Uzupełnienie aktywności splicingu przez kompleks galektyny-3 - U1 snRNP na kulkach

Summary

Ten artykuł opisuje eksperymentalne procedury (a) zubożenia U1 snRNP z ekstraktów jądrowych, przy jednoczesnej utracie aktywności splicingu; oraz (b) odtworzenia aktywności splicingu w ekstrakcie zubożonym w U1 przez cząstki snRNP galektyny-3 - U1 związane z kulkami kowalencyjnie sprzężonymi z przeciwciałami anty-galektyny-3.

Abstract

Klasyczne eksperymenty z odtwarzaniem zubożenia wskazują, że galektyna-3 jest wymaganym czynnikiem splicingu w ekstraktach jądrowych. W artykule omówiono mechanizm włączenia galektyny-3 do szlaku splicingu. Sedymentacja ekstraktów jądrowych komórek HeLa na gradientach glicerolu 12%-32% daje frakcje wzbogacone w endogenną cząstkę ~10S, która zawiera galektynę-3 i U1 snRNP. Opisujemy teraz protokół zubożenia ekstraktów jądrowych U1 snRNP z jednoczesną utratą aktywności splicingu. Aktywność splicingu w ekstrakcie zubożonym w U1 może być odtworzona przez cząstkę snRNP galektyny-3 - U1 uwięzioną na kulkach agarozy kowalencyjnie sprzężonych z przeciwciałami anty-galektyny-3. Wyniki wskazują, że trójskładnikowy kompleks galektyna-3 - U1 snRNP - pre-mRNA jest funkcjonalnym kompleksem E prowadzącym do półproduktów i produktów reakcji splicingu oraz że galektyna-3 wchodzi na szlak splicingu poprzez asocjację z U1 snRNP. Schemat wykorzystania kompleksów wyselekcjonowanych pod względem powinowactwa lub immunologicznym na kulkach w celu odtworzenia aktywności splicingu w ekstraktach pozbawionych określonego czynnika splicingu może być ogólnie stosowany w innych systemach.

Introduction

Produkcja większości eukariotycznych informacyjnych RNA (mRNA) polega na usunięciu intronów i ligacji eksonów w procesie jądrowym zwanym splicingiem pre-mRNA¹. Dwie klasy kompleksów RNA-białko (RNP) kierują przetwarzaniem preinformacyjnego RNA w dojrzałe mRNA za pośrednictwem kompleksów spliceosomalnych. Jedna klasa, powstające pre-przekaźnikowe RNP, jest tworzona kotranskrypcyjnie przez wiązanie heterogenicznych jądrowych białek RNP i innych białek wiążących RNA, w tym niektórych członków rodziny SR, dając kompleksy hnRNP². Druga klasa, bogate w uracyl małe jądrowe RNP (U snRNP z U1, U2, U4, U5 i U6 snRNA) jest związana z białkami specyficznymi dla U i rdzeniowymi^3,4. U snRNP oddziałują w uporządkowany sposób z określonymi regionami pre-przekaźnikowych RNP w dynamicznym szlaku przebudowy, gdy introny są wycinane, a egzony są ligowane w celu wytworzenia dojrzałych mRNPs⁵. Wiele dodatkowych białek jądrowych uczestniczy w tych zdarzeniach przetwarzania⁶.

Galektyna-1 (Gal1) i galektyna-3 (Gal3) to dwa białka, które są wymaganymi czynnikami w szlaku splicingu, jak wykazały badania nad deplecją-rekonstytucją^7,8. Usunięcie obu galektyn z splicing właściwych ekstraktów jądrowych (NE) znosi aktywność składania i splicingu spliceosomów na wczesnym etapie. Dodanie którejkolwiek z galektyny do takiego podwójnie zubożonego NE przywraca obie czynności. Gal1 i Gal3 są składnikami aktywnych spliceosomów, o czym świadczy swoista immunoprecypitacja pre-mRNA, półproduktów splicingu i dojrzałego mRNA przez surowicę specyficzną dla Gal1 lub Gal3⁹. Co ważne, Gal3 wiąże się z endogennymi cząstkami U snRNA zawierającymi w NE poza szlakiem splicingu, jak pokazano przez wytrącanie snRNP przez antysurowicę anty-Gal3 antissur¹⁰. Wreszcie, wyciszenie Gal3 w komórkach HeLa zmienia wzorce splicingu wielu genów¹¹.

