Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Uzupełnienie aktywności splicingu przez kompleks galektyny-3 - U1 snRNP na kulkach

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61990

⸱

9 grudnia 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje eksperymentalne procedury (a) zubożenia U1 snRNP z ekstraktów jądrowych, przy jednoczesnej utracie aktywności splicingu; oraz (b) odtworzenia aktywności splicingu w ekstrakcie zubożonym w U1 przez cząstki snRNP galektyny-3 - U1 związane z kulkami kowalencyjnie sprzężonymi z przeciwciałami anty-galektyny-3.

Streszczenie

Klasyczne eksperymenty z odtwarzaniem zubożenia wskazują, że galektyna-3 jest wymaganym czynnikiem splicingu w ekstraktach jądrowych. W artykule omówiono mechanizm włączenia galektyny-3 do szlaku splicingu. Sedymentacja ekstraktów jądrowych komórek HeLa na gradientach glicerolu 12%-32% daje frakcje wzbogacone w endogenną cząstkę ~10S, która zawiera galektynę-3 i U1 snRNP. Opisujemy teraz protokół zubożenia ekstraktów jądrowych U1 snRNP z jednoczesną utratą aktywności splicingu. Aktywność splicingu w ekstrakcie zubożonym w U1 może być odtworzona przez cząstkę snRNP galektyny-3 - U1 uwięzioną na kulkach agarozy kowalencyjnie sprzężonych z przeciwciałami anty-galektyny-3. Wyniki wskazują, że trójskładnikowy kompleks galektyna-3 - U1 snRNP - pre-mRNA jest funkcjonalnym kompleksem E prowadzącym do półproduktów i produktów reakcji splicingu oraz że galektyna-3 wchodzi na szlak splicingu poprzez asocjację z U1 snRNP. Schemat wykorzystania kompleksów wyselekcjonowanych pod względem powinowactwa lub immunologicznym na kulkach w celu odtworzenia aktywności splicingu w ekstraktach pozbawionych określonego czynnika splicingu może być ogólnie stosowany w innych systemach.

Wprowadzenie

Produkcja większości eukariotycznych cząsteczek mRNA (matrycowego RNA) obejmuje usuwanie intronów i ligację eksonów w procesie jądrowym zwanym splicingiem pre-mRNA1. Dwie klasy kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP) kierują przetwarzaniem pre-mRNA w dojrzałe mRNA za pośrednictwem kompleksów spliceosomalnych. Pierwsza klasa, rodzące się pre-mRNA RNP, powstaje w sposób kotranskrypcyjny poprzez wiązanie białek heterogennych jądrowych RNP oraz innych białek wiążących RNA, w tym niektórych członków rodziny SR, co prowadzi do powstania kompleksów hnRNP2. Druga klasa, bogate w uracyl małe jądrowe RNP (U snRNP z snRNA U1, U2, U4, U5 i U6), wiąże się z białkami specyficznymi dla U oraz białkami rdzeniowymi3,4. U snRNP oddziałują w uporządkowany sposób ze specyficznymi regionami pre-mRNA RNP w dynamicznej ścieżce przebudowy, podczas gdy introny są wycinane, a eksony ligowane w celu wytworzenia dojrzałych mRNP5. W tych procesach przetwarzania uczestniczy wiele dodatkowych białek jądrowych6.

Galektyna-1 (Gal1) i galektyna-3 (Gal3) są dwoma białkami, które, jak wykazały badania z usunięciem i rekonstytucją, stanowią niezbędne czynniki w ścieżce splicingu7,8. Usunięcie obu galektyn z wydobyć jądrowych (NE) zdolnych do splicingu znosi montaż spliceosomu oraz aktywność splicingu na wczesnym etapie. Dodanie którejkolwiek z galektyn do takiego podwójnie uszczuplonego NE przywraca obie te aktywności. Gal1 i Gal3 są komponentami aktywnych spliceosomów, o czym świadczy swoista immunoprecypitacja pre-mRNA, produktów pośrednich splicingu oraz dojrzałego mRNA za pomocą antyserum specyficznego dla Gal1 lub Gal39. Co istotne, Gal3 wiąże się z endogennymi cząsteczkami zawierającymi U snRNA w NE poza ścieżką splicingu, co wykazano poprzez precypitację snRNP za pomocą antyserem anty-Gal310. Wreszcie, wyciszenie Gal3 w komórkach HeLa zmienia wzorce splicingu licznych genów11.

