Artykuł metodologiczny

Studiowanie terapii wzmocnionej kawitacją

DOI:

10.3791/61989

⸱

9 kwietnia 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Oxford

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany protokół eksperymentalny może być wykorzystany do wykonywania pomiarów aktywności kawitacyjnej w czasie rzeczywistym w urządzeniu do hodowli komórkowej w celu umożliwienia zbadania warunków wymaganych do skutecznego dostarczania leku i/lub innych efektów biologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zainteresowanie terapeutycznymi zastosowaniami ultradźwięków jest znaczące i rośnie, z potencjalnymi celami klinicznymi od raka do choroby Alzheimera. Kawitacja - tworzenie i późniejszy ruch pęcherzyków w polu ultradźwiękowym - stanowi kluczowe zjawisko leżące u podstaw wielu z tych zabiegów. Pozostaje jednak znaczna niepewność co do szczegółowych mechanizmów działania, za pomocą których kawitacja sprzyja efektom terapeutycznym, i istnieje potrzeba opracowania wiarygodnych technik monitorowania, które można wdrożyć klinicznie. W szczególności istnieją znaczne różnice między badaniami w zakresie parametrów narażenia, o których stwierdzono, że skutecznie przynoszą efekty terapeutyczne, a odpowiadającymi im emisjami akustycznymi. Celem niniejszego artykułu jest przedstawienie wytycznych projektowych i protokołu eksperymentalnego wykorzystującego powszechnie dostępne komponenty do przeprowadzania badań efektów biodynamicznych za pośrednictwem kawitacji, a także monitorowanie akustyczne w czasie rzeczywistym. Oczekuje się, że protokół umożliwi szersze włączenie monitorowania akustycznego do terapeutycznych eksperymentów ultrasonograficznych i ułatwi porównywanie warunków ekspozycji i ich korelacji z istotnymi skutkami biologicznymi w badaniach nad warunkami ekspozycji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ultrasonografia (US) jest szeroko stosowana jako technika obrazowania diagnostycznego ze względu na jej bezpieczny i nieinwazyjny charakter, łatwość wdrożenia przy łóżku pacjenta oraz opłacalność1. Oprócz możliwości diagnostycznych i monitorujących, US ma znaczny potencjał w zakresie zastosowań terapeutycznych. Wczesne prace dotyczyły jego zastosowania w trombolizie, transfekcji DNA i dostarczaniu leków2,3,4 i terapeutyczne US stanowi obecnie bardzo aktywny obszar badań, z zastosowaniami obejmującymi leczenie nowotworów5,6,7, immunotherapy8,9, zakłócenie bariery krew-mózg (BBB)10,11,12, tromboliza13,14,15, oraz leczenie infekcji bakteryjnych16,17. Kluczowym zjawiskiem leżącym u podstaw tych zastosowań jest kawitacja: zarodkowanie, wzrost i oscylacja wnęk gazowych spowodowane zmianami ciśnienia płynu18,19.

Istnieje szereg mechanizmów, dzięki którym kawitacja wywołuje efekty biologiczne. Na przykład, wysoce nieliniowy charakter oscylacji pęcherzyków pod wpływem zastosowanego pola US może generować mikrostrumienie w otaczającej cieczy, które mogą zarówno zwiększyć konwekcję leku20, jak i wywierać naprężenia ścinające na tkankę w pobliżu pęcherzyków. Jest to szczególnie powszechne, gdy pęcherzyki znajdują się w pobliżu granicy, powodując niesferyczne oscylacje pęcherzyków i mogą potencjalnie sprzyjać wchłanianiu leku poprzez przenikanie wywołane ścinaniem21,22,23,24. Przy wyższych ciśnieniach obserwuje się oscylacje o większej amplitudzie i szybkie zapadanie się pęcherzyków, co powoduje bezpośrednie naprężenia mechaniczne25 i często generuje fale uderzeniowe, a w konsekwencji duże gradienty ciśnienia, które mogą zakłócać i przenikać tkanki26,27. Zapadanie się pęcherzyków w pobliżu powierzchni może również powodować powstawanie mikrodżetów cieczy o dużej prędkości28,29,30. Te mikrodżety mogą przenikać do tkanki, potencjalnie tworząc pory lub wywołując wtórne fale stresu31,32. Przenikanie błon biologicznych zarówno na poziomie tkankowym, jak i komórkowym jest różnie określane jako sonoforeza, stosowana głównie w kontekście wywołanego przez USA zwiększenia przepuszczalności skóry 33,34, oraz sonoporację, używaną głównie do opisania odwracalnej przepuszczalności błony komórkowej w wyniku tworzenia się porów błony35,36.

Absorpcja lepkości w cieczy bezpośrednio otaczającej oscylującą bańkę może wywołać znaczny efekt grzewczy37. Co więcej, wysoce nieliniowe oscylacje wytwarzają promieniowanie akustyczne o częstotliwościach wyższych niż napędzające pole amerykańskie. Prowadzi to do zwiększonej absorpcji w otaczającej tkance i dalszego podgrzewania38. Zapadaniu się pęcherzyków mogą również towarzyszyć efekty chemiczne spowodowane przejściowymi wysokimi temperaturami i ciśnieniami w rdzeniu pęcherzyka, takie jak wytwarzanie wysoce reaktywnych form i promieniowanie elektromagnetyczne, znane jako sonoluminescencja32. Efekty te zostały zbadane w celu oceny potencjalnych uszkodzeń i/lub aktywacji odpowiednich szlaków komórkowych do dostarczania39 i wykorzystane w lokalnej aktywacji leków wrażliwych na światło w podejściu znanym jako terapia sonodynamiczna40,41,42,43.

Wiele efektów biologicznych, w których pośredniczy USA, może być inicjowanych wyłącznie poprzez kontrolę parametrów pola amerykańskiego (amplituda ciśnienia, częstotliwość, długość impulsu i częstotliwość powtarzania oraz czas trwania ekspozycji), ale niezawodne generowanie kawitacji w tkance biologicznej często wymaga wysokich energii wejściowych, a zatem niesie ze sobą podwyższone ryzyko uszkodzenia. Wprowadzenie egzogennych lub sztucznych jąder kawitacji może znacznie zmniejszyć energię wejściową wymaganą do wytworzenia szerokiego zakresu efektów omówionych powyżej, a ponadto wprowadzić dodatkowe efekty, które mogą nie być możliwe w przypadku samych US. Jądra kawitacji obejmują pęcherzyki gazu26,44, kropelki cieczy45,46,47 i cząstki stałe48,49,50, przy czym jądra kawitacji w nanoskali są nowym obszarem badań pod kątem ich korzyści pod względem wydłużonego czasu krążenia, Poprawa wynaczynienia i przedłużona aktywność kawitacyjna49,51,52,53.

Najczęściej używanymi jądrami są mikropęcherzyki gazu (MBs), pierwotnie używane jako środki kontrastowe w diagnostyce obrazowej. Mają one zwykle średnicę 1-2 mikrometrów i zawierają rdzeń gazu o dużej masie cząsteczkowej o niskiej rozpuszczalności w wodzie w otaczającym podłożu. Rdzeń jest otoczony ochronną powłoką lipidową, białkową lub polimerową, najczęściej składającą się z fosfolipidów54. Po wystawieniu na działanie pola amerykańskiego, ściśliwość MB powoduje ich oscylacje objętościowe, co w konsekwencji powoduje silne rozpraszanie akustyczne, które jest odpowiedzialne za sukces MB jako środka kontrastowego. Jak wspomniano, oscylacje te prowadzą również do wyżej wymienionych efektów mechanicznych, termicznych i chemicznych, które można wykorzystać w zastosowaniach terapeutycznych. Proces powlekania MB oferuje również mechanizm kapsułkowania leków w strukturze MB oraz przyłączania leków i/lub gatunków docelowych do powierzchni MB. Technika ta ułatwia wyzwalanie uwalniania leków w celu zmniejszenia toksyczności ogólnoustrojowej55. Niedawno wykazano również, że materiał z powierzchni MB może być przenoszony do struktur biologicznych, usprawniając dostarczanie leków poprzez tzw. "sonoprinting"56,57,58.

Monitorowanie aktywności kawitacyjnej za pośrednictwem USA może dostarczyć wglądu w wynikowe efekty biologiczne zarówno in vitro, jak i in vivo i potencjalnie pozwala na dostrojenie i optymalizację tych efektów. Dwie najpowszechniej stosowane metody monitorowania aktywności kawitacyjnej to i) optyczna, która wykorzystuje ultraszybką mikroskopię wideo i jest generalnie niewykonalna in vivo; oraz ii) akustyczna, która rejestruje ponownie wypromieniowane pola dźwiękowe wytwarzane przez oscylujące i/lub zapadające się pęcherzyki. Zarówno składowe amplitudy, jak i częstotliwości sygnału akustycznego zawierają informacje o zachowaniu pęcherzyków. Wykazano, że niskie stężenia pęcherzyków przy niskich amplitudach incydentalnych w USA powodują głównie emisje harmoniczne (całkowite wielokrotności częstotliwości jazdy)59. Wraz ze wzrostem ciśnienia napędowego, widmo emisji pęcherzyków może również zawierać składowe ułamkowe znane jako subharmoniczne i ultraharmoniczne60, które wskazują na silniejsze zachowanie nieliniowe, a także szum szerokopasmowy, który wskazuje na kawitację bezwładnościową. Harmoniczne całkowite są podstawowym wskaźnikiem oscylacji pęcherzykowej, ale mogą być również spowodowane nieliniowością w dowolnym miejscu systemu eksperymentalnego, np. z powodu propagacji nieliniowej. Natomiast harmoniczne ułamkowe i szum szerokopasmowy są bardzo silnie skorelowane z dynamiką pęcherzyków.

