Artykuł metodologiczny

Studiowanie terapii wzmocnionej kawitacją

6.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61989

⸱

9 kwietnia 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Oxford

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany protokół eksperymentalny może być wykorzystany do wykonywania pomiarów aktywności kawitacyjnej w czasie rzeczywistym w urządzeniu do hodowli komórkowej w celu umożliwienia zbadania warunków wymaganych do skutecznego dostarczania leku i/lub innych efektów biologicznych.

Streszczenie

Zainteresowanie terapeutycznymi zastosowaniami ultradźwięków jest znaczące i rośnie, z potencjalnymi celami klinicznymi od raka do choroby Alzheimera. Kawitacja - tworzenie i późniejszy ruch pęcherzyków w polu ultradźwiękowym - stanowi kluczowe zjawisko leżące u podstaw wielu z tych zabiegów. Pozostaje jednak znaczna niepewność co do szczegółowych mechanizmów działania, za pomocą których kawitacja sprzyja efektom terapeutycznym, i istnieje potrzeba opracowania wiarygodnych technik monitorowania, które można wdrożyć klinicznie. W szczególności istnieją znaczne różnice między badaniami w zakresie parametrów narażenia, o których stwierdzono, że skutecznie przynoszą efekty terapeutyczne, a odpowiadającymi im emisjami akustycznymi. Celem niniejszego artykułu jest przedstawienie wytycznych projektowych i protokołu eksperymentalnego wykorzystującego powszechnie dostępne komponenty do przeprowadzania badań efektów biodynamicznych za pośrednictwem kawitacji, a także monitorowanie akustyczne w czasie rzeczywistym. Oczekuje się, że protokół umożliwi szersze włączenie monitorowania akustycznego do terapeutycznych eksperymentów ultrasonograficznych i ułatwi porównywanie warunków ekspozycji i ich korelacji z istotnymi skutkami biologicznymi w badaniach nad warunkami ekspozycji.

Wprowadzenie

Ultrasonografia (US) jest szeroko stosowana jako technika obrazowania diagnostycznego ze względu na jej bezpieczny i nieinwazyjny charakter, łatwość wdrożenia przy łóżku pacjenta oraz opłacalność1. Oprócz możliwości diagnostycznych i monitorujących, US ma znaczny potencjał w zakresie zastosowań terapeutycznych. Wczesne prace dotyczyły jego zastosowania w trombolizie, transfekcji DNA i dostarczaniu leków2,3,4 i terapeutyczne US stanowi obecnie bardzo aktywny obszar badań, z zastosowaniami obejmującymi leczenie nowotworów5,6,7, immunotherapy8,9, zakłócenie bariery krew-mózg (BBB)10,11,12, tromboliza13,14,15, oraz leczenie infekcji bakteryjnych16,17. Kluczowym zjawiskiem leżącym u podstaw tych zastosowań jest kawitacja: zarodkowanie, wzrost i oscylacja wnęk gazowych spowodowane zmianami ciśnienia płynu18,19.

Istnieje szereg mechanizmów, dzięki którym kawitacja wywołuje efekty biologiczne. Na przykład, wysoce nieliniowy charakter oscylacji pęcherzyków pod wpływem zastosowanego pola US może generować mikrostrumienie w otaczającej cieczy, które mogą zarówno zwiększyć konwekcję leku20, jak i wywierać naprężenia ścinające na tkankę w pobliżu pęcherzyków. Jest to szczególnie powszechne, gdy pęcherzyki znajdują się w pobliżu granicy, powodując niesferyczne oscylacje pęcherzyków i mogą potencjalnie sprzyjać wchłanianiu leku poprzez przenikanie wywołane ścinaniem21,22,23,24. Przy wyższych ciśnieniach obserwuje się oscylacje o większej amplitudzie i szybkie zapadanie się pęcherzyków, co powoduje bezpośrednie naprężenia mechaniczne25 i często generuje fale uderzeniowe, a w konsekwencji duże gradienty ciśnienia, które mogą zakłócać i przenikać tkanki26,27. Zapadanie się pęcherzyków w pobliżu powierzchni może również powodować powstawanie mikrodżetów cieczy o dużej prędkości28,29,30. Te mikrodżety mogą przenikać do tkanki, potencjalnie tworząc pory lub wywołując wtórne fale stresu31,32. Przenikanie błon biologicznych zarówno na poziomie tkankowym, jak i komórkowym jest różnie określane jako sonoforeza, stosowana głównie w kontekście wywołanego przez USA zwiększenia przepuszczalności skóry 33,34, oraz sonoporację, używaną głównie do opisania odwracalnej przepuszczalności błony komórkowej w wyniku tworzenia się porów błony35,36.

Absorpcja lepkości w cieczy bezpośrednio otaczającej oscylującą bańkę może wywołać znaczny efekt grzewczy37. Co więcej, wysoce nieliniowe oscylacje wytwarzają promieniowanie akustyczne o częstotliwościach wyższych niż napędzające pole amerykańskie. Prowadzi to do zwiększonej absorpcji w otaczającej tkance i dalszego podgrzewania38. Zapadaniu się pęcherzyków mogą również towarzyszyć efekty chemiczne spowodowane przejściowymi wysokimi temperaturami i ciśnieniami w rdzeniu pęcherzyka, takie jak wytwarzanie wysoce reaktywnych form i promieniowanie elektromagnetyczne, znane jako sonoluminescencja32. Efekty te zostały zbadane w celu oceny potencjalnych uszkodzeń i/lub aktywacji odpowiednich szlaków komórkowych do dostarczania39 i wykorzystane w lokalnej aktywacji leków wrażliwych na światło w podejściu znanym jako terapia sonodynamiczna40,41,42,43.

Wiele efektów biologicznych, w których pośredniczy USA, może być inicjowanych wyłącznie poprzez kontrolę parametrów pola amerykańskiego (amplituda ciśnienia, częstotliwość, długość impulsu i częstotliwość powtarzania oraz czas trwania ekspozycji), ale niezawodne generowanie kawitacji w tkance biologicznej często wymaga wysokich energii wejściowych, a zatem niesie ze sobą podwyższone ryzyko uszkodzenia. Wprowadzenie egzogennych lub sztucznych jąder kawitacji może znacznie zmniejszyć energię wejściową wymaganą do wytworzenia szerokiego zakresu efektów omówionych powyżej, a ponadto wprowadzić dodatkowe efekty, które mogą nie być możliwe w przypadku samych US. Jądra kawitacji obejmują pęcherzyki gazu26,44, kropelki cieczy45,46,47 i cząstki stałe48,49,50, przy czym jądra kawitacji w nanoskali są nowym obszarem badań pod kątem ich korzyści pod względem wydłużonego czasu krążenia, Poprawa wynaczynienia i przedłużona aktywność kawitacyjna49,51,52,53.

Najczęściej używanymi jądrami są mikropęcherzyki gazu (MBs), pierwotnie używane jako środki kontrastowe w diagnostyce obrazowej. Mają one zwykle średnicę 1-2 mikrometrów i zawierają rdzeń gazu o dużej masie cząsteczkowej o niskiej rozpuszczalności w wodzie w otaczającym podłożu. Rdzeń jest otoczony ochronną powłoką lipidową, białkową lub polimerową, najczęściej składającą się z fosfolipidów54. Po wystawieniu na działanie pola amerykańskiego, ściśliwość MB powoduje ich oscylacje objętościowe, co w konsekwencji powoduje silne rozpraszanie akustyczne, które jest odpowiedzialne za sukces MB jako środka kontrastowego. Jak wspomniano, oscylacje te prowadzą również do wyżej wymienionych efektów mechanicznych, termicznych i chemicznych, które można wykorzystać w zastosowaniach terapeutycznych. Proces powlekania MB oferuje również mechanizm kapsułkowania leków w strukturze MB oraz przyłączania leków i/lub gatunków docelowych do powierzchni MB. Technika ta ułatwia wyzwalanie uwalniania leków w celu zmniejszenia toksyczności ogólnoustrojowej55. Niedawno wykazano również, że materiał z powierzchni MB może być przenoszony do struktur biologicznych, usprawniając dostarczanie leków poprzez tzw. "sonoprinting"56,57,58.

Monitorowanie aktywności kawitacyjnej za pośrednictwem USA może dostarczyć wglądu w wynikowe efekty biologiczne zarówno in vitro, jak i in vivo i potencjalnie pozwala na dostrojenie i optymalizację tych efektów. Dwie najpowszechniej stosowane metody monitorowania aktywności kawitacyjnej to i) optyczna, która wykorzystuje ultraszybką mikroskopię wideo i jest generalnie niewykonalna in vivo; oraz ii) akustyczna, która rejestruje ponownie wypromieniowane pola dźwiękowe wytwarzane przez oscylujące i/lub zapadające się pęcherzyki. Zarówno składowe amplitudy, jak i częstotliwości sygnału akustycznego zawierają informacje o zachowaniu pęcherzyków. Wykazano, że niskie stężenia pęcherzyków przy niskich amplitudach incydentalnych w USA powodują głównie emisje harmoniczne (całkowite wielokrotności częstotliwości jazdy)59. Wraz ze wzrostem ciśnienia napędowego, widmo emisji pęcherzyków może również zawierać składowe ułamkowe znane jako subharmoniczne i ultraharmoniczne60, które wskazują na silniejsze zachowanie nieliniowe, a także szum szerokopasmowy, który wskazuje na kawitację bezwładnościową. Harmoniczne całkowite są podstawowym wskaźnikiem oscylacji pęcherzykowej, ale mogą być również spowodowane nieliniowością w dowolnym miejscu systemu eksperymentalnego, np. z powodu propagacji nieliniowej. Natomiast harmoniczne ułamkowe i szum szerokopasmowy są bardzo silnie skorelowane z dynamiką pęcherzyków.

Związek między zachowaniem pęcherzyków a wykrytymi emisjami akustycznymi może być skomplikowany przez takie czynniki, jak pole zdarzenia w USA, środowisko zarodkowania i charakterystyka ścieżki detekcji60. Niemniej jednak ważne informacje na temat zachowania pęcherzyków i ich interakcji z komórkami można uzyskać, dostrzegając trendy w częstotliwości i energii w widmie akustycznym. Dane te mogą również dostarczyć cennych informacji, które mogą być wykorzystane do stworzenia podstawy dla technik klinicznego monitorowania leczenia. Aby w pełni wykorzystać te informacje, konieczne jest opracowanie solidnych, przekładalnych i odtwarzalnych metod eksperymentalnych.