W ekstraktach jądrowych (NE) poddanych preinkubacji w celu rozmontowania wcześniej powstałych spliceosomów12, snRNP występują w wielu kompleksach sedymentujących w gradientach glicerolu od 7S do ponad 60S. Choć frakcjonowanie w gradiencie glicerolu jest powszechną techniką izolacji kompleksów i komponentów spliceosomalnych (patrz np. referencje13,14,15), rozszerzyliśmy tę metodę poprzez charakteryzację specyficznych frakcji za pomocą immunoprecypitacji z przeciwciałami. snRNP sedymentujący przy 10S zawiera wyłącznie U1 snRNA wraz z Gal3. Immunoprecypitacja frakcji 10S z antyserami specyficznymi dla Gal3 lub U1 snRNP powoduje współwytrącanie zarówno U1, jak i Gal3, co wskazuje, że niektóre mon cząsteczki U1 snRNP są związane z Gal310. Ponieważ U1 snRNP jest pierwszym kompleksem, który wiąże się z pre-mRNP podczas składania spliceosomu1,5, etap ten stanowi potencjalny punkt wejścia Gal3 do szlaku splicingu. Na tej podstawie wykazaliśmy, że mon cząsteczki 10S Gal3-U1 snRNP związane z kuleczkami zawierającymi anty-Gal3 przywracały aktywność splicingu w NE pozbawionym U1 snRNP, co potwierdza, że kompleks ten jest jednym z mechanizmów rekrutacji Gal3 do szlaku spliceosomalnego16. Kontrastuje to z próbami izolacji spliceosomów na określonych etapach reakcji splicingu i katalogowania powiązanych z nimi czynników17,18. W takich badaniach stwierdza się obecność pewnych czynników w konkretnym punkcie czasowym, ale nie mechanizm ich ładowania.

Wcześniej szczegółowo opisaliśmy przygotowanie NE, substratu do splicingu, skład mieszaniny reakcyjnej splicingu oraz analizę produktów w naszej dokumentacji dotyczącej roli galektyn w splicingu pre-mRNA19. Opisujemy teraz procedury eksperymentalne dotyczące frakcjonowania ekstraktów jądrowych w celu uzyskania frakcji wzbogaconej w kompleks Gal3 - U1 snRNP oraz immunoselekcji wspomnianego kompleksu w celu reconstitui aktywności splicingu w ekstrakcie jądrowym pozbawionym U1.

Schemat rekonstrukcji splicingu z użyciem U1 snRNP, interakcji Gal3, frakcjonowania w gradiencie glicerolu.
Rycina 1: Schemat ilustrujący komplementację aktywności splicingu w ekstrakcie jądrowym pozbawionym U1 snRNP za pomocą kompleksu Gal3-U1 snRNP na koralikach. (A) Ekstrakt jądrowy (NE) w buforze C (NE(C)) inkubuje się z koralikami Protein A-Sepharose kowalencyjnie sprzężonymi z przeciwciałem przeciwko U1 snRNP (koraliki αU1). Frakcja niezwiązana jest pozbawiona U1 snRNP (U1ΔNE). (B) Ekstrakt jądrowy w buforze D (NE(D)) jest frakcjonowany w gradiencie glicerolu 12%-32% za pomocą ultrawirowania. Frakcje odpowiadające regionowi 10S (frakcje 3-5) są łączone i mieszane z koralikami kowalencyjnie sprzężonymi z przeciwciałami przeciwko Gal3 (koraliki αGal3). Materiał związany z koralikami zawiera monopartykułę Gal3-U1 snRNP. (C) Kompleks Gal3-U1 snRNP z części (B) miesza się z U1ΔNE z części (A) w teście splicingu z wykorzystaniem substratu pre-mRNA MINX znakowanego 32P, a produkty i produkty pośrednie reakcji splicingu analizuje się za pomocą elektroforezy w żelu i autoradiografii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Uwagi o ogólnych procedurach

