Artykuł metodologiczny

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61991

⸱

3 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 3The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 4Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 5Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje konwersję fibroblastów skóry w mioblasty i ich różnicowanie w miotuby. Linie komórkowe pochodzą od pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów patologicznych i testowania strategii terapeutycznych.

Streszczenie

Badania zarówno nad patofizjologią, jak i celami terapeutycznymi w dystrofiach mięśniowych były utrudnione przez ograniczoną zdolność proliferacyjną ludzkich mioblastów. Stworzono kilka modeli mysich, ale albo nie reprezentują one tak naprawdę ludzkiej fizjopatologii choroby, albo nie są reprezentatywne dla szerokiego spektrum mutacji występujących u ludzi. Unieśmiertelnienie ludzkich mioblastów pierwotnych jest alternatywą dla tego ograniczenia; Jednak nadal jest to zależne od biopsji mięśni, które są inwazyjne i nie są łatwo dostępne. W przeciwieństwie do tego, biopsje skóry są łatwiejsze do uzyskania i mniej inwazyjne dla pacjentów. Fibroblasty pochodzące z biopsji skóry mogą być unieśmiertelnione i transróżnicowane w mioblasty, stanowiąc źródło komórek o doskonałym potencjale miogennym. Tutaj opisujemy szybką i bezpośrednią metodę przeprogramowania fibroblastów na linię miogenną. Fibroblasty są transdukowane za pomocą dwóch lentiwirusów: hTERT w celu unieśmiertelnienia pierwotnej kultury i indukowanego przez tet MYOD, który po dodaniu doksycykliny indukuje przekształcenie fibroblastów w mioblasty, a następnie dojrzałe miotuby, które wyrażają późne markery różnicowania. Ten protokół szybkiej transdyferencjacji stanowi potężne narzędzie do badania mechanizmów patologicznych i badania innowacyjnych genowych lub farmakologicznych terapii biologicznych zaburzeń nerwowo-mięśniowych.

Wprowadzenie

Modele komórkowe uzyskane bezpośrednio z tkanek ludzkich są przydatne do modelowania wielu ludzkich zaburzeń genetycznych, z tą zaletą, że mają oryginalny kontekst genomiczny i, w wielu przypadkach, odtwarzają te same molekularne i komórkowe cechy charakterystyczne, które obserwuje się u pacjentów. W dziedzinie zaburzeń nerwowo-mięśniowych biopsje mięśni były doskonałym źródłem ludzkich mioblastów i pomogły w wyjaśnieniu mechanizmów patologicznych. Ponadto są ważnym narzędziem do testowania in vivo leków i terapii genowych. Z jednej strony wyprowadzenie mioblastów z fragmentów mięśni jest stosunkowo łatwe. Z drugiej strony, hodowla i utrzymanie pierwotnych mioblastów są wyzwaniem ze względu na ich ograniczone tempo proliferacji i replikacyjne starzenie się in vitro1. Alternatywą dla tych ograniczeń jest unieśmiertelnienie mioblastów z insercją genów ludzkiej telomerazy (hTERT) i/lub kinazy zależnej od cykliny 4 (CDK4) 2,3, z zachowaniem cech mięśni szkieletowych4. Niemniej jednak uzyskanie pierwotnych mioblastów jest nadal zależne od biopsji mięśni, zabiegu chirurgicznego niekorzystnego dla pacjentów, którzy w wielu przypadkach mają mięśnie w zaawansowanym zwyrodnieniu. Tak więc mięśnie tych pacjentów składają się ze znacznej części tkanki zwłóknieniowej i/lub tłuszczowej i dają mniej komórek mięśniowych, co wymaga oczyszczenia komórek przed unieśmiertelnieniem.

W przeciwieństwie do biopsji mięśni, biopsje skóry są bardziej dostępne i mniej szkodliwe dla pacjentów. Pierwotne fibroblasty mogą pochodzić z fragmentów skóry in vitro. Chociaż fibroblasty nie są przede wszystkim dotknięte mutacjami powodującymi zaburzenia nerwowo-mięśniowe, mogą być transróżnicowane w mioblasty. Można to osiągnąć poprzez wprowadzenie genu Myod, miogennego regulatorowego czynnika transkrypcyjnego5. W tym manuskrypcie opisujemy protokół otrzymywania transzróżnicowanych mioblastów, od ustanowienia kultur fibroblastów do uzyskania zróżnicowanych miotub (reprezentatywne podsumowanie metody przedstawiono w Rysunek 1).

