozpuszczalników: (A) woda + 0,1% kwasu mrówkowego i (B) ACN + 0,1% kwasu mrówkowego, używając gradientu (np. Rysunek 2), aby uzyskać najlepszą separację peptydów.
   UWAGA: Czas separacji można zoptymalizować w oparciu o złożoność próbki, a natężenie przepływu fazy ruchomej zależy od tego, czy używana jest kapilara, czy nano LC.
2. Użyj spektrometru mas zdolnego do wykonywania on-line LC-MS i MS/MS w celu zidentyfikowania miejsc modyfikacji DEPC na peptydzie. W naszych eksperymentach z powodzeniem wykorzystaliśmy kilka rodzajów spektrometrów masowych. Każdy spektrometr masowy zdolny do automatycznego wykonywania MS/MS wielu peptydów w trakcie analizy LC-MS powinien być odpowiedni. Istotne parametry MS obejmują: napięcie źródła ESI = -4000 V dla zwykłego ESI; -2000 V dla nanosprayu; Rozdzielczość orbitrapu = 60 000; Czas trwania dynamicznego wykluczenia = 30 s; Typ aktywacji MS/MS: CID, ETD lub oba; Zakres skanowania masowego = 200-2,000; Automatyczna kontrola wzmocnienia = 4.0E5 (MS¹ w Orbitrap) i 5.0E4 (MS² w liniowej kwadrupolowej pułapce jonowej).
3. Załadować i wstrzyknąć strawioną, znakowaną próbkę białka do systemu LC i rozpocząć akwizycję LC-MS/MS. Jeśli próbka została zamrożona błyskawicznie, rozmrozić ją przed analizą. Przez pierwsze 5 minut należy skierować ścieki LC do odpadów, aby uniknąć przedostania się nadmiernej ilości soli do źródła ESI.
   UWAGA: Zwykle stosuje się pętlę iniekcyjną o pojemności 5 μl, co pozwala na wstrzyknięcie około 2,5 μg białka do LC-MS/MS. Jest to zależne od warunków obciążenia LC, aby nie zatkać wtryskiwacza próbki.

5. Analiza danych

1. Zidentyfikuj miejsca etykiet DEPC i określ ilościowo obszary pików peptydów za pomocą odpowiedniego oprogramowania dla używanego spektrometru mas.
2. Uwzględnij addycję DEPC (72,02 Da) i karbamidometylację (57,02 Da) jako modyfikacje zmiennych. Dodatkowe parametry wyszukiwania dla analizy MS/MS są następujące: Maksymalne pominięte rozszczepienia = 3; Typy jonów fragmentacyjnych = b i y; Tolerancja prekursora m/z = 10 ppm (wartość ta powinna być wyższa, jeśli stosuje się spektrometr masowy z kwadrupolową pułapką jonową); Tolerancja fragmentu m/z = 0,5 Da (wartość ta powinna być niższa, jeśli do skanowania jonów produktu używany jest spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości); Ładunek prekursora = 1-4,
   UWAGA: Różne algorytmy przeszukiwania baz danych mają różne systemy punktacji, a wiele z nich może mieć trudności z identyfikacją peptydów zmodyfikowanych przez DEPC, ponieważ poziomy modyfikacji mogą być niskie. Dostosowanie wartości odcięcia wyniku może być konieczne w celu zidentyfikowania większej liczby znakowanych peptydów. Jeśli tak, to należy zastosować ręczne przeszukiwanie danych MS/MS w celu weryfikacji peptydów o niskiej punktacji. Produkt hydrolizy etykiety DEPC nie jest uwzględniany w wyszukiwaniu danych, ponieważ zhydrolizowany DEPC nie jest już reaktywny w stosunku do nukleofilowych łańcuchów bocznych.
3. Określić procentową modyfikację poziomu pozostałości, używając chromatograficznych obszarów pików zmodyfikowanych i niezmodyfikowanych wersji peptydów.
   UWAGA: Każdy peptyd zawierający zmodyfikowaną resztę będącą przedmiotem zainteresowania musi być wzięty pod uwagę, a wszystkie zawarte w nim stany naładowania muszą być obecne we wszystkich mierzonych próbkach. Peptydy o różnej wydajności jonizacji i elucji w różnym czasie powodują, że wartość ta jest względną, a nie bezwzględną miarą modyfikacji określonego miejsca.
   
   gdzie A_{i, z} reprezentuje powierzchnię piku dowolnego peptydu (i), który zawiera resztę będącą przedmiotem zainteresowania i uwzględnia wszystkie wykryte stany ładunku (z).
4. Określ, czy zmiana etykietowania między próbką kontrolną a eksperymentalną jest znacząca, korzystając z oceny statystycznej. Typowe są trzy powtórzone pomiary dla każdej próby, a testy t są najczęściej stosowane z 95 lub 99% przedziałami ufności.