Związek między zachowaniem pęcherzyków a wykrytymi emisjami akustycznymi może być skomplikowany przez takie czynniki, jak pole zdarzenia w USA, środowisko zarodkowania i charakterystyka ścieżki detekcji60. Niemniej jednak ważne informacje na temat zachowania pęcherzyków i ich interakcji z komórkami można uzyskać, dostrzegając trendy w częstotliwości i energii w widmie akustycznym. Dane te mogą również dostarczyć cennych informacji, które mogą być wykorzystane do stworzenia podstawy dla technik klinicznego monitorowania leczenia. Aby w pełni wykorzystać te informacje, konieczne jest opracowanie solidnych, przekładalnych i odtwarzalnych metod eksperymentalnych.

Obecnie istnieją znaczne różnice w raportowanych protokołach projektowania systemów i prowadzenia badań wspierających rozwój terapii wspomaganych kawitacją. Jeśli chodzi o aparaturę, podjęto szereg podejść projektowych. Kilka grup korzystało z komór z płytami równoległymi56,61,62,63, zbudowanych na zamówienie lub dostępnych na rynku (np. OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu i in. (2013) opracowali komorę komórkową sprzężoną z amerykańskim modułem sonikacyjnym i obrazowaniem konfokalnym w czasie rzeczywistym64, Carugo i in. (2015) wykorzystali system składający się z dostępnego na rynku naczynia do hodowli komórkowej z niestandardową pokrywą PDMS, aby umożliwić zanurzenie w kąpieli wodnej podczas ekspozycji w USA65, a Pereno i in. (2018) wykorzystali urządzenie składające się z warstwowych rezonatorów akustycznych, które pozwalają na jednoczesną charakterystykę optyczną i akustyczną Dynamika bąbelków i interakcje między komórkami bąbelkowymi66. Stosowanie niestandardowych i specyficznych dla aplikacji projektów komplikuje charakterystykę pola w USA i innych warunków narażenia środowiskowego, co utrudnia porównania między badaniami. Na przykład, istnieje znaczna zmienność w amerykańskich parametrach zidentyfikowanych dla osiągnięcia udanej sonoporacji, które obejmują częstotliwości środkowe w zakresie od 0,02 do 15 MHz, cykle pracy wahające się od 1% do fali ciągłej oraz ciśnienie rozrzedzające w zakresie od 0,1 do 20 MPa23,64,67,68,69,70 (Tabela 1). Podobnie znaczne są różnice w składowych widmowych (harmoniczne, podharmoniczne itp.), które zostały zidentyfikowane jako związane z określonymi efektami biologicznymi.

Celem tej pracy jest zatem dostarczenie łatwego do odtworzenia systemu projektowania i implementacji ram do badania in vitro komórkowych efektów biologicznych wywołanych kawitacją, ze szczególnym uwzględnieniem możliwości monitorowania kawitacji.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zasady projektowania systemu

UWAGA: Ta sekcja przedstawia zasady projektowania używane do tworzenia systemów do monitorowania ekspozycji i kawitacji w USA. Zasady te są zilustrowane dwoma istniejącymi systemami transfekcji akustycznej (SAT) (pokazanymi na Rysunek 1). Każdy system składa się z komory naświetlania komórek, źródła amerykańskiego i jednoelementowego przetwornika działającego jako pasywny detektor kawitacji (PCD), z których wszystkie są zintegrowane w komorze testowej na stanowisku laboratoryjnym. Projekty te opierają się na wcześniejszym rozwoju systemu opisanym w Carugo et al. (2015)65.

  1. Maksymalizuj łatwość użytkowania.
    1. Spraw, aby komora ekspozycji komórek była kompatybilna z istniejącymi technikami hodowli i systemami obrazowania, wykorzystując istniejące komercyjne urządzenia do hodowli komórkowych jako substraty do wysiewu/wzrostu.
      1. W przypadku SAT2 użyj naczynia hodowlanego (o średnicy 35 mm, z czego widoczny jest obszar o średnicy 21 mm, patrz Tabela materiałów).
      2. W przypadku SAT3 należy użyć wkładki Transwell (średnica 6.5 mm, patrz Tabela materiałów). Transwells mają przepuszczalną membranę i dlatego muszą być umieszczane w pożywkach komórkowych, a nie w wodzie.
  2. Umożliwiają szybkie załadowanie i uszczelnienie komory ekspozycji komórek.
    1. Uformuj komorę ekspozycji komórek SAT2, wciskając elastyczną polimerową pokrywę na naczynie hodowlane (Carugo i in. 201565). Jak widać na Rysunek 1C, pokrywka ma parę otworów o średnicy 1,2 mm, które umożliwiają napełnienie komory strzykawką z igłą 18 G. Po napełnieniu uszczelnij te otwory napełniania krótkimi plastikowymi prętami (Tabela materiałów).
    2. Napełnij komorę SAT3 za pomocą strzykawki lub pipety i zamknij, wciskając gumowy korek/zatyczkę.
    3. Umożliwiają szybkie załadowanie zamkniętej komory naświetlania komórek do komory testowej. Uchwyty do komór do ekspozycji komórek zostały wbudowane w pokrywy komory, gdzie wystarczy lekkie dopasowanie wciskane, aby zapewnić prawidłowe wyrównanie. W przypadku systemów pokazanych w Rysunek 1, czas na zmiany próbki może wynosić zaledwie 20 sekund, jeśli wcześniej przygotowano wiele komór do ekspozycji komórek.
    4. Zminimalizuj wewnętrzną objętość komory, aby system był przenośny, a ilość wymaganej wody/mediów mogła zostać zminimalizowana. Przyspiesza to również odzyskiwanie po przypadkowym rozlaniu lub wycieku środków kawitacyjnych z komory ekspozycji komórek.
      UWAGA: Wewnętrzna objętość SAT2 wynosi około 0.8 l. Wewnętrzna objętość SAT3 wynosi około 7,6 l - jest większa, aby umożliwić łatwe ładowanie i zmianę przetwornika źródłowego lub jego konfiguracji. Dodano wewnętrzną komorę o pojemności 0,3 l, aby zminimalizować objętość dyspozycyjną i umożliwić stosowanie biologicznie istotnych płynów innych niż woda wypełniająca zbiornik (np. pożywki do hodowli komórkowych). Wewnętrzne dno komory wykonane jest z arkusza mylaru o grubości 30 μm, aby umożliwić maksymalną transmisję akustyczną.
      5. Jeśli
    5. to możliwe, komorę i elementy wewnętrzne należy wykonać z optycznie przezroczystych materiałów, aby wszelkie problemy (np. nieszczelności, uwięzione makropęcherzyki) można było szybko zaobserwować i zaradzić.
  3. Maksymalizuj przepuszczalność akustyczną komory ekspozycyjnej.
    1. Zmaksymalizuj zdolność przenoszenia dzięki doborowi materiałów i grubości ścianek komory. Przy założeniu, że ciecze po obu stronach ściany są zasadniczo takie same (np. woda), wielkość normalnego współczynnika przenikania ciśnienia padania71 wynosi:
      figure-protocol-1, gdzie λ jest długością fali w ściance o grubości L, figure-protocol-2, a zL i zo są impedancjami charakterystycznymi (iloczynami gęstości i prędkości dźwięku) odpowiednio dla materiału ściany i cieczy. T = 1 oznacza doskonałą transmisję.
    2. W przypadku monitorowania kawitacji w szerokim spektrum (np. 1-8 MHz), większość polimerów laboratoryjnych (np. PDMS, PTFE, polistyren) zmieni przenoszone ciśnienie o nie więcej niż 10%, jeśli grubość materiału jest mniejsza niż 1/10 długości fali w materiale. Warunek ten może być trudny do spełnienia przy standardowych dostawach przy wysokich częstotliwościach (np. #1,5 szkiełko nakrywkowe przy 8 MHz), dlatego dobrą praktyką jest przewidywanie lub bezpośrednia kalibracja pasma przenoszenia.
    3. W przypadku wąskopasmowej transmisji sygnału źródłowego USA do komory ekspozycji ogniwa, należy zezwolić na grubszą warstwę, jeśli jest to w przybliżeniu całkowita wielokrotność połowy długości fali w materiale warstwy. Na przykład pokrywa PDMS w SAT2 jest używana przy grubości 2,0 mm (~2 długość fali przy 1 MHz, cPDMS ~ 1000 m/s).
  4. Zmaksymalizuj obszar ekspozycji poprzez wybór środowiska źródłowego i komórkowego.
    1. Aby zmaksymalizować liczbę naświetlonych komórek, należy jak najszerzej ustawić obszar przyczepu komórek, zachowując jednocześnie kompatybilność z dostępnym sprzętem do hodowli i obrazowania.
    2. Użyj źródła amerykańskiego z polem, które obejmuje obszar przyczepu komórki z minimalną zmiennością przestrzenną, używając obszaru przedogniskowego dużego skupionego źródła (SAT2) lub skupionego lub soczewkowanego źródła o szerokości płata głównego odpowiadającej średnicy obszaru przyczepu komórki (SAT3). Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi źródłami.
    3. Zminimalizuj złożoność pola wprowadzaną przez uchwyt komory celi poprzez mechaniczne podparcie komory celi z dala od najsilniejszej części pola padającego, zminimalizowanie przekroju poprzecznego rozpraszania uchwytu lub umieszczenie materiału absorbującego na oprawce. Przykłady są pokazane w Rysunek 1A i 1D.
  5. Zapewnij powtarzalne warunki ekspozycji.
    1. Zakończ pole akustyczne w ustalonej granicy, aby wyeliminować zmienność, która może wynikać z interfejsów powietrze-woda w częściowo wypełnionych komorach. W SAT2 i 3 osiąga się to poprzez zainstalowanie absorbera akustycznego (patrz Tabela materiałów) na pokrywie komory, co zapewnia dodatkową korzyść w postaci zmniejszenia złożoności pola, która może powstać w wyniku odbić granicznych.
    2. Monitoruj i rejestruj napięcie napędu źródłowego na wyjściu wzmacniacza/wejściu źródła, aby można było szybko wykryć drobne odchylenia lub poważne awarie. Użyj voltage sonda lub inne urządzenie, które jest bezpieczne w użyciu w zakresie napięcia napędu, który Cię interesuje. Okresowo sprawdzaj kalibrację sondy napięcia za pomocą dobrze znanego źródła, takiego jak generator przebiegów.
    3. Kontroluj, monitoruj i rejestruj temperaturę komory i jej zawartości. Reakcje komórek, przetworników i pożywki propagacyjnej mogą być wrażliwe na temperaturę. W SAT2 monitorowanie i sterowanie odbywa się za pomocą pary portów cyrkulacyjnych podłączonych do systemu uzdatniania wody, podczas gdy SAT3 wykorzystuje grzałkę akwariową (nie pokazano). Ustaw temperaturę wody zgodnie z potrzebami, aby naśladować odpowiednie warunki fizjologiczne dla aplikacji terapeutycznej.
      UWAGA: temperatury wewnętrzne mogą ulec zmianie zarówno w wyniku czynników zewnętrznych, jak i ogrzewania przetwornika i medium przez USA.
    4. Ostrożnie odgazować ciecz(e) w komorze, aby zminimalizować prawdopodobieństwo niezamierzonej kawitacji i/lub rozproszenia z wcześniej istniejących pęcherzyków na ścieżce propagacji.
      UWAGA: jeśli odgazowanie nie zostanie przeprowadzone, np. ze względu na negatywny wpływ na komórki, wówczas nastąpi zwiększony poziom aktywności pęcherzyków w tle, dla którego jest to odpowiednie.
  6. Skalibruj w pełni zmontowany system.
    1. Zawierać środki do pomiaru pola ciśnienia padającego na odsłonięte ogniwa, gdy wszystkie elementy systemu są na swoim miejscu, w tym komora ekspozycji ogniwa. W SAT2 i 3 odbywa się to za pomocą otworu w pokrywie komory, przez który można wprowadzić igłę lub hydrofon światłowodowy bez naruszania mierzonego pola. Pomiary należy wykonywać jak najbliżej miejsca, w którym znajdują się komórki.
    2. Wybierz hydrofon, którego czuły promień (rcv) jest na tyle mały, że nie będzie błędnie zgłaszał mierzonego pola ciśnienia. Dopuszczalna wielkość jest funkcją częstotliwości źródła (f) i promienia (a src), a także odległości między źródłem a skanowaniem pola (zrcv). Ogólnym kryterium wyboru rozmiaru hydrofonu jest: figure-protocol-3, co prowadzi do: figure-protocol-4, gdzie c to prędkość dźwięku72.
    3. Upewnij się, że hydrofon jest skalibrowany w warunkach stosowanych w charakterystyce systemu, w tym w temperaturze określonej w sekcji 1.6. W szczególności, jeśli hydrofon jest trzymany pod kątem w stosunku do płaszczyzny skanowania, hydrofon musi być skalibrowany pod tym kątem, ponieważ efekty kierunkowości mogą się znacznie różnić od tych oczekiwanych na podstawie czysto geometrycznej. Zmiana czułości hydrofonu w odniesieniu do temperatury powinna być dostępna u producenta.
    4. Przeskanuj cały region, w którym mogą być odsłonięte komórki. Aby uchwycić odpowiedni poziom szczegółowości pola, należy użyć odstępu między skanami nie większego niż 1/5 długości fali przy najwyższej częstotliwości będącej przedmiotem zainteresowania. Jeśli zaobserwuje się nieoczekiwaną złożoność pola, rozważ użycie krótkich sygnałów impulsów (np. 1-3 cykle), aby umożliwić identyfikację i kwantyfikację bezpośrednich i rozproszonych wkładów pola.
  7. Włącz funkcję monitorowania kawitacji.
    1. Określ typ i rozmieszczenie przetwornika monitorującego jako część projektu całego systemu, a nie jako modernizację. W praktyce prowadzi to do powstania systemu, który jest maksymalnie kompaktowy bez poświęcania możliwości niezawodnego dopasowania krytycznych komponentów systemu.
    2. Umieść urządzenie monitorujące kawitację w systemie w taki sposób, aby można je było powtarzalnie ustawiać przy minimalnym dodatkowym czasie konfiguracji lub zakłóceniu pracy. W SAT2 osiąga się to za pomocą jednoelementowego przetwornika piezoelektrycznego działającego jako PCD zamontowanego w pokrywie komory, podczas gdy SAT3 integruje PCD z podstawą źródłową za pomocą reflektora 90°.
    3. Wybierz kształt PCD zgodnie z celami eksperymentów. W Rysunek 2, obliczenia konturów połowy amplitudy urządzeń nieostrych (po lewej) i skupionych (po prawej) pokazują głębokie różnice we wrażliwości przestrzennej w odniesieniu do częstotliwości. Nieostre urządzenie lepiej nadaje się do monitorowania dużych objętości z niewielkimi zmianami przestrzennymi w odniesieniu do częstotliwości, podczas gdy zogniskowane urządzenie lepiej nadaje się do bardziej zwartych promieniowo pomiarów na interesujących nas częstotliwościach.
    4. Wybierz częstotliwość środkową PCD i szerokość pasma, aby dopasować ją do potrzeb eksperymentu. Częstotliwość środkowa jest zwykle wybierana tak, aby była co najmniej pięciokrotnie większa niż w przypadku źródła amerykańskiego, aby zminimalizować wrażliwość na emisje ze źródła bezpośredniego. Przepustowość jest zwykle maksymalizowana w celu zaobserwowania szerokiego zakresu zachowań pęcherzyków (szum harmoniczny i szerokopasmowy).
    5. Wybierz metody kondycjonowania, rejestrowania i przetwarzania, aby umożliwić analizę danych kawitacji, zgodnie z opisem w następnej sekcji.