Obecnie istnieją znaczne różnice w raportowanych protokołach projektowania systemów i prowadzenia badań wspierających rozwój terapii wspomaganych kawitacją. Jeśli chodzi o aparaturę, podjęto szereg podejść projektowych. Kilka grup korzystało z komór z płytami równoległymi56,61,62,63, zbudowanych na zamówienie lub dostępnych na rynku (np. OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu i in. (2013) opracowali komorę komórkową sprzężoną z amerykańskim modułem sonikacyjnym i obrazowaniem konfokalnym w czasie rzeczywistym64, Carugo i in. (2015) wykorzystali system składający się z dostępnego na rynku naczynia do hodowli komórkowej z niestandardową pokrywą PDMS, aby umożliwić zanurzenie w kąpieli wodnej podczas ekspozycji w USA65, a Pereno i in. (2018) wykorzystali urządzenie składające się z warstwowych rezonatorów akustycznych, które pozwalają na jednoczesną charakterystykę optyczną i akustyczną Dynamika bąbelków i interakcje między komórkami bąbelkowymi66. Stosowanie niestandardowych i specyficznych dla aplikacji projektów komplikuje charakterystykę pola w USA i innych warunków narażenia środowiskowego, co utrudnia porównania między badaniami. Na przykład, istnieje znaczna zmienność w amerykańskich parametrach zidentyfikowanych dla osiągnięcia udanej sonoporacji, które obejmują częstotliwości środkowe w zakresie od 0,02 do 15 MHz, cykle pracy wahające się od 1% do fali ciągłej oraz ciśnienie rozrzedzające w zakresie od 0,1 do 20 MPa23,64,67,68,69,70 (Tabela 1). Podobnie znaczne są różnice w składowych widmowych (harmoniczne, podharmoniczne itp.), które zostały zidentyfikowane jako związane z określonymi efektami biologicznymi.

Celem tej pracy jest zatem dostarczenie łatwego do odtworzenia systemu projektowania i implementacji ram do badania in vitro komórkowych efektów biologicznych wywołanych kawitacją, ze szczególnym uwzględnieniem możliwości monitorowania kawitacji.

Protokół

1. Zasady projektowania systemu

UWAGA: W tej sekcji przedstawiono zasady projektowe stosowane przy tworzeniu systemów do naświetlania ultradźwiękami (US) i monitorowania kawitacji. Zasady te zilustrowano na przykładzie dwóch istniejących systemów transdukcji akustycznej (SAT), pokazanych na Rysunku 1. Każdy system składa się z komory do naświetlania komórek, źródła US oraz pojedynczego przetwornika działającego jako pasywny detektor kawitacji (PCD), które wszystkie są zintegrowane w komorze testowej umieszczanej na blacie laboratoryjnym. Opisane konstrukcje oparte są na wcześniejszym rozwoju systemów opisanym przez Carugo et al. (2015)65.

  1. Maksymalizuj łatwość użytkowania.
    1. Dopasuj komorę ekspozycyjną dla komórek do istniejących technik hodowli i systemów wizyjnych, wykorzystując dostępne komercyjnie urządzenia do hodowli komórkowych jako podłoża do zasiewania i wzrostu.
      1. W przypadku SAT2 należy użyć płytki hodowlanej (średnica 35 mm, z której obserwowalna jest powierzchnia o średnicy 21 mm, zobacz Spis materiałów).
      2. Dla SAT3 użyj wkładki Transwell (średnica 6,5 mm, zobacz Spis materiałów). Transwell posiada przepuszczalną membranę, dlatego należy je umieszczać w pożywce komórkowej, a nie w wodzie.
  2. Umożliwia szybkie załadowanie i uszczelnienie komory ekspozycji komórkowej.
    1. Utwórz komorę ekspozycji komórek SAT2, nasuwając elastyczny polimerowy pokrywacz na szalkę hodowlą (Carugo et al. 2015)65). Jak widać na Rycina 1C, pokrywka posiada parę otworów o średnicy 1,2 mm, umożliwiających wypełnienie komory strzykawką z tępym nakretnikiem o kalibrze 18 G. Po wypełnieniu zamknij te otwory wlewowo krótkimi plastikowymi prętami (Spis materiałów).
    2. Wypełnij komorę SAT3 za pomocą szpryty lub pipety i zamknij, wciskając korek gumowy.
    3. Umożliwia szybkie załadowanie uszczelnionego kompartmentu do ekspozycji komórek do komory testowej. Uchwyty na kompartmenty do ekspozycji komórek zostały wbudowane w pokrywy komory, gdzie lekki wcisk zapewnia odpowiednie ustawienie. W przypadku systemów pokazanych na Rycina 1, czas wymiany próbek może być tak krótki jak 20 sekund, gdy wcześniej przygotowano wiele komór do ekspozycji komórek.
    4. Zminimalizuj objętość wewnętrzną komory, aby system był przenośny, a ilość potrzebnej wody/środowiska mogła być zredukowana do minimum. Pozwala to również na przyspieszenie odbudowy po przypadkowych wyciekach lub rozlaniach środków kawitacyjnych poza komorę ekspozycyjną.
      UWAGA: Objętość wewnętrzna SAT2 wynosi około 0,8 L. Objętość wewnętrzna SAT3 wynosi około 7,6 L – zwiększono ją, aby umożliwić łatwe montowanie i wymianę przetwornika źródłowego lub jego konfiguracji. Dodano komorę wewnętrzną o pojemności 0,3 L, aby zminimalizować objętość jednorazowego zużycia i umożliwić stosowanie płynów biologicznie istotnych innych niż woda wypełniająca zbiornik (np. ośrodków hodowlanych komórek). Spód komory wewnętrznej wykonany jest z 30 μm gruba płytka z mylaru umożliwiająca maksymalną transmisję akustyczną
    5. Wykonaj komorę i elementy wewnętrzne z materiałów optycznie przezroczystych, o ile to możliwe, aby wszelkie problemy (np. wycieki, uwięzione makrobąbelki) można było szybko wykryć i usunąć.
  3. Zmaksymalizuj przepuszczalność akustyczną komory ekspozycyjnej.
    1. Zmaksymalizuj przepuszczalność poprzez odpowiedni wybór materiałów i grubości ścianek komory. Przy założeniu, że ciecze po obu stronach ścianki są w zasadzie takie same (np. woda), wartość współczynnika transmisji ciśnienia przy normalnym padaniu71 jest:
      Równanie współczynnika transmisji, wynik eksperymentu optycznego, zawiera funkcję sinusoidalną, analiza fazy., gdzie λ to długość fali w ścianie o grubości L, Wzór na obciążenie dynamiczne, γ=0,5|zL/z0−z0/zL|, związany z analizą stabilności mechanicznej., oraz zL i zo to charakterystyczne impedancje (iloczyny gęstości i prędkości dźwięku) odpowiednio dla materiału ścianki i cieczy. T = 1 oznacza idealne przepuszczanie.
    2. Do szerokopasmowego monitorowania kawitacji (np. 1–8 MHz) większość laboratoryjnych polimerów (np. PDMS, PTFE, polistyren) zmienia ciśnienie przenoszone o nie więcej niż 10%, jeśli grubość materiału jest mniejsza niż 1/10th długości fali w materiale. Spełnienie tego warunku może być trudne przy użyciu standardowych materiałów przy wysokich częstotliwościach (np. szkiełko #1,5 przy 8 MHz), dlatego zaleca się przewidywanie lub bezpośrednią kalibrację odpowiedzi częstotliwościowej transmisji.
    3. Aby zapewnić wąskopasmową transmisję sygnału US do komory ekspozycyjnej, należy dobrać grubość warstwy tak, by była ona w przybliżeniu całkowitą wielokrotnością połowy długości fali w materiale warstwy. Na przykład pokrywka z PDMS w SAT2 ma grubość 2,0 mm (~2 długości fali przy 1 MHz, cPDMS ~ 1000 m/s
  4. Maksymalizuj obszar ekspozycji poprzez wybór źródła i środowiska komórkowego.
    1. Aby zwiększyć maksymalnie liczbę wystawionych komórek, obszar przyczepiania komórek należy wykonać jak najszerszy, zachowując jednocześnie kompatybilność z dostępnym sprzętem do hodowli i obrazowania.
    2. Użyj źródła US o polu obejmującym obszar przylegania komórek przy minimalnej zmienności przestrzennej, wykorzystując przedogniskową strefę dużego skupionego źródła (SAT2) lub źródło skupione lub wyposażone w soczewkę o szerokości głównego piku odpowiadającej średnicy obszaru przylegania komórek (SAT3). Zobacz Spis materiałów dla konkretnych źródeł
    3. Zminimalizuj złożoność pola wprowadzoną przez uchwyt komory komórkowej, mechanicznie podpierając komorę komórkową w dużej odległości od najintensywniejszej części padającego pola, minimalizując przekrój czynny rozpraszania uchwytu lub umieszczając materiał absorbujący na uchwycie. Przykłady pokazano w Rysunek 1A i 1D.
  5. Zapewnij powtarzalne warunki ekspozycji.
    1. Zakończ pole akustyczne na stałej granicy, aby wyeliminować zmienność wynikającą z powierzchni międzypłynowych powietrze-woda w częściowo wypełnionych komorach. W SAT2 i 3 osiąga się to poprzez zamontowanie absorbera akustycznego (patrz Tabela materiałów) na pokrywie komory, co dodatkowo zmniejsza złożoność pola, jaka może wynikać z odbić brzegowych.
    2. Monitoruj i zapisuj napięcie zasilania na wyjściu wzmacniacza/wejściu źródła, aby móc szybko wykryć niewielkie zmiany lub poważne awarie. Użyj sondy napięciowej lub innego urządzenia bezpiecznego w zakresie badanego napięcia zasilania. Co pewien czas sprawdzaj kalibrację sondy napięciowej za pomocą dobrze znanego źródła, takiego jak generator przebiegów.
    3. Kontroluj, monitoruj i rejestruj temperaturę komory oraz jej zawartości. Odpowiedzi komórek, przetworników i ośrodka propagacyjnego mogą być wrażliwe na temperaturę. W SAT2 monitorowanie i kontrola odbywają się za pomocą pary portów cyrkulacyjnych połączonych z systemem kondycjonowania wody, podczas gdy SAT3 wykorzystuje grzałkę akwariową (nie pokazano). Ustaw temperaturę wody zgodnie z potrzebami, aby naśladować odpowiednie warunki fizjologiczne dla zastosowania terapeutycznego.
      UWAGA: temperatura wewnętrzna może ulegać zmianie zarówno na skutek czynników zewnętrznych, jak i wywołanego przez US ogrzewania przetwornika oraz ośrodka.
    4. Starannie odgazuj ciecz(e) w komorze, aby zminimalizować ryzyko niezamierzonej kawitacji i/lub rozpraszania przez istniejące pęcherzyki w ścieżce propagacji.
      UWAGA: jeśli nie przeprowadzi się odgazowania, np. ze względu na negatywny wpływ na komórki, poziom tła aktywności pęcherzyków będzie zwiększony, co należy odpowiednio uwzględnić.
  6. Wykalibruj całkowicie zmontowany system.
    1. Dołącz urządzenie do pomiaru pola ciśnienia padającego na ekspouowane komórki, gdy wszystkie elementy systemu są na swoich miejscach, w tym komora do ekspozycji komórek. W SAT2 i SAT3 osiąga się to poprzez otwór w pokrywie komory, przez który można wstawić sondę igłową lub hydrofon światłowodowy bez zakłócania mierzonego pola. Pomiary należy wykonywać jak najbliżej położenia komórek.
    2. Wybierz hydrofon z czułym promieniem (arcv) jest wystarczająco mała, aby nie zafałszować mierzonego pola ciśnienia. Dopuszczalny rozmiar zależy od częstotliwości źródła (f) i promień (asrc) oraz odległość między źródłem a skanowaniem pola (zrcv). Ogólnym kryterium doboru wielkości hydrofonu jest: Nierówność propagacji fali: \( \frac{4\pi f}{c} \frac{a_{src} a_{rcv}}{z_{rcv}} < 1 \)., prowadząc do: Wzór równowagi statycznej; równanie przedstawiające równowagę; analiza badawcza; symbol., gdzie c to prędkość dźwięku72.
    3. Upewnij się, że hydrofon został skalibrowany w warunkach używanych podczas charakteryzacji systemu, w tym w temperaturze określonej w sekcji 1.6. W szczególności, jeśli hydrofon jest umieszczony pod kątem względem płaszczyzny skanowania, kalibracja musi zostać przeprowadzona pod tym samym kątem, ponieważ efekty kierunkowości mogą istotnie różnić się od tych wynikających wyłącznie z geometrii. Zmiana czułości hydrofonu w zależności od temperatury powinna być dostępna u producenta.
    4. Przeskanuj cały obszar, w którym komórki mogą być narażone. Aby uzyskać odpowiedni poziom szczegółowości pola, użyj odstępu skanowania nie większego niż 1/5th o długości fali odpowiadającej najwyższej częstotliwości, która nas interesuje. Jeżeli zaobserwuje się nieoczekiwaną złożoność pola, rozważ użycie krótkich impulsów sygnału (np. 1–3 cykle), aby umożliwić identyfikację i ilościowe określenie wkładów pola bezpośredniego i rozproszonego.
  7. Wprowadź możliwość monitorowania kawitacji.
    1. Określ typ i rozmieszczenie przetwornika monitorującego jako część projektowania całego systemu, a nie w ramach późniejszej modyfikacji. W praktyce prowadzi to do systemu maksymalnie zwartego, bez utraty możliwości niezawodnego wyrównania kluczowych komponentów systemu.
    2. Umieść urządzenie do monitorowania kawitacji w systemie w taki sposób, aby można je było powtarzalnie pozycjonować przy minimalnym dodatkowym czasie przygotowania i bez zakłócania pracy. W SAT2 osiąga się to za pomocą jednoelementowego przetwornika piezoelektrycznego działającego jako PCD, umieszczonego w pokrywie komory, podczas gdy w SAT3 PCD jest zintegrowane z podstawą źródła przy użyciu 90° reflektor
    3. Wybierz kształt PCD zgodnie z celami eksperymentów. W Rycina 2, obliczenia konturów półamplitudy urządzeń bezogniskowych (lewo) i ogniskowych (prawo) pokazują znaczące różnice w czułości przestrzennej w zależności od częstotliwości. Urządzenie bezogniskowe lepiej nadaje się do monitorowania dużych objętości ze skromną zmiennością przestrzenną w funkcji częstotliwości, podczas gdy urządzenie ogniskowe lepiej nadaje się do bardziej promieniowo skompaktowanych pomiarów przy częstotliwościach interesujących.
    4. Wybierz częstotliwość środkową i szerokość pasma PCD zgodnie z potrzebami eksperymentu. Częstotliwość środkową dobiera się zazwyczaj jako co najmniej pięciokrotnie wyższą niż częstotliwość źródła US, aby zminimalizować wrażliwość na bezpośrednie emisje źródła. Szerokość pasma zazwyczaj maksymalizuje się, aby zaobserwować szeroki zakres zachowań pęcherzyków (szum harmoniczny i szerokopasmowy).
    5. Wybierz metody kondycjonowania, rejestracji i przetwarzania umożliwiające analizę danych kawitacyjnych, zgodnie z opisem w kolejnej sekcji.

