Artykuł metodologiczny

Analiza przesiewowa, różnicowanie i dojrzewanie płodowych i dorosłych komórek macierzystych pochodzących z płodowych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego

DOI:

10.3791/61988

⸱

10 marca 2021

1Health Science and Technologies Interdepartmental Center for Industrial Research (HST-ICIR), University of Bologna

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy produkcję mieszanych kultur astrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów pochodzących z płodowych lub dorosłych nerwowych komórek macierzystych różnicujących się w dojrzałe oligodendrocyty, oraz modelowanie in vitro szkodliwych bodźców. Połączenie z techniką badań przesiewowych o wysokiej zawartości komórek tworzy niezawodny i solidny system badań przesiewowych leków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Główną przeszkodą w rozwoju technik badań przesiewowych leków do oceny skuteczności strategii terapeutycznych w złożonych chorobach jest osiągnięcie równowagi między uproszczeniem in vitro a odtworzeniem złożonego środowiska in vivo, wraz z głównym celem, wspólnym dla wszystkich strategii przesiewowych, jakim jest uzyskanie solidnych i wiarygodnych danych, wysoce predykcyjnych dla translacji in vivo.

W dziedzinie chorób demielinizacyjnych, większość strategii badań przesiewowych leków opiera się na unieśmiertelnionych liniach komórkowych lub czystych kulturach izolowanych pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) od nowonarodzonych zwierząt, co prowadzi do silnych uprzedzeń z powodu braku różnic związanych z wiekiem i jakiegokolwiek rzeczywistego patologicznego stanu lub złożoności.

Tutaj pokazujemy konfigurację systemu in vitro mającego na celu modelowanie fizjologicznego różnicowania/dojrzewania OPC pochodzących z nerwowych komórek macierzystych (NSC), które można łatwo manipulować w celu naśladowania stanów patologicznych typowych dla chorób demielinizacyjnych. Co więcej, metoda obejmuje izolację od mózgów płodów i dorosłych, dając system, który dynamicznie różnicuje się od OPC do dojrzałych oligodendrocytów (OL) w spontanicznej kokulturze, która obejmuje również astrocyty. Model ten fizjologicznie przypomina proces mielinizacji i naprawy mieliny za pośrednictwem hormonów tarczycy, co pozwala na dodanie patologicznych zakłóceń, które modelują mechanizmy chorobowe. Pokazujemy, jak naśladować dwa główne składniki chorób demielinizacyjnych (tj. niedotlenienie/niedokrwienie i stan zapalny), odtwarzając ich wpływ na mielinizację rozwojową i naprawę mieliny u dorosłych oraz biorąc pod uwagę wszystkie komponenty komórkowe systemu przez cały czas, koncentrując się na różnicowaniu OPC.

Ten spontaniczny model mieszany, w połączeniu z technologiami badań przesiewowych o wysokiej zawartości komórek, pozwala na opracowanie solidnego i niezawodnego systemu badań przesiewowych leków dla strategii terapeutycznych mających na celu zwalczanie patologicznych procesów związanych z demielinizacją i wywoływanie remielinizacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), komórki tworzące mielinę (oligodendrocyty, OL) i ich prekursory (komórki prekursorowe oligodendrocytów, OPC) są odpowiedzialne za rozwojową mielinizację, proces zachodzący w okresie około- i pourodzeniowym, oraz za obrót i naprawę mieliny (remielinizację) w wieku dorosłym1. Komórki te są wysoce wyspecjalizowane, oddziałują anatomicznie i funkcjonalnie ze wszystkimi innymi komponentami glejowymi i neuronalnymi, co czyni je fundamentalną częścią struktury i funkcji OUN.

Zdarzenia demielinizacyjne są związane z różnymi urazami i chorobami OUN2, i głównie działają na OPC i OL poprzez mechanizmy wieloczynnikowe, zarówno podczas rozwoju, jak i dorosłości. Niezróżnicowane prekursory są napędzane przez czynniki różnicujące, głównie hormon tarczycy (TH), w zsynchronizowanym procesie3, co prowadzi OPC do rozpoznawania i reagowania na określone bodźce, które indukują proliferację, migrację do niemielinizowanego aksonu i różnicowanie w dojrzałe OL, które z kolei rozwijają osłonkę mielinową 4. Wszystkie te procesy są precyzyjnie kontrolowane i zachodzą w złożonym środowisku.