2. Oprzyrządowanie i przetwarzanie do monitorowania kawitacji

UWAGA: Ta sekcja przedstawia komponenty przepływu sygnału i funkcje zalecane do zbierania danych monitorowania kawitacji oraz przetwarzanie danych, które prowadzi do jakościowej i ilościowej oceny aktywności kawitacyjnej.

  1. Oprzyrządowanie (Zobacz też Rysunek 3).
    1. O ile aplikacja nie wymaga urządzenia dostosowanego do potrzeb klienta, należy wybrać PCD z szerokiej gamy dostępnych na rynku przetworników jednoelementowych, zwykle sprzedawanych do badań nieniszczących zanurzonych celów. Dostawcy ci posiadają również okablowanie i akcesoria (np. odbłyśnik lustrzany w SAT3).
    2. Zminimalizuj odpowiedź PCD na źródło amerykańskie. Można to zrobić zarówno poprzez wybór PCD (częstotliwość środkowa i szerokość pasma), jak i za pomocą filtra wycinającego lub górnoprzepustowego. Ten ostatni może być zaimplementowany zarówno jako samodzielny moduł, jak i jako część urządzenia kondycjonującego sygnał.
    3. Użyj digitizera o dużym zakresie dynamiki (co najmniej 12 bitów), aby przechwycić jak najwięcej danych przy minimalnym prawdopodobieństwie wysokiego przesterowania sygnału i maksymalnym stosunku sygnału do szumu (SNR) najmniejszych sygnałów. Porównując urządzenia, należy zapoznać się ze specyfikacjami dotyczącymi stosunku sygnału do szumu i zniekształceń i/lub efektywnej liczby bitów, ponieważ są to bardziej kompletne opisy osiągalnego zakresu dynamiki. Należy również rozważyć, czy rozmiar bufora pamięci jest wystarczający dla żądanej długości i szybkości przechwytywania danych.
    4. Zoptymalizuj wykorzystanie zakresu dynamiki digitizera. Sygnały PCD mogą obejmować kilka rzędów wielkości, zarówno ze względu na długą ekspozycję (gdy pęcherzyki są eliminowane), jak i w przypadku przeprowadzania eksperymentów na różnych poziomach napędu w USA. Dlatego konieczne jest sprawdzenie, czy łańcuch kondycjonowania sygnału skaluje wszystkie sygnały, aby można je było prawidłowo zarejestrować.
    5. Dołącz przedwzmacniacz do łańcucha sygnałowego, aby najmniejsze oczekiwane sygnały mogły być odpowiednio przechwycone. Z naszego doświadczenia wynika, że szum własny PCD jest znacznie niższy niż w większości digitizerów, więc niewielki stopień przedwzmacniacza (np. <100x) może nadal poprawić SNR końcowego wyniku.
    6. Przefiltruj częstotliwość źródła amerykańskiego przed preamplifikacja, aby uniknąć nasycenia amplifier.
    7. Jeśli impulsator/odbiornik US jest używany do zapewnienia wzmocnienia i/lub możliwości filtrowania, użyj go w trybie pulsatora, aby potwierdzić długość/wyrównanie ścieżki lub sprawdzić, czy w ścieżce propagacji między PCD a komorą ekspozycji komórki nie ma nieoczekiwanych rozpraszaczy.
    8. Włącz strumieniowe przesyłanie danych w czasie rzeczywistym do pamięci masowej. Systemy SAT2 i SAT3 wykorzystują 12-bitowe strumieniowe oscyloskopy USB (patrz tabela materiałów), które mają wygodę przenośności i dobrze zbudowane interfejsy użytkownika.
    9. Potwierdź prawidłowe dopasowanie impedancji w łańcuchu sygnałowym, aby uniknąć błędów wzmocnienia lub przepustowości. Urządzenia PCD zazwyczaj mają impedancje wyjściowe bliskie 50 omomów, więc odpowiednim procesem jest zastąpienie PCD znanym sygnałem z generatora przebiegów (o impedancji wyjściowej 50 omów) i potwierdzenie, że rozmiar sygnału pojawiający się na digitizerze jest zgodny z oczekiwaniami, skaluje się liniowo po zmianie wstrzykiwanego sygnału i nie obserwuje się przesterowania dla największego sygnału będącego przedmiotem zainteresowania.
  2. Przetwarzanie wstępne
    1. Skorygować surowe sygnały napięciowe dla wszystkich znanych wzmocnień i czułości na ścieżce sygnału, które odnoszą się do przetwarzania danych w interesującym nas zakresie częstotliwości.
    2. Jeśli dane zostały zarejestrowane ze sprzężeniem wejściowym DC lub w inny sposób wykazują przesunięcie DC, usuń to przesunięcie przez bezpośrednie odejmowanie lub za pomocą filtra górnoprzepustowego.
  3. Oblicz widmo mocy P każdego zarejestrowanego sygnału.
    1. Ustaw długość transformaty Fouriera Nft tak, aby podstawowa częstotliwość amerykańskiego źródła f0 była dużą całkowitą wielokrotnością szerokości przedziału transformacji: Nft = nfs/f0, gdzie n jest liczbą całkowitą, a fs jest częstotliwością próbkowania zdigitalizowanych danych. Ustaw n ≥ 50, aby wyraźnie uchwycić cechy spektralne. Dla przykładu podstawowego próbkowania 1 MHz z częstotliwością 50 MHz, Nft wynosi 2500, a szerokość przedziału wynosi 0,02 MHz.
    2. Ponieważ długość transformacji Nft jest zwykle mniejsza niż czas trwania zarejestrowanego sygnału, należy użyć estymatora gęstości widmowej mocy (PSD), takiego jak metoda Welcha73. Moc w paśmie częstotliwości od f 1 dof 2 wynosi figure-protocol-5, gdzie dF jest szerokością pojemnika transformacyjnego.
    3. Aby scharakteryzować aktywność pęcherzyków podczas każdej ekspozycji, oszacuj wkład w widmo mocy na podstawie całkowitych wielokrotności f0 (harmoniczne), nieparzystych wielokrotności całkowitych f0/2 (ultraharmoniczne) i szumu szerokopasmowego (kawitacja bezwładnościowa).
    4. Zawartość harmonicznych i ultraharmonicznych najprościej szacuje się, wybierając wartości widma mocy dla określonych częstotliwości. Jednak odpowiedzi tonalne o dużej amplitudzie mogą rozprzestrzeniać się na niewielką liczbę sąsiadujących ze sobą przedziałów częstotliwości (np. f0 ± 2-3), dlatego powinny one zostać uwzględnione w obliczeniach mocy w wąskim paśmie i wyłączone z obliczeń szerokopasmowych.
    5. Oszacuj moc kawitacji pasma szerokopasmowego przez odjęcie wkładów harmonicznych i ultraharmonicznych od całkowitego widma mocy. Alternatywnie, wkład ten można oszacować za pomocą bardziej zaawansowanego przetwarzania wstępnego74.
    6. Oszacuj skumulowaną energię sygnału kawitacji w czasie trwania ekspozycji, najlepiej zgodnie z cechą widma / typem aktywności pęcherzyków.
    7. Zakładając, że wszystkie rekordy danych miały równy czas trwania Tr, skumulowana energia w zarejestrowanych danych wynosi figure-protocol-6, gdzie M oznacza liczbę rekordów.
    8. Jeśli występują przerwy między nagraniami, co może się zdarzyć, gdy ekspozycja jest ciągła, a zapisane pliki przechwytują ułamek całkowitego czasu trwania ekspozycji Te, skumulowaną energię można oszacować jako figure-protocol-7
    9. Oszacuj SNR pomiaru przez porównanie poziomów widma z poziomami szumu tła zarejestrowanego przy braku US.