  1. Upewnij się, że wszystkie substancje chemiczne (składniki buforowe, enzymy itp.) są wolne od rybonukleazy (RNazy). Odsekwestruj wszystkie zakupione komercyjnie butelki z odczynnikami do ogólnego użytku laboratoryjnego. Nosić rękawice na wszystkich etapach procedury eksperymentalnej. Używaj wyłącznie szklanych naczyń i przyborów kuchennych, które zostały upieczone (patrz krok 1.2 poniżej) oraz roztworów, które zostały poddane wstępnej obróbce (patrz krok 1.3 poniżej).
  2. Piec wszystkie szklane naczynia (zlewki, kolby, butelki, pipety itp.) przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 177 °C. Zawiń inne przybory (szpatułki, mieszadła itp.) w folię aluminiową przed pieczeniem w tych samych warunkach.
  3. Przygotować 0,1% (obj./obj.) roztwór dietylopirowęglanu (DEPC) w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O). Za pomocą mieszadła magnetycznego mieszaj ten roztwór przez noc, a następnie autoklaw. Użyj tego H2O poddanego działaniu DEPC, aby przygotować wszystkie roztwory zawierające Tris; Następnie wysterylizuj filtr za pomocą filtra próżniowego od butelki. Użyj zwykłego ddH2O do przygotowania wszystkich innych roztworów (bez Tris); następnie potraktuj DEPC (0,1%, obj./obj.) i autoklaw.
    UWAGA: stosowane w poniższym zestawie procedur doświadczalnych są wymienione alfabetycznie w tabeli 1.
Nazwa buforakompozycja
Bufor boranowy0,2 M boran sodu, pH 9
Bufor C20 mM HEPES, pH 7,9, 25% (obj./obj.) glicerol, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), 0,5 mM ditiotreitol (DTT)
Bufor D10 mM HEPES, pH 7,9, 20% (obj.) glicerol, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM naziemna telewizja cyfrowa
60%D60% bufor D i 40%H2O
Etanoloaminy0,2 M etanoloamina, pH 8
Bufor wiązania HEPES20 mM HEPES, pH 7,9
Bufor płuczący HEPES20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M NaCl
Bufor ładujący RNA90% formamidu, 20 mM EDTA, pH 8, 0,05% (w/v) błękit bromofenolowy
Bufor SDS-PAGE25 mM Tris, 169 mM glicyna, 0,1% dodecylosiarczan sodu (SDS), pH 8,8
Bufor próbki SDS62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 5% 2-merkaptoetanol, 0,1% (w/v) błękit bromofenolowy
Bufor TBE do żeli RNA89 mM Tris, 89 mM kwas borowy, 2,5 mM EDTA, pH 8,3
Bufor TE10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA
Bufor transferowy25 mM Tris, 1,92 M glicyna, 20% metanolu, pH 8,3
Bufor T-TBS10 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,5
Bufor myjący TX0,05% Triton X-100 (TX) w 60%D