Ze względu na złożoną naturę zdarzeń mielinizacji, remielinizacji i demielinizacji, istnieje duże zapotrzebowanie na uproszczoną i niezawodną metodę in vitro do badania podstawowych mechanizmów i opracowywania nowych strategii terapeutycznych, koncentrując się na głównym graczu komórkowym: klasie OPC5.

Aby system in vitro był niezawodny, należy wziąć pod uwagę szereg czynników: złożoność środowiska komórkowego, różnice wewnętrzne komórek związane z wiekiem, fizjologiczne różnicowanie za pośrednictwem TH, patologiczne mechanizmy i solidność danych6. Rzeczywiście, niezaspokojoną potrzebą w tej dziedzinie jest model, który naśladuje złożoność warunków in vivo, której nie udało się osiągnąć dzięki zastosowaniu izolowanych czystych kultur OPC. Ponadto dwa główne składniki zdarzeń demielinizacyjnych, stan zapalny i niedotlenienie/niedokrwienie (HI), bezpośrednio angażują inne składniki komórkowe, które mogą pośrednio wpływać na fizjologiczne różnicowanie i dojrzewanie OPC, co jest aspektem, którego nie można badać w nadmiernie uproszczonych modelach in vitro.

Zaczynając od wysoce predykcyjnego systemu hodowli, kolejnym i bardziej ogólnym wyzwaniem jest uzyskanie solidnych i wiarygodnych danych. W tym kontekście, przesiewanie o wysokiej zawartości w oparciu o komórki (HCS) jest najbardziej odpowiednią techniką7, ponieważ naszym celem jest, po pierwsze, analiza całej kultury w automatycznym przepływie pracy, unikanie stronniczości związanej z wyborem reprezentatywnych pól, a po drugie, uzyskanie automatycznego i jednoczesnego generowania danych o wysokiej zawartości opartych na obrazowaniu8.

Biorąc pod uwagę, że główną potrzebą jest osiągnięcie najlepszej równowagi między uproszczeniem in vitro a złożonością naśladującą in vivo, przedstawiamy tutaj wysoce powtarzalną metodę uzyskiwania OPC pochodzących z nerwowych komórek macierzystych (NSC) wyizolowanych z przodomózgowia płodu i dorosłej strefy podkomorowej (SVZ). Ten model in vitro obejmuje cały proces różnicowania OPC, od multipotencjalnego NSC do dojrzałego/mielinizującego OL, w fizjologiczny sposób zależny od TH. Otrzymana kultura jest dynamicznie różnicującym/dojrzewającym systemem, w wyniku którego powstaje spontaniczna kokultura składająca się głównie z różnicujących się OPC i astrocytów, z niskim odsetkiem neuronów. Ta pierwotna hodowla lepiej naśladuje złożone środowisko in vivo, podczas gdy jej pochodzenie komórek macierzystych pozwala na wykonywanie prostych manipulacji w celu uzyskania pożądanego wzbogacenia linii komórkowej.

W przeciwieństwie do innych strategii badań przesiewowych leków wykorzystujących linie komórkowe lub czyste kultury pierwotnych OPC, opisana tutaj metoda pozwala na badanie wpływu patologicznych zakłóceń lub cząsteczek terapeutycznych w złożonym środowisku, nie tracąc przy tym ostrości na pożądanym typie komórki. Opisany przepływ pracy HCS pozwala na analizę żywotności komórek i specyfikacji linii, a także specyficznej dla linii śmierci komórki i parametrów morfologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt opisane tutaj zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywami Rady Wspólnoty Europejskiej (86/609/EWG) i są zgodne z wytycznymi opublikowanymi w Przewodniku NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Roztwory i odczynniki