3. Protokół eksperymentalny

  1. Przygotowanie do SAT
    1. Zminimalizuj prawdopodobieństwo kawitacji na ścieżce propagacji, odgazowując ciecz wypełniającą (zwykle przefiltrowaną wodę) pod ciśnieniem -105 Pa przez co najmniej dwie godziny. Zaleca się potwierdzenie za pomocą sondy tlenu rozpuszczonego, że ciśnienie parcjalne tlenu jest poniżej 10 kPa.
    2. Napełniaj komorę testową powoli, aby zminimalizować ponowne wprowadzenie powietrza do odgazowanej cieczy. W razie potrzeby kontynuować odgazowywanie napełnionej komory.
    3. Usuń wszystkie pozostałości pęcherzyków z powierzchni przetwornika i pojemnika na pożywkę natychmiast po napełnieniu i ponownie tuż przed rozpoczęciem eksperymentów z ekspozycją.
    4. Upewnij się, że temperatura komory i jej zawartość ustabilizowały się przed rozpoczęciem eksperymentów z ekspozycją.
    5. Pozwól amerykańskiemu wzmacniaczowi mocy rozgrzać się (zgodnie z zaleceniem producenta), aby wzmocnienie i moc wyjściowa były stabilne w odniesieniu do czasu.
  2. Przygotowanie komory ekspozycyjnej
    1. Zawiesina środka kawitacyjnego
      1. Podczas rozcieńczania środka kawitacyjnego delikatnie i ciągle mieszać, aby uzyskać jednolitą zawiesinę bez uwięzienia makropęcherzyków lub zniszczenia środka (zwłaszcza jeśli są to pęcherzyki łuskane).
      2. Podczas pracy z MB należy powoli pobierać i dozować za pomocą największej dostępnej igły, aby zminimalizować zniszczenia podczas procesu ładowania75. igła do napełniania 18 G jest regularnie używana z systemami SAT.
  3. Przygotowanie do egzaminu SAT2
    1. Wysterylizuj pokrywę PDMS przed użyciem w eksperymentach z żywymi komórkami.
    2. Uformuj komorę ekspozycji komórek, wciskając pokrywę PDMS do naczynia hodowlanego.
    3. Przygotować strzykawkę z igłą o sile 18 g i napełnić ją około 10 ml płynu (np. zawiesiny MB lub kontroli wody).
    4. Włóż igłę przez jeden z otworów wypełniających PDMS i powoli napełnij komorę, przechylając tak, aby makropęcherzyki mogły wydostać się przez otwarty otwór do napełniania. Aby uzyskać najlepsze wyniki, przechyl komorę tak, aby otwarty otwór znajdował się nad otworem napełniającym.
    5. Po napełnieniu zamknij otwarty otwór, wkładając krótki (4-5 mm) pręt polimerowy. Ustaw zespół tak, aby oba otwory były poziome.
    6. Usunąć igłę do napełniania podczas wstrzykiwania dodatkowego płynu, aby powietrze nie zostało zassane. Zamknij otwór innym prętem polimerowym. Proces ten kończy uszczelnianie komory ekspozycji komórek.
    7. Sprawdzić wzrokowo komorę pod kątem śladów uwięzionych makropęcherzyków, a jeśli takie zostaną znalezione, powtórzyć czynności 3.3.3.-3.3.6.
    8. Dociśnij komorę ekspozycji ogniw w uchwycie komory. Zamontuj pokrywę komory na miejscu na górze komory. Opuszczenie pokrywy pod kątem do poziomu zniechęca makropęcherzyki do spoczywania na zanurzonych częściach (absorberze, uchwycie).
    9. Rozważ wyporność cząstek w zawiesinie przy podejmowaniu decyzji o orientacji komory ekspozycji komórek (np. unoszące się pęcherzyki lub tonące nanocząstki) i jak wpłynie to na ich kontakt z komórkami.
    10. We wszystkich operacjach używaj jak najmniejszej siły, aby zminimalizować zginanie powierzchni wzrostu komórek i odklejanie komórek.
  4. Przygotowanie do egzaminu SAT3
    1. Napełnij Transwell około 150 μl płynu (np. zawiesiny MB lub kontroli wody).
    2. Uformuj komorę ekspozycji komórek, ostrożnie uszczelniając transwell gumową zatyczką, usuwając nadmiar płynu czystym ręcznikiem papierowym lub chusteczką. Przed użyciem w eksperymentach z żywymi komórkami wysterylizuj gumową zatyczkę.
    3. Sprawdzić wzrokowo komorę pod kątem śladów uwięzionych makropęcherzyków, a jeśli takie zostaną znalezione, wyjąć korek, usunąć makropęcherzyki i powtórzyć czynności opisane w ppkt 4.4.2.
    4. Dociśnij komorę ekspozycji ogniw w uchwycie komory. Zamontuj pokrywę komory na miejscu na górze komory. Opuszczenie pokrywy pod kątem do poziomu zapobiega osadzaniu się makropęcherzyków na zanurzonych częściach (absorber, uchwyt).
      UWAGA: Jak wspomniano powyżej, makrobańki mogą powodować różne niepowtarzalne i potencjalnie szkodliwe skutki dla eksperymentów z ekspozycją w USA. Co najważniejsze, makropęcherzyki uwięzione w komorze ekspozycji komórkowej mogą powodować reakcje PCD i lokalne bioefekty komórkowe, które nie są reprezentatywne dla zamierzonego leczenia. Zawsze sprawdzaj wzrokowo wszystkie elementy systemu, aby znaleźć i usunąć makropęcherzyki przed rozpoczęciem eksperymentów w USA.