Tabela 1: Nazwa i skład

2. Przygotowanie NE zubożonego w U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. Przygotowanie kulek anty-U1 do immunoadsorpcji
    1. Wstępnie pęcznieje 50 mg kulek białkowych A-sefarozy CL-4B w nadmiarze 2Opoddanego działaniu DEPC, aby wytworzyć około 200 μl spęczniałych kulek, a następnie przemyć w buforze do płukania HEPES.
    2. Dla tego płukania i wszystkich następnych płukań granulki należy zagnieździć przez odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s) i usunąć niezwiązany płyn za pomocą mikropipetora i wyrzucić.
    3. Zmieszać 150 μl przemytych kulek ze 150 μl ludzkiej surowicy autoimmunologicznej swoistej dla U1 snRNP (objętość przeciwciała do objętości kulek w stosunku 1:1).
    4. Dostosować, na podstawie całkowitej objętości (~300 μL od kroku 2.1.3 powyżej), mieszaninę do 20 mM HEPES, pH 7,9, odpowiadającego warunkom buforu wiążącego HEPES; inkubować tę mieszaninę z ciągłym kołysaniem w temperaturze pokojowej przez 60 minut.
    5. Przemyć kulki związane przeciwciałami 1 ml buforu boranowego (0,2 M boranu sodu, pH 9) i ponownie zawiesić w 1 ml tego samego buforu boranowego.
    6. Aby kowalencyjnie sparować przeciwciało związane z kulkami białka A-sepharozy, dodaj dimetylopimelimidat do końcowego stężenia 20 mM i inkubuj w temperaturze pokojowej z kołysaniem przez 60 minut.
    7. Przemyć kulki 1 ml buforu boranowego.
    8. Aby zablokować nieprzereagowany odczynnik sieciujący, dodaj 1 ml 0,2 M etanoloaminy (pH 8) i inkubuj w temperaturze pokojowej z kołysaniem przez 60 minut.
    9. Przemyć kulki sprzężone z przeciwciałami, zwane dalej kulkami anty-U1, dwukrotnie 0,5 ml buforu do przemywania TX (0,05% Triton X-100 w 60% D).
  2. Zubożenie U1 snRNP w stosunku do NE (patrz Rysunek 1A)
    UWAGA: Procedura przygotowania NE z komórek HeLa została początkowo opracowana przez Dignam et al.20. Opisaliśmy materiały i szczegółowe metody przygotowania NE do testów splicingu19 (patrz kroki 2.1 i 3.1 tego odniesienia). NE, w pierwotnym brzmieniu, znajduje się w buforze C i będzie dalej oznaczany jako NE(C). NE(C) dializowany i równoważony buforem D będzie oznaczony jako NE(D).
    1. Inkubować 200 μl NE(C) ze 100 μl kulek anty-U1 z kroku 2.1.9 powyżej.
    2. Do mieszaniny dodać 5 μl RNasin.
    3. Obracać mikrorurkę od głowy do ogona w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    4. Mieszaninę należy obrabiać przez odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s) i zebrać niezwiązany materiał (U1ΔNE) za pomocą strzykawki Hamiltona.
    5. Dializować całą objętość U1ΔNE, wraz z oddzielną 50 μl podwielokrotnością pierwotnego niezubożonego NE(C), w oddzielnych komorach mikrodializatora, mieszając, przez 75 minut w stosunku do 60% D, używając membrany dializacyjnej z odciętą masą cząsteczkową 8 K.
    6. Bezpośrednio po dializie należy podzielić te preparaty (U1ΔNE i NE w 60% D) na 20 μl podwielokrotności, a następnie zamrozić w kąpieli suchego lodu i etanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Analiza zawartości RNA i białka w U1ΔNE i materiale związanym na kulkach anty-U1
    1. Po usunięciu niezwiązanego materiału (U1ΔNE) (krok 2.2.4) należy przepłukać materiał związany z kulkami anty-U1, dodając 0,5 ml buforu do przemywania TX. Mieszaninę osadzić przez odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s), usunąć supernatant za pomocą mikropipetora i wyrzucić.
    2. Powtórzyć kroki prania 2.3.1 dwukrotnie.
    3. Usunąć materiał związany z kulkami anty-U1, dodając 100 μl buforu do próbki 2x SDS do 100 μl kulek i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Mieszaninę osadzić przez odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s); usunąć supernatant za pomocą strzykawki Hamiltona i zamrozić w kąpieli suchego lodu i etanolu. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    5. Porównać niezubożony NE, zubożony NE (U1ΔNE) i materiał związany z kulkami (usunięty z kulek za pomocą bufora próbki SDS, jak opisano w krokach 2.3.3 i 2.3.4 powyżej). Wykonaj kroki 2.3.6-2.3.8 w przypadku analizy RNA lub kroki 2.3.9-2.3.10 w przypadku analizy białek.
    6. Dla każdej próbki ekstrahować RNA za pomocą 200 μl chloroformu fenolowego (50:50, v/v), a następnie ponownie ekstrahować 180 μl alkoholu chloroformowo-izoamylowego (25:1, v/v). Po ekstrakcji dodać 300 μl zimnego 200-procentowego etanolu, odwrócić do wymieszania i przechowywać wytrącone RNA przez noc w temperaturze -20 °C.
    7. Odwirować RNA wytrącone etanolem (12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C). Umyj granulki 150 μl zimnego 70% etanolu. Ponownie odwirować (12 000 x g) w temperaturze 4 °C przez 15 min. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety i suszyć granulki w odkurzaczu przez 10-15 minut bez podgrzewania.
    8. Wysuszony osad RNA zawiesić ponownie w 10 μl buforu ładującego RNA, delikatnie wirować, podgrzewać do temperatury 75-85 °C przez 90 s, a następnie inkubować na lodzie przez 2 min. Oddzielić snRNA za pomocą elektroforezy żelowej (2 h przy 16 mA) przez 13% poliakryloamid - 8,3 M żele mocznikowe, a następnie zabarwić bromkiem etydyny lub poddać northern blotting10, 16.
    9. Załadować próbki białek do bufora próbek SDS z kroku 2.3.5 na 12,5% żele poliakrylamidowe i elektroforę pod napięciem 200 V przez około 45-50 minut do buforu SDS-PAGE (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu).
    10. Przenieść oddzielone białka do membrany nitrocelulozowej pod ciśnieniem 400 mA przez 2 godziny w buforze transferowym. Po przeniesieniu zablokuj błonę, inkubując przez noc w T-TBS zawierającym 10% odtłuszczonego mleka w proszku. Następnie poddaj błonę immunoblotowi, aby odsłonić określone białka8,21.

