Artykuł metodologiczny

Znakowanie kowalencyjne dietylopirowęglanem do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61983

⸱

15 czerwca 2021

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Massachusetts Amherst, 2Molecular and Cellular Biology Program, University of Massachusetts Amherst, 3Department of Food and Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano eksperymentalne procedury znakowania kowalencyjnego na bazie dietylopirowęglanów z detekcją spektrometryczną mas. Wodorowęglan dietylu jest po prostu mieszany z białkiem lub kompleksem białkowym będącym przedmiotem zainteresowania, co prowadzi do modyfikacji reszt aminokwasowych dostępnych w rozpuszczalniku. Zmodyfikowane pozostałości można zidentyfikować po mineralizacji proteolitycznej i analizie metodą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas.

Streszczenie

Scharakteryzowanie struktury wyższego rzędu białka jest niezbędne do zrozumienia jego funkcji. Spektrometria mas (MS) stała się potężnym narzędziem do tego celu, szczególnie w przypadku układów białkowych, które są trudne do zbadania tradycyjnymi metodami. Aby zbadać strukturę białka za pomocą stwardnienia rozsianego, w roztworze przeprowadza się określone reakcje chemiczne, które kodują informacje strukturalne białka w jego masie. Jednym ze szczególnie skutecznych podejść jest użycie odczynników, które kowalencyjnie modyfikują łańcuchy boczne aminokwasów dostępnych w rozpuszczalniku. Reakcje te prowadzą do wzrostu masy, który może być zlokalizowany z rozdzielczością na poziomie pozostałości w połączeniu z trawieniem proteolitycznym i tandemową spektrometrią mas. W tym miejscu opisujemy protokoły związane ze stosowaniem dietylopirowęglanu (DEPC) jako odczynnika do znakowania kowalencyjnego wraz z wykrywaniem stwardnienia rozsianego. DEPC jest wysoce elektrofilową cząsteczką zdolną do znakowania do 30% reszt w przeciętnym białku, zapewniając w ten sposób doskonałą rozdzielczość strukturalną. DEPC jest z powodzeniem stosowany w połączeniu ze stwardnieniem rozsianym w celu uzyskania informacji strukturalnych dla małych białek jednodomenowych, takich jak β2-mikroglobulina, do dużych białek wielodomenowych, takich jak przeciwciała monoklonalne.

Wprowadzenie

Białka są niezbędnymi biomolekułami w praktycznie każdym procesie fizjologicznym. Różnorodność funkcji pełnionych przez białka jest możliwa ze względu na struktury, które przyjmują, oraz interakcje, jakie mają z innymi biomolekułami. Aby zrozumieć funkcję białek na głębszym poziomie, potrzebne są narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które wyjaśnią te ważne cechy strukturalne i interakcje. Tradycyjnie, krystalografia rentgenowska, kriogeniczna mikroskopia elektronowa i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) dostarczyły pożądanych szczegółów na poziomie atomowym, aby ujawnić strukturę białka. Jednak wiele układów białkowych nie może być zbadanych za pomocą tych technik ze względu na słabe zachowanie krystalizacji, ograniczoną dostępność białek, nadmierną niejednorodność próbki lub ograniczenia masy cząsteczkowej. W związku z tym pojawiły się nowsze metody analizy, które przezwyciężają te ograniczenia. Jedną z pojawiających się technik, które mogą dostarczyć informacji o strukturze białek, jest spektrometria mas.