4. Gromadzenie danych

  1. Ustal poziomy odpowiedzi na PCD w tle, przeprowadzając wstępne eksperymenty z komorą ekspozycji na komórki wypełnioną cieczą kontrolną (np. odgazowaną wodą lub pożywką komórkową).
  2. Rejestruj dane PCD bez kierowania źródła amerykańskiego w celu ustalenia poziomów szumów elektronicznych tła.
  3. Rejestruj dane PCD podczas pracy ze źródłem w USA w pełnym zakresie planowanych poziomów napędu. Dane te wskażą, które części odpowiedzi akustycznej nie są związane ze środkami kawitacyjnymi, które mają być następnie badane.
    UWAGA: Zwykłe ciecze laboratoryjne (np. PBS lub pożywki komórkowe) będą wykazywać kawitację przy umiarkowanych ciśnieniach (np. 0.5 MPa przy 0.5 MHz), jeśli nie zostaną odgazowane.
  4. Przed przystąpieniem do pomiarów należy dać czas na wyrównanie termiczne zawiesiny z temperaturą komory. Do tego celu przydatna może być termopara z cienką igłą.
  5. Monitoruj eksperymenty w czasie rzeczywistym zarówno w dziedzinie czasu, jak i częstotliwości.
    1. Monitorowanie PCD w dziedzinie czasu ujawnia, czy sygnały są odpowiednio zwymiarowane do bieżących ustawień oprzyrządowania. W szczególności należy unikać przesterowania sygnału, ponieważ pojawi się ono w dziedzinie częstotliwości jako wielotonowa odpowiedź harmoniczna.
    2. Monitorowanie PCD w dziedzinie czasu pokazuje również, czy sygnały kawitacji są widziane wcześniej niż oczekiwano na podstawie czasu propagacji ze źródła w USA do przedziału ekspozycji na PCD. Jeśli takie sygnały są widoczne, może to wskazywać na wyciek środka kawitacyjnego do komory testowej.
    3. Monitorowanie PCD w dziedzinie częstotliwości wskazuje rodzaj zachowania pęcherzyków i może być wykorzystane do dostosowania poziomów napędu w razie potrzeby w celu uzyskania pożądanego bodźca komórkowego (np. niższe poziomy napędu dla wzbudzenia harmonicznego).
  6. Aby upewnić się, że pierwsze ekspozycje nie zostaną pominięte, rozpocznij proces zbierania danych przed włączeniem amerykańskiego sygnału źródłowego napędu.
  7. Monitoruj sygnał wyjściowy wzmacniacza, który napędza źródło amerykańskie (w przeciwieństwie do wyjścia generatora przebiegów) przez cały czas trwania eksperymentu, aby upewnić się, że ekspozycja przebiega zgodnie z oczekiwaniami. Do tego pomiaru należy użyć sondy wysokonapięciowej i upewnić się, że oscyloskop jest ustawiony tak, aby kompensować tłumienie sondy.
  8. Po naświetleniu próbki ostrożnie wyjmij ją z komory testowej.
    1. Zdejmij i wyczyść pokrywę PDMS (SAT2)/gumową zatyczkę (SAT3) w ramach przygotowań do kolejnego użycia.
    2. Przenieść szalkę hodowlaną (SAT2)/Transwell (SAT3) w razie potrzeby do późniejszej analizy (np. mikroskopii, obrazowania fluorescencyjnego).
    3. Po niewielkiej liczbie ekspozycji (np. 3-5) dobrą praktyką jest ponowne uzyskanie podstawowych sygnałów kawitacji (przy braku czynnika kawitacyjnego) i porównanie z oryginalnym zestawem danych, aby upewnić się, że media komory nie zostały zanieczyszczone.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 4 pokazuje przykłady reakcji PCD w dziedzinie czasu i częstotliwości, ilustrując trzy różne zachowania kawitacji. Wszystkie dane zebrano na SAT3 przy użyciu SonoVue MBs rozcieńczonych 5x w PBS, o końcowym stężeniu ~2*107 MBs/ml. Temperatura dla wszystkich przykładów w tej sekcji wynosiła 19 ± 1 °C. Źródło amerykańskie było napędzane impulsem 2,0 ms przy 0,5 MHz, aby osiągnąć szczytowe podciśnienie 0,20 (Rysunek 4A i 4B), 0,30 (Rysunek 4C i 4D) i 0,70 MPa (Rysunek 4E i 4F). Zapisy sygnału rozpoczęły się 1,4 ms przed rozpoczęciem impulsu amerykańskiego t = 0. Ścieżki wstawkowe pokazują sygnał jako zarejestrowany (czerwony) i z filtrem górnoprzepustowym 2 MHz (niebieski) dla okna czasowego wyśrodkowanego w momencie przelotu ze źródła do komory ekspozycji komórki na PCD. Odpowiedź niskiego poziomu przed tym czasem jest spowodowana bezpośrednio odbieranym promieniowaniem ze źródła, co jest powszechne w konfiguracjach, w których PCD znajduje się za źródłem amerykańskim.

Przy najniższym ciśnieniu padającym odpowiedź PCD składa się wyłącznie z całkowitych harmonicznych podstawowej częstotliwości US 0,5 MHz. Zwiększenie z 0,20 do 0,30 MPa powoduje wyraźne ultraharmoniczne w widmie, a także dalsze podwyższone harmoniczne całkowite. Przebiegi w dziedzinie czasu przy tych dwóch ciśnieniach wyglądają podobnie, chociaż wyniki 0,30 MPa wykazują większą zmienność w czasie trwania impulsu. Przy najwyższym ciśnieniu amplituda fali w dziedzinie czasu wzrosła nieliniowo w stosunku do niższych ciśnień w wyniku wyraźnie podwyższonego szumu szerokopasmowego widocznego w widmie. Szum ten jest powszechnie uważany za wynik kawitacji bezwładnościowej i w tym przykładzie odpowiada zniszczeniu MB.

Aby to lepiej zobaczyć, odpowiedzi PCD w funkcji czasu są pokazane w Rysunek 5. W lewym panelu (Rysunek 5A) pokazane są pełne widma w ciągu 50 sekund czasu naświetlania, podczas którego źródło emitujące impulsy 2,0 ms co 0,20 sekundy. Odpowiednie moce sumaryczne, harmoniczne i szerokopasmowe są pokazane w prawym panelu (Rysunek 5B). Stany Zjednoczone zostały włączone w t = 3,0 s, w którym to czasie zaobserwowano odpowiedzi szerokopasmowe o dużej amplitudzie. Uważa się, że początkowy skok odpowiada zniszczeniu największych pęcherzyków w zawiesinie (SonoVue jest polidyspersyjny) i jest powszechną obserwacją w eksperymentach kawitacyjnych z pęcherzykami skorupowymi, a nawet z mediami nieodgazowanymi (np. PBS).

Po kilku sekundach, odpowiedź szerokopasmowa gwałtownie się zmniejszyła, najwyraźniej z powodu zniszczenia bąbelków, a sygnał składa się głównie z harmonicznych. Sugeruje to, że uwolniony gaz i pozostałe MB wibrują stabilnie i nieinercyjnie. W t~50s komponent szerokopasmowy spadł do poziomu pierwotnego szumu tła. Testy ekspozycji, takie jak ten, są zatem ważne, gdy próbujesz zrozumieć skale czasowe, w których różne efekty pęcherzyków mogą działać na komórki w komorze.

Pęcherzyki mogą się przemieszczać w odpowiedzi na siły promieniowania generowane podczas ekspozycji na USA, a ruch MB do i z pola widzenia PCD może prowadzić do zwiększonej zmienności monitorowanego sygnału kawitacji, zwłaszcza gdy mamy do czynienia z rozcieńczonymi zawiesinami. Wrażliwy obszar PCD powinien zatem obejmować jak największą powierzchnię ekspozycji komórek. Porównanie skoncentrowanych i nieskoncentrowanych PCD odpowiedzi o identycznych częstotliwościach środkowych (patrz Rysunek 2) pokazano w Rysunek 6, przy użyciu rozcieńczenia 20:1 MB w normalnym PBS to SAT2. Uśrednione w czasie i dla próbki widma w panelu Rysunek 6A pokazuje, że nieskoncentrowany PCD zawiera silniejszą odpowiedź szerokopasmową, której towarzyszy zmniejszona zmienność między próbkami zarówno w zakresie mocy harmonicznych (Rysunek 6B), jak i ultraharmonicznych (Rysunek 6C).

Ważne jest, aby rozpoznać, że media używane do pracy z komórkami in vitro nie są odgazowywane i mogą wykazywać zwiększony poziom aktywności bąbelkowej tła. Rysunek 7 pokazuje reakcję w SAT2 PBS używanego w formie dostarczonej przez dostawcę i po dwóch godzinach odgazowywania w próżni, po czym nasycenie powietrza zostało zmniejszone z 92% do 46%, jak określono za pomocą czujnika optycznego (PreSens, Niemcy). Widma w klasie Rysunek 7A zostały uśrednione w czasie ekspozycji i powtórzeniach z pięcioma niezależnymi próbkami i wyraźnie pokazują wyraźnie podwyższone ultraharmoniczne w normalnym PBS. Potęgi zsumowane dla trzech harmonicznych ( Rysunek 7B) mieszczą się w granicach odchylenia standardowego każdego wyjścia eksperymentalnego. Dla porównania, sumy ultraharmoniczne w Rysunek 7C pokazują, że normalny PBS ma prawie o rząd wielkości wyższy poziom i znacznie większą zmienność między próbkami. Przykłady te wskazują, że powszechne podłoże kompatybilne z komórkami może wykazywać zachowania, które można (nieprawidłowo) przypisać obecności MB. Ponieważ odgazowanie pożywki hodowlanej jest zwykle niepraktyczne ze względu na negatywny wpływ na komórki i/lub stabilność czynnika kawitacyjnego, bardzo ważne jest przeprowadzenie odpowiednich kontroli w każdym badaniu związanym z kawitacją.