W NE wstępnie inkubowanym w celu demontażu wstępnie uformowanych spliceosomów¹², snRNP znajdują się w wielu kompleksach sedymentujących w gradientach glicerolu od 7S do ponad 60S. Chociaż frakcjonowanie gradientu glicerolu jest powszechną techniką izolacji kompleksów i składników spliceosomalnych (patrz referencje^13,14,15 na przykład), rozszerzyliśmy tę metodę, charakteryzując określone frakcje za pomocą immunoprecypitacji przeciwciał. Sedymentacja snRNP w 10S zawiera tylko U1 snRNA wraz z Gal3. Immunoprecypitacja frakcji 10S surowicami odpornościowymi specyficznymi dla Gal3 lub U1 snRNP powoduje współwytrącanie zarówno U1, jak i Gal3, co wskazuje, że niektóre z monocząstek U1 snRNP są związane z Gal3¹⁰. Ponieważ U1 snRNP jest pierwszym kompleksem, który wiąże się z pre-mRNP w spliceosomal assembly^1,5, ten krok reprezentuje potencjalne miejsce wejścia Gal3 do ścieżki splicingu. Na tej podstawie wykazaliśmy, że monocząstki 10S Gal3-U1 snRNP związane z kulkami zawierającymi anty-Gal3 przywróciły aktywność splicingu do U1 snRNP zubożonego w Ne, ustanawiając ten kompleks jako jeden z mechanizmów, za pomocą którego Gal3 jest rekrutowany do szlaku spliceosomalnego¹⁶. Kontrastuje to z próbami wyizolowania spliceosomów na określonych etapach reakcji splicingu i katalogowania powiązanych czynników^17,18. W takich badaniach stwierdza się obecność pewnych czynników w pewnym momencie czasu, ale nie mechanizm, za pomocą którego zostały one załadowane.

Wcześniej szczegółowo opisaliśmy przygotowanie NE, substrat do splicingu, montaż mieszaniny reakcyjnej splicingu oraz analizę produktów w naszej dokumentacji dotyczącej roli galektyn w splicingu pre-mRNA¹⁹. Opisujemy teraz eksperymentalne procedury frakcjonowania ekstraktów jądrowych w celu otrzymania frakcji wzbogaconej w kompleks Gal3 - U1 snRNP oraz selekcji immunologicznej tego ostatniego kompleksu w celu odtworzenia aktywności splicingowej w ekstrakcie jądrowym zubożonym w U1.

Rysunek 1: Schemat ideowy ilustrujący komplementarność aktywności splicingu w ekstrakcie jądrowym zubożonym w U1 snRNP przez kompleks Gal3-U1 snRNP na koralikach. (A) NE w buforze C (NE(C)) jest inkubowany z kulkami białka A-sefarozy kowalencyjnie sprzężonymi z anty-U1 snRNP (kulki αU1). Frakcja niezwiązana jest pozbawiona U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE w buforze D (NE(D)) jest frakcjonowany w gradiencie glicerolu 12%-32% przez ultrawirowanie. Frakcje odpowiadające regionowi 10S (frakcje 3-5) są łączone i mieszane z kulkami kowalencyjnie sprzężonymi z przeciwciałami anty-Gal3 (kulki αGal3). Materiał związany z kulkami zawiera monocząstkę Gal3-U1 snRNP. (C) Kompleks Gal3-U1 snRNP z części (B) miesza się z U1ΔNE z części (A) w teście splicingu przy użyciu ³²znakowanych P substratów pre-mRNA MINX, a produkty pośrednie i produkty reakcji splicingu są analizowane za pomocą elektroforezy żelowej i autoradiografii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