  1. Przygotować pożywkę wzorcową: DMEM/F12 GlutaMAX 1x; 8 mmol/L HEPES; 100 U/100 μg Penicylina/Streptomycyna (1% P/S); 1x B27; 1x N-2.
  2. Przygotować pożywkę neurosferyczną: dodać 10 ng/ml bFGF; 10 ng/ml EGF do standardowej pożywki.
  3. Przygotować oligosferę/pożywkę OPC: dodać 10 ng/ml bFGF; 10 ng/mL PDGF-AA do pożywki wzorcowej.
  4. Przygotować pożywkę różnicującą oligodendroctye: dodać 50 nM T3; 10 ng/ml CNTF; 1x N-acetylo-L-cysteinę (NAC) do pożywki wzorcowej.
  5. Przygotuj nieenzymatyczny bufor dysocjacyjny: dodaj 1% P/S do nieenzymatycznego buforu dysocjacyjnego i utrzymuj lód w chłodzie.
  6. Przygotuj roztwór sacharozy: HBSS, 0,3 g/ml sacharozy.
  7. Przygotować roztwór myjący BSA: EBSS, 40 mg/ml BSA, 0,02 mL/l HEPES.
  8. Przygotować enzymatyczny bufor dysocjacyjny: HBSS, 5,4 mg/ml D-glukozy, 15 mmol/L HEPES, 1,33 mg/ml trypsyna, 0,7 mg/ml hialuronidaza, 80 U/ml DNazy.
  9. Przygotuj mieszaninę cytokin: TGF-β1, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 i IFN-γ (po 20 ng/ml).
  10. Przygotować podłoże mieszaniny cytokin: 0,04% zapasu (10% glicerol/100 nM glicyny/25 nM Tris, pH 7,3).
  11. Przygotować pożywkę do deprywacji tlenowo-glukozowej: standardową pożywkę przy użyciu DMEM bez glukozy. W zależności od surowości pożądanego warunku deprywacji glukozy, możliwe jest usunięcie również B27 i/lub N2 z pożywki, aby uniknąć związków pochodnych glukozy (np. D-galaktoza w B27).

2. Sekcja i izolacja NSC

UWAGA: Płodowe i dorosłe NSC zostały wyizolowane z przodomózgowia płodu E13.5 lub strefy podkomorowej (SVZ) u 2,5 miesiąca dorosłego, zgodnie z protokołem Ahleniusa i Kokaia9 z modyfikacjami.

  1. Posiewy płodowego NSC
    UWAGA: Przed rozpoczęciem sekcji należy przygotować probówki o pojemności 1,5 ml zawierające po 150 μl nieenzymatycznego buforu dysocjacyjnego każda; Umyj szalki Petriego i dodaj lodowaty HBSS.
    1. Zebrać zarodki w temperaturze E13,5 - 14,5 od ciężarnych myszy z pomiarem czasu i umieścić na szalce Petriego zawierającej zimny HBSS.
    2. Odetnij głowy embrionom za pomocą kleszczy.
    3. Umieść głowy zarodków na czystej szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS i usuń skórę z czaszki za pomocą kleszczy, używając szkieł powiększających lub stereoskopu.
    4. Gdy mózg jest widoczny i oczyszczony ze skóry, wyciśnij go, wywierając nacisk po bokach kleszczami.
    5. Usuń móżdżek, zachowaj tylko przodomózgowie i usuń opony mózgowe za pomocą kleszczy.
    6. Umieść wyizolowaną tkankę w nieenzymatycznym buforze dysocjacyjnym i powtórz etapy sekcji z innymi zarodkami. Umieść tkankę od 2-3 zwierząt do każdej probówki zawierającej bufor.
    7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut pod ciągłym wstrząsaniem.
    8. Po inkubacji dodać 850 μl standardowej pożywki i mieszać pipetując, aż zawiesina będzie wolna od grudek.
    9. Jeśli niezdysocjowana tkanka jest nadal widoczna, odczekaj 2 minuty w temperaturze pokojowej, aż osadza się na dnie probówki.
    10. Po zakończeniu dysocjacji policz komórki i umieść je w zawiesinie o gęstości 10-50 komórek/μl w kolbie T-25 lub T-45 zawierającej 10-30 ml pożywki neurosferycznej, utrzymywanej w pozycji pionowej, aby uniknąć adhezji komórek.
  2. Dorosłe posiewy NSC
    1. Składaj ofiary ze zwierząt przez zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Zbierz mózgi od 4-5 myszy w probówce o pojemności 50 ml zawierającej lodowaty HBSS.
    3. Umieść mózg na zimnej, sterylnej powierzchni. W tym celu należy użyć kolby T-25 wypełnionej wodą i umieszczonej na noc w temperaturze -20 °C. W czasie eksperymentu przykryj kolbę sterylną folią aluminiową.
    4. Umieść brzuszną stronę mózgu w dół, w kierunku ostro-ogonowym i usuń opuszki węchowe za pomocą żyletki.
    5. Za pomocą żyletki wytnij 2–3 plastry koronalne o grubości 1 mm, od kory do skrzyżowania optycznego.
    6. Umieść plastry na zimnej powierzchni w pozycji brzuszno-grzbietowej i zidentyfikuj ciało modzelowate i dwie boczne komory.
    7. Za pomocą szpar powiększających lub stereoskopu należy odizolować ściany komór bocznych, uważając, aby nie przenosić kawałków ciała modzelowatego.
    8. Umieścić wyizolowaną tkankę w enzymatycznym buforze dysocjacyjnym (5–10 ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    9. Wymieszać roztwór, pipetując kilkakrotnie (co najmniej 50 razy) i ponownie inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    10. Zneutralizować trypsynę, dodając 5 ml standardowej pożywki hodowlanej i przefiltrować roztwór za pomocą filtra 70 μm.
    11. Odwirować przefiltrowany roztwór przez 5 minut przy 400 x g.
    12. Zawiesić osad w roztworze sacharozy i odwirowywać przez 10 minut przy 500 x g.
    13. Zawiesić osad w roztworze myjącym BSA i odwirować przez 7 minut przy 400 x g.
    14. Zawiesić osad w standardowej pożywce hodowlanej, policzyć komórki i przeprowadzić posiew, jak opisano powyżej (w kroku 2.1.10).