2. Aparatura i przetwarzanie sygnałów do monitorowania kawitacji

UWAGA: W tej sekcji przedstawiono zalecane składniki i funkcje przepływu sygnału do zbierania danych monitorowania kawitacji oraz przetwarzanie danych prowadzące do ocen jakościowych i ilościowych aktywności kawitacyjnej.

  1. Urządzenia pomiarowe (zobacz również Rysunek 3).
    1. Jeśli zastosowanie nie wymaga urządzenia niestandardowego, wybierz przetwornik PCD spośród szerokiej gamy dostępnych komercyjnie przetworników jednoelementowych, zwykle oferowanych do nieniszczącego testowania obiektów zanurzonych. Ci sami dostawcy oferują również kable i akcesoria (np. lustrzany reflektor w SAT3).
    2. Minimalizuj odpowiedź PCD na źródło US. Można to osiągnąć zarówno poprzez odpowiedni wybór przetwornika PCD (częstotliwość środkowa i pasmo), jak również poprzez zastosowanie filtru wycinającego lub górnoprzepustowego. Ostatni może być zrealizowany jako moduł autonomiczny lub jako część urządzenia do kondycjonowania sygnału.
    3. Użyj cyfrowego rejestratora o dużej dynamice (co najmniej 12 bitów), aby uzyskać jak największą ilość danych przy minimalnym ryzyku przesterowania sygnału i maksymalnym stosunku sygnału do szumu (SNR) dla najmniejszych sygnałów. Porównując urządzenia, przeanalizuj specyfikacje dotyczące stosunku sygnału do szumu i zniekształceń oraz/lub efektywnej liczby bitów, ponieważ te parametry dokładniej opisują osiągalną dynamikę. Należy również ocenić, czy pojemność bufora pamięci jest wystarczająca dla wymaganej długości i szybkości rejestracji danych.
    4. Optymalizuj wykorzystanie dynamiki rejestratora cyfrowego. Sygnały z PCD mogą obejmować kilka rzędów wielkości, zarówno z powodu długiego czasu ekspozycji (podczas usuwania pęcherzyków), jak i przeprowadzania eksperymentów przy różnych poziomach wysterowania US. Dlatego konieczne jest sprawdzenie, czy łańcuch kondycjonowania sygnału skaluje wszystkie sygnały tak, aby mogły być poprawnie zarejestrowane.
    5. Dołącz wzmacniacz wstępny do łańcucha sygnałowego, aby zapewnić adekwatne wychwycenie najmniejszych oczekiwanych sygnałów. Według naszego doświadczenia, szum własny PCD jest znacznie niższy niż większości rejestratorów cyfrowych, więc umiarkowane wstępne wzmocnienie (np. <100x) może nadal poprawić SNR końcowego wyniku.
    6. Przefiltruj częstotliwość źródła US przed wstępny wzmacniaczem, aby uniknąć nasycenia wzmacniacza.
    7. Jeśli do wzmocnienia i/lub filtrowania sygnału stosuje się pulsator/odbiornik US, użyj trybu pulsatora, aby potwierdzić długość drogi propagacji/wyjustowanie lub wykryć nieoczekiwane rozpraszacze na drodze propagacji między PCD a komorą ekspozycyjną.
    8. Włącz przesyłanie danych w czasie rzeczywistym do pamięci. Systemy SAT2 i SAT3 wykorzystują oscyloskopy USB z możliwością strumieniowania danych o rozdzielczości 12-bitowej (zobacz Tabelę materiałów), które oferują wygodę przenośności i dobrze zaprojektowane interfejsy użytkownika.
    9. Sprawdź poprawne dopasowanie impedancji w łańcuchu sygnałowym, aby uniknąć błędów wzmocnienia lub pasma. Przetworniki PCD mają zwykle impedancję wyjściową bliską 50 omów, więc odpowiednią procedurą jest zastąpienie PCD znanym sygnałem z generatora przebiegów (o impedancji wyjściowej 50 omów) i potwierdzenie, że wielkość sygnału pojawiającego się na rejestratorze odpowiada oczekiwaniom, że skaluje się liniowo przy zmianie sygnału wejściowego i że nie występuje przesterowanie dla największego interesującego sygnału.
  2. Przetwarzanie wstępnego
    1. Skoryguj surowe sygnały napięciowe dla wszystkich znanych wzmocnień i czułości w łańcuchu sygnałowym, które odnoszą się do przetwarzania danych w zakresie częstotliwości interesującym.
    2. Jeśli dane zostały zarejestrowane z sprzężeniem wejściowym prądu stałego lub inaczej wykazują przesunięcie DC, usuń to przesunięcie przez bezpośrednie odjęcie lub zastosowanie filtru górnoprzepustowego.
  3. Oblicz widmo mocy P każdego zarejestrowanego sygnału.
    1. Ustaw długość transformaty Fouriera Nft tak, aby częstotliwość podstawowa źródła US f0 była dużą wielokrotnością szerokości pasma transformaty: Nft = nfs/f0, gdzie n jest liczbą całkowitą, a fs to częstotliwość próbkowania danych cyfrowych. Ustaw n ≥ 50, aby wyraźnie uchwycić cechy widmowe. Dla przykładu, przy częstotliwości podstawowej 1 MHz próbkowanej z częstotliwością 50 MHz, Nft wynosi 2500, a szerokość pasma to 0,02 MHz.
    2. Ponieważ długość transformaty Nft jest zazwyczaj mniejsza niż czas trwania zarejestrowanego sygnału, użyj estymatora gęstości widmowej mocy (PSD), takiego jak metoda Welcha73. Moc w paśmie częstotliwości obejmującym f1-f2 wynosi Wzór całkowania gęstości widmowej mocy, P=∫ PSD dF, równanie, analiza przetwarzania sygnału., gdzie dF to szerokość pasma transformaty.
    3. Aby scharakteryzować aktywność pęcherzykową podczas każdej ekspozycji, oszacuj wkłady do widma mocy pochodzące od wielokrotności całkowitych f0 (harmoniki), nieparzystych wielokrotności f0/2 (ultraharmoniki) oraz szumu szerokopasmowego (kawitacja bezwładnościowa).
    4. Wkład harmoniczny i ultraharmoniczny można najprościej oszacować, wybierając wartości widma mocy przy określonych częstotliwościach. Jednakże duże amplitudy odpowiedzi tonalnych mogą rozprzestrzenić się na niewielką liczbę sąsiednich pasm częstotliwości (np. f0 ± 2-3), które należy uwzględnić w obliczeniach mocy wąskopasmowej i wykluczyć z obliczeń szerokopasmowych.
    5. Oszacuj moc kawitacji szerokopasmowej przez odjęcie wkładów harmonicznych i ultraharmonicznych od całkowitego widma mocy. Alternatywnie, te wkłady mogą być oszacowane za pomocą bardziej zaawansowanego przetwarzania wstępnego74.
    6. Oszacuj skumulowaną energię sygnału kawitacji w czasie trwania ekspozycji, najlepiej według rodzaju cechy widmowej / typu aktywności pęcherzykowej.
    7. Zakładając, że wszystkie zapisy danych miały jednakową długość Tr, skumulowana energia w zarejestrowanych danych wynosi Równanie oczekiwania energii, wzór: E=Tr ΣPm, stosowane w mechanice kwantowej, wyrażenie matematyczne., gdzie M oznacza liczbę zapisów.
    8. Jeśli występują przerwy między rejestracjami, co może mieć miejsce, gdy ekspozycja jest ciągła, a zapisane pliki obejmują jedynie część całkowitego czasu ekspozycji Te, skumulowaną energię można oszacować jako Równanie obliczania rozkładu energii, wzór: E=(Te/M)∑[m=1 do M]Pm.
    9. Oszacuj SNR pomiaru poprzez porównanie poziomów widma z poziomami szumu tła zarejestrowanego w braku US.