Przedkliniczne testowanie strategii terapeutycznych zależy od modeli komórkowych i zwierzęcych zawierających mutacje podobne do mutacji występujących u ludzkich pacjentów. Chociaż rozwój modeli zwierzęcych stał się bardziej realny dzięki postępowi technologii edycji genów, takich jak CRISPR/Cas96, nadal jest to trudne i kosztowne. W związku z tym linie komórkowe pochodzące od pacjentów są dostępną opcją do posiadania modeli, obejmujących szerokie spektrum mutacji chorób, takich jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD). Obdukcja i tworzenie modeli komórkowych mają kluczowe znaczenie dla rozwoju spersonalizowanych terapii takich patologii.

Wśród spersonalizowanych terapii, które zostały zbadane, strategie pomijania eksonów są jedną z najbardziej obiecujących dla różnych dystrofii mięśniowych7,8. Strategia ta polega na wytwarzaniu krótszego, ale funkcjonalnego białka. Odbywa się to poprzez ukrycie definicji eksonu w spliceosomie, a tym samym wykluczenie zmutowanego eksonu z końcowego przekaźnika. Jest to bardzo obiecująca technologia, która została zatwierdzona przez FDA dla DMD. W związku z tym w niniejszym protokole opisujemy również metody transfekcji mioblastów za pomocą dwóch różnych technologii związanych z pomijaniem eksonów: oligonukleotydów antysensownych (AON) i wirusa związanego z adenowirusem U7snRNA (AAV). Transfekcja AON jest dobrym narzędziem do wstępnego badania przesiewowego kilku sekwencji zaprojektowanych w celu promowania pomijania eksonów9. Jednak aktywność AON-ów jest przejściowa. Aby uzyskać trwałą ekspresję sekwencji antysensownych, zbadaliśmy również małe jądrowe RNA (snRNA) w połączeniu z AAV, umożliwiając lokalizację jądra i włączenie do maszynerii splicingu10. U7 to snRNA biorący udział w przetwarzaniu mRNA histonów, który można zaprojektować tak, aby wiązał białka, które przekierują go do spliceosomu i dostarczą sekwencje antysensowne11. Zastosowanie zmodyfikowanych snRNA U7 w połączeniu z wektorami AAV pokonuje ograniczenia AON, co skutkuje ciągłą ekspresją AONs i lepszą transdukcją tkanek będących przedmiotem zainteresowania12. W tym protokole używamy komórek pochodzących od pacjentów z DMD, aby zilustrować strategię pomijania eksonów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i biopsje zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami etycznymi zaangażowanych instytucji, za zgodą Nationwide Children's Hospital Institutional Review Board.