3. Pierwotne neurosfery

  1. Dodawaj czynniki wzrostu (bFGF/EGF) co 2 dni.
  2. Co 4–6 dni (w zależności od gęstości komórek) zmieniaj połowę pożywki w następujący sposób:
    1. Przenieść całą zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 lub 50 ml.
    2. Wirować przez 5 minut przy 400 x g.
    3. Usuń połowę objętości.
    4. Dodać taką samą ilość świeżej pożywki, delikatnie wymieszać pipetując i dodać czynniki wzrostu.

4. Oligosfery

UWAGA: Różnicowanie oligodendrocytów odbywa się zgodnie z protokołem Chen10 z modyfikacjami.

  1. Kiedy neurosfery osiągną średnicę 100–150 μm, są gotowe do przejścia. W tym celu należy przenieść całą zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 lub 50 ml i odwirować przez 5 minut przy 400 x g.
    1. Szybko oceń średnicę, wykonując zdjęcia kulek za pomocą mikroskopu odwróconego światła przechodzącego i otwierając je za pomocą oprogramowania ImageJ.
    2. Kliknij menu Analizuj i w oknie Narzędzia wybierz opcję Pasek skali.
    3. Ustaw 150 μm jako szerokość w mikronach i porównaj podziałkę z kulkami.
  2. Usunąć całą objętość przez odwrócenie i ponownie zawiesić osad w 180 μl świeżej standardowej pożywki hodowlanej. Odpipetuj 50 razy, aby umożliwić dezagregację kulek.
  3. Dodać 810 μl świeżej standardowej pożywki hodowlanej, policzyć komórki i ponownie je pokryć zgodnie z opisem dla neurosfer.
  4. Dodawaj bFGF/PDGF-AA 10 ng/ml co 2 dni.
  5. Co 4–6 dni (w zależności od gęstości komórek) zmieniaj połowę pożywki w następujący sposób:
  6. Przenieść całą zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 lub 50 ml.
  7. Wirować przez 5 minut przy 400 x g.
  8. Usuń połowę objętości.
  9. Dodać taką samą ilość świeżej pożywki, delikatnie wymieszać pipetując i dodać czynniki wzrostu.

5. Powłoka płyty

  1. Powlekanie poli-D,L-ornityną/lamininą: co najmniej 2 dni przed posiewem OPC dodać 50 μg/ml roztworu poli-D,L-ornityny, rozcieńczonego w PBS, do każdego dołka (40 μl/basenik dla płytek 96-dołkowych) i inkubować w temperaturze pokojowej przez noc.
  2. Następnego dnia usuń płyn i umyj trzy razy destylowaną sterylną wodą.
  3. Pozostaw talerze do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc. Następnego dnia dodać roztwór lamininy rozcieńczony w PBS (5 μg/ml; 40 μl/basenik dla płytek 96-dołkowych) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.

6. Sadzenie komórek

  1. Gdy oligosfery osiągną średnicę 100–150 μm, są gotowe do dysocjacji i zasiania na płytkach pokrytych poli-D,L-ornityną/blaminą. W tym celu należy przenieść całą zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 lub 50 ml i wirować przez 5 minut przy 400 x g (jak wskazano w kroku 4.1)
  2. Usunąć całą objętość przez odwrócenie i ponownie zawiesić osad w 180 μl świeżej standardowej pożywki hodowlanej. Odpipetuj 50 razy, aby umożliwić dezagregację kulek.
  3. Dodać 810 μl świeżej standardowej pożywki hodowlanej i policzyć komórki.
  4. Usunąć roztwór lamininy z dołków i pokryć komórki płytką o gęstości 3 000 komórek/cm2 (100 μl/dołek dla płytek 96-dołkowych).