figure-results-1
Rysunek 1: Ilustracje dwóch amerykańskich projektów systemów ekspozycji obejmujących monitorowanie kawitacji: SAT3 (D-F). (A) Zespół z adnotacjami SAT2 z usuniętą ścianką boczną w celu zapewnienia przejrzystości. (B) SAT2 z nienaruszoną ścianą boczną. (C) Komora ekspozycji ogniw SAT2, zdemontowana. (D) Zespół z adnotacjami SAT3. (E) SAT3 w konfiguracji normalnej (po lewej) i soczewkowanej (po prawej) w celu dopasowania szerokości wiązki przy różnych częstotliwościach. (F) Komora ekspozycji ogniw SAT3, zdemontowana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Obliczenia konturów pola ciśnienia o połowie amplitudy dla przetworników nieogniskowanych (po lewej) i sferycznie skupionych (po prawej) o średnicy 12,7 mm. Częstotliwości 2, 4 i 8 MHz są pokazane odpowiednio jako kontury czerwone, niebieskie i zielone dla elementu PCD w początku współrzędnych (0,0). Najbardziej zewnętrzne kontury nieostrego urządzenia są stosunkowo niewrażliwe na częstotliwość, ale struktura wewnętrzna jest zależna od częstotliwości. Sferycznie skupione pole kurczy się wraz ze wzrostem częstotliwości, ale wewnątrz konturów pola zmieniają się płynnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Oprzyrządowanie do kondycjonowania i rejestrowania sygnału kawitacyjnego (niebieskie strzałki), wzbudzenia źródła amerykańskiego (czerwone linie) i wyzwalania akwizycji danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Odpowiedzi PCD w domenie czasu (po lewej) i częstotliwości (po prawej) zarejestrowane z MB rozcieńczonymi 5-krotnie w PBS. Padające szczytowe podciśnienia wynosiły (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, wszystkie przy 0,5 MHz. Zapisy sygnału rozpoczynają się 1,4 ms przed rozpoczęciem t=0 impulsu ultradźwiękowego o czasie trwania 2,0 ms. (A, C, E) Sygnały w dziedzinie czasu (czerwone) są wyświetlane na ustalonej skali pionowej, wskazującej, jak zmienia się poziom reakcji wraz z presją incydentu. Ścieżki wstawkowe pokazują sygnał jako zarejestrowany (czerwony) i z filtrem górnoprzepustowym 2 MHz (niebieski) dla okna czasowego wyśrodkowanego w momencie przelotu ze źródła do komory ekspozycji komórki na PCD. (B, D, F) Gęstości widmowe szumu i mocy sygnału są obliczane odpowiednio dla t<0 i t>0. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Historie widma w ciągu 50 sekund ekspozycji zawiesiny MB rozcieńczonej 5-krotnie w PBS. (A) pełne widma i (B) całkowite, harmoniczne i szerokopasmowe moce sygnału, wszystko w funkcji czasu. Warunki napędu to 0,5 MHz, szczytowe podciśnienie 0,7 MPa, czas trwania impulsu 2,0 ms, okres powtarzania impulsu 200 ms. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Wpływ geometrii ogniskowania PCD zarejestrowanej przy rozcieńczeniu mikropęcherzyków w proporcji 20:1 w normalnym PBS. Warunki napędu były następujące: 1,0 MHz, szczytowe podciśnienie 0,50 MPa, czas trwania impulsu 3,0 ms, okres powtarzania impulsu 10 ms. (A) Pełne widma uśrednione w czasie ekspozycji i trzy niezależne powtórzenia próbki. (B) moc w harmonicznych 3, 4 i 5 MHz, oraz (C) moc w ultraharmonicznych 2,5, 3,5 i 4,5 MHz. Grube linie to średnie próbki, zacienione obszary wskazują +/- 1 odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Wpływ odgazowanych mediów zarejestrowanych za pomocą PBS. (A) Pełne widma uśrednione w czasie ekspozycji i pięciu niezależnych powtórzeniach próbki. (B) moc w harmonicznych 3, 4 i 5 MHz, oraz (C) moc w ultraharmonicznych 2,5, 3,5 i 4,5 MHz. Grube linie to średnie próbki, zacienione obszary wskazują +/- 1 odchylenie standardowe. Warunki napędu to 1,0 MHz, szczytowe podciśnienie 0,50 MPa, czas trwania impulsu 1,0 ms, okres powtarzania impulsu 200 ms. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. szt.
parametrjednostkaminimummaksimum
częstotliwośćMhz0,0215
ciśnienie (szczyt ujemny)Mpa0,120
Długość impulsuCykli1Cw
Cykl%1Cw
czas naświetlanias101000

Tabela 1: Podsumowanie zakresu zgłaszanych parametrów ułatwiających sonoporację in vitro.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe etapy każdego pomiaru akustycznego zostały ujęte przez Apfela w 1981 roku76 jako "poznaj swoją ciecz, poznaj swoje pole dźwiękowe, dowiedz się, kiedy coś się dzieje". W kontekście tego protokołu obejmują one kalibrację i wyrównanie przetwornika oraz etapy przygotowania wody i obchodzenia się z pęcherzykami. Po pierwsze, ważne jest, aby hydrofon używany do kalibracji przetwornika sterującego i/lub PCD był sam w sobie dokładnie skalibrowany poprzez regularne serwisowanie zewnętrzne lub wewnętrzne porównanie z wzorcem odniesienia. Podobnie, odpowiedź zarówno przetwornika sterującego, jak i PCD musi być regularnie charakteryzowana w celu sprawdzenia jakichkolwiek zmian w mocy wyjściowej i/lub utraty czułości. Jeżeli warunki jazdy i czułość odbioru systemu nie są znane, niemożliwe będzie wywnioskowanie jakiegokolwiek znaczącego związku między warunkami narażenia, skutkami biologicznymi i emisjami akustycznymi. Bezpośrednio związane z tym należy dokładnie sprawdzić ustawienie przetworników względem siebie i komory próbki, aby upewnić się, że warunki ekspozycji w komorze są zgodne z oczekiwaniami, a objętość próbki dla PCD odpowiada obszarowi zainteresowania. Jak wskazano, temperatura i zawartość gazu w podwieszanym medium mogą mieć znaczący wpływ na końcowe wyniki, a konsystencja jest w tym względzie niezwykle ważna77,78. Podobnie, przygotowanie, charakterystyka i obchodzenie się z zawiesiną środka kawitacyjnego wymagają bardzo szczególnej uwagi, aby upewnić się, że oczekiwany rozkład wielkości i stężenie cząstek są obecne w próbce. Na przykład, jeśli stężenie pęcherzyków jest zbyt wysokie, nastąpi skuteczne ekranowanie objętości próbki przed incydentem w polu amerykańskim. Środki MB są szczególnie podatne na niszczenie i koalescencję, a dalsze wskazówki dotyczące obchodzenia się z nimi można znaleźć w Mulvana et. al. (2012)79.

Bardzo częstym problemem z detekcją sygnałów kawitacyjnych jest uzyskanie odpowiedniego SNR. Wynika to częściowo z opisanej natury samego sygnału, ale może to być również spowodowane źródłami szumu elektrycznego w układzie doświadczalnym. Sprawdzenie połączeń między elementami systemu, w szczególności tych, które obejmują kable koncentryczne, może pomóc w wyeliminowaniu niektórych z nich. Może być konieczna wymiana lub naprawa kabli koncentrycznych. Pomocne może być również identyfikowanie i usuwanie lub dezaktywowanie innego sprzętu w laboratorium, takiego jak pompy, które mogą powodować zakłócenia elektryczne. Słabe dopasowanie impedancji elektrycznej między elementami systemu może być kolejną przyczyną słabego stosunku sygnału do szumu, a także potencjalnego uszkodzenia sprzętu i powinno być dokładnie sprawdzone. Ustawienia wyzwalania w generatorze sygnału i oscyloskopie powinny być podobnie sprawdzone, aby potwierdzić, że są one odpowiednio skonfigurowane dla eksperymentu i nie powróciły do domyślnych ustawień producenta. W przypadku znacznego zniszczenia pęcherzyków podczas obsługi, w przypadku SAT2, pomocne może być podłączenie drugiej strzykawki do portu wylotowego i użycie jej do delikatnego wydobycia płynu z komory, wciągając w ten sposób zawiesinę. Może to również pomóc w wyeliminowaniu makropęcherzyków lub umożliwieniu przepływu podczas ekspozycji na USA, jeśli jest to pożądane.

Nie jest możliwe całkowite wyeliminowanie odbić akustycznych w komorze próbki, a zatem pole padające nie będzie całkowicie jednorodne w całej objętości próbki. Jak wspomniano w krokach 1.3.2 i 1.3.3, przepuszczalność okien akustycznych będzie zależna od częstotliwości, a zatem należy dokładnie rozważyć pożądaną szerokość pasma do pomiarów emisji akustycznej. W szczególności mogą wystąpić znaczne odbicia wielokrotne składowych o wyższej częstotliwości. Jest to kolejny powód, dla którego kalibracja pola w całkowicie zmontowanym systemie jest tak ważna dla zminimalizowania niepewności ciśnienia zdarzenia. Należy również wziąć pod uwagę odpowiednie bramkowanie rejestrowanych sygnałów, aby zminimalizować skutki wielokrotnych odbić. Korzystanie z komercyjnych urządzeń dla wygody i potrzeba przejrzystości akustycznej oznacza, że należy poświęcić pewną przezroczystość optyczną. Może to mieć wpływ na jakość kolejnych badań obrazowych, np. w celu oceny żywotności komórek lub wchłaniania leków. Niektóre membrany stosowane w urządzeniach komercyjnych są również porowate, a zatem dochodzi do niedoskonałej izolacji między komorą próbki a otaczającą ją łaźnią wodną. Jak wyżej, związane z tym ryzyko zanieczyszczenia można ograniczyć poprzez zastosowanie mniejszej podkomory, której zawartość można regularnie wymieniać. Urządzenia do hodowli komórkowych wskazane w tabeli materiałów są odpowiednie przede wszystkim dla monowarstw komórkowych, które mogą nie być reprezentatywne dla tkanek pod względem wszystkich efektów biologicznych za pośrednictwem US/kawitacji. Bliskość komórek do stałej powierzchni będzie również wpływać na dynamikę MB w sposób, który może nie odzwierciedlać warunków in vivo, np. promując mikrostrumieniowanie i mikroodrzuty, jak opisano we wprowadzeniu. Ograniczeniom tym można jednak zaradzić poprzez proste zastąpienie ich alternatywnymi modelami tkankowymi.