1. Uwagi o ogólnych procedurach

1. Upewnij się, że wszystkie substancje chemiczne (składniki buforowe, enzymy itp.) są wolne od rybonukleazy (RNazy). Odsekwestruj wszystkie zakupione komercyjnie butelki z odczynnikami do ogólnego użytku laboratoryjnego. Nosić rękawice na wszystkich etapach procedury eksperymentalnej. Używaj wyłącznie szklanych naczyń i przyborów kuchennych, które zostały upieczone (patrz krok 1.2 poniżej) oraz roztworów, które zostały poddane wstępnej obróbce (patrz krok 1.3 poniżej).
2. Piec wszystkie szklane naczynia (zlewki, kolby, butelki, pipety itp.) przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 177 °C. Zawiń inne przybory (szpatułki, mieszadła itp.) w folię aluminiową przed pieczeniem w tych samych warunkach.
3. Przygotować 0,1% (obj./obj.) roztwór dietylopirowęglanu (DEPC) w wodzie podwójnie destylowanej (_ddH2O). Za pomocą mieszadła magnetycznego mieszaj ten roztwór przez noc, a następnie autoklaw. Użyj tego H₂O poddanego działaniu DEPC, aby przygotować wszystkie roztwory zawierające Tris; Następnie wysterylizuj filtr za pomocą filtra próżniowego od butelki. Użyj zwykłego ddH₂O do przygotowania wszystkich innych roztworów (bez Tris); następnie potraktuj DEPC (0,1%, obj./obj.) i autoklaw.
   UWAGA: stosowane w poniższym zestawie procedur doświadczalnych są wymienione alfabetycznie w tabeli 1.

Nazwa bufora	kompozycja
Bufor boranowy	0,2 M boran sodu, pH 9
Bufor C	20 mM HEPES, pH 7,9, 25% (obj./obj.) glicerol, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), 0,5 mM ditiotreitol (DTT)
Bufor D	10 mM HEPES, pH 7,9, 20% (obj.) glicerol, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM naziemna telewizja cyfrowa
60%D	60% bufor D i 40%H2O
Etanoloaminy	0,2 M etanoloamina, pH 8
Bufor wiązania HEPES	20 mM HEPES, pH 7,9
Bufor płuczący HEPES	20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M NaCl
Bufor ładujący RNA	90% formamidu, 20 mM EDTA, pH 8, 0,05% (w/v) błękit bromofenolowy
Bufor SDS-PAGE	25 mM Tris, 169 mM glicyna, 0,1% dodecylosiarczan sodu (SDS), pH 8,8
Bufor próbki SDS	62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 5% 2-merkaptoetanol, 0,1% (w/v) błękit bromofenolowy
Bufor TBE do żeli RNA	89 mM Tris, 89 mM kwas borowy, 2,5 mM EDTA, pH 8,3
Bufor TE	10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA
Bufor transferowy	25 mM Tris, 1,92 M glicyna, 20% metanolu, pH 8,3
Bufor T-TBS	10 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,5
Bufor myjący TX	0,05% Triton X-100 (TX) w 60%D