3. Protokół eksperymentalny

  1. Przygotowanie SAT
    1. Minimalizuj prawdopodobieństwo kawitacji w ścieżce propagacji, odgazowując ciecz wypełniającą (zwykle odfiltrowaną wodę) pod ciśnieniem -105 Pa przez co najmniej dwie godziny. Zaleca się potwierdzenie za pomocą sondy do pomiaru stężenia tlenu rozpuszczonego, że ciśnienie parcjalne tlenu jest poniżej 10 kPa.
    2. Wypełnij komorę badawczą powoli, aby zminimalizować ponowne wprowadzenie powietrza do odgazowanej cieczy. W razie potrzeby kontynuuj odgazowywanie wypełnionej komory.
    3. Usuwaj natychmiast wszelkie pozostałe pęcherzyki z powierzchni przetwornika i pojemnika z ośrodkiem zarówno tuż po wypełnieniu, jak i bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentów z napromieniowaniem.
    4. Upewnij się, że temperatura komory i jej zawartości ustabilizowała się przed rozpoczęciem eksperymentów z napromieniowaniem.
    5. Przed rozpoczęciem eksperymentów pozwól wzmacniaczowi mocy źródła US ogrzać się (zgodnie z zaleceniem producenta), aby wzmocnienie i wyjście były stabilne w czasie.
  2. Przygotowanie komory ekspozycyjnej
    1. Suszpenzja czynnika kawitacyjnego
      1. Podczas rozcieńczania czynnika kawitacyjnego delikatnie i ciągle mieszaj, aby uzyskać jednorodną zawiesinę bez wychwytywania makropęcherzyków lub niszczenia czynnika (szczególnie jeśli są to pęcherzyki otoczone powłoką).
      2. Podczas pracy z MB (mikropęcherzykami) pobieraj i dozuj powoli, używając największej dostępnej igły, aby zminimalizować ich uszkodzenie w trakcie ładowania75. W systemach SAT regularnie stosowano tępy igłę o kalibrze 18 G.
  3. Przygotowanie SAT2
    1. Sterylizuj pokrywkę z PDMS przed użyciem w eksperymentach z żywymi komórkami.
    2. Utwórz komorę ekspozycyjną komórek, wciskając pokrywkę z PDMS do płytki hodowlanej.
    3. Przygotuj strzykawkę z tępą igłą o kalibrze 18 G i napełnij ją około 10 mL cieczy (np. zawiesiną MB lub wodą jako kontrolą).
    4. Wprowadź igłę przez jedno z otworów wypełniających PDMS i powoli napełnij komorę, przechylając ją tak, aby makropęcherzyki mogły uciec przez otwarty otwór wypełniający. Dla najlepszych wyników przechylaj komorę tak, aby otwarty otwór znajdował się powyżej otworu wypełniającego.
    5. Po wypełnieniu zamknij otwarty otwór, wstawiając krótki (4–5 mm) pręt polimerowy. Ustaw zestaw tak, aby oba otwory były poziome.
    6. Usuń tępy igłę wypełniającą, kontynuując wlew cieczy, aby nie wciągnąć powietrza. Zamknij otwór kolejnym prętem polimerowym. Ten proces kończy uszczelnienie komory ekspozycyjnej komórek.
    7. Wizualnie sprawdź komorę pod kątem obecności uwięzionych makropęcherzyków; jeśli zostaną wykryte, powtórz punkty 3.3.3.–3.3.6.
    8. Wciśnij komorę ekspozycyjną komórek do uchwytu komory. Umieść pokrywę komory na jej szczycie. Opuszczanie pokrywy pod kątem do poziomu zmniejsza ryzyko, że makropęcherzyki osiądą na zanurzonych elementach (absorber, uchwyt).
    9. Podczas decydowania o orientacji komory ekspozycyjnej komórek rozważ nośność cząstek w zawiesinie (np. unoszące się pęcherzyki lub osiadające nanocząstki) oraz to, jak wpłynie to na ich kontakt z komórkami.
    10. Wszystkie operacje wykonuj z jak najmniejszym użyciem siły, aby zminimalizować ugięcie powierzchni hodowli komórek i ich odłączanie.
  4. Przygotowanie SAT3
    1. Wypełnij Transwell około 150 μL cieczy (np. zawiesiną MB lub wodą jako kontrolą).
    2. Utwórz komorę ekspozycyjną komórek, ostrożnie uszczelniając Transwell za pomocą korka gumowego, usuwając nadmiar cieczy czystą chusteczką lub wacikiem. Przed użyciem w eksperymentach z żywymi komórkami korek gumowy należy zesterilizować.
    3. Wizualnie sprawdź komorę pod kątem obecności uwięzionych makropęcherzyków; jeśli zostaną wykryte, usuń korek, usuń makropęcherzyki i powtórz punkt 4.4.2.
    4. Wciśnij komorę ekspozycyjną komórek do uchwytu komory. Umieść pokrywę komory na jej szczycie. Opuszczanie pokrywy pod kątem do poziomu zmniejsza ryzyko, że makropęcherzyki osiądą na zanurzonych elementach (absorber, uchwyt).
      UWAGA: Jak wspomniano powyżej, makropęcherzyki mogą powodować różnorodne niepowtarzalne i potencjalnie szkodliwe skutki w eksperymentach z napromieniowaniem US. Najpoważniej, makropęcherzyki uwięzione w komorze ekspozycyjnej komórek mogą wywoływać odpowiedzi PCD oraz lokalne bioefekty komórkowe, które nie są reprezentatywne dla zamierzonego leczenia. Zawsze wizualnie sprawdzaj wszystkie komponenty systemu, aby wykryć i usunąć makropęcherzyki przed rozpoczęciem eksperymentów z US.

4. Zbieranie danych

  1. Ustal poziomy tła odpowiedzi PCD, przeprowadzając wstępne eksperymenty z komorą do narażania komórek wypełnioną cieczą kontrolną (np. odgazowaną wodą lub ośrodkiem komórkowym).
  2. Zarejestruj dane PCD bez włączania źródła US, aby ustalić poziomy tła szumów elektronicznych.
  3. Zarejestruj dane PCD, włączając źródło US w całym zakresie planowanych poziomów wysterowania. Dane te pozwolą określić, które części odpowiedzi akustycznej nie są związane z badanymi w dalszej kolejności czynnikami kawitacyjnymi.
    UWAGA: Typowe ciecze laboratoryjne (np. PBS lub ośrodek komórkowy) ulegają kawitacji przy umiarkowanych ciśnieniach (np. 0,5 MPa przy 0,5 MHz), jeśli nie zostały odgazowane.
  4. Przed rozpoczęciem pomiarów należy poczekać, aż zawiesina osiągnie równowagę termiczną z temperaturą komory. Do tego celu może się przydać cienka igła termopary.
  5. Monitoruj eksperymenty w czasie rzeczywistym zarówno w dziedzinie czasu, jak i częstotliwości.
    1. Monitorowanie w dziedzinie czasu sygnału PCD pozwala ocenić, czy sygnały są odpowiedniej wielkości dla aktualnych ustawień aparatury. Należy szczególnie unikać przesterowania sygnału, ponieważ w dziedzinie częstotliwości będzie ono widoczne jako wielotonowa odpowiedź harmoniczna.
    2. Monitorowanie w dziedzinie czasu sygnału PCD pokazuje również, czy sygnały kawitacyjne pojawiają się wcześniej niż oczekiwano, biorąc pod uwagę czas propagacji od źródła US do komory narażenia i dalej do detektora PCD. Obecność takich sygnałów może wskazywać na wyciek czynnika kawitacyjnego do komory testowej.
    3. Monitorowanie w dziedzinie częstotliwości sygnału PCD wskazuje typ zachowania pęcherzyków i może służyć do dostosowania poziomów wysterowania w celu uzyskania pożądanego bodźca komórkowego (np. niższe poziomy wysterowania w przypadku wzbudzania harmonicznego).
  6. Aby upewnić się, że nie zostaną przegapione pierwsze narażenia, należy rozpocząć proces zbierania danych przed włączeniem sygnału wysterowania źródła US.
  7. Monitoruj sygnał wyjściowy wzmacniacza napędzającego źródło US (a nie tylko sygnał wyjściowy generatora fal) przez cały czas trwania eksperymentu, aby upewnić się, że narażenie przebiega zgodnie z oczekiwaniami. Do tego pomiaru użyj sondy wysokiego napięcia i upewnij się, że oscyloskop jest ustawiony z kompensacją tłumienia sondy.
  8. Po zakończeniu narażenia próbki, ostrożnie usuń ją z komory testowej.
    1. Usuń i oczyść pokrywkę z PDMS (SAT2) / korek gumowy (SAT3), aby przygotować ją do ewentualnego kolejnego użycia.
    2. Przenieś szalkę hodowlaną (SAT2) / Transwell (SAT3) zgodnie z potrzebami do dalszej analizy (np. mikroskopia, obrazowanie fluorescencyjne).
    3. Po kilku narażeniach (np. 3–5) zaleca się ponowne zarejestrowanie sygnałów kawitacyjnych w warunkach podstawowych (bez obecności czynnika kawitacyjnego) i porównanie ich z oryginalnym zestawem danych, aby upewnić się, że ośrodek w komorze nie został zanieczyszczony.