Celem zaproponowania SAT jest zapewnienie środków do poprawy odtwarzalności warunków ekspozycji akustycznej i emisji akustycznych między badaniami skutków biologicznych, w których pośredniczą Stany Zjednoczone, co miejmy nadzieję ułatwi lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw leczenia i rozwój technik monitorowania leczenia w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności. Systemy zostały zaprojektowane tak, aby były kompatybilne z dostępnymi na rynku urządzeniami do hodowli komórkowych, umożliwiając wykonywanie szerokiego zakresu testów biologicznych w zależności od interesującego zastosowania i umożliwiając przeprowadzanie eksperymentów o wysokiej przepustowości, eliminując potrzebę czasochłonnych procedur dopasowywania między seriami. Miejmy nadzieję, że dzięki standaryzacji protokołów charakterystyki warunków ekspozycji i wychwytywania emisji akustycznych, zmienność zależna od systemu może zostać zmniejszona. Zakres parametrów, które należy zbadać w danym eksperymencie, będzie zależał od zastosowania (pożądany efekt biologiczny, typ komórki, głębokość tkanki docelowej w przypadku in vivo itp.) oraz charakteru stosowanego środka kawitacyjnego. Biorąc pod uwagę dużą liczbę zmiennych (częstotliwość amerykańska, amplituda ciśnienia, długość impulsu, częstotliwość powtarzania impulsów itp.), pełne zbadanie całej przestrzeni parametrów jest mało prawdopodobne. Zaletą proponowanego protokołu jest to, że umożliwia on szybkie ustalenie pewnych granic w tej przestrzeni parametrów. Na przykład umożliwia określenie minimalnego ciśnienia, przy którym generowany jest sygnał kawitacyjny, maksymalnego ciśnienia lub długości impulsu, które można zastosować, zanim nastąpi odłączenie/śmierć komórki, oraz ciśnienia, przy którym wytwarzane są harmoniczne ułamkowe lub szum szerokopasmowy. Zaleca się, aby taki zestaw pomiarów zakresu został przeprowadzony jako pierwszy krok w każdym badaniu.

Jak przedstawiono, SAT są przeznaczone do monitorowania emisji akustycznych w czasie rzeczywistym, przy czym testy biologiczne są wykonywane poza eksperymentem. Stosunkowo łatwo byłoby jednak zmodyfikować SAT tak, aby umożliwić bezpośrednią obserwację optyczną komory próbki za pomocą obiektywu mikroskopowego. To z kolei można połączyć z systemem fluorescencji i/lub mikroskopii o dużej szybkości, aby umożliwić na przykład obserwację wychwytu leku i dynamiki pęcherzyków. Wyjście PCD przedstawione obecnie pod względem napięcia wskazuje: i) rodzaje zachowania kawitacji i ich względne proporcje; ii) jak długo utrzymują się te zachowania kawitacyjne; (iii) czy obserwowane skumulowane w czasie charakterystyki narażenia są skorelowane z konkretnym efektem biologicznym; oraz iv) czy względne poziomy i zachowania zależne od czasu są zgodne z poprzednimi eksperymentami w systemie ekspozycji. Podczas gdy czułość odbioru PCD można określić ilościowo, w celu wiarygodnego scharakteryzowania emisji akustycznych pod względem energii bezwzględnej potrzebne są dodatkowe informacje przestrzenne. Można to osiągnąć poprzez zastąpienie PCD sondą matrycową w celu realizacji pasywnego mapowania akustycznego (PAM)80. Zwiększyłoby to jednak złożoność przetwarzania sygnałów oraz wymagany czas i moc obliczeniową.

Można również zastosować inne oprzyrządowanie do pomiaru oporu elektrycznego membrany lub zastosowania fizycznych metod celowania, na przykład pól magnetycznych. Możliwe byłoby również wykorzystanie trójwymiarowych struktur tkankowych, takich jak sferoidy guza, organoidy, a nawet próbki tkanek ex vivo na akustycznie "miękkich" podłożach żelowych zamiast monowarstw komórkowych do badania efektów amerykańskich i kawitacji w bardziej realistycznych środowiskach tkankowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Radzie Badań Nauk Inżynieryjnych i Fizycznych za wsparcie tej pracy poprzez grant EP/L024012/1. VB jest również wspierany przez Radę ds. Badań Inżynieryjnych i Fizycznych (EPSRC) oraz Radę ds. Badań Medycznych (MRC) (grant EP/L016052/1). VB i AV dziękują Fundacji Clarendon za stypendia podyplomowe. AV dziękuje również Exeter College za stypendium Santander. Autorzy są wdzięczni Jamesowi Fiskowi i Davidowi Salisbury'emu za ich nieocenioną pomoc w produkcji aparatury. Wyrażają również wdzięczność za wkład dr Dario Carugo i Joshuy Owena w rozwój wcześniejszych prototypów SAT.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AbsorberPrecision AcousticsAPTFlex F28 panelo standardowej grubości 1,0 cm
Wzmacniacz (moc)E& I Sp. z o.o.Wzmacniacz mocy 1040L400W do napędzania źródła ultradźwięków
Wzmacniacz (pre)Stanford Research SystemsSR445AWielostopniowy przedwzmacniacz o stałym wzmocnieniu dla sygnałów PCD
Grzałka akwariowaAquaelUltra 50WRóżne modele dla różnych rozmiarów zbiorników.
DigitizerTiePie EngineeringHS5-110-XMOpcja rozszerzonej pamięci: 32 mln punktów na kanał
HydrofonPrecyzyjna akustykaFOHWrażliwy obszar o średnicy 0,01 mm minimalizuje efekty kierunkowości
MikropęcherzykiBraccoSonoVueZatwierdzone przez FDA mikropęcherzyki
Lustro PCD (SAT3)Olympus NDTF-102Odbicie
wiązki 90 stopniPrzetwornik PCDOlympus NDTV320-SUPrzetwornik zanurzeniowy, wodoodporny PCD 7,5 MHz
Olympus NDTBCU-58-1 W
PDMS (pokrywa komory SAT2)CorningSylgard 184Zobacz Carugo i in. (2015), aby uzyskać wskazówki dotyczące przygotowania
Pręt polimerowy (uszczelka SAT2)ZeusMonofilament
Zatyczka gumowa (pokrywa/uszczelka SAT3)VWR391-2101Średnica dolna 6 mm, średnica górna 8 mm, czerwona
Generator sygnałuAgilent33250Generator przebiegów do źródła ultradźwięków
Podłoże do komory ekspozycji komórek, SAT2Ibidiµ-Dish 35mm
Podłoże do komory ekspozycji komórek, SAT3CorningTranswell 6,5 mm
(SAT3)Sonic ConceptsH107 z otwór centralnyZastosowanie źródła obsługującego HIFU umożliwia generowanie ciśnienia >1 MPa zarówno w ognisku, jak i przed ogniskiem, co zapewnia rozszerzony zasięg przestrzenny
PTFE Źródło ultradźwięków