Tabela 1: Nazwa i skład

2. Przygotowanie NE zubożonego w U1 snRNP (U1 ΔNE)

1. Przygotowanie kulek anty-U1 do immunoadsorpcji
   1. Wstępnie pęcznieje 50 mg kulek białkowych A-sefarozy CL-4B w nadmiarze 2Opoddanego działaniu DEPC, aby wytworzyć około 200 μl spęczniałych kulek, a następnie przemyć w buforze do płukania HEPES.
   2. Dla tego płukania i wszystkich następnych płukań granulki należy zagnieździć przez odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s) i usunąć niezwiązany płyn za pomocą mikropipetora i wyrzucić.
   3. Zmieszać 150 μl przemytych kulek ze 150 μl ludzkiej surowicy autoimmunologicznej swoistej dla U1 snRNP (objętość przeciwciała do objętości kulek w stosunku 1:1).
   4. Dostosować, na podstawie całkowitej objętości (~300 μL od kroku 2.1.3 powyżej), mieszaninę do 20 mM HEPES, pH 7,9, odpowiadającego warunkom buforu wiążącego HEPES; inkubować tę mieszaninę z ciągłym kołysaniem w temperaturze pokojowej przez 60 minut.
   5. Przemyć kulki związane przeciwciałami 1 ml buforu boranowego (0,2 M boranu sodu, pH 9) i ponownie zawiesić w 1 ml tego samego buforu boranowego.
   6. Aby kowalencyjnie sparować przeciwciało związane z kulkami białka A-sepharozy, dodaj dimetylopimelimidat do końcowego stężenia 20 mM i inkubuj w temperaturze pokojowej z kołysaniem przez 60 minut.
   7. Przemyć kulki 1 ml buforu boranowego.
   8. Aby zablokować nieprzereagowany odczynnik sieciujący, dodaj 1 ml 0,2 M etanoloaminy (pH 8) i inkubuj w temperaturze pokojowej z kołysaniem przez 60 minut.
   9. Przemyć kulki sprzężone z przeciwciałami, zwane dalej kulkami anty-U1, dwukrotnie 0,5 ml buforu do przemywania TX (0,05% Triton X-100 w 60% D).
2. Zubożenie U1 snRNP w stosunku do NE (patrz Rysunek 1A)
   UWAGA: Procedura przygotowania NE z komórek HeLa została początkowo opracowana przez Dignam et al.²⁰. Opisaliśmy materiały i szczegółowe metody przygotowania NE do testów splicingu¹⁹ (patrz kroki 2.1 i 3.1 tego odniesienia). NE, w pierwotnym brzmieniu, znajduje się w buforze C i będzie dalej oznaczany jako NE(C). NE(C) dializowany i równoważony buforem D będzie oznaczony jako NE(D).
   1. Inkubować 200 μl NE(C) ze 100 μl kulek anty-U1 z kroku 2.1.9 powyżej.
   2. Do mieszaniny dodać 5 μl RNasin.
   3. Obracać mikrorurkę od głowy do ogona w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
   4. Mieszaninę należy obrabiać przez odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s) i zebrać niezwiązany materiał (U1ΔNE) za pomocą strzykawki Hamiltona.
   5. Dializować całą objętość U1ΔNE, wraz z oddzielną 50 μl podwielokrotnością pierwotnego niezubożonego NE(C), w oddzielnych komorach mikrodializatora, mieszając, przez 75 minut w stosunku do 60% D, używając membrany dializacyjnej z odciętą masą cząsteczkową 8 K.