Wyniki

Rysunek 4 przedstawia przykłady odpowiedzi PCD w dziedzinie czasu i częstotliwości, ilustrując trzy odmienne zachowania kawitacyjne. Wszystkie dane zostały zebrane na urządzeniu SAT3 przy użyciu mikrobąbelek (MBs) SonoVue rozcieńczonych 5-krotnie w PBS, z końcową koncentracją ~2*107 MBs/ml. Temperatura dla wszystkich przykładów w tej sekcji wynosiła 19 ± 1 °C. Źródło US było pobudzane impulsem o czasie trwania 2,0 ms przy częstotliwości 0,5 MHz, aby uzyskać szczytowe ujemne ciśnienia padające wynoszące 0,20 (Rysunek 4A i 4B), 0,30 (Rysunek 4C i 4D) oraz 0,70 MPa (Rysunek 4E i 4F). Rejestracja sygnału rozpoczęła się 1,4 ms przed momentem t = 0, czyli startem impulsu US. Ślady wstawkowe pokazują sygnał w postaci zapisanej (kolor czerwony) oraz po zastosowaniu filtru górnoprzepustowego 2 MHz (kolor niebieski) dla okna czasowego wycentrowanego na czasie przelotu od źródła przez komorę ekspozycji komórek do detektora PCD. Niskopoziomowa odpowiedź przed tym czasem wynika z bezpośrednio odebranego promieniowania ze źródła, co jest powszechne w konfiguracjach, w których PCD znajduje się za źródłem US.

Przy najniższym ciśnieniu padania odpowiedź PCD składa się całkowicie z harmonicznych całkowitoliczbowych podstawowej częstotliwości US wynoszącej 0,5 MHz. Zwiększenie ciśnienia z 0,20 do 0,30 MPa skutkuje pojawieniem się wyraźnych ultraharmonicznych w widmie, oprócz dodatkowo podniesionych harmonicznych całkowitoliczbowych. Kształty fal w dziedzinie czasu przy tych dwóch ciśnieniach wyglądają podobnie, choć wyniki dla 0,30 MPa wykazują większą zmienność w czasie trwania impulsu. Przy najwyższym ciśnieniu amplituda kształtu fali w dziedzinie czasu wzrosła nieliniowo w stosunku do niższych ciśnień, co jest wynikiem wyraźnie podniesionego szumu szerokopasmowego widocznego w widmie. Szum ten jest powszechnie uważany za efekt kawitacji inercyjnej i w tym przykładzie odpowiada zniszczeniu MBs.

Aby dokładniej to zobrazować, odpowiedzi PCD w funkcji czasu przedstawiono na Rysunku 5. Na panelu lewym (Rysunek 5A) pokazano pełne widma przy czasie ekspozycji wynoszącym 50 s, podczas którego źródło emitowało impulsy o czasie trwania 2.0 ms co 0,20 s. Odpowiadające im całkowite, harmoniczne i szerokopasmowe moce przedstawiono na panelu prawym (Rysunek 5B). Ultradźwięki (US) włączono w t = 3,0 s, w którym momencie zaobserwowano szerokopasmowe odpowiedzi o dużej amplitudzie. Uważa się, że początkowy skok odpowiada zniszczeniu największych pęcherzyków w zawiesinie (SonoVue jest polidyspersyjne), co jest częstą obserwacją w eksperymentach kawitacyjnych z pęcherzykami posiadającymi otoczkę, a nawet w mediach niedegazowanych (np. PBS).

Po kilku sekundach odpowiedź szerokopasmowa gwałtownie zmalała, co wynikało prawdopodobnie z zniszczenia pęcherzyków, a sygnał zaczął składać się głównie z harmonicznych. Sugeruje to, że uwolniony gaz i pozostałe MB wibrują w sposób stabilny i niebezwładnościowy. W t~50s składowa szerokopasmowa spadła do poziomu pierwotnego szumu tła. Testy ekspozycyjne tego typu są zatem istotne przy próbach zrozumienia ram czasowych, w których różne efekty pęcherzykowe mogą oddziaływać na komórki w komorze.

Pęcherzyki prawdopodobnie przemieszczają się w odpowiedzi na siły radiacyjne generowane podczas ekspozycji na US, a ruch MB w obrębie pola widzenia PCD i poza nie może prowadzić do zwiększonej zmienności monitorowanego sygnału kawitacji, szczególnie w przypadku rozcieńczonych zawiesin. Dlatego obszar czuły PCD powinien obejmować jak największą część powierzchni ekspozycji komórek. Porównanie odpowiedzi skupionych i nieskupionych PCD o identycznych częstotliwościach środkowych (patrz Rysunek 2) przedstawiono na Rysunku 6, przy zastosowaniu 20-krotnego rozcieńczenia MB w normalnym PBS w SAT2. Widma uśrednione w czasie i dla próbek na panelu Rysunek 6A pokazują, że nieskupiony PCD wykazuje silniejszą odpowiedź szerokopasmową, której towarzyszy mniejsza zmienność między próbkami zarówno w przypadku mocy harmonicznych (Rysunek 6B), jak i ultraharmonicznych (Rysunek 6C).

Ważne jest uświadomienie sobie, że pożywki stosowane do hodowli komórkowych in vitro nie są odgazowane i mogą wykazywać podwyższony poziom tła w zakresie aktywności pęcherzyków. Rysunek 7 przedstawia odpowiedź w SAT2 dla PBS stosowanego w formie dostarczonej przez producenta oraz po dwóch godzinach odgazowywania w próżni, po czym nasycenie powietrzem spadło z 92% do 46%, co określono za pomocą czujnika optycznego (PreSens, Niemcy). Widma na Rysunku 7A zostały uśrednione w czasie ekspozycji i powtórzeń z pięcioma niezależnymi próbkami i wyraźnie pokazują znacznie podwyższone ultraharmoniczne w zwykłym PBS. Mocy zsumowane dla trzech harmonicznych (Rysunek 7B) mieszczą się w granicach odchylenia standardowego każdego wyniku eksperymentalnego. W przeciwieństwie do tego, sumy ultraharmonicznych na Rysunku 7C wykazują, że zwykły PBS ma poziom wyższy niemal o rząd wielkości i znacznie większą zmienność między próbkami. Przykłady te wskazują, że powszechnie stosowana pożywka kompatybilna z komórkami może wykazywać zachowania, które mogłyby zostać (błędnie) przypisane obecności MBs. Ponieważ odgazowywanie pożywki hodowlanej jest zazwyczaj niepraktyczne ze względu na negatywny wpływ na komórki i/lub stabilność czynnika kawitacyjnego, kluczowe jest przeprowadzenie odpowiednich kontroli w każdym badaniu związanym z kawitacją.