Spektrometria mas (MS) mierzy stosunek masy do ładunku cząsteczki (m/z), więc informacje strukturalne wyższego rzędu białka muszą być uzyskane poprzez zakodowanie pożądanej informacji strukturalnej w masie białka. Opracowano kilka podejść do kodowania tych informacji, w tym wymianę wodorowo-deuterową (HDX)1,2,3,4, chemiczne sieciowanie (XL)5,6, oraz etykietowanie kowalencyjne (CL)7,8,9, 10. W HDX wodory amidowe w szkielecie są wymieniane przez nieco masywniejsze deutery w tempie zależnym od dostępności rozpuszczalnika i stopnia wiązania H. Zakres HDX można zlokalizować poprzez szybkie trawienie białka na fragmenty peptydu przed oddzieleniem i pomiarem tych fragmentów za pomocą spektrometru mas lub przez dysocjację białka w eksperymencie odgórnym. Określenie kursu wymiany dostarcza dalszych informacji na temat dynamiki białek. HDX okazał się cennym narzędziem do charakteryzowania struktury białek pomimo wyzwań związanych z wymianą wsteczną i potrzebą specjalistycznego sprzętu w celu maksymalizacji odtwarzalności. W XL-MS białka reagują z odczynnikami dwufunkcyjnymi, które kowalencyjnie łączą sąsiednie łańcuchy boczne reszt w danym białku lub między dwoma białkami. W ten sposób XL-MS może zapewnić ograniczenia odległości, które można wykorzystać do scharakteryzowania struktury białka. Regiony białka, które są usieciowane, można zidentyfikować za pomocą trawienia proteolitycznego, a następnie analizy metodą chromatografii cieczowej (LC)-MS. Chociaż XL-MS jest wszechstronnym narzędziem, które było używane do badania różnych kompleksów białkowych, w tym wewnątrz komórek, identyfikacja produktów XL jest trudna i wymaga specjalistycznego oprogramowania.

CL-MS pojawił się ostatnio jako komplementarne, a czasem alternatywne narzędzie oparte na MS do badania struktury i interakcji białek. W CL-MS białko lub kompleks białkowy jest kowalencyjnie modyfikowany za pomocą odczynnika jednofunkcyjnego, który może reagować z łańcuchami bocznymi wystawionymi na działanie rozpuszczalnika (Rysunek 1). Porównując zakresy modyfikacji białka lub kompleksu białkowego w różnych warunkach, można ujawnić zmiany konformacji, miejsca wiązania i interfejsy białko-białko. Po reakcji CL informacje specyficzne dla miejsca, często na poziomie pojedynczego aminokwasu, można uzyskać za pomocą typowych procesów proteomiki typu bottom-up, w których białka są trawione proteolitycznie, fragmenty peptydowe są rozdzielane przez LC, a zmodyfikowane miejsca są identyfikowane za pomocą tandem MS (MS/MS). Bogata historia chemii biokoniugatów sprawiła, że dostępnych jest wiele odczynników do eksperymentów CL-MS. Odczynniki CL dzielą się na dwie ogólne kategorie: (i) specyficzne i (ii) niespecyficzne. Określone odczynniki reagują z pojedynczą grupą funkcyjną (np. wolne aminy)8,10 i są łatwe do wdrożenia, ale zwykle dostarczają ograniczonych informacji strukturalnych. Odczynniki niespecyficzne reagują z szeroką gamą łańcuchów bocznych, ale często wymagają specjalistycznego sprzętu, takiego jak lasery lub źródła synchrotronowe, do wytworzenia tych wysoce reaktywnych gatunków. Rodniki hydroksylowe są najczęściej stosowanym odczynnikiem niespecyficznym, który został zastosowany w eksperymentach z śladem rodników hydroksylowych (HRF)7,11,12,13 eksperymentach w celu zbadania szerokiego zakresu białek i kompleksów białkowych w różnych warunkach.

Nasza grupa badawcza z powodzeniem wykorzystała inny stosunkowo niespecyficzny odczynnik o nazwie dietylopirowęglan (DEPC) do badania struktury i interakcji białek w kontekście eksperymentów CL-MS14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC oferuje prostotę specyficznych odczynników do znakowania (tj. do przeprowadzenia reakcji nie jest potrzebny specjalistyczny sprzęt), jednocześnie reagując z maksymalnie 30% aminokwasów w przeciętnym białku. Jako wysoce elektrofilowy odczynnik, DEPC jest zdolny do reagowania z N-końcem i nukleofilowymi łańcuchami bocznymi reszt cysteiny, histydyny, lizyny, tyrozyny, seryny i treoniny. Zazwyczaj generowany jest pojedynczy produkt tych reakcji, co powoduje wzrost masy o 72,02 Da. Ten pojedynczy rodzaj produktu kontrastuje z nawet 55 różnymi produktami, które mogą być wytwarzane, gdy białka reagują z rodnikami hydroksylowymi7. Tak prosta chemia ułatwia identyfikację oznakowanych miejsc.