7. Indukcja różnicowania OPC

  1. Po 3 dniach usuń całą pożywkę i dodaj taką samą objętość pożywki do różnicowania oligodendrocytów.
  2. Zmieniaj połowę pożywki co 4 dni i dodawaj świeżą mieszankę różnicującą (T3/CNTF/NAC) co 2 dni.

8. Indukcja bloku różnicowania za pośrednictwem stanu zapalnego

  1. Po dysocjacji neurosfery i wytworzeniu oligosfery (sekcja 4) dodaj mieszaninę cytokin do pożywki hodowlanej i utrzymuj oligosfery wystawione na działanie cytokin przez cały etap tworzenia sfer.
    UWAGA: Objętość zależy od liczby komórek, ponieważ w przypadku tworzących się kulek komórki są wysiewane w ilości 10–50 komórek/μl.
  2. Jeśli konieczna jest zmiana pożywki, zmień całą objętość i ponownie dodaj mieszaninę cytokin.

9. Indukcja śmierci komórki powodującej deprywację tlenu i glukozy

  1. Przy -1 działce (2 dni po wysiewie komórek na płytkach wielodołkowych) usuń pożywkę i zakonserwuj ją w nowej płytce wielodołkowej.
  2. Dodać połowę objętości (50 μl dla płytek 96-dołkowych) pożywki OGD (grupa OGD) lub świeżej pożywki (grupa kontrolna). Połowa objętości służy do zmniejszenia wymiany tlenu między cieczą a powietrzem.
  3. Umieść kultury grupy OGD w hermetycznej komorze hipoksji nasyconej 95% N2 i 5% CO2 . Aby osiągnąć nasycenie komory, należy pozwolić mieszaninie gazów przepływać przez 6 minut z prędkością 25 l/min przed zamknięciem rur komory.
  4. Inkubować komorę hipoksyjną w inkubatorze przez 3 godziny. W inkubatorze należy również pozostawić grupę kontrolną i płytki zawierające pożywkę usuniętą i zakonserwowaną w kroku 9.1.
  5. Usunąć pożywkę wolną od glukozy (grupa OGD) lub nową (grupa kontrolna) i dodać pożywkę usuniętą i zakonserwowaną w kroku 9.1.

10. Immunocytochemia

  1. W pożądanym momencie utrwal komórki zimnym 4% paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Przemyć dwukrotnie PBS (10 minut inkubacji na każde przemycie w temperaturze pokojowej).
  3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z roztworem blokującym (PBS Triton 0,3% zawierający 1% BSA i 1% normalnej surowicy osła/kozy).
  4. Inkubować z mieszaniną przeciwciał pierwszorzędowych (Tabela 1), rozcieńczoną w PBS tryton 0,3%, przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Przemyć dwukrotnie PBS (10 minut inkubacji na każde przemycie w temperaturze pokojowej).
  6. Inkubować z roztworem przeciwciała drugorzędowego (Tabela 1) rozcieńczonym w PBS tryton 0,3%, dodając Hoechst 33258 przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  7. Przemyć dwukrotnie PBS (10 minut inkubacji na każde przemycie w temperaturze pokojowej).

11. Analiza HCS żywotności komórek, składu linii i śmierci komórek specyficznej dla danej linii

UWAGA: Reprezentatywne obrazy HCS i przepływ pracy są pokazane w Rysunek 2A,B.