Identyfikacja miejsc modyfikacji DEPC i procentów modyfikacji
Przyrost masy spowodowany znakowaniem kowalencyjnym można zmierzyć na poziomie (a) nienaruszonego białka i (b) peptydu8,9. Na nienaruszonym poziomie rozkład gatunków białek o różnej liczbie znaczników można uzyskać z bezpośredniej analizy lub LC-MS znakowanych próbek białek. Aby uzyskać informacje strukturalne o wyższej rozdzielczości (tj. dane dotyczące etykietowania specyficzne dla danego miejsca), pomiary muszą być wykonywane na poziomie peptydu. Po etapach znakowania i hartowania, znakowane białka są poddawane oddolnej analizie proteomicznej (tj. Redukcja dwusiarczków, alkilowanie, trawienie proteolityczne i LC-MS/MS). Rysunek 3 pokazuje, w jaki sposób identyfikowane są miejsca oznaczone DEPC i obliczane są ich poziomy modyfikacji dla eksperymentu DEPC CL-MS na białku β-2-mikroglobuliny (β2m)21. MS / MS służy do sekwencjonowania znakowanych peptydów i wskazywania ich miejsc znakowanych DEPC, podczas gdy procenty modyfikacji są obliczane na podstawie ich względnych obszarów pików w wyekstrahowanych chromatogramach jonowych (patrz Rysunek 3A).

Mapowanie powierzchni białek za pomocą DEPC CL-MS
Ze względu na związek między topologią białka a szybkością znakowania, DEPC został wykorzystany do badania zmian w strukturze białka wyższego rzędu (HOS) i identyfikacji miejsc interakcji białek8,9. Przykładem jest wpływ wiązania Cu(II) na strukturę β2m. Współczynniki szybkości modyfikacji DEPC fragmentów peptydów z niezwiązanego β2m i Cu(II) związanego β2m (b2m-Cu) można zmierzyć (Tabela 2) poprzez różnicowanie stężeń DEPC i generowanie wykresów kinetycznych drugiego rzędu14,24. Reaktywność DEPC reszt w β2m-Cu ujawnia znaczące zmiany szybkości znakowania dla His31, Ser33 i Thr4, podczas gdy inne miejsca, w tym różne reszty He, są statystycznie niezmienione. Dane te są zgodne z faktem, że His31, ale nie inne jego pozostałości w β2m, wiąże Cu, powodując zmiany strukturalne w pobliżu His31 (tj. Ser33) i w pobliżu N-końca (tj. Thr4) (Rysunek 4)14,26,27.

DEPC CL-MS do identyfikacji zmian w HOS
Znakowanie DEPC z detekcją stwardnienia rozsianego jest również cennym narzędziem do charakteryzowania zmian HOS w białkach, co ma ważne implikacje dla terapii białkowych, które są obecnie najszybciej rozwijającym się segmentem rynku farmaceutycznego28. DEPC CL może identyfikować określone regiony białek, które ulegają zmianom strukturalnym pod wpływem stresu termicznego i oksydacyjnego18. Po tym, jak β2m jest wystawiony na stres cieplny, wiele reszt, które ulegają znacznemu zmniejszeniu w zakresie znakowania (N-endus, Ser28, His31, Ser33, Ser55, Ser57, Lys58) jest skupionych po jednej stronie białka, co sugeruje, że ten region białka ulega zmianie konformacyjnej lub prawdopodobnie pośredniczy w agregacji (Rysunek 5A). Oprócz tych reszt, po wystawieniu białka na stres oksydacyjny, inne reszty ze spadkiem znakowania (Ser11, His13, Lys19, Lys41, Lys94) tworzą klaster na innej stronie białka, co wskazuje, że zmiany konformacyjne wywołane utlenianiem zachodzą gdzie indziej (Rysunek 5B). Inne prace naszej grupy wykazały również, że DEPC CL-MS może wykrywać i identyfikować miejsca zmian konformacyjnych w terapiach przeciwciałami monoklonalnymi poddanymi stresowi cieplnemu20.

DEPC CL-MS do badania interakcji białko-białko<br /> Wgląd w miejsca interakcji białko-białko i interfejsy agregacji dla białek tworzących amyloid można również uzyskać za pomocą znakowania DEPC9. Spadki poziomów modyfikacji reszt po tworzeniu oligomerów mogą ujawnić interfejsy wiązania. DEPC CL-MS został użyty do scharakteryzowania oligomerów przedamyloidowych β2m, który jest białkiem tworzącym amyloidy w amyloidozie związanej z dializą29, po zainicjowaniu tworzenia amyloidu za pomocą Cu(II)15,16,26. Porównanie reaktywności DEPC monomeru β2m z dimerem β2m sprzed amyloidu, który powstaje 2 godziny po dodaniu Cu(II), pokazuje, że dziewięć reszt ulega zmniejszeniu znakowania, podczas gdy sześć reszt nie ulega zmianom lub nieznacznie wzrasta znakowanie (Figura 6A). Po odwzorowaniu tych zmian na β2m od razu widać, że interfejs dimerów obejmuje arkusze β ABED monomerów β2m (Rysunek 6B)15.