Tutaj udostępniamy protokoły do badania struktury i interakcji białek opartych na DEPC. Opisano szczegóły związane z przygotowaniem odczynników, reakcjami z białkiem DEPC, warunkami trawienia białek, parametrami LC-MS i MS/MS oraz analizą danych. Pokazujemy również użyteczność znakowania DEPC, podając przykładowe wyniki interakcji białko-metal, białko-ligand i białko-białko, a także białek ulegających zmianom strukturalnym po podgrzaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie białek i odczynników

UWAGA: Niniejszy protokół zawiera przykładowy schemat znakowania białka za pomocą DEPC. Niektóre wymienione warunki i stężenia odczynników mogą różnić się w zależności od wybranego białka.

  1. Przygotować wszystkie roztwory reagentów w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.
  2. Przygotuj roztwór białka o żądanym stężeniu, zazwyczaj w zakresie od kilkunastu do kilkudziesięciu µMw 10 mM buforze kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS) o pH 7,4. Alternatywnie, w przypadku gdy próbka zawiera bufor nukleofilowy, który mógłby reagować z DEPC, należy przeprowadzić wymianę buforu w istniejącym roztworze białka na 10 mM MOPS o pH 7,4. Można stosować również inne bufory (np. bufor fosforanowo-solny), pod warunkiem, że nie posiadają one nukleofilowych grup funkcyjnych.
  3. Przygotuj 10 mM roztwór DEPC w suchym acetonitrylu (ACN), odmierzając odpowiednią objętość pipetą 1.45 µL roztworu stokowego DEPC o stężeniu 6,9 M do 98.55 µL ACN.
    UWAGA: Nie istnieje jeden zestaw stężeń, który będzie odpowiedni dla każdego białka, choć optymalne stężenia można oszacować na podstawie liczby reszt His i Lys23Na przykład, z 50 µL z 50 µM βroztwór $\beta$-mikroglobuliny, poddać białko reakcji z 0.2 µL z 100 mM DEPC, aby uzyskać końcowe stężenie DEPC wynoszące 200 µM (równe 4-krotności stężenia białka), aby zapewnić pożądany stosunek molowy w tym ogólnym przykładzie (Tabela 1). Znakowanie DEPC to 2nd reakcja rzędu pierwszego, zatem zmiana stężenia białka lub DEPC w mieszaninie reakcyjnej spowoduje zmianę szybkości znakowania.
  4. Przygotuj 1 M roztwór imidazolu, odważając 10 mg imidazolu i rozpuszczając go w 146.9 µL wody klasy HPLC.

2. Kowalencyjne znakowanie nienaruszonego białka

  1. Ustaw temperaturę kąpieli wodnej na 37 °C i poczekaj, aż temperatura się ustabilizuje.
    UWAGA: Stężenia i objętości odczynników dla przykładowego protokołu znakowania znajdują się w Tabeli 1.
  2. W nowej probówce do mikrocentryfugi zmieszaj bufor MOPS i roztwór białka w objętościach podanych w Tabeli 1.
  3. Do białka i buforu dodaj 0,2 µL roztworu DEPC, upewniając się, że otrzymany roztwór został odpowiednio wymieszany, a następnie umieść probówkę z mieszaniną reakcyjną w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 1 minutę.
    UWAGA: Dodana objętość ACN nie powinna przekraczać 1% całkowitej objętości reakcji, aby uniknąć zaburzenia struktury białka podczas reakcji znakowania. Czas reakcji zależy od użytkownika, choć 1-minutowa reakcja w warunkach przykładu minimalizuje nadmierne znakowanie i potencjalną hydrolizę DEPC14.
  4. Po 1 minucie wyjmij probówkę z mieszaniną reakcyjną z kąpieli wodnej i przerwij reakcję, dodając 1 µL roztworu imidazolu 1 M w celu usunięcia pozostałego, niezereagowanego DEPC.
    UWAGA: Końcowe stężenie imidazolu w mieszaninie reakcyjnej powinno być 50-krotnie większe od stężenia DEPC w mieszaninie reakcyjnej. Zapewni to usunięcie pozostałego, niezereagowanego DEPC.