Schemat komory ekspozycji ultradźwiękowej; obejmuje PCD, przedział komórkowy, absorber, układ optyczny.
Rycina 1: Ilustracje dwóch projektów systemów ekspozycji US z monitorowaniem kawitacji: SAT3 (D-F). (A) Opisany montaż SAT2 z usuniętą ścianką boczną dla przejrzystości. (B) SAT2 z nienaruszoną ścianką boczną. (C) Rozmontowany przedział ekspozycji komórek SAT2. (D) Opisany montaż SAT3. (E) SAT3 w konfiguracji normalnej (lewo) i z soczewką (prawo) w celu dopasowania szerokości wiązki przy różnych częstotliwościach. (F) Rozmontowany przedział ekspozycji komórek SAT3. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wzory wiązki ultradźwiękowej; niefokusowana w porównaniu do sferycznie fokusowanej, wykresy odpowiedzi częstotliwościowej.
Rycina 2: Obliczenia konturów pola ciśnienia o połowę amplitudy dla przetworników niefokusowanych (lewo) i sferycznie fokusowanych (prawo) o średnicy 12,7 mm. Częstotliwości 2, 4 i 8 MHz są przedstawione odpowiednio jako kontury czerwone, niebieskie i zielone dla elementu PCD w początku układu współrzędnych (0,0). Zewnętrzne kontury urządzenia niefokusowanego są stosunkowo niewrażliwe na częstotliwość, ale struktura wewnętrzna jest zależna od częstotliwości. Pole sferycznie fokusowane kurczy się wraz ze wzrostem częstotliwości, ale wewnątrz konturów pola zmieniają się płynnie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat przetwarzania sygnałów ultradźwiękowych z konfiguracją PCD, filtra, przedwzmacniacza i generatora przebiegów.
Rysunek 3: Aparatura do kondycjonowania i rejestracji sygnałów kawitacyjnych (niebieskie strzałki), wzbudzenia źródła US (czerwone linie) oraz wyzwalania akwizycji danych. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Wykresy przetwarzania sygnałów akustycznych przedstawiające napięcie w funkcji czasu oraz widma częstotliwości dla analizy szumu.
Rysunek 4: Odpowiedzi PCD w dziedzinie czasu (lewo) i częstotliwości (prawo) zarejestrowane dla MB rozcieńczonych 5x w PBS. Wartości szczytowego ujemnego ciśnienia padającego wynosiły (A, B) 0,2 MPa, (C, D) 0,4 MPa, (E, F) 0,7 MPa, przy częstotliwości 0,5 MHz. Rejestracja sygnałów rozpoczyna się 1,4 ms przed t=0, czyli początkiem impulsu ultradźwiękowego o czasie trwania 2,0 ms. (A, C, E) Sygnały w dziedzinie czasu (czerwone) przedstawiono w stałej skali pionowej, co wskazuje, jak poziom odpowiedzi zmienia się wraz z ciśnieniem padającym. Wstawki pokazują sygnał zarejestrowany (czerwony) oraz po zastosowaniu filtra górnoprzepustowego 2 MHz (niebieski) dla okna czasowego wycentrowanego na czasie przelotu od źródła, przez komorę ekspozycji komórek, do PCD. (B, D, F) Gęstości widmowe mocy szumu i sygnału obliczono odpowiednio dla t<0 i t>0. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Spektrogram i wykres analizy mocy przedstawiający częstotliwość w funkcji czasu; dane całkowite, harmoniczne i szerokopasmowe.
Rysunek 5: Historie widm podczas 50-sekundowej ekspozycji zawiesiny MB rozcieńczonej 5x w PBS.(A) Pełne widma oraz (B) całkowita, harmoniczna i szerokopasmowa moc sygnału, wszystkie w funkcji czasu. Warunki wzbudzenia: 0.5 MHz, szczytowe ciśnienie ujemne 0.7 MPa, czas trwania impulsu 2.0 ms, okres powtarzania impulsów 200 ms. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza ultradźwięków skupionych i nieskupionych; wykresy częstotliwości i czasu; gęstość widmowa mocy, harmoniczne.
Rycina 6: Wpływ geometrii ogniskowania PCD zarejestrowany przy 20-krotnym rozcieńczeniu mikropęcherzyków w zwykłym PBS. Warunki wzbudzenia: 1,0 MHz, szczytowe ciśnienie ujemne 0,50 MPa, czas trwania impulsu 3,0 ms, okres powtarzania impulsów 10 ms. (A) Pełne widma uśrednione w czasie ekspozycji i dla trzech niezależnych powtórzeń próbek. (B) Moc w harmonicznych 3, 4 i 5 MHz oraz (C) moc w ultraharmonicznych 2,5, 3,5 i 4,5 MHz. Grube linie przedstawiają średnie z próbek, obszary zacienione wskazują +/- 1 odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres gęstości widma mocy i analizy mocy harmonicznej; PBS, odgazowany PBS, porównanie tła.
Rycina 7: Efekt odgazowanego medium zarejestrowany przy użyciu PBS. (A) Pełne widma uśrednione w czasie ekspozycji oraz dla pięciu niezależnych powtórzeń próbek. (B) Moc w harmonicznych 3, 4 i 5 MHz oraz (C) moc w ultraharmonicznych 2,5, 3,5 i 4,5 MHz. Grube linie reprezentują średnie z próbek, a obszary zacieniowane oznaczają +/- 1 odchylenie standardowe. Warunki wzbudzenia: 1,0 MHz, szczytowe ciśnienie ujemne 0,50 MPa, czas trwania impulsu 1,0 ms, okres powtarzania impulsów 200 ms. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

ParametrJednostkaMinimumMaksimum
częstotliwośćMHz0.0215
ciśnienie (szczytowe ujemne)MPa0.120
długość impulsucykle1CW
cykl pracy%1CW
czas ekspozycjis101000

Tabela 1: Podsumowanie zakresu zgłoszonych parametrów ułatwiających sonoporację in vitro.

Dyskusja

Kluczowe etapy każdego pomiaru akustycznego zostały ujęte przez Apfela w 1981 roku76 jako "poznaj swoją ciecz, poznaj swoje pole dźwiękowe, dowiedz się, kiedy coś się dzieje". W kontekście tego protokołu obejmują one kalibrację i wyrównanie przetwornika oraz etapy przygotowania wody i obchodzenia się z pęcherzykami. Po pierwsze, ważne jest, aby hydrofon używany do kalibracji przetwornika sterującego i/lub PCD był sam w sobie dokładnie skalibrowany poprzez regularne serwisowanie zewnętrzne lub wewnętrzne porównanie z wzorcem odniesienia. Podobnie, odpowiedź zarówno przetwornika sterującego, jak i PCD musi być regularnie charakteryzowana w celu sprawdzenia jakichkolwiek zmian w mocy wyjściowej i/lub utraty czułości. Jeżeli warunki jazdy i czułość odbioru systemu nie są znane, niemożliwe będzie wywnioskowanie jakiegokolwiek znaczącego związku między warunkami narażenia, skutkami biologicznymi i emisjami akustycznymi. Bezpośrednio związane z tym należy dokładnie sprawdzić ustawienie przetworników względem siebie i komory próbki, aby upewnić się, że warunki ekspozycji w komorze są zgodne z oczekiwaniami, a objętość próbki dla PCD odpowiada obszarowi zainteresowania. Jak wskazano, temperatura i zawartość gazu w podwieszanym medium mogą mieć znaczący wpływ na końcowe wyniki, a konsystencja jest w tym względzie niezwykle ważna77,78. Podobnie, przygotowanie, charakterystyka i obchodzenie się z zawiesiną środka kawitacyjnego wymagają bardzo szczególnej uwagi, aby upewnić się, że oczekiwany rozkład wielkości i stężenie cząstek są obecne w próbce. Na przykład, jeśli stężenie pęcherzyków jest zbyt wysokie, nastąpi skuteczne ekranowanie objętości próbki przed incydentem w polu amerykańskim. Środki MB są szczególnie podatne na niszczenie i koalescencję, a dalsze wskazówki dotyczące obchodzenia się z nimi można znaleźć w Mulvana et. al. (2012)79.

Bardzo częstym problemem z detekcją sygnałów kawitacyjnych jest uzyskanie odpowiedniego SNR. Wynika to częściowo z opisanej natury samego sygnału, ale może to być również spowodowane źródłami szumu elektrycznego w układzie doświadczalnym. Sprawdzenie połączeń między elementami systemu, w szczególności tych, które obejmują kable koncentryczne, może pomóc w wyeliminowaniu niektórych z nich. Może być konieczna wymiana lub naprawa kabli koncentrycznych. Pomocne może być również identyfikowanie i usuwanie lub dezaktywowanie innego sprzętu w laboratorium, takiego jak pompy, które mogą powodować zakłócenia elektryczne. Słabe dopasowanie impedancji elektrycznej między elementami systemu może być kolejną przyczyną słabego stosunku sygnału do szumu, a także potencjalnego uszkodzenia sprzętu i powinno być dokładnie sprawdzone. Ustawienia wyzwalania w generatorze sygnału i oscyloskopie powinny być podobnie sprawdzone, aby potwierdzić, że są one odpowiednio skonfigurowane dla eksperymentu i nie powróciły do domyślnych ustawień producenta. W przypadku znacznego zniszczenia pęcherzyków podczas obsługi, w przypadku SAT2, pomocne może być podłączenie drugiej strzykawki do portu wylotowego i użycie jej do delikatnego wydobycia płynu z komory, wciągając w ten sposób zawiesinę. Może to również pomóc w wyeliminowaniu makropęcherzyków lub umożliwieniu przepływu podczas ekspozycji na USA, jeśli jest to pożądane.

Nie jest możliwe całkowite wyeliminowanie odbić akustycznych w komorze próbki, a zatem pole padające nie będzie całkowicie jednorodne w całej objętości próbki. Jak wspomniano w krokach 1.3.2 i 1.3.3, przepuszczalność okien akustycznych będzie zależna od częstotliwości, a zatem należy dokładnie rozważyć pożądaną szerokość pasma do pomiarów emisji akustycznej. W szczególności mogą wystąpić znaczne odbicia wielokrotne składowych o wyższej częstotliwości. Jest to kolejny powód, dla którego kalibracja pola w całkowicie zmontowanym systemie jest tak ważna dla zminimalizowania niepewności ciśnienia zdarzenia. Należy również wziąć pod uwagę odpowiednie bramkowanie rejestrowanych sygnałów, aby zminimalizować skutki wielokrotnych odbić. Korzystanie z komercyjnych urządzeń dla wygody i potrzeba przejrzystości akustycznej oznacza, że należy poświęcić pewną przezroczystość optyczną. Może to mieć wpływ na jakość kolejnych badań obrazowych, np. w celu oceny żywotności komórek lub wchłaniania leków. Niektóre membrany stosowane w urządzeniach komercyjnych są również porowate, a zatem dochodzi do niedoskonałej izolacji między komorą próbki a otaczającą ją łaźnią wodną. Jak wyżej, związane z tym ryzyko zanieczyszczenia można ograniczyć poprzez zastosowanie mniejszej podkomory, której zawartość można regularnie wymieniać. Urządzenia do hodowli komórkowych wskazane w tabeli materiałów są odpowiednie przede wszystkim dla monowarstw komórkowych, które mogą nie być reprezentatywne dla tkanek pod względem wszystkich efektów biologicznych za pośrednictwem US/kawitacji. Bliskość komórek do stałej powierzchni będzie również wpływać na dynamikę MB w sposób, który może nie odzwierciedlać warunków in vivo, np. promując mikrostrumieniowanie i mikroodrzuty, jak opisano we wprowadzeniu. Ograniczeniom tym można jednak zaradzić poprzez proste zastąpienie ich alternatywnymi modelami tkankowymi.

Celem zaproponowania SAT jest zapewnienie środków do poprawy odtwarzalności warunków ekspozycji akustycznej i emisji akustycznych między badaniami skutków biologicznych, w których pośredniczą Stany Zjednoczone, co miejmy nadzieję ułatwi lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw leczenia i rozwój technik monitorowania leczenia w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności. Systemy zostały zaprojektowane tak, aby były kompatybilne z dostępnymi na rynku urządzeniami do hodowli komórkowych, umożliwiając wykonywanie szerokiego zakresu testów biologicznych w zależności od interesującego zastosowania i umożliwiając przeprowadzanie eksperymentów o wysokiej przepustowości, eliminując potrzebę czasochłonnych procedur dopasowywania między seriami. Miejmy nadzieję, że dzięki standaryzacji protokołów charakterystyki warunków ekspozycji i wychwytywania emisji akustycznych, zmienność zależna od systemu może zostać zmniejszona. Zakres parametrów, które należy zbadać w danym eksperymencie, będzie zależał od zastosowania (pożądany efekt biologiczny, typ komórki, głębokość tkanki docelowej w przypadku in vivo itp.) oraz charakteru stosowanego środka kawitacyjnego. Biorąc pod uwagę dużą liczbę zmiennych (częstotliwość amerykańska, amplituda ciśnienia, długość impulsu, częstotliwość powtarzania impulsów itp.), pełne zbadanie całej przestrzeni parametrów jest mało prawdopodobne. Zaletą proponowanego protokołu jest to, że umożliwia on szybkie ustalenie pewnych granic w tej przestrzeni parametrów. Na przykład umożliwia określenie minimalnego ciśnienia, przy którym generowany jest sygnał kawitacyjny, maksymalnego ciśnienia lub długości impulsu, które można zastosować, zanim nastąpi odłączenie/śmierć komórki, oraz ciśnienia, przy którym wytwarzane są harmoniczne ułamkowe lub szum szerokopasmowy. Zaleca się, aby taki zestaw pomiarów zakresu został przeprowadzony jako pierwszy krok w każdym badaniu.