  1. Wybierz algorytm analizy kompartmentowej z menu głównego oprogramowania (HCS Studio v 6.6.0) i wybierz Skanuj z menu głównego Develop Assay/Scan Plate.
  2. W oknie iDev wybierz opcję Nowy, a następnie wybierz opcję Narzędzie do pomiaru intensywności ogólnej z szablonu Opracuj test.
  3. Kliknij Utwórz po prawej stronie menu, wybierając cel 10x.
  4. Spowoduje to otwarcie menu Konfiguruj pobieranie. W tym oknie należy wybrać następujące parametry: (a) liczba kanałów: pierwszy dla barwienia jądrowego Hoechst (BGRFR_386) i po jednym dla każdego markera specyficznego dla linii użytego w reakcji (b) wybrać programowe ustawienie ostrości na kanale 1 i interwał autofokusa jako 1 (c) wybrać model płytki z listy.
  5. Z menu akwizycji spójrz na jakość barwienia w różnych studzienkach i różnych polach, a następnie ręcznie wybierz czas ekspozycji, wybierając z menu opcję Stały czas ekspozycji.
  6. Po ustawieniu parametrów akwizycji wybierz Mini Scan u góry menu i wybierz dziesięć pól na studzienkę w dwóch dołkach na warunki eksperymentalne. Umożliwi to ustawienie wszystkich parametrów analizy w podzbiorze pól dla całej płyty.
  7. Po zakończeniu mini skanowania kliknij Konfiguruj parametr testu, aby skonfigurować algorytm analizy.
  8. Kliknij Konfiguruj grupy po prawej stronie okna, a następnie przeciągnij i upuść studnie miniscanu. Kliknij przycisk Dodaj w podsekcji Grupy, aby skonfigurować różne grupy.
  9. Postępuj zgodnie z przepływem pracy po lewej stronie okna, krok po kroku, aby opracować cały algorytm. Najpierw wybierz Przetwarzaj obraz dla każdego kanału i kliknij Usuwanie tła i na żądany poziom.
  10. Najpierw zidentyfikuj i wybierz jądra przez barwienie jądrowe. Kliknij na Identify Primary Object – Channel 1, aby wybrać prawdziwe jądra i uniknąć analizowania artefaktów i szczątków. W tym celu należy powiększyć reprezentatywny obraz barwienia jądrowego i sprawdzić, czy jądra są dobrze otoczone obwodem zbudowanym przez oprogramowanie. Możliwa jest zmiana wartości progowej oraz zastosowanie algorytmów segmentacji w celu lepszej identyfikacji pojedynczych jąder.
  11. Po poprawnym zdefiniowaniu jąder kliknij na następujący krok: Sprawdź poprawność obiektu podstawowego. Wybierz Object.BorderObject.Ch1, aby uniknąć analizy jąder na granicy każdego obrazu pola. Wybierz Object.Area.Ch1 i przesuwając "niskie" i "wysokie" paski na histogramach, usuń wszystkie zidentyfikowane szczątki lub duże obiekty odpowiadające agregacjom lub artefaktom.
  12. Sprawdź wszystkie reprezentatywne obrazy mini skanu wszystkich warunków eksperymentalnych, aby upewnić się, że wybrane parametry pasują do nich wszystkich.
  13. Kliknij Zidentyfikuj miejsca dla każdego kanału odpowiadające określonym znacznikom pochodzenia i wybierz wartości pierścienia: Szerokość = 3 i Odległość = 0. Pozwoli to na identyfikację fluorescencji cytoplazmatycznej. W zależności od gęstości komórek wartości te można dostosować. Oprogramowanie automatycznie uniknie nakładania się sąsiednich pierścieni.
  14. Wybierz opcję Poziomy odniesienia w przepływie pracy, aby utworzyć analizę. Ustawienie poziomów odniesienia pozwoli na automatyczne zliczanie skondensowanych jąder, w oparciu o rozmiar jądra i intensywność barwienia jądrowego, oraz specyficznych komórek markerowo-dodatnich, w oparciu o cytopalaztyczną fluorescencję zidentyfikowaną przez pierścień.
  15. Najpierw kliknij Object.Area.Ch1. Na obrazach mini skanów wybierz skondensowane jądro i przesuń pasek "NISKI" na histogramach, aby wybrać jako "skondensowane" wszystkie jądra poniżej tego rozmiaru.
  16. Kliknij Object.AvgIntensity.Ch1. Na obrazach mini skanów wybierz skondensowane jądro i przesuń pasek "HIGH" na histogramach, aby wybrać jako "skondensowane" wszystkie jądra powyżej tej intensywności fluorescencji.
  17. Kliknij Object.RingAvgIntensity dla każdego kanału znaczników specyficznych dla pochodzenia. Wybierz na swoich miniaturowych obrazach skanowania komórkę pozytywową i przesuń pasek "WYSOKI" na histogramach, aby wybrać jako "pozytywne" wszystkie komórki powyżej tej intensywności fluorescencji.
  18. Sprawdź wszystkie reprezentatywne obrazy mini skanu wszystkich warunków eksperymentalnych, aby upewnić się, że wybrane parametry pasują do nich wszystkich.
  19. W górnym menu wybierz pozycję Charakterystyka populacji i wybierz pozycję Subpopulacja zdarzeń.
  20. Jako zdarzenie typu 1 wybierz ObjectAreaCh1 z lewej listy, a następnie kliknij przycisk I >, a na koniec wybierz ObjectAvgIntensityCh1. Pozwoli to na identyfikację jąder skondensowanych, jako kombinacji małej powierzchni i dużej intensywności.
  21. W tym samym oknie usuń zaznaczenie opcji Wszystkie limity skanowania.
  22. Kliknij opcję Wybierz cechy do zapisania w górnym menu, aby wybrać parametry, które mają zostać zachowane w analizie.
  23. Wybierz opcję Well Features (Cechy studni) i przejdź z lewej listy na prawą tylko żądane parametry: (a) SelectedObjectCountPErValidField (b) %EventType1ObjectCount (c) %High_RingAvgIntensity (Dla każdego kanału określonych znaczników pochodzenia).
    UWAGA: Ta analiza da jako odczyt całkowitą liczbę komórek, procent skondensowanych jąder oraz procent komórek dodatnich specyficznych dla linii dla każdego analizowanego markera w całkowitej liczbie komórek. Jeśli procent różnych linii jest potrzebny tylko na żywych komórkach, czy możliwe jest zachowanie wartości "High_RingAvgIntensity" dla kanału (bezwzględna liczba komórek dodatnich) i ponowne obliczenie procentu całkowitej liczby komórek po odjęciu procentu martwych komórek.
    1. Alternatywnie możliwe jest usunięcie martwych komórek z analizy, ustawienie tych samych parametrów, które są używane do identyfikacji skondensowanych jąder (kroki 11.14–11.15) w walidacji jąder (krok 11.11).
  24. Wybierz opcję Skanuj płytę z głównego górnego menu i kliknij symbol płyty w podmenu Ustawienia skanowania w górnej sekcji, aby zidentyfikować odwiert do analizy.
  25. Wpisz nazwę eksperymentu i opis, a po zakończeniu wszystkich ustawień naciśnij symbol odtwarzania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwsza faza hodowli może różnić się czasem trwania, w zależności od gęstości zasiewu i od tego, czy kule są pochodzenia płodowego czy dorosłego. Co więcej, oligosfery wykazują zmniejszone podwojenie populacji w porównaniu z neurosferami (Rysunek 1B). Co więcej, produkcja kulek z dorosłej tkanki jest wolniejsza i może zająć 2-3 tygodnie, aby wytworzyć oligosfery, w porównaniu z płodem, który może potrzebować 1-2 tygodni, w zależności od gęstości wysiewu.