3. Przygotowanie trawienia białek do analizy LC-MS bottom-up

UWAGA: Należy dobrać warunki trawienia odpowiednie dla badanego białka. Typowe etapy obejmują rozfałdowanie białka oraz redukcję i alkilację wszelkich mostków disiarczkowych.

  1. Rozwiń białko, dodając do mieszaniny reakcyjnej odpowiedni odczyn rozwijający.
    UWAGA: Powszechnie stosowane środki rozwijające to ACN, mocznik oraz chlorek guanidyny (GuHCl).
  2. Przygotuj roztwory Tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) i jodoacetamidu (IAM), odważając po 5 mg każdego z nich i rozpuszczając je w nowych probówkach do mikrocentryfugi odpowiednio w 174,4 i 270,3 µL buforu MOPS 10 mM o pH 7,4, przeznaczonych do etapów redukcji i alkilacji.
  3. Zredukuj mostki disiarczkowe, dodając 2 µL roztworu TCEP 10 mM (stężenie końcowe 2 mM w mieszaninie reakcyjnej) do mieszaniny reakcyjnej i inkubując przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Końcowe stężenie TCEP powinno być 40-krotnie wyższe od stężenia białka w przeliczeniu na jeden mostek disiarczkowy obecny w roztworze.
  4. Alkiluj zredukowane cysteiny, dodając 4 µL roztworu IAM 100 mM (stężenie końcowe 4 mM w mieszaninie reakcyjnej) i inkubując przez 30 minut w ciemności. IAM jest światłoczuły i ulega rozkładowi pod wpływem bezpośredniego światła.
    UWAGA: Końcowe stężenie IAM w roztworze powinno być dwukrotnie wyższe od stężenia użytego dla TCEP, czyli 80-krotnością stężenia białka w przeliczeniu na jeden mostek disiarczkowy.
  5. Przetraw białko odpowiednim enzymem, takim jak trypsyna lub chymotrypsyna. W przypadku białek znakowanych DEPC zazwyczaj wystarczający jest stosunek białka do enzymu 10:1 podczas 3-godzinnego trawienia w temperaturze 37 °C z użyciem enzymu unieruchomionego przy szybkości wstrząsania 300 uderzeń/min. Patrz: Dyskusja.
  6. Po trawieniu oddziel unieruchomiony enzym od przetrawionych peptydów poprzez wirowanie przy 12 0 obr./min przez 5 minut.
  7. Przeanalizuj próbkę niezwłocznie metodą LC-MS/MS lub zamroź ją gwałtownie w ciekłym azocie, aby zminimalizować degradację próbki i utratę znakowania. Próbki zamrożone gwałtownie przechowuj w temperaturze < -20 °C do momentu przeprowadzenia analizy LC-MS/MS.

4. Analiza LC-MS/MS

UWAGA: Standardowe parametry LC-MS/MS dla proteomiki bottom-up mogą być wykorzystane do identyfikacji znakowanych miejsc w proteolitycznych fragmentach peptydów. Poniżej przedstawiono ogólny przykład.