   6. Bezpośrednio po dializie należy podzielić te preparaty (U1ΔNE i NE w 60% D) na 20 μl podwielokrotności, a następnie zamrozić w kąpieli suchego lodu i etanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Analiza zawartości RNA i białka w U1ΔNE i materiale związanym na kulkach anty-U1
   1. Po usunięciu niezwiązanego materiału (U1ΔNE) (krok 2.2.4) należy przepłukać materiał związany z kulkami anty-U1, dodając 0,5 ml buforu do przemywania TX. Mieszaninę osadzić przez odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s), usunąć supernatant za pomocą mikropipetora i wyrzucić.
   2. Powtórzyć kroki prania 2.3.1 dwukrotnie.
   3. Usunąć materiał związany z kulkami anty-U1, dodając 100 μl buforu do próbki 2x SDS do 100 μl kulek i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Mieszaninę osadzić przez odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s); usunąć supernatant za pomocą strzykawki Hamiltona i zamrozić w kąpieli suchego lodu i etanolu. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
   5. Porównać niezubożony NE, zubożony NE (U1ΔNE) i materiał związany z kulkami (usunięty z kulek za pomocą bufora próbki SDS, jak opisano w krokach 2.3.3 i 2.3.4 powyżej). Wykonaj kroki 2.3.6-2.3.8 w przypadku analizy RNA lub kroki 2.3.9-2.3.10 w przypadku analizy białek.
   6. Dla każdej próbki ekstrahować RNA za pomocą 200 μl chloroformu fenolowego (50:50, v/v), a następnie ponownie ekstrahować 180 μl alkoholu chloroformowo-izoamylowego (25:1, v/v). Po ekstrakcji dodać 300 μl zimnego 200-procentowego etanolu, odwrócić do wymieszania i przechowywać wytrącone RNA przez noc w temperaturze -20 °C.
   7. Odwirować RNA wytrącone etanolem (12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C). Umyj granulki 150 μl zimnego 70% etanolu. Ponownie odwirować (12 000 x g) w temperaturze 4 °C przez 15 min. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety i suszyć granulki w odkurzaczu przez 10-15 minut bez podgrzewania.
   8. Wysuszony osad RNA zawiesić ponownie w 10 μl buforu ładującego RNA, delikatnie wirować, podgrzewać do temperatury 75-85 °C przez 90 s, a następnie inkubować na lodzie przez 2 min. Oddzielić snRNA za pomocą elektroforezy żelowej (2 h przy 16 mA) przez 13% poliakryloamid - 8,3 M żele mocznikowe, a następnie zabarwić bromkiem etydyny lub poddać northern blotting^{10, 16}.
   9. Załadować próbki białek do bufora próbek SDS z kroku 2.3.5 na 12,5% żele poliakrylamidowe i elektroforę pod napięciem 200 V przez około 45-50 minut do buforu SDS-PAGE (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu).
   10. Przenieść oddzielone białka do membrany nitrocelulozowej pod ciśnieniem 400 mA przez 2 godziny w buforze transferowym. Po przeniesieniu zablokuj błonę, inkubując przez noc w T-TBS zawierającym 10% odtłuszczonego mleka w proszku. Następnie poddaj błonę immunoblotowi, aby odsłonić określone białka^8,21.