3. Immunoprecypitacja frakcji 10S gradientów glicerolu przez anty-Gal3

  1. Przygotowanie kulek anty-Gal3 do immunoadsorpcji
    UWAGA: Wyprowadzenie i charakterystyka poliklonalnych surowic odpornościowych królika przeciwko Gal3 dla królika #2421 i dla królika #4910 zostały opisane wcześniej.
    1. Użyj surowicy przedimmunologicznej od królika #49 jako kontroli.
    2. W celu przygotowania kulek anty-Gal3 postępuj zgodnie z procedurą opisaną wcześniej dla przygotowania kulek anty-U1 (krok 2.1), z wyjątkiem tego, że odpowiadając krokowi 2.1.3, stosunek surowicy (np. anty-Gal3, #49) do kulek wynosi 3:1.
    3. Tuż przed użyciem przemyj dwukrotnie kulki sprzężone z przeciwciałami, zwane dalej kulkami anty-Gal3, 0,5 ml buforu do płukania TX. Usunąć supernatant, najpierw za pomocą mikropipetora, aby usunąć większość płynu, a następnie za pomocą strzykawki Hamiltona, aby usunąć płyn z kulek; odrzucić.
  2. Immunoprecytaton frakcji gradientu glicerolu przez anty-Gal3 (patrz Rysunek 1B)
    1. Frakcjonować NE(D) w gradiencie glicerolu 12%-32%10. Połącz i wymieszaj frakcje gradientu glicerolu 3, 4 i 5 (ponumerowane od góry gradientu), które znajdują się w pobliżu obszaru 10S gradientu.
    2. Przygotować dwie próbki, każda zawierająca 150 μl podwielokrotności połączonych frakcji gradientowych 3-5 (etap 3.2.1) i umieścić w 50 μl kulek anty-Gal3.
    3. Równolegle przygotuj dwie próbki, każda o objętości 150 μl frakcji 1 (zawierającej Gal3 nie będący w kompleksie z U1 snRNP10; krok 3.2.1) i umieść w 50 μl kulek anty-Gal3.
    4. Jako kontrolę umieść 150 μl 60% D w innej mikroprobówce z kulkami anty-Gal3 o pojemności 50 μl.
    5. Delikatnie wymieszaj, stukając w probówkę, a następnie obracaj mikroprobówkę głową nad ogonem w temperaturze 4°C przez 1 godzinę.
    6. Mieszaninę granulować przez delikatne odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s).
    7. Usunąć supernatant (niezwiązany materiał) za pomocą strzykawki Hamiltona. Nie myć kulek i użyć natychmiast w celu dodania reakcji splicingu (punkt 4.2).
  3. Analiza zawartości RNA i białka w materiale niezwiązanym i związanym z wytrącania anty-Gal3 frakcji gradientu 10S
    1. Do analizy składników związanego i niezwiązanego materiału z wytrącania anty-Gal3 frakcji gradientu 10S, zebrać niezwiązany materiał (supernatant po kroku 3.2.6), przenieść do świeżej mikroprobówki i zamrozić w temperaturze -20 °C.
    2. Przemyć wytrącone kulki z kroku 3.2.6 (zawierające materiał związany z anty-Gal3) przez dodanie 0,5 ml buforu do przemywania TX.
    3. Mieszaninę osadzić przez delikatne odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s); usunąć supernatant za pomocą mikropipetora i wyrzucić. Powtórz kroki prania jeszcze dwa razy.
    4. Dodać 50 μl buforu do próbki 2X SDS do przemytych i granulowanych kulek anty-Gal3.
    5. Delikatnie wymieszaj kulki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Mieszaninę należy zagnieździć przez delikatne odwirowanie (1 000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s), zebrać supernatant za pomocą strzykawki Hamilton i przechowywać w świeżej mikroprobówce w temperaturze -20 °C.
    7. Porównać materiał niezwiązany (sekcja 3.3.1) i materiał związany (etap 3.3.6) wytrącania anty-Gal3 pod względem RNA i składników białkowych, stosując procedury opisane odpowiednio w krokach 2.3.6 do 2.3.10.