  1. Oddziel peptydy znakowane DEPC, wykorzystując stacjonarną fazę odwróconą C18. Użyj typowej mobilnej fazy LC składającej się z dwóch rozpuszczalników: (A) woda + 0,1% kwasu mrówkowego oraz (B) ACN + 0,1% kwasu mrówkowego, stosując gradient (np. Rysunek 2), aby uzyskać najlepszą separację peptydów.
    UWAGA: Czas separacji można zoptymalizować w zależności od złożoności próbki, a szybkość przepływu fazy mobilnej zależy od tego, czy stosowana jest kapilarna, czy nano LC.
  2. Użyj spektrometru mas zdolnego do prowadzenia analizy on-line LC-MS oraz MS/MS, aby zidentyfikować miejsca modyfikacji DEPC w peptydzie. W naszych eksperymentach z sukcesem wykorzystaliśmy kilka typów spektrometrów mas. Odpowiedni będzie każdy spektrometr mas zdolny do automatycznego przeprowadzania analizy MS/MS wielu peptydów w trakcie analizy LC-MS. Istotne parametry MS obejmują: napięcie źródła ESI = -400 V dla standardowego ESI; -20 V dla nanospray; rozdzielczość Orbitrap = 60 00; czas dynamicznej ekskluzji = 30 s; typ aktywacji MS/MS: CID, ETD lub oba; zakres skanowania masy = 200-2 0; automatyczna kontrola wzmocnienia (Automatic Gain Control) = 4,0E5 (MS1 w Orbitrap) i 5,0E4 (MS2 w liniowej pułapce jonowej kwadrupolowej).
  3. Załaduj i wstrzyknij strawioną, znakowaną próbkę białka do systemu LC i rozpocznij akwizycję LC-MS/MS. Jeśli próbka była zamrożona metodą flash-freezing, rozmroź ją przed analizą. Przekieruj eluat LC do odpadu przez pierwsze 5 minut, aby uniknąć dostania się nadmiaru soli do źródła ESI.
    ​UWAGA: Zazwyczaj stosuje się pętlę wtryskową o pojemności 5 µL, co pozwala na wstrzyknięcie do LC-MS/MS około 2,5 µg białka. Zależy to od warunków załadunku LC, aby nie zapchać wtryskiwacza próbek.