Jak przedstawiono, SAT są przeznaczone do monitorowania emisji akustycznych w czasie rzeczywistym, przy czym testy biologiczne są wykonywane poza eksperymentem. Stosunkowo łatwo byłoby jednak zmodyfikować SAT tak, aby umożliwić bezpośrednią obserwację optyczną komory próbki za pomocą obiektywu mikroskopowego. To z kolei można połączyć z systemem fluorescencji i/lub mikroskopii o dużej szybkości, aby umożliwić na przykład obserwację wychwytu leku i dynamiki pęcherzyków. Wyjście PCD przedstawione obecnie pod względem napięcia wskazuje: i) rodzaje zachowania kawitacji i ich względne proporcje; ii) jak długo utrzymują się te zachowania kawitacyjne; (iii) czy obserwowane skumulowane w czasie charakterystyki narażenia są skorelowane z konkretnym efektem biologicznym; oraz iv) czy względne poziomy i zachowania zależne od czasu są zgodne z poprzednimi eksperymentami w systemie ekspozycji. Podczas gdy czułość odbioru PCD można określić ilościowo, w celu wiarygodnego scharakteryzowania emisji akustycznych pod względem energii bezwzględnej potrzebne są dodatkowe informacje przestrzenne. Można to osiągnąć poprzez zastąpienie PCD sondą matrycową w celu realizacji pasywnego mapowania akustycznego (PAM)80. Zwiększyłoby to jednak złożoność przetwarzania sygnałów oraz wymagany czas i moc obliczeniową.

Można również zastosować inne oprzyrządowanie do pomiaru oporu elektrycznego membrany lub zastosowania fizycznych metod celowania, na przykład pól magnetycznych. Możliwe byłoby również wykorzystanie trójwymiarowych struktur tkankowych, takich jak sferoidy guza, organoidy, a nawet próbki tkanek ex vivo na akustycznie "miękkich" podłożach żelowych zamiast monowarstw komórkowych do badania efektów amerykańskich i kawitacji w bardziej realistycznych środowiskach tkankowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Radzie Badań Nauk Inżynieryjnych i Fizycznych za wsparcie tej pracy poprzez grant EP/L024012/1. VB jest również wspierany przez Radę ds. Badań Inżynieryjnych i Fizycznych (EPSRC) oraz Radę ds. Badań Medycznych (MRC) (grant EP/L016052/1). VB i AV dziękują Fundacji Clarendon za stypendia podyplomowe. AV dziękuje również Exeter College za stypendium Santander. Autorzy są wdzięczni Jamesowi Fiskowi i Davidowi Salisbury'emu za ich nieocenioną pomoc w produkcji aparatury. Wyrażają również wdzięczność za wkład dr Dario Carugo i Joshuy Owena w rozwój wcześniejszych prototypów SAT.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AbsorberPrecision AcousticsAPTFlex F28 panelo standardowej grubości 1,0 cm
Wzmacniacz (moc)E& I Sp. z o.o.Wzmacniacz mocy 1040L400W do napędzania źródła ultradźwięków
Wzmacniacz (pre)Stanford Research SystemsSR445AWielostopniowy przedwzmacniacz o stałym wzmocnieniu dla sygnałów PCD
Grzałka akwariowaAquaelUltra 50WRóżne modele dla różnych rozmiarów zbiorników.
DigitizerTiePie EngineeringHS5-110-XMOpcja rozszerzonej pamięci: 32 mln punktów na kanał
HydrofonPrecyzyjna akustykaFOHWrażliwy obszar o średnicy 0,01 mm minimalizuje efekty kierunkowości
MikropęcherzykiBraccoSonoVueZatwierdzone przez FDA mikropęcherzyki
Lustro PCD (SAT3)Olympus NDTF-102Odbicie
wiązki 90 stopniPrzetwornik PCDOlympus NDTV320-SUPrzetwornik zanurzeniowy, wodoodporny PCD 7,5 MHz
Olympus NDTBCU-58-1 W
PDMS (pokrywa komory SAT2)CorningSylgard 184Zobacz Carugo i in. (2015), aby uzyskać wskazówki dotyczące przygotowania
Pręt polimerowy (uszczelka SAT2)ZeusMonofilament
Zatyczka gumowa (pokrywa/uszczelka SAT3)VWR391-2101Średnica dolna 6 mm, średnica górna 8 mm, czerwona
Generator sygnałuAgilent33250Generator przebiegów do źródła ultradźwięków
Podłoże do komory ekspozycji komórek, SAT2Ibidiµ-Dish 35mm
Podłoże do komory ekspozycji komórek, SAT3CorningTranswell 6,5 mm
(SAT3)Sonic ConceptsH107 z otwór centralnyZastosowanie źródła obsługującego HIFU umożliwia generowanie ciśnienia >1 MPa zarówno w ognisku, jak i przed ogniskiem, co zapewnia rozszerzony zasięg przestrzenny
PTFE Źródło ultradźwięków