1. Inicjacja hodowli fibroblastów skórnych

  1. Założenie hodowli fibroblastów
    1. Podwielokrotność 10 ml pożywki fibroblastowej (Tabela 1) w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml. Biopsja skóry powinna być umieszczona i transportowana w tym podłożu. Biopsja może być przechowywana w temperaturze 4 °C do czasu jej przetworzenia, najlepiej tego samego dnia.
      UWAGA: Wykonaj biopsję skóry w ciągu 24-36 godzin, aby uniknąć potencjalnego wzrostu zanieczyszczenia.
    2. Odessać pożywkę z probówki i przepłukać biopsję trzykrotnie 10 ml 1X PBS (temperatura pokojowa). Po trzecim praniu pozostaw PBS w tubce.
    3. Wylej PBS i skórę na naczynie o powierzchni 10cm2.
    4. Za pomocą sterylnych skalpeli pokrój biopsję na jak najmniejsze fragmenty.
    5. Za pomocą pipety przenieś pojedynczy fragment skóry i wrzuć go do czystego naczynia o wymiarach 10cm2. Umieść od 10 do 12 fragmentów w naczyniu.
    6. Odessać nadmiar PBS z okolic każdego fragmentu. Uważaj, aby nie zassać fragmentu.
    7. Przykryj naczynia częściowo pokrywką i pozostaw fragmenty skóry do wyschnięcia na 5-20 minut. Nie dopuścić do nadmiernego wyschnięcia fragmentów.
    8. Gdy fragmenty wyschną, przechyl naczynie pod kątem 45 stopni i powoli dodaj 12 ml pożywki fibroblastowej do rogu. Opuść naczynie, ostrożnie rozprowadzając pożywkę, aby fragmenty nie unosiły się przez pożywkę.
    9. Umieścić naczynia w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ). Wymień nośnik za 5-7 dni, a następnie raz w tygodniu.
    10. Obserwuj fibroblasty wyłaniające się z fragmentu (Ryc. 2) i, po zlaniu, przejdź komórki do kolb o długości 75 cm2. Usunąć pożywkę, przepłukać komórki PBS i dodać 1 ml 0,25% trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu, gdy wszystkie komórki zostaną podniesione. Dodać 10 ml pożywki wzrostowej fibroblastów, aby zahamować trypsynę i przenieść komórki do nowej kolby.
      UWAGA: Dla nomenklatury numerów pasaży, P1 ustala się, gdy pierwsze fibroblasty, które wyłoniły się z biopsji skóry, są przenoszone do nowej kolby w celu proliferacji.
  2. Kriokonserwacja pierwotnych linii fibroblastów
    1. Gdy kolba o długości 75cm2 zlewnie się zlewa, przepłukać ją 10 ml 1X PBS i odessać PBS.
    2. Dodaj 3 ml 0,25% trypsyny na powierzchnię komórki. Umieścić kolbę w inkubatorze na 5 minut. Sprawdź kolby pod mikroskopem, aby zobaczyć, czy komórki są podniesione. W przeciwnym razie umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 5 minut.
    3. Po odłączeniu komórek dodaj 7 ml pożywki z fibroblastami do kolby i pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić komórki. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    4. Przygotować 100 μl podwielokrotności błękitu trypanowego i usunąć 100 μl z próbki poddawanej krioprezerwacji, wymieszać z błękitem trypanowym. Załaduj mieszaninę na hemocytometr, aby policzyć. Policz komórki w czterech różnych polach hemocytometru pod mikroskopem. Aby obliczyć całkowitą liczbę komórek, użyj wzoru: (zliczone komórki/100) * objętość hodowli.
    5. Wirować stożkowe rurki o wymiarach 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
    6. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki zamrażającej: 1 ml na każdy 1 milion komórek/fiolkę. Pipetować w górę i w dół, aby homogenizować i rozprowadzić 1 ml do każdego oznakowanego kriowialu.
    7. Umieścić fiolki w pojemniku do zamrażania i pozostawić do zamrożenia w temperaturze 1 °C/min w temperaturze -80 °C w zamrażarce przez noc.
    8. Następnego dnia przenieść fiolki do zbiornika z ciekłym azotem lub zamrażarki o temperaturze -150 °C.