5. Analiza danych

  1. Zidentyfikuj miejsca znakowania DEPC i określ ilościowo pola piku peptydów, korzystając z odpowiedniego oprogramowania dla zastosowanego spektrometru masowego.
  2. Należy uwzględnić dodanie DEPC (72,02 Da) oraz karbamidometylowanie (57,02 Da) jako modyfikacje zmienne. Dodatkowe parametry wyszukiwania dla analizy MS/MS są następujące: maksymalna liczba pominiętych cięć = 3; typy jonów fragmentacyjnych = b i y; tolerancja m/z prekursora = 10 ppm (wartość ta powinna być wyższa w przypadku użycia spektrometru mas z pułapką jonową typu kwadrupol); tolerancja m/z fragmentu = 0,5 Da (wartość ta powinna być niższa w przypadku użycia spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości do skanowania jonów produktów); ładunek prekursora = 1-4.
    UWAGA: Różne algorytmy przeszukiwania baz danych stosują różne systemy punktacji, a wiele z nich może mieć trudności z identyfikacją peptydów zmodyfikowanych DEPC, ponieważ poziom modyfikacji może być niski. W celu zidentyfikowania większej liczby znakowanych peptydów konieczna może być korekta progu punktowego. W takim przypadku należy przeprowadzić ręczną analizę danych MS/MS w celu weryfikacji peptydów o niskiej punktacji. Produkt hydrolizy znacznika DEPC nie jest uwzględniany w przeszukiwaniu danych, ponieważ hydrolizowany DEPC nie wykazuje już reaktywności wobec nukleofilowych łańcuchów bocznych.
  3. Wyznacz procenty modyfikacji na poziomie poszczególnych reszt, wykorzystując pola pików chromatograficznych zmodyfikowanych i niemodyfikowanych wersji peptydów.
    UWAGA: Należy wziąć pod uwagę każdy peptyd zawierający interesującą nas zmodyfikowaną resztę, a wszystkie uwzględnione stany ładunku muszą być obecne we wszystkich mierzonych próbkach. Peptydy wykazujące różną wydajność jonizacji i eluujące w różnym czasie sprawiają, że wartość ta jest miarą względną, a nie bezwzględną modyfikacji konkretnego miejsca.
    figure-protocol-1
    gdzie Ai,z reprezentuje powierzchnię piku dowolnego peptydu (i), który zawiera interesującą nas pozostałość, i uwzględnia wszystkie wykryte stany ładunku (z).
  4. Należy określić, czy zmiana w znakowaniu pomiędzy próbką kontrolną a doświadczalną jest istotna, stosując ocenę statystyczną. Typowo wykonuje się trzy pomiary powtórne dla każdej próbki, a najczęściej wykorzystywanym narzędziem są testy t z 95% lub 99% przedziałem ufności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Identyfikacja miejsc modyfikacji DEPC i procentów modyfikacji
Przyrost masy wynikający z znakowania kowalencyjnego można zmierzyć na poziomie (a) białka w całości oraz (b) peptydów8,9. Na poziomie białka w całości, rozkład gatunków białek z różną liczbą znaczników można uzyskać bezpośrednio z analizy lub LC-MS próbek białek poddanych znakowaniu. Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje strukturalne (tj. dane o znakowaniu w konkretnych miejscach)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kroki krytyczne
Należy wziąć pod uwagę kilka punktów dotyczących projektowania eksperymentów, aby zapewnić wiarygodne wyniki etykietowania. Po pierwsze, aby zmaksymalizować znakowanie białek, konieczne jest unikanie z silnie nukleofilowymi grupami (np. Tris), ponieważ mogą one reagować z DEPC i zmniejszać zakres znakowania. Można sobie również wyobrazić, że takie mogą reagować z oznakowanymi pozostałościami, powodując usunięcie etykiety, a tym samym utratę informacji strukturalnych. Zalecamy MOPS jako bufor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony National Institutes of Health (NIH) w ramach grantu R01 GM075092. Spektrometr masowy Thermo Orbitrap Fusion wykorzystany do pozyskania części opisanych tutaj danych został pozyskany dzięki środkom z grantu National Institutes of Health S10OD010645.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówka do mikrowirówekThermo Fisher Scientific3448
Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowyMillipore SigmaM1254
Sól sodowa kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowegoMillipore SigmaM9381
Acclaim PepMap RSLC C18 KolumnaThermo Scientific164537300 μ m x 15 cm, C18, 2 μ m, 100 A
AcetonitrylFisher ScientificA998-1
DietylopirowęglanMilipor SigmaD5758
Woda klasy HPLCFisher ScientificW5-1
ImidazolMillipore SigmaI5513
Unieruchomiona chymotrypsynaProteoChemg4105
Unieruchomiona trypsyna, TPCK Poddane obróbceThermo Fisher Scientific20230
JodoacetamidMillipore SigmaI1149
Tris(2-karboksyetylo)fosfinaMillipore SigmaC4706

Bibliografia

  1. Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
  2. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
  3. Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
  4. Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
  5. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
  6. Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
  7. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
  8. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
  9. Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
  10. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335(2020).
  11. Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
  12. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
  13. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
  14. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
  15. Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochemistry. 49, 1522-1532 (2010).
  16. Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochemistry. 50, 6711-6722 (2011).
  17. Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
  18. Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
  19. Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
  20. Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
  21. Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
  22. Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
  23. Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
  24. Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
  25. Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
  26. Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochemistry. 48, 9871-9881 (2009).
  27. Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
  28. Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115(2019).
  29. Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164(2001).
  30. Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
  31. Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochemistry. 53, 1263-1274 (2014).
  32. Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochemistry. 59, 1093-1103 (2020).
  33. Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
  34. Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
  35. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
  36. Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
  37. Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
  38. Pan, Y., Piyadasa, H., O'Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
  39. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
  40. Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochemistry. 56, 1095-1104 (2017).
  41. Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochemistry. 58, 1074-1080 (2019).
  42. Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO - A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
  43. Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Struktura bia katrawienie proteolitycznetandemowa spektrometria masLC MS MSreszty histydyny i lizynydost pno dla rozpuszczalnikarozdzielczo strukturalna

Powiązane artykuły