3. Immunoprecypitacja frakcji 10S gradientów glicerolu przez anty-Gal3

1. Przygotowanie kulek anty-Gal3 do immunoadsorpcji
   UWAGA: Wyprowadzenie i charakterystyka poliklonalnych surowic odpornościowych królika przeciwko Gal3 dla królika #24²¹ i dla królika #49¹⁰ zostały opisane wcześniej.
   1. Użyj surowicy przedimmunologicznej od królika #49 jako kontroli.
   2. W celu przygotowania kulek anty-Gal3 postępuj zgodnie z procedurą opisaną wcześniej dla przygotowania kulek anty-U1 (krok 2.1), z wyjątkiem tego, że odpowiadając krokowi 2.1.3, stosunek surowicy (np. anty-Gal3, #49) do kulek wynosi 3:1.
   3. Tuż przed użyciem przemyj dwukrotnie kulki sprzężone z przeciwciałami, zwane dalej kulkami anty-Gal3, 0,5 ml buforu do płukania TX. Usunąć supernatant, najpierw za pomocą mikropipetora, aby usunąć większość płynu, a następnie za pomocą strzykawki Hamiltona, aby usunąć płyn z kulek; odrzucić.
2. Immunoprecytaton frakcji gradientu glicerolu przez anty-Gal3 (patrz Rysunek 1B)
   1. Frakcjonować NE(D) w gradiencie glicerolu 12%-32%¹⁰. Połącz i wymieszaj frakcje gradientu glicerolu 3, 4 i 5 (ponumerowane od góry gradientu), które znajdują się w pobliżu obszaru 10S gradientu.
   2. Przygotować dwie próbki, każda zawierająca 150 μl podwielokrotności połączonych frakcji gradientowych 3-5 (etap 3.2.1) i umieścić w 50 μl kulek anty-Gal3.
   3. Równolegle przygotuj dwie próbki, każda o objętości 150 μl frakcji 1 (zawierającej Gal3 nie będący w kompleksie z U1 snRNP¹⁰; krok 3.2.1) i umieść w 50 μl kulek anty-Gal3.
   4. Jako kontrolę umieść 150 μl 60% D w innej mikroprobówce z kulkami anty-Gal3 o pojemności 50 μl.
   5. Delikatnie wymieszaj, stukając w probówkę, a następnie obracaj mikroprobówkę głową nad ogonem w temperaturze 4^°C przez 1 godzinę.
   6. Mieszaninę granulować przez delikatne odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s).
   7. Usunąć supernatant (niezwiązany materiał) za pomocą strzykawki Hamiltona. Nie myć kulek i użyć natychmiast w celu dodania reakcji splicingu (punkt 4.2).
3. Analiza zawartości RNA i białka w materiale niezwiązanym i związanym z wytrącania anty-Gal3 frakcji gradientu 10S
   1. Do analizy składników związanego i niezwiązanego materiału z wytrącania anty-Gal3 frakcji gradientu 10S, zebrać niezwiązany materiał (supernatant po kroku 3.2.6), przenieść do świeżej mikroprobówki i zamrozić w temperaturze -20 °C.
   2. Przemyć wytrącone kulki z kroku 3.2.6 (zawierające materiał związany z anty-Gal3) przez dodanie 0,5 ml buforu do przemywania TX.
   3. Mieszaninę osadzić przez delikatne odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s); usunąć supernatant za pomocą mikropipetora i wyrzucić. Powtórz kroki prania jeszcze dwa razy.
   4. Dodać 50 μl buforu do próbki 2X SDS do przemytych i granulowanych kulek anty-Gal3.
   5. Delikatnie wymieszaj kulki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Mieszaninę należy zagnieździć przez delikatne odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s), zebrać supernatant za pomocą strzykawki Hamilton i przechowywać w świeżej mikroprobówce w temperaturze -20 °C.
   7. Porównać materiał niezwiązany (sekcja 3.3.1) i materiał związany (etap 3.3.6) wytrącania anty-Gal3 pod względem RNA i składników białkowych, stosując procedury opisane odpowiednio w krokach 2.3.6 do 2.3.10.