DEPC CL-MS do badania wiązania białka z ligandem
Wiązanie ligandów z białkami prowadzi do zmniejszenia dostępności rozpuszczalnika dla reszt, które oddziałują z ligandem, a CL-MS oparty na DEPC może być używany do identyfikacji miejsc wiązania ligandów na białkach. Na przykład, miejsca wiązania 3-galusanu epigallokatechiny (EGCG) na β2m w warunkach tworzenia amyloidu można zidentyfikować poprzez znaczne zmniejszenie znakowania DEPC na pozostałościach zakopanych przez wiązanie EGCG. W obecności ECGC, Lys6 i Lys91 mają niższy procent modyfikacji DEPC (Ryc. 7), a reszty te są skupione w jednym regionie białka, co wskazuje na ochronę pozostałości dzięki wiązaniu ligandów. Tymczasem N-koniec, Thr4 i His31 ulegają wzrostowi zakresów znakowania (Rysunek 7), co wskazuje na zmiany strukturalne wywołane przez EKG i sugeruje, że miejsca wiązania Cu(II) na β2m (N-koniec i His31)14,30,31 mogą zostać zakłócone w wyniku wiązania ECGC32. Ponadto miejsca wiązania pozostałych dwóch małocząsteczkowych inhibitorów tworzenia amyloidu β2m, ryfamycyny SV i doksycykliny, zostały zidentyfikowane przy użyciu CL-MS19. Jednak w tym badaniu wyniki samego znakowania DEPC nie były wystarczające do zmapowania miejsc wiązania z wystarczającą rozdzielczością strukturalną. Wyniki trzech różnych odczynników CL, a mianowicie DEPC, BD i pary 1-etylo-3-(3-(dimetyloamino)propylo)karbodimid-ester etylowy glicyny (EDC/GEE) były niezbędne do lepszego określenia miejsc wiązania19.

Poprawa rozdzielczości strukturalnej i ograniczenie kodowania etykiet
Mimo że znakowanie DEPC powoduje tworzenie się wiązania kowalencyjnego, może wystąpić utrata etykiety z powodu hydrolizy, szczególnie w przypadku reszt Ser, Thr i Tyr (Rysunek 8). Utratę etykiety można zminimalizować poprzez skrócenie czasu między reakcją DEPC CL a analizą LC-MS przy użyciu krótkich trawień proteolitycznych (np. 2-godzinne trawienie z immobilizowanymi enzymami) zamiast trawienia przez noc. Szybkie trawienie powoduje pomiar większej liczby zmodyfikowanych reszt, co zwiększa ilość informacji strukturalnych białka. Na przykład, 2-godzinne trawienie z unieruchomioną chymotrypsyną konsekwentnie prowadzi do identyfikacji większej liczby reszt zmodyfikowanych przez DEPC w β2m (Rysunek 9)17. Przy trawieniu przez noc wykrywa się około 75% reszt Ser, Thr, Tyr, His i Lys w β2m, ale gdy czas między znakowaniem a LC-MS zostanie skrócony przy użyciu 2-godzinnego trawienia, wykrywa się 95% tych pozostałości w β2m. Większość nowo wykrytych zmodyfikowanych pozostałości to pozostałości Tyr i Thr, które są podatne na hydrolizę.

W trakcie naszej pracy z DEPC, zauważyliśmy, że w niektórych białkach, reszty Cys pochodzące z wiązań dwusiarczkowych są modyfikowane przez DEPC, mimo że wiązania dwusiarczkowe są nienaruszone podczas reakcji znakowania DEPC. Takie znakowanie reszt Cys ma miejsce, ponieważ wolne tiole mogą reagować z innymi zmodyfikowanymi pozostałościami w roztworze (Rysunek 10), co prowadzi do tak zwanego "kodowania etykiet", ponieważ grupa karbethoksy jest przenoszona do reszty Cys. Szyfrowanie etykiet zmniejsza poziomy modyfikacji innych reszt i dostarcza nieprawidłowych informacji o strukturze białka. Aby uniknąć mieszania etykiet, wolne tiole Cys muszą być w pełni alkilowane zaraz po redukcji dwusiarczku33.