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maier, A., Steidl, S., Christlein, V., Hornegger, J. Medical Imaging Systems - An Introductory Guide. Lecture Notes in Computer Science. , Springer. (2018).
  2. Tachibana, K., Tachibana, S. Albumin microbubble echo-contrast material as an enhancer for ultrasound accelerated thrombolysis. Circulation. 92, 1148-1150 (1995).
  3. Bao, S., Thrall, B. D., Miller, D. L. Transfection of a reporter plasmid into cultured cells by sonoporation in vitro. Ultrasound in Medicine and Biology. 23 (6), 953-959 (1997).
  4. Price, R. J., Skyba, D. M., Kaul, S., Skalak, T. C. Delivery of colloidal particles and red blood cells to tissue through microvessel ruptures created by targeted microbubble destruction with ultrasound. Circulation. 98 (13), 1264-1267 (1998).
  5. Theek, B., et al. Sonoporation enhances liposome accumulation and penetration in tumors with low EPR. Journal of Controlled Release. 231, 77-85 (2016).
  6. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. Journal of Controlled Release. 243, 172-181 (2016).
  7. Snipstad, S., et al. Ultrasound Improves the Delivery and Therapeutic Effect of Nanoparticle-Stabilized Microbubbles in Breast Cancer Xenografts. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2651-2669 (2017).
  8. Unga, J., Hashida, M. Ultrasound induced cancer immunotherapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 144-153 (2014).
  9. Yang, C., Du, M., Yan, F., Chen, Z. Focused ultrasound improves NK-92MI cells infiltration into tumors. Frontiers in Pharmacology. 10, 326(2019).
  10. McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
  11. O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Ultrasound and microbubble-mediated blood-brain barrier disruption for targeted delivery of therapeutics to the brain. Methods in Molecular Biology. 1831, 111-119 (2018).
  12. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9, 321(2019).
  13. Ebben, H. P., Nederhoed, J. H., Lely, R. J., Wisselink, W., Yeung, K. Microbubbles and UltraSound-accelerated Thrombolysis (MUST) for peripheral arterial occlusions: Protocol for a phase II single-arm trial. BMJ Open. 7, 014365(2017).
  14. de Saint Victor, M., Barnsley, L. C., Carugo, D., Owen, J., Coussios, C. C., Stride, E. Sonothrombolysis with Magnetically Targeted Microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1151-1163 (2019).
  15. Dixon, A. J., Li, J., Rickel, J. M. R., Klibanov, A. L., Zuo, Z., Hossack, J. A. Efficacy of Sonothrombolysis Using Microbubbles Produced by a Catheter-Based Microfluidic Device in a Rat Model of Ischemic Stroke. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  16. Horsley, H., et al. Ultrasound-activated microbubbles as a novel intracellular drug delivery system for urinary tract infection. Journal of Controlled Release. 301, 166-175 (2019).
  17. Lattwein, K. R., et al. Sonobactericide: An Emerging Treatment Strategy for Bacterial Infections. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (2), 193-215 (2020).
  18. Crum, L. A., Fowlkes, J. B. Acoustic cavitation generated by microsecond pulses of ultrasound. Nature. 319, 52-54 (1986).
  19. Holland, C. K., Apfel, R. E. Thresholds for transient cavitation produced by pulsed ultrasound in a controlled nuclei environment. Journal of the Acoustical Society of America. 88, 2059-2069 (1990).
  20. Rifai, B., Arvanitis, C. D., Bazan-Peregrino, M., Coussios, C. C. Cavitation-enhanced delivery of macromolecules into an obstructed vessel. The Journal of the Acoustical Society of America. 128, (2010).
  21. Wu, J., Ross, J. P., Chiu, J. F. Reparable sonoporation generated by microstreaming. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (3), 1460-1464 (2002).
  22. Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
  23. De Cock, I., et al. Ultrasound and microbubble mediated drug delivery: acoustic pressure as determinant for uptake via membrane pores or endocytosis. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 197, 20-28 (2015).
  24. Pereno, V., Lei, J., Carugo, D., Stride, E. Microstreaming inside Model Cells Induced by Ultrasound and Microbubbles. Langmuir. 36, 6388-6398 (2020).
  25. Chen, H., Brayman, A. A., Kreider, W., Bailey, M. R., Matula, T. J. Observations of translation and jetting of ultrasound-activated microbubbles in mesenteric microvessels. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (12), 2139-2148 (2011).
  26. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5, 2161-2170 (2009).
  27. Song, J. H., Moldovan, A., Prentice, P. Non-linear Acoustic Emissions from Therapeutically Driven Contrast Agent Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 45 (8), 2188-2204 (2019).
  28. Ohl, C., Arora, M., Ikink, R., De Jong, N., Versluis, M., Delius, M. Sonoporation from Jetting Cavitation Bubbles. Biophysical Journal. 91 (11), 4285-4295 (2006).
  29. Li, Z. G., Liu, aQ., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
  30. Wang, Q. X., Manmi, K. Three dimensional microbubble dynamics near a wall subject to high intensity ultrasound. Physics of Fluids. 26, 032104(2014).
  31. Suslick, K. S. Ultrasound: Its Chemical, Physical, and Biological Effects. Radiology. , VHC Publishers. New York. (1988).
  32. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nature reviews. Drug discovery. 4 (3), 255-260 (2005).
  33. Mitragotri, S. Sonophoresis: Ultrasound-mediated transdermal drug delivery. Percutaneous Penetration Enhancers Physical Methods in Penetration Enhancement. , 3-14 (2017).
  34. Park, J., Lee,, et al. Enhanced Transdermal Drug Delivery by Sonophoresis and Simultaneous Application of Sonophoresis and Iontophoresis. AAPS PharmSciTech. 20 (3), 96(2019).
  35. Lentacker, I., De Cock, I., Deckers, R., De Smedt, S. C., Moonen, C. T. W. Understanding ultrasound induced sonoporation: Definitions and underlying mechanisms. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 49-64 (2014).
  36. Wawryka, P., Kiełbik, A., Iwanek, G. Microbubble based sonoporation - the basics into clinical implications. Medical Research Journal. 4 (3), 178-183 (2019).
  37. Hilgenfeldt, S., Lohse, D., Zomack, M. Sound scattering and localized heat deposition of pulse-driven microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 107 (6), 3530-3539 (2000).
  38. Holt, R. G., Roy, R. A. Measurements of bubble-enhanced heating from focused, MHz-frequency ultrasound in a tissue-mimicking material. Ultrasound Medical Biology. 27 (10), 1399-1412 (2001).
  39. Tan, J., Li, P., Xue, H., Li, Q. Cyanidin-3-glucoside prevents hydrogen peroxide (H 2 O 2 )-induced oxidative damage in HepG2 cells. Biotechnology Letters. 42 (11), 2453-2466 (2020).
  40. Costley, D., et al. Treating cancer with sonodynamic therapy: A review. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 107-117 (2015).
  41. You, D. G., et al. ROS-generating TiO2 nanoparticles for non-invasive sonodynamic therapy of cancer. Scientific Reports. 6, 23200(2016).
  42. Canavese, G., et al. Nanoparticle-assisted ultrasound: A special focus on sonodynamic therapy against cancer. Chemical Engineering Journal. 340, 155-172 (2018).
  43. Beguin, E., et al. Direct Evidence of Multibubble Sonoluminescence Using Therapeutic Ultrasound and Microbubbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (22), 19913-19919 (2019).
  44. Stride, E., et al. Microbubble Agents: New Directions. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  45. Rapoport, N., Gao, Z., Kennedy, A. Multifunctional nanoparticles for combining ultrasonic tumor imaging and targeted chemotherapy. Journal of the National Cancer Institute. 99 (14), 1095-1106 (2007).
  46. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  47. Zhang, L., et al. Mitochondria-Targeted and Ultrasound-Activated Nanodroplets for Enhanced Deep-Penetration Sonodynamic Cancer Therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (9), 9355-9366 (2019).
  48. Delogu, L. G., et al. Functionalized multiwalled carbon nanotubes as ultrasound contrast agents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16612-16617 (2012).
  49. Paris, J. L., et al. Ultrasound-mediated cavitation-enhanced extravasation of mesoporous silica nanoparticles for controlled-release drug delivery. Chemical Engineering Journal. 340, 2-8 (2018).
  50. Mannaris, C., et al. Gas-Stabilizing Gold Nanocones for Acoustically Mediated Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1800184(2018).
  51. Kwan, J. J., et al. Ultrasound-induced inertial cavitation from gas-stabilizing nanoparticles. Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 92 (2), (2015).
  52. Kwan, J. J., et al. Ultrasound-Propelled Nanocups for Drug Delivery. Small. 11 (39), 5305-5314 (2015).
  53. Mannaris, C., et al. Microbubbles, Nanodroplets and Gas-Stabilizing Solid Particles for Ultrasound-Mediated Extravasation of Unencapsulated Drugs: An Exposure Parameter Optimization Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 45, 954-967 (2019).
  54. Roovers, S., et al. The Role of Ultrasound-Driven Microbubble Dynamics in Drug Delivery: From Microbubble Fundamentals to Clinical Translation. Langmuir. 35, 10173-10191 (2019).
  55. Lentacker, I., Geers, B., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Design and Evaluation of Doxorubicin-containing Microbubbles for Ultrasound-triggered Doxorubicin Delivery: Cytotoxicity and Mechanisms Involved. Molecular Therapy. 18 (1), 101-108 (2010).
  56. De Cock, I., Lajoinie, G., Versluis, M., De Smedt, S. C., Lentacker, I. Sonoprinting and the importance of microbubble loading for the ultrasound mediated cellular delivery of nanoparticles. Biomaterials. 83, 294-307 (2016).
  57. Roovers, S., et al. Sonoprinting of nanoparticle-loaded microbubbles: Unraveling the multi-timescale mechanism. Biomaterials. 217, 119250(2019).
  58. Carugo, D., et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. 113, 105-117 (2017).
  59. Stride, E. P., Coussios, C. C. Cavitation and contrast: The use of bubbles in ultrasound imaging and therapy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 224 (2), 171-191 (2010).
  60. Stride, E., Coussios, C. Nucleation, mapping and control of cavitation for drug delivery. Nature Reviews Physics. 1, 495-509 (2019).
  61. Dong, Y., et al. Antibiofilm effect of ultrasound combined with microbubbles against Staphylococcus epidermidis biofilm. International Journal of Medical Microbiology. 307 (6), 321-328 (2017).
  62. Van Rooij, T., et al. Vibrational Responses of Bound and Nonbound Targeted Lipid-Coated Single Microbubbles. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (5), 785-797 (2017).
  63. Duan, X., Yu, A. C. H., Wan, J. M. F. Cellular Bioeffect Investigations on Low-Intensity Pulsed Ultrasound and Sonoporation: Platform Design and Flow Cytometry Protocol. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (9), 1422-1434 (2019).
  64. Hu, Y., Wan, J. M. F., Yu, A. C. H. Membrane Perforation and Recovery Dynamics in Microbubble-Mediated Sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  65. Carugo, D., Owen, J., Crake, C., Lee, J. Y., Stride, E. Biologicallyand acoustically compatible chamber for studying ultrasound-mediated delivery of therapeutic compounds. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (7), 1927-1937 (2015).
  66. Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterisation of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12 (3), 034109(2018).
  67. Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16486-16491 (2012).
  68. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2016).
  69. Helfield, B. L., Chen, X., Qin, B., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Mechanistic Insight into Sonoporation with Ultrasound-Stimulated Polymer Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2678-2689 (2017).
  70. Aron, M., Vince, O., Gray, M., Mannaris, C., Stride, E. Investigating the Role of Lipid Transfer in Microbubble-Mediated Drug Delivery. Langmuir. 35 (40), 13205-13215 (2019).
  71. Kinsler, L. E., Frey, A. R., Coppens, A. B., Sanders, J. V. Fundamentals of Acoustics, 4th Edition. , Wiley. ISBN: 0-471-84789-5 (2000).
  72. Wear, K. A. Considerations for Choosing Sensitive Element Size for Needle and Fiber-Optic Hydrophones-Part I: Spatiotemporal Transfer Function and Graphical Guide. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (2), 318-339 (2019).
  73. Stoica, P., Moses, R. Spectral Analysis of Signals. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2005).
  74. Lyka, E., Coviello, C., Kozick, R., Coussios, C. C. Sum-of-harmonics method for improved narrowband and broadband signal quantification during passive monitoring of ultrasound therapies. Journal of the Acoustical Society of America. 140 (1), 741-754 (2016).
  75. Barrack, T., Stride, E. Microbubble Destruction During Intravenous Administration: A Preliminary Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (3), 515-522 (2009).
  76. Apfel, R. E. Acoustic cavitation. Methods in Experimental Physics. 19, 355-411 (1981).
  77. Mulvana, H., Stride, E., Tang, M. X., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. The Influence of Gas Saturation on Microbubble Stability. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (6), 1097-1100 (2012).
  78. Mulvana, H., Stride, E., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. Temperature dependent behavior of ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 36 (6), 925-934 (2010).
  79. Mulvana, H., Eckersley, R. J., Tang, M. X., Pankhurst, Q., Stride, E. Theoretical and Experimental Characterisation of Magnetic Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (5), 864-875 (2012).
  80. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Terapia ultrad wi kamipasywna detekcja kawitacjimonitorowanie akustycznemanipulacja mikrop cherzykamiuk ad ekspozycji kom rekcytometria przep ywowamikroskopia fluorescencyjnadostarczanie lek wsonoporacja

Powiązane artykuły