Po wysiani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożony charakter procesów mielinizacji/remielinizacji i zdarzeń demielinizacyjnych sprawia, że opracowanie systemów predykcyjnych in vitro jest niezwykle trudne. Najpowszechniej stosowanymi systemami badań przesiewowych leków in vitro są głównie ludzkie linie komórkowe lub pierwotne hodowle czystego OL, przy coraz częstszym wykorzystaniu bardziej złożonych kokultur lub systemów organotypowych15. Nawet jeśli takie systemy są sprzężone z technologiami o wysokiej zawartości, czyste kultury OL pozost...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspierane przez MIUR National Technology Clustersproject IRMI (CTN01_00177_888744) oraz Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.

Specjalne podziękowania dla Fundacji IRET za organizację eksperymentalnych prac.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytki 96-dołkowe - nieleczoneNUNC267313
suplement B27 (100x)GIBCO17504-044
podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)GIBCOPHG0024
BSASigma-AldrichA2153
Rzęskowy czynnik neurotropowy (CNTF)GIBCOPHC7015
DMEM bez glukozyGIBCOA14430-01
DMEM/F12 GlutaMAXGIBCO31331-028
DNaseSigma-AldrichD5025-150KU
EBSSGIBCO14155-048
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)GIBCOPHG6045
HBSSGIBCO14170-088
HEPESGIBCO15630-056
HialuronidazaSigma-AldrichH3884
IFN-γOrigeneTP721239
IL-17AOrigeneTP723199
IL-1βOrigeneTP723210
IL-6OrigeneTP723240
lamininaGIBCO23017-051
N-acetylo-L-cysteinaSigma-AldrichA9165
Suplement N2 (50x)GIBCO17502-048
Nieenzymatyczny bufor dysocjacyjnyGIBCO13150-016
PBSGIBCO70011-036
Penicylina / StreptomycynaSigma-AldrichP4333
Płytkowy czynnik wzrostu (PDGF-AA)GIBCOPHG0035
poli-D,L-ornitynaSigma-AldrichP4957
TGF-β 1OrygenezaTP720760
TNF-&alfa;OrygenezaTP723451
TrójjodotyroninaSigma-AldrichT2752-1G
TrypsynaSigma-AldrichT1426