4. Montaż reakcji splicingu i analiza produktów

  1. Przygotowanie podłoża do łączenia wstęg
    UWAGA: Substrat pre-mRNA, oznaczony jako MINX, zawiera dwie sekwencje eksonów i jedną sekwencję intronową z klasy Adenovirus22. Sekwencja DNA MINX w plazmidzie jest pod kontrolą promotorów polimerazy RNA T3, T7 lub SP6. Materiały i szczegółowe metody linearyzacji plazmidowego DNA MINX za pomocą endonukleazy restrykcyjnej BamHI, transkrypcji przez polimerazę RNA SP6 w obecności α-32P[GTP] oraz oczyszczania 32znakowanych P MINX do testów splicingu opisano wcześniej19 (patrz kroki 2.2 i 3.2 tego odniesienia).
    1. Znakowany radioizotopowo MINX należy przechowywać jako osad etanolu w temperaturze -20 °C; zużyć znakowany substrat do splicingu w ciągu 4-6 tygodni po transkrypcji.
    2. Tuż przed użyciem odwirować wytrącony etanolem 32MINX znakowany P w temperaturze 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; usunąć supernatant za pomocą mikropipetora i wyrzucić.
    3. Dodać 150 μl 70% etanolu i odwirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant i suszyć osad w próżni bez podgrzewania przez 15 minut.
    4. Ponownie uwodnić granulat w 50 μl wody DEPC. Umieścić 2 μl na każdym z dwóch filtrów GF/C; zanurzyć filtry w zimnym 5% kwasie trichlorooctowym (TCA) na 10 minut. Spłukać zimnym 5% TCA, a następnie 180-procentowym etanolem na kolbie próżniowej. Wysuszyć filtry na powietrzu i poddać zliczaniu scyntylacyjnemu w 4 ml Safety-Solve.
    5. Rozcieńczyć 32MINX znakowany P w 60% D do 104 cpm/μL do testu splicingu.
  2. Montaż reakcji splicingu (patrz Rysunek 1C)
    1. Zbierz na lodzie reakcje splicingu w całkowitej objętości 24 μL (8 μL U1ΔNE (od kroku 2.2.6), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM fosforanu kreatyny, 0,5 mM DTT, 20 jednostek RNasin, 4 μL 32substratu do łączenia MINX znakowanego P (104 cpm/μL), 60% D) i dodaj do każdej probówki kulek z sekcji 3.2.7. Zebrać identyczny zestaw reakcji splicingu w całkowitej objętości 24 μl, ale bez U1ΔNE i dodać do każdej probówki kulki z kroku 3.2.7.
    2. Przygotować kontrolną reakcję splicingu w 12 μL całkowitej objętości (4 μL NE(D), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM fosforanu kreatyny, 0,5 mM DTT, 20 jednostek RNasin, 2 μL 32znakowanego P substratu do łączenia MINX (104 cpm / μL), 60% D).
    3. Delikatnie wymieszać probówki, stukając i obracając od końca do ogona w temperaturze 30°C przez 90 minut. Mieszaninę osadzać przez delikatne odwirowanie w temperaturze 1 000 x g w kołyszącym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s.
    4. Zatrzymać reakcję i wymyć białka z kulek, dodając 24 μl buforu do próbek 2x SDS do probówek zawierających kulki i 12 μl buforu do próbki 2x SDS do probówki kontrolnej zawierającej NE, ale bez kulek. Podgrzewać rurki w temperaturze 100 °C przez 7 minut.
    5. Delikatnie odwirować probówki przy 1.000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10-15 s.
    6. Przenieść supernatanty (elutiony) do świeżych mikroprobówek: około 48 μl z probówek z kulkami i 24 μl z probówki kontrolnej NE.
    7. Dodać proteinazę K (20 mg/ml) w celu strawienia i rozpuszczenia białek: dodać 5 μl do 48 μl elucji z kulek i dodać 2,5 μl do 24 μl kontroli NE.
    8. Inkubować probówki w temperaturze 37°C przez 40 minut.
    9. Delikatnie odwirować probówki o sile 1.000 x g w obracającym się wirniku kubełkowym w temperaturze 4 °C przez 10 s.
    10. Rozcieńczyć elutiony kulek 39,5 μl TE i 10 μl 3 M octanu sodu. Rozcieńczyć kontrolę NE 63,5 μl TE i 10 μl 3 M octanu sodu.
    11. Wyodrębnij i przeanalizuj RNA zgodnie z opisem poniżej (sekcja 4.3).
  3. Analiza produktów reakcji splicingu
    1. Ekstrahować RNA w każdej próbce chloroformem fenolowym, a następnie alkoholem chloroformowo-izoamylowym; wytrącić RNA etanolem, odwirować, umyć granulki, usunąć supernatant i wysuszyć granulki zgodnie z tą samą procedurą, jak opisano w krokach 2.3.6 i 2.3.7.
    2. Wysuszony osad RNA zawiesić ponownie w 10 μl buforu ładującego RNA, delikatnie wirować, podgrzewać do 75-85 °C przez 90 s, a następnie inkubować na lodzie przez 2 minuty.
    3. Przygotować 20 ml roztworu zawierającego 13% poliakrylamidu (bisakryloamid: akrylamid, 1,9:50 [wag./wag]) w 8,3 M moczniku; rozlać żele o długości 15 cm, używając tego roztworu.
    4. Po odlaniu żelu należy go poddać elektroforezie (bez załadowanych próbek) pod napięciem 400 V przez 20 minut, używając TBE jako bufora bieżącego. Po tym kroku umyj studzienki buforem do pracy TBE.
    5. Załadować próbki RNA do buforu ładującego RNA i elektroforezy z buforem TBE pracującym pod napięciem 400 V przez 3,5 do 4 godzin. Po elektroforezie usunąć mocznik, zanurzając i obracając żel w wodzie destylowanej na 10 minut.
    6. Suszyć próżniowo żel na bibule filtracyjnej o długości 3 M, najpierw przez 2 godziny i 15 minut w temperaturze 80 °C, a następnie przez 30 minut bez podgrzewania, aby powoli schłodzić. Poddać wysuszony żel autoradiografii na kliszy w celu wykrycia pozycji migracji składników promieniotwórczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