Bibliografia

  1. Maier, A., Steidl, S., Christlein, V., Hornegger, J. Medical Imaging Systems - An Introductory Guide. Lecture Notes in Computer Science. , Springer. (2018).
  2. Tachibana, K., Tachibana, S. Albumin microbubble echo-contrast material as an enhancer for ultrasound accelerated thrombolysis. Circulation. 92, 1148-1150 (1995).
  3. Bao, S., Thrall, B. D., Miller, D. L. Transfection of a reporter plasmid into cultured cells by sonoporation in vitro. Ultrasound in Medicine and Biology. 23 (6), 953-959 (1997).
  4. Price, R. J., Skyba, D. M., Kaul, S., Skalak, T. C. Delivery of colloidal particles and red blood cells to tissue through microvessel ruptures created by targeted microbubble destruction with ultrasound. Circulation. 98 (13), 1264-1267 (1998).
  5. Theek, B., et al. Sonoporation enhances liposome accumulation and penetration in tumors with low EPR. Journal of Controlled Release. 231, 77-85 (2016).
  6. Dimcevski, G., et al. A human clinical trial using ultrasound and microbubbles to enhance gemcitabine treatment of inoperable pancreatic cancer. Journal of Controlled Release. 243, 172-181 (2016).
  7. Snipstad, S., et al. Ultrasound Improves the Delivery and Therapeutic Effect of Nanoparticle-Stabilized Microbubbles in Breast Cancer Xenografts. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2651-2669 (2017).
  8. Unga, J., Hashida, M. Ultrasound induced cancer immunotherapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 144-153 (2014).
  9. Yang, C., Du, M., Yan, F., Chen, Z. Focused ultrasound improves NK-92MI cells infiltration into tumors. Frontiers in Pharmacology. 10, 326(2019).
  10. McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
  11. O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Ultrasound and microbubble-mediated blood-brain barrier disruption for targeted delivery of therapeutics to the brain. Methods in Molecular Biology. 1831, 111-119 (2018).
  12. Mainprize, T., et al. Blood-Brain Barrier Opening in Primary Brain Tumors with Non-invasive MR-Guided Focused Ultrasound: A Clinical Safety and Feasibility Study. Scientific Reports. 9, 321(2019).
  13. Ebben, H. P., Nederhoed, J. H., Lely, R. J., Wisselink, W., Yeung, K. Microbubbles and UltraSound-accelerated Thrombolysis (MUST) for peripheral arterial occlusions: Protocol for a phase II single-arm trial. BMJ Open. 7, 014365(2017).
  14. de Saint Victor, M., Barnsley, L. C., Carugo, D., Owen, J., Coussios, C. C., Stride, E. Sonothrombolysis with Magnetically Targeted Microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (5), 1151-1163 (2019).
  15. Dixon, A. J., Li, J., Rickel, J. M. R., Klibanov, A. L., Zuo, Z., Hossack, J. A. Efficacy of Sonothrombolysis Using Microbubbles Produced by a Catheter-Based Microfluidic Device in a Rat Model of Ischemic Stroke. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  16. Horsley, H., et al. Ultrasound-activated microbubbles as a novel intracellular drug delivery system for urinary tract infection. Journal of Controlled Release. 301, 166-175 (2019).
  17. Lattwein, K. R., et al. Sonobactericide: An Emerging Treatment Strategy for Bacterial Infections. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (2), 193-215 (2020).
  18. Crum, L. A., Fowlkes, J. B. Acoustic cavitation generated by microsecond pulses of ultrasound. Nature. 319, 52-54 (1986).
  19. Holland, C. K., Apfel, R. E. Thresholds for transient cavitation produced by pulsed ultrasound in a controlled nuclei environment. Journal of the Acoustical Society of America. 88, 2059-2069 (1990).
  20. Rifai, B., Arvanitis, C. D., Bazan-Peregrino, M., Coussios, C. C. Cavitation-enhanced delivery of macromolecules into an obstructed vessel. The Journal of the Acoustical Society of America. 128, (2010).
  21. Wu, J., Ross, J. P., Chiu, J. F. Reparable sonoporation generated by microstreaming. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (3), 1460-1464 (2002).
  22. Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
  23. De Cock, I., et al. Ultrasound and microbubble mediated drug delivery: acoustic pressure as determinant for uptake via membrane pores or endocytosis. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 197, 20-28 (2015).
  24. Pereno, V., Lei, J., Carugo, D., Stride, E. Microstreaming inside Model Cells Induced by Ultrasound and Microbubbles. Langmuir. 36, 6388-6398 (2020).
  25. Chen, H., Brayman, A. A., Kreider, W., Bailey, M. R., Matula, T. J. Observations of translation and jetting of ultrasound-activated microbubbles in mesenteric microvessels. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (12), 2139-2148 (2011).
  26. Lentacker, I., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Drug loaded microbubble design for ultrasound triggered delivery. Soft Matter. 5, 2161-2170 (2009).
  27. Song, J. H., Moldovan, A., Prentice, P. Non-linear Acoustic Emissions from Therapeutically Driven Contrast Agent Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 45 (8), 2188-2204 (2019).
  28. Ohl, C., Arora, M., Ikink, R., De Jong, N., Versluis, M., Delius, M. Sonoporation from Jetting Cavitation Bubbles. Biophysical Journal. 91 (11), 4285-4295 (2006).
  29. Li, Z. G., Liu, aQ., Klaseboer, E., Zhang, J. B., Ohl, C. D. Single cell membrane poration by bubble-induced microjets in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 13 (6), 1144-1150 (2013).
  30. Wang, Q. X., Manmi, K. Three dimensional microbubble dynamics near a wall subject to high intensity ultrasound. Physics of Fluids. 26, 032104(2014).
  31. Suslick, K. S. Ultrasound: Its Chemical, Physical, and Biological Effects. Radiology. , VHC Publishers. New York. (1988).
  32. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nature reviews. Drug discovery. 4 (3), 255-260 (2005).
  33. Mitragotri, S. Sonophoresis: Ultrasound-mediated transdermal drug delivery. Percutaneous Penetration Enhancers Physical Methods in Penetration Enhancement. , 3-14 (2017).
  34. Park, J., Lee,, et al. Enhanced Transdermal Drug Delivery by Sonophoresis and Simultaneous Application of Sonophoresis and Iontophoresis. AAPS PharmSciTech. 20 (3), 96(2019).
  35. Lentacker, I., De Cock, I., Deckers, R., De Smedt, S. C., Moonen, C. T. W. Understanding ultrasound induced sonoporation: Definitions and underlying mechanisms. Advanced Drug Delivery Reviews. 72, 49-64 (2014).
  36. Wawryka, P., Kiełbik, A., Iwanek, G. Microbubble based sonoporation - the basics into clinical implications. Medical Research Journal. 4 (3), 178-183 (2019).
  37. Hilgenfeldt, S., Lohse, D., Zomack, M. Sound scattering and localized heat deposition of pulse-driven microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 107 (6), 3530-3539 (2000).
  38. Holt, R. G., Roy, R. A. Measurements of bubble-enhanced heating from focused, MHz-frequency ultrasound in a tissue-mimicking material. Ultrasound Medical Biology. 27 (10), 1399-1412 (2001).
  39. Tan, J., Li, P., Xue, H., Li, Q. Cyanidin-3-glucoside prevents hydrogen peroxide (H 2 O 2 )-induced oxidative damage in HepG2 cells. Biotechnology Letters. 42 (11), 2453-2466 (2020).
  40. Costley, D., et al. Treating cancer with sonodynamic therapy: A review. International Journal of Hyperthermia. 31 (2), 107-117 (2015).
  41. You, D. G., et al. ROS-generating TiO2 nanoparticles for non-invasive sonodynamic therapy of cancer. Scientific Reports. 6, 23200(2016).
  42. Canavese, G., et al. Nanoparticle-assisted ultrasound: A special focus on sonodynamic therapy against cancer. Chemical Engineering Journal. 340, 155-172 (2018).
  43. Beguin, E., et al. Direct Evidence of Multibubble Sonoluminescence Using Therapeutic Ultrasound and Microbubbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (22), 19913-19919 (2019).
  44. Stride, E., et al. Microbubble Agents: New Directions. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  45. Rapoport, N., Gao, Z., Kennedy, A. Multifunctional nanoparticles for combining ultrasonic tumor imaging and targeted chemotherapy. Journal of the National Cancer Institute. 99 (14), 1095-1106 (2007).
  46. Cao, Y., et al. Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound. Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).
  47. Zhang, L., et al. Mitochondria-Targeted and Ultrasound-Activated Nanodroplets for Enhanced Deep-Penetration Sonodynamic Cancer Therapy. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (9), 9355-9366 (2019).
  48. Delogu, L. G., et al. Functionalized multiwalled carbon nanotubes as ultrasound contrast agents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16612-16617 (2012).
  49. Paris, J. L., et al. Ultrasound-mediated cavitation-enhanced extravasation of mesoporous silica nanoparticles for controlled-release drug delivery. Chemical Engineering Journal. 340, 2-8 (2018).
  50. Mannaris, C., et al. Gas-Stabilizing Gold Nanocones for Acoustically Mediated Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1800184(2018).
  51. Kwan, J. J., et al. Ultrasound-induced inertial cavitation from gas-stabilizing nanoparticles. Physical Review E - Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 92 (2), (2015).
  52. Kwan, J. J., et al. Ultrasound-Propelled Nanocups for Drug Delivery. Small. 11 (39), 5305-5314 (2015).
  53. Mannaris, C., et al. Microbubbles, Nanodroplets and Gas-Stabilizing Solid Particles for Ultrasound-Mediated Extravasation of Unencapsulated Drugs: An Exposure Parameter Optimization Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 45, 954-967 (2019).
  54. Roovers, S., et al. The Role of Ultrasound-Driven Microbubble Dynamics in Drug Delivery: From Microbubble Fundamentals to Clinical Translation. Langmuir. 35, 10173-10191 (2019).
  55. Lentacker, I., Geers, B., Demeester, J., De Smedt, S. C., Sanders, N. N. Design and Evaluation of Doxorubicin-containing Microbubbles for Ultrasound-triggered Doxorubicin Delivery: Cytotoxicity and Mechanisms Involved. Molecular Therapy. 18 (1), 101-108 (2010).
  56. De Cock, I., Lajoinie, G., Versluis, M., De Smedt, S. C., Lentacker, I. Sonoprinting and the importance of microbubble loading for the ultrasound mediated cellular delivery of nanoparticles. Biomaterials. 83, 294-307 (2016).
  57. Roovers, S., et al. Sonoprinting of nanoparticle-loaded microbubbles: Unraveling the multi-timescale mechanism. Biomaterials. 217, 119250(2019).
  58. Carugo, D., et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. 113, 105-117 (2017).
  59. Stride, E. P., Coussios, C. C. Cavitation and contrast: The use of bubbles in ultrasound imaging and therapy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 224 (2), 171-191 (2010).
  60. Stride, E., Coussios, C. Nucleation, mapping and control of cavitation for drug delivery. Nature Reviews Physics. 1, 495-509 (2019).
  61. Dong, Y., et al. Antibiofilm effect of ultrasound combined with microbubbles against Staphylococcus epidermidis biofilm. International Journal of Medical Microbiology. 307 (6), 321-328 (2017).
  62. Van Rooij, T., et al. Vibrational Responses of Bound and Nonbound Targeted Lipid-Coated Single Microbubbles. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (5), 785-797 (2017).
  63. Duan, X., Yu, A. C. H., Wan, J. M. F. Cellular Bioeffect Investigations on Low-Intensity Pulsed Ultrasound and Sonoporation: Platform Design and Flow Cytometry Protocol. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (9), 1422-1434 (2019).
  64. Hu, Y., Wan, J. M. F., Yu, A. C. H. Membrane Perforation and Recovery Dynamics in Microbubble-Mediated Sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  65. Carugo, D., Owen, J., Crake, C., Lee, J. Y., Stride, E. Biologicallyand acoustically compatible chamber for studying ultrasound-mediated delivery of therapeutic compounds. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (7), 1927-1937 (2015).
  66. Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterisation of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12 (3), 034109(2018).
  67. Fan, Z., Liu, H., Mayer, M., Deng, C. X. C. X. Spatiotemporally controlled single cell sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16486-16491 (2012).
  68. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2016).
  69. Helfield, B. L., Chen, X., Qin, B., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Mechanistic Insight into Sonoporation with Ultrasound-Stimulated Polymer Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (11), 2678-2689 (2017).
  70. Aron, M., Vince, O., Gray, M., Mannaris, C., Stride, E. Investigating the Role of Lipid Transfer in Microbubble-Mediated Drug Delivery. Langmuir. 35 (40), 13205-13215 (2019).
  71. Kinsler, L. E., Frey, A. R., Coppens, A. B., Sanders, J. V. Fundamentals of Acoustics, 4th Edition. , Wiley. ISBN: 0-471-84789-5 (2000).
  72. Wear, K. A. Considerations for Choosing Sensitive Element Size for Needle and Fiber-Optic Hydrophones-Part I: Spatiotemporal Transfer Function and Graphical Guide. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (2), 318-339 (2019).
  73. Stoica, P., Moses, R. Spectral Analysis of Signals. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2005).
  74. Lyka, E., Coviello, C., Kozick, R., Coussios, C. C. Sum-of-harmonics method for improved narrowband and broadband signal quantification during passive monitoring of ultrasound therapies. Journal of the Acoustical Society of America. 140 (1), 741-754 (2016).
  75. Barrack, T., Stride, E. Microbubble Destruction During Intravenous Administration: A Preliminary Study. Ultrasound in Medicine and Biology. 35 (3), 515-522 (2009).
  76. Apfel, R. E. Acoustic cavitation. Methods in Experimental Physics. 19, 355-411 (1981).
  77. Mulvana, H., Stride, E., Tang, M. X., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. The Influence of Gas Saturation on Microbubble Stability. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (6), 1097-1100 (2012).
  78. Mulvana, H., Stride, E., Hajnal, J. V., Eckersley, R. J. Temperature dependent behavior of ultrasound contrast agents. Ultrasound in Medicine and Biology. 36 (6), 925-934 (2010).
  79. Mulvana, H., Eckersley, R. J., Tang, M. X., Pankhurst, Q., Stride, E. Theoretical and Experimental Characterisation of Magnetic Microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (5), 864-875 (2012).
  80. Coviello, C., et al. Passive acoustic mapping utilizing optimal beamforming in ultrasound therapy monitoring. Journal of the Acoustical Society of America. 137 (5), 2573-2585 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Terapia ultrad wi kamipasywna detekcja kawitacjimonitorowanie akustycznemanipulacja mikrop cherzykamiuk ad ekspozycji kom rekcytometria przep ywowamikroskopia fluorescencyjnadostarczanie lek wsonoporacja
Studiowanie terapii wzmocnionej kawitacją
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.