4. Montaż reakcji splicingu i analiza produktów

1. Przygotowanie podłoża do łączenia wstęg
   UWAGA: Substrat pre-mRNA, oznaczony jako MINX, zawiera dwie sekwencje eksonów i jedną sekwencję intronową z klasy Adenovirus²². Sekwencja DNA MINX w plazmidzie jest pod kontrolą promotorów polimerazy RNA T3, T7 lub SP6. Materiały i szczegółowe metody linearyzacji plazmidowego DNA MINX za pomocą endonukleazy restrykcyjnej BamHI, transkrypcji przez polimerazę RNA SP6 w obecności ^α-32P[GTP] oraz oczyszczania ³²znakowanych P MINX do testów splicingu opisano wcześniej¹⁹ (patrz kroki 2.2 i 3.2 tego odniesienia).
   1. Znakowany radioizotopowo MINX należy przechowywać jako osad etanolu w temperaturze -20 °C; zużyć znakowany substrat do splicingu w ciągu 4-6 tygodni po transkrypcji.
   2. Tuż przed użyciem odwirować wytrącony etanolem ³²MINX znakowany P w temperaturze 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; usunąć supernatant za pomocą mikropipetora i wyrzucić.
   3. Dodać 150 μl 70% etanolu i odwirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant i suszyć osad w próżni bez podgrzewania przez 15 minut.
   4. Ponownie uwodnić granulat w 50 μl wody DEPC. Umieścić 2 μl na każdym z dwóch filtrów GF/C; zanurzyć filtry w zimnym 5% kwasie trichlorooctowym (TCA) na 10 minut. Spłukać zimnym 5% TCA, a następnie 180-procentowym etanolem na kolbie próżniowej. Wysuszyć filtry na powietrzu i poddać zliczaniu scyntylacyjnemu w 4 ml Safety-Solve.
   5. Rozcieńczyć ³²MINX znakowany P w 60% D do 10⁴ cpm/μL do testu splicingu.
2. Montaż reakcji splicingu (patrz Rysunek 1C)
   1. Zbierz na lodzie reakcje splicingu w całkowitej objętości 24 μL (8 μL U1ΔNE (od kroku 2.2.6), 3,5 mM MgCl_2, 1,5 mM ATP, 20 mM fosforanu kreatyny, 0,5 mM DTT, 20 jednostek RNasin, 4 μL ³²substratu do łączenia MINX znakowanego P (10⁴ cpm/μL), 60% D) i dodaj do każdej probówki kulek z sekcji 3.2.7. Zebrać identyczny zestaw reakcji splicingu w całkowitej objętości 24 μl, ale bez U1ΔNE i dodać do każdej probówki kulki z kroku 3.2.7.
   2. Przygotować kontrolną reakcję splicingu w 12 μL całkowitej objętości (4 μL NE(D), 3,5 mM MgCl₂, 1,5 mM ATP, 20 mM fosforanu kreatyny, 0,5 mM DTT, 20 jednostek RNasin, 2 μL ³²znakowanego P substratu do łączenia MINX (10⁴ cpm / μL), 60% D).
   3. Delikatnie wymieszać probówki, stukając i obracając od końca do ogona w temperaturze 30^°C przez 90 minut. Mieszaninę osadzać przez delikatne odwirowanie w temperaturze 1 000 x g w kołyszącym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s.
   4. Zatrzymać reakcję i wymyć białka z kulek, dodając 24 μl buforu do próbek 2x SDS do probówek zawierających kulki i 12 μl buforu do próbki 2x SDS do probówki kontrolnej zawierającej NE, ale bez kulek. Podgrzewać rurki w temperaturze 100 °C przez 7 minut.
   5. Delikatnie odwirować probówki przy 1.000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s.
   6. Przenieść supernatanty (elutiony) do świeżych mikroprobówek: około 48 μl z probówek z kulkami i 24 μl z probówki kontrolnej NE.
   7. Dodać proteinazę K (20 mg/ml) w celu strawienia i rozpuszczenia białek: dodać 5 μl do 48 μl elucji z kulek i dodać 2,5 μl do 24 μl kontroli NE.
   8. Inkubować probówki w temperaturze 37^°C przez 40 minut.
   9. Delikatnie odwirować probówki o sile 1.000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10 s.
   10. Rozcieńczyć elutiony kulek 39,5 μl TE i 10 μl 3 M octanu sodu. Rozcieńczyć kontrolę NE 63,5 μl TE i 10 μl 3 M octanu sodu.
   11. Wyodrębnij i przeanalizuj RNA zgodnie z opisem poniżej (sekcja 4.3).
3. Analiza produktów reakcji splicingu
   1. Ekstrahować RNA w każdej próbce chloroformem fenolowym, a następnie alkoholem chloroformowo-izoamylowym; wytrącić RNA etanolem, odwirować, umyć granulki, usunąć supernatant i wysuszyć granulki zgodnie z tą samą procedurą, jak opisano w krokach 2.3.6 i 2.3.7.
   2. Wysuszony osad RNA zawiesić ponownie w 10 μl buforu ładującego RNA, delikatnie wirować, podgrzewać do 75-85 °C przez 90 s, a następnie inkubować na lodzie przez 2 minuty.
   3. Przygotować 20 ml roztworu zawierającego 13% poliakrylamidu (bisakryloamid: akrylamid, 1,9:50 [wag./wag]) w 8,3 M moczniku; rozlać żele o długości 15 cm, używając tego roztworu.
   4. Po odlaniu żelu należy go poddać elektroforezie (bez załadowanych próbek) pod napięciem 400 V przez 20 minut, używając TBE jako bufora bieżącego. Po tym kroku umyj studzienki buforem do pracy TBE.
   5. Załadować próbki RNA do buforu ładującego RNA i elektroforezy z buforem TBE pracującym pod napięciem 400 V przez 3,5 do 4 godzin. Po elektroforezie usunąć mocznik, zanurzając i obracając żel w wodzie destylowanej na 10 minut.
   6. Suszyć próżniowo żel na bibule filtracyjnej o długości 3 M, najpierw przez 2 godziny i 15 minut w temperaturze 80 °C, a następnie przez 30 minut bez podgrzewania, aby powoli schłodzić. Poddać wysuszony żel autoradiografii na kliszy w celu wykrycia pozycji migracji składników promieniotwórczych.