NE pozbawiony U1 snRNP (U1ΔNE z sekcji 2.2.6) oraz kompleksy Gal3 – U1 snRNP z regionu 10S gradientu glicerolowego, immunoprecypitowane przeciwciałami anty-Gal3 (krok 3.2.7), zmieszano w reakcji splicingu. Ta mieszanina reakcyjna zawierała U1 snRNA (Rysunek 2A, ścieżka 3), a także białko specyficzne dla U1, U1-70K (Rysunek 2B, ścieżka 3). Zgodnie z oczekiwaniami, przeciwciała anty-Gal3 wytrąciły Gal3 (Rysunek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Raport ten zawiera szczegóły eksperymentalne, które dokumentują, że kompleks snRNP Gal3 - U1 uwięziony na kulkach pokrytych anty-Gal3 może wiązać się z substratem pre-mRNA, a ten trójskładnikowy kompleks może przywrócić aktywność splicingową do NE, zubożonego w U1 snRNP. Gal3 jest jednym z członków rodziny białek pierwotnie wyizolowanych na podstawie specyficznej dla galaktozy aktywności wiązania węglowodanów23. Wczesne badania immunofluorescencji i frakcjonowania subkomórkowego dostarczyły wstępn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez National Science Foundation Grant MCB-0092919 i Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (dla RJP) oraz przez National Institutes of Health Grant GM-38740 i Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (dla JLW).