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Michalski, J. P., Kothary, R. Oligodendrocytes in a nutshell. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 340(2015).
  2. Verden, D., Macklin, W. B. Neuroprotection by central nervous system remyelination: molecular, cellular, and functional considerations. Journal of Neuroscience Research. 94, 1411-1420 (2016).
  3. Raff, M. C., Lillien, L. E., Richardson, W. D., Burne, J. F., Noble, M. D. Platelet-derived growth factor from astrocytes drives the clock that times oligodendrocyte development in culture. Nature. 333, 562-565 (1988).
  4. Crawford, A. H., Chambers, C., Franklin, R. J. M. Remyelination: The true regeneration of the central nervous system. Journal of Comparative Pathology. 149, 242-254 (2013).
  5. Butt, A. M., Papanikolaou, M., Rivera, A. Physiology of oligodendroglia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 11175, 117-128 (2019).
  6. Baldassarro, V. A., Giardino, L., Calzà, L. Oligodendrocytes in a dish for the drug discovery pipeline: the risk of oversimplification. Neural Regeneration Research. 16, 291-293 (2021).
  7. Buchser, W. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. 1, Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. 1-80 (2014).
  8. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
  9. Ahlenius, H., Kokaia, Z. Isolation and generation of neurosphere cultures from embryonic and adult mouse brain. Methods in Molecular Biology. 633, Clifton, N.J. 241-252 (2010).
  10. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse Oligodendrocyte Precursor Cells. Nature Protocols. 2 (5), 1044-1051 (2007).
  11. Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443(2019).
  12. Baldassarro, V. A., et al. The role of nuclear receptors in the differentiation of Oligodendrocyte Precursor Cells derived from fetal and adult neural stem cells. Stem Cell Research. 37, 101443(2019).
  13. Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure. Glia. 64, 1573-1589 (2016).
  14. Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. Differential effects of glucose deprivation on the survival of fetal versus adult neural stem cells-derived Oligodendrocyte Precursor Cells. Glia. , 23750(2019).
  15. Merrill, J. E. In vitro and in vivo pharmacological models to assess demyelination and remyelination. Neuropsychopharmacology. 34, 55-73 (2009).
  16. Lariosa-Willingham, K. D., et al. A high throughput drug screening assay to identify compounds that promote oligodendrocyte differentiation using acutely dissociated and purified oligodendrocyte precursor cells. BMC Research Notes. 9, 419(2016).
  17. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. Journal of Neuroscience Methods. 209, 219-226 (2012).
  18. Fancy, S. P. J., Chan, J. R., Baranzini, S. E., Franklin, R. J. M., Rowitch, D. H. Myelin regeneration: a recapitulation of development. Annual Review of Neuroscience. 34, 21-43 (2011).
  19. Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. Regenerating CNS Myelin - from mechanisms to experimental medicines. Nature Reviews Neuroscience. 18, 753-769 (2017).
  20. Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation. Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).
  21. Leong, S. Y., et al. Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development. Neurology. 82, (2014).
  22. Bribián, A., et al. Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis. Journal of Clinical Medicine. 9, 1681(2020).
  23. Jäkel, S., et al. Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis. Nature. 566, 543-547 (2019).
  24. Medina-Rodríguez, E. M., Arenzana, F. J., Bribián, A., de Castro, F. Protocol to isolate a large amount of functional oligodendrocyte precursor cells from the cerebral cortex of adult mice and humans. PloS One. 8, 81620(2013).
  25. Baldassarro, V. A., et al. Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases. Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja neuronalnych kom rek macierzystychkom rki prekursorowe oligodendrocyt wp odowy i doros y m zgr nicowanie oligodendrocyt wdeprywacja tlenowo glukozowablokada indukowana stanem zapalnymtesty hodowli kom rkowychanaliza mielinizacji i remielinizacjispontaniczna hodowla mieszana

Powiązane artykuły