Rysunek 1: Kowalencyjne znakowanie - spektrometria mas (CL-MS). Odczynnik jednofunkcyjny służy do modyfikowania aminokwasów dostępnych w rozpuszczalniku i może być używany do dostarczania specyficznych dla miejsca informacji o zmianach konformacyjnych lub interfejsach interakcji w białkach (obraz na górze i na dole). Zmodyfikowane białko jest trawione proteolitycznie, a powstałe peptydy są analizowane za pomocą chromatografii cieczowej (LC) w połączeniu ze stwardnieniem rozsianym i tandemowym MS (MS/MS). Rysunek został zaadaptowany z Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent Labeling-Mass Spectrometry for Study Protein Structure and Interactions. Metody 144, 79-93 (2018). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Ogólny protokół etykietowania DEPC.

Rysunek 2. Przykładowy gradient LC do rozdzielania peptydów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3 Ilustracja przedstawiająca, w jaki sposób identyfikowane są witryny oznaczone etykietą DEPC i obliczane są ich poziomy modyfikacji. Po znakowaniu DEPC i trawieniu proteolitycznym przeprowadza się analizę (A) LC-MS strawionego białka. Obszary pików peptydów (B) nieznakowanych i (C) znakowanych peptydów w chromatogramie są wykorzystywane do obliczenia procentu znakowania. Podczas LC-MS peptydy są poddawane CID MS/MS. Tandemowe widma masowe peptydów (D) nieznakowanych oraz peptydów znakowanych (E) i (F) uzyskane w określonych czasach retencji są wykorzystywane do sekwencjonowania peptydów i identyfikacji miejsc znakowanych DEPC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 2 Współczynniki modyfikacji DEPC specyficzne dla danego miejsca (k, M-1 s-1) dla b2m w przypadku braku i obecności Cu(II).

Rysunek 4 Za pomocą DEPC CL-MS do określenia wpływu wiązania Cu(II) na strukturę β2m: (A) Mapowanie powierzchni białek reszt ze znaczącymi spadkami szybkości znakowania DEPC (niebieski), wskazujące na zmiany w ich dostępności rozpuszczalnika po związaniu Cu(II) oraz tych, które nie mają znaczących zmian w szybkości znakowania (magenta) (kod dostępu PDB 1JNJ). (B) Przykładowe specyficzne dla miejsca wykresy kinetyczne drugiego rzędu reakcji β2m z różnymi stężeniami DEPC w obecności i bez Cu(II). Współczynnik szybkości etykietowania (k) można uzyskać na podstawie nachylenia wykresu kinetycznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5 Wyniki znakowania kowalencyjnego dla naprężonego vs. natywnego β2m: (A) stres cieplny - ogrzewanie w temperaturze 75 °C przez 24 godziny i (B) stres oksydacyjny - z 3% H2O2 przez 24 godziny. Znaczące zmiany w procentach modyfikacji są pokazane na niebiesko (spadek oznakowania) i na czerwono (wzrost oznakowania), podczas gdy pozostałości bez znaczących zmian w oznakowaniu są pokazane na jasnozielono (kod przystąpienia do PDB 1JNJ). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6 Wykorzystanie DEPC CL-MS do wyznaczenia interfejsu dimerów dla pre-amyloidowego dimeru β2m: (A) Podsumowanie zmian poziomu modyfikacji DEPC dla zmodyfikowanych reszt w monomerze (tj. t = 0) i dimerze 2 h po dodaniu Cu(II). Pozostałości, w przypadku których zakres oznakowania uległy znacznemu zmniejszeniu, są oznaczone gwiazdką (*). (B) Wyniki znakowania kowalencyjnego odwzorowane na strukturze β2m. Pozostałości ze zmniejszonym oznakowaniem są pokazane na niebiesko, a pozostałości, które nie uległy zmianie lub nieznacznie wzrosły w oznakowaniu, są pokazane na czerwono (kod przystąpienia PDB 1LDS). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7 Wyniki znakowania kowalencyjnego dla b2m związanego i niezwiązanego EGCG. Procenty modyfikacji DEPC są pokazane dla wyświetlanych pozostałości. Statystycznie istotne różnice w procentowym znakowaniu kowalencyjnym są oznaczone gwiazdką (*). Zwiększenie znakowania po związaniu EGC jest pokazane na czerwono, podczas gdy spadki są pokazane na niebiesko. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8 Reakcje znakowania kowalencyjnego DEPC (substytucja acylowa nukleofilowa) i utrata etykiety (hydroliza resztek karbetoksylowanych) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9 Mapowanie zmierzonych miejsc modyfikacji na β2m. (A) znakowane miejsca po konwencjonalnym trawieniu przez noc i (B) znakowane miejsca po 2-godzinnym trawieniu unieruchomioną chymotrypsyną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10 Hipotetyczny mechanizm szyfrowania etykiet DEPC (przechwytywanie karbekoksylowanego Hisa przez Cys) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.