Substrat pre-mRNA MINX używany w testach splicingu był miłym prezentem od dr Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
anty-U1 snRNPMiejsce wiązaniaHu ENA-RNP #33471ludzka surowica autoimmunologiczna specyficzna dla filtra próżniowego do butelki U1 snRNP
Fisher ScientificCorning 431153 (0,22 μ m; PES 150 ml)do filtrowania roztworów zawierających
wirówkęInternational Equipment CompanyIEC Model PR-6do granulowania kulek sepharose w immunoprecypitacji
dietylowęglan (DEPC)Sigma-Aldrich159220-5Gdo uzdatniania wody używanej do przygotowania wszystkich roztworów
dimetylopimelimidat (DMP)Sigma-Aldrich80490-5Gdo sieciowania przeciwciała przeciwko komórce elektroforetycznej z kulkami sefalozy
BioRad Laboratories, IncMini-Protean IIdo SDS-PAGE separacji białek
etanoloaminySigma-Aldrich411000-100mldo blokowania po reakcji sieciowania
system elektroforezy żelowejHoefer, IncHSI SE 500Series do separacji snRNA za pomocą żelowej płyty żelowej do elektroforezy
suszarkaBioRadModel 224do suszenia płyt żelowych do autoradiografii
Membrana Hybond ECLGE HealthcareRPN3032D (0,2 μ m; 30 cm x 3 m)do immunoblottingu białek na
mikrodializatorze błonowym (12 x 100 μ l pojemność próbki)Systemmikrodializatora Pierce 100do wymiany buforu ekstraktu jądrowego   
membrany mikrodializatora (odcięcie 8K)Pierce66310do wymiany buforu ekstraktu jądrowego 
beztłuszczowe mleko w proszkuSpartan StoresSpartan Instant Beztłuszczowe mleko
Białko A Sepharose CL-4BMillipore-SigmaGE 17-0780-01do sprzęgania przeciwciała z kulkami
Proteinaza KMillipore-SigmaP2308-5mgdo zatrzymywania reakcji splicingu w celu wyizolowania RNA
RNasinPromegaN2111do hamowania aktywności
rybonukleazywahacz/rotatorLab Industries, Inc Labquake Shaker 400-110do mieszania roztworów białkowych w reakcjach sprzęgania i immunoprecypitacji
Safety-SolveResearch Products International Corp.Nr 111177koktajl scyntylacyjny do oznaczania promieniotwórczości w
liczniku scyntylacyjnymBeckman InstrumentsLS6000SClicznik scyntylacyjny do oznaczania radioaktywności 
Szybki koncentrator próżniowySavantSVC 100Hdo suszenia granulek RNA wytrąconych etanolem
Jednostka do elektroforezy transforowejHoefer, IncHoefer TE Series Transphordo przenoszenia białek z SDS-PAGE do błony bibułkowej
Tris w proszku substratu do splicingu

Bibliografia

  1. Hoskins, A. A., Moore, M. J. The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine. Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).
  2. Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing. Science. 231, 1534-1539 (1986).
  3. Lerner, M., Steitz, J. A. Snurps and scyrps. Cell. 25, 298-300 (1981).
  4. Maniatis, T., Reed, R. The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing. Nature. 325, 673-678 (1987).
  5. Hoskins, A. A., et al. Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes. Science. 331, 1289-1295 (2011).
  6. Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins. International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).
  7. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).
  8. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).
  9. Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3. Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).
  10. Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP. Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).
  11. Fritsch, K., et al. Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex. BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).
  12. Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).
  13. Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA. Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).
  14. Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes. Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).
  15. Malca, H., Shomron, N., Ast, G. The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex. Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).
  16. Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes. Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).
  17. Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome. Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).
  18. Jurica, M. S., Moore, M. J. Capturing splicing complexes to study structure and mechanism. Methods. 28, 336-345 (2002).
  19. Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing. Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).
  20. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).
  21. Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains. Journal of Biological Chemistry. 268, 14932(1993).
  22. Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles. Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).
  23. Barondes, S. H., et al. Galectins: a family of animal β-galactoside-binding proteins. Cell. 76, 597-598 (1994).
  24. Laing, J. G., Wang, J. L. Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex. Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).
  25. Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components. Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).
  26. Michaud, S., Reed, R. An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway. Genes & Development. 5, 2534-2546 (1991).
  27. Chiu, Y. -F., et al. Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction. Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).
  28. Krishnan, R., et al. Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).
  29. Gray, R. M., et al. Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3. Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rekonstytucja aktywności splicingudeplecja U1 snRNPfrakcjonowanie w gradiencie glicerolukulki z przeciwciałami anty-galektynie-3dializa ekstraktu jądrowegoprotokół reakcji splicinguanaliza substratu RNAtraktowanie proteinazą Kbufor do próbek SDS
Uzupełnienie aktywności splicingu przez kompleks galektyny-3 - U1 snRNP na kulkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.