Results

NE pozbawiony U1 snRNP (U1ΔNE z sekcji 2.2.6) i kompleksy snRNP Gal3 - U1 z regionu 10S gradientu glicerolu immunoprecypitowanego przez anty-Gal3 (krok 3.2.7) zostały zmieszane w reakcji splicingu. Ta mieszanina reakcyjna zawierała U1 snRNA (Figura 2A, linia 3), a także białko specyficzne dla U1, U1-70K (Figura 2B, pas ruchu 3). Zgodnie z oczekiwaniami, anty-Gal3 wytrącił Gal3 (Rysunek 2B, pas 3). Składniki te (U1 snRNA, białko U...

Discussion

Raport ten zawiera szczegóły eksperymentalne, które dokumentują, że kompleks snRNP Gal3 - U1 uwięziony na kulkach pokrytych anty-Gal3 może wiązać się z substratem pre-mRNA, a ten trójskładnikowy kompleks może przywrócić aktywność splicingową do NE, zubożonego w U1 snRNP. Gal3 jest jednym z członków rodziny białek pierwotnie wyizolowanych na podstawie specyficznej dla galaktozy aktywności wiązania węglowodanów²³. Wczesne badania immunofluorescencji i frakcjonowania subkomórkowego dostarczyły wstępn...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anty-U1 snRNP	Miejsce wiązania	Hu ENA-RNP #33471	ludzka surowica autoimmunologiczna specyficzna dla filtra próżniowego do butelki U1 snRNP
	Fisher Scientific	Corning 431153 (0,22 μ m; PES 150 ml)	do filtrowania roztworów zawierających
wirówkę	International Equipment Company	IEC Model PR-6	do granulowania kulek sepharose w immunoprecypitacji
dietylowęglan (DEPC)	Sigma-Aldrich	159220-5G	do uzdatniania wody używanej do przygotowania wszystkich roztworów
dimetylopimelimidat (DMP)	Sigma-Aldrich	80490-5G	do sieciowania przeciwciała przeciwko komórce elektroforetycznej z kulkami sefalozy
	BioRad Laboratories, Inc	Mini-Protean II	do SDS-PAGE separacji białek
etanoloaminy	Sigma-Aldrich	411000-100ml	do blokowania po reakcji sieciowania
system elektroforezy żelowej	Hoefer, Inc	HSI SE 500	Series do separacji snRNA za pomocą żelowej płyty żelowej do elektroforezy
suszarka	BioRad	Model 224	do suszenia płyt żelowych do autoradiografii
Membrana Hybond ECL	GE Healthcare	RPN3032D (0,2 μ m; 30 cm x 3 m)	do immunoblottingu białek na
mikrodializatorze błonowym (12 x 100 μ l pojemność próbki)	System	mikrodializatora Pierce 100	do wymiany buforu ekstraktu jądrowego
membrany mikrodializatora (odcięcie 8K)	Pierce	66310	do wymiany buforu ekstraktu jądrowego
beztłuszczowe mleko w proszku	Spartan Stores	Spartan Instant Beztłuszczowe mleko
Białko A Sepharose CL-4B	Millipore-Sigma	GE 17-0780-01	do sprzęgania przeciwciała z kulkami
Proteinaza K	Millipore-Sigma	P2308-5mg	do zatrzymywania reakcji splicingu w celu wyizolowania RNA
RNasin	Promega	N2111	do hamowania aktywności
rybonukleazywahacz/rotator	Lab Industries, Inc	Labquake Shaker 400-110	do mieszania roztworów białkowych w reakcjach sprzęgania i immunoprecypitacji
Safety-Solve	Research Products International Corp.	Nr 111177	koktajl scyntylacyjny do oznaczania promieniotwórczości w
liczniku scyntylacyjnym	Beckman Instruments	LS6000SC	licznik scyntylacyjny do oznaczania radioaktywności
Szybki koncentrator próżniowy	Savant	SVC 100H	do suszenia granulek RNA wytrąconych etanolem
Jednostka do elektroforezy transforowej	Hoefer, Inc	Hoefer TE Series Transphor	do przenoszenia białek z SDS-PAGE do błony bibułkowej