2. Ustanowienie linii komórkowej fibromioblastów (FM)

  1. Wysiewaj pierwotne fibroblasty w około 30% konfluencji w dwóch dołkach 12-dołkowej płytki (2 x 104 komórki / dołek), aby następnego dnia uzyskać około 50% konfluencji.
  2. W przypadku transdukcji lentiwirusowej dodać 2 do 5 x 109 vg (cząstki genomu wirusa) lentiwirusa hTERT-puromycyny w 400 μl pożywki fibroblastowej. Do drugiego dołka dodaj tylko 400 μl pożywki fibroblastowej. Następnego dnia dodać 1 ml pożywki.
    UWAGA: Plazmidy do produkcji lentiwirusa uzyskano od grupy, która opublikowała artykuł Chaouch i in. z 2009 roku. Są one również opisane indywidualnie w Aure et al, 200713 dla plazmidu hTERT oraz Barde et al, 200614 dla systemu Tet-on wykorzystywanego do projektowania plazmidu MyoD. Zostały one uzyskane dzięki Umowie o Transferze Materiałów z Genethon, Francja (prosimy o kontakt z dr Vincentem Mouly w celu uzyskania tych plazmidów - vincent.mouly@upmc.fr). Krótko mówiąc, hTERT składa się z wariantu hTERT 1 napędzanego przez promotor CMV, podczas gdy puromycyna jest napędzana przez promotor PGK. Plazmid MyoD zawiera wariant MyoD 1 napędzany przez promotor CMV pod kontrolą represora rtTA2. Plazmid ten zawiera również selekcję higromycyny wyrażoną dzięki promotorowi SV40.
    Lentiwirusy zostały wyprodukowane przy użyciu regularnej produkcji lentiwirusa (patrz protokół Wang i McManus JoVe15). Krótko mówiąc, MDL-helper, Rev-Helper, SVS-G-helper transfekowano poprzez wytrącanie chlorku wapnia, również plazmidów hTERT lub MyoD. Po 48 godzinach pobrano supernatant, a następnie przez dodatkowe trzy dni. Cały supernatant został następnie zagęszczony przez ultrawirowanie. Osad został następnie ponownie zawieszony w buforze Tris-HCL+NaCl+EDTA. Oszacowanie miana oceniano za pomocą standardowego testu qPCR lentiwirusa.
  3. Jeden lub dwa dni później przenieś komórki na 6-dołkową płytkę i hoduj je, aż osiągną 60-70% konfluencji.
  4. Uzupełnij pożywkę fibroblastową 1 μg/ml puromycyny i dodaj 2 ml do każdej studzienki.
  5. Utrzymuj wybrane komórki, aż wszystkie komórki w studzience kontrolnej będą martwe (do 12 dni), zmieniając pożywkę co 2-3 dni. Przenieś komórki z płytki 6-dołkowej do dwóch szalek o długości 10 cm2 w celu dalszej proliferacji.
  6. Zamrozić fiolki fibroblastów po selekcji. Oznacz jako F(hTer).
  7. Nasiona fibroblastów wyrażających hTERT (F(hTer)) przy około 30% konfluencji w pożywce fibroblastowej, w dwóch dołkach 12-dołkowej płytki, aby następnego dnia uzyskać około 50% konfluencji.
  8. W przypadku transdukcji lentiwirusa zmieszać 2 do 5 x 109 vg lentiwirusa MyoD-hygromycyny B w 400 μl pożywki fibroblastowej i dodać do odpowiednich studzienek; do trzeciego dołka dodać 400 μl pożywki fibroblastowej. Następnego dnia dodaj 1 ml pożywki.
  9. Jeden lub dwa dni później przenieś komórki do płytki 6-dołkowej i rosły aż do 60-70% zbieżności.
  10. Uzupełnij pożywkę wzrostową fibroblastów higromycyną B (400 μg/ml) i dodaj 2 ml do każdej studzienki.
  11. Utrzymuj wybrane komórki, aż wszystkie komórki w studzience kontrolnej będą martwe (do 12 dni), zmieniając pożywkę co 2-3 dni.
  12. Zamrozić fiolki fibroblastów po selekcji. Oznaczyć jako FM, a następnie podać numer/nazwę identyfikacyjną komórki.

3. Protokół transdyferencjacji

  1. Nasiona transdukowane FM na 10 cm2 szalki z 30-40% konfluencją. Na 12-dołkowej płytce wysiej 6 x 104 komórek (zależy to od indywidualnej linii komórkowej).
    UWAGA: Do barwienia immunologicznego komórki nasienne na szklanych szkiełkach nakrywkowych lub szkiełkach komorowych pokrytych Matrigelem. Rozcieńczyć Matrigel w stosunku 1:10 w podłożu DMEM, dodać objętość wystarczającą do pokrycia powierzchni i pozostawić szkiełka w temperaturze pokojowej na godzinę. Odessać tuż przed wysianiem komórek.
  2. W przypadku indukcji mioblastów, gdy fibroblasty osiągnęły 70% konfluencji (Rysunek 3A), przepłucz powierzchnię komórki PBS i dodaj świeże podłoże mioblastów uzupełnione świeżą 8 μg/ml doksycykliną.
    UWAGA: Powodzenie różnicowania jest zagrożone po przekroczeniu 80% zbieżności.
  3. Po dwóch, trzech dniach później komórki zlewają się w 90-95%, a ich morfologia ulegnie zmianie (Ryc. 3B). Przepłukać powierzchnię komórek PBS i dodać świeże pożywki różnicujące uzupełnione świeżą doksycykliną o stężeniu 8 μg/ml.
  4. Kontynuuj zmianę pożywki co 2-3 dni bez pasażowania, aż do ustalenia miotubes (potwierdź za pomocą morfologii) (Rysunek 3C).
  5. Siedem do dziesięciu dni po rozpoczęciu różnicowania rurki mięśniowej komórki powinny być w pełni zróżnicowane i mogą zacząć się odłączać lub umierać. Zanim to nastąpi, zbierz miotubki do dalszej analizy.
    UWAGA: Przebieg czasowy powstawania miotubki zależy od linii komórkowej. Mutacje w białkach związanych z mięśniami mogą zakłócać potencjał miogenny. Kiedy myotubes zaczynają wydawać się jasne i wyglądają na białe na brzegach, jest to sygnał, że zaczynają się odłączać (Rysunek 4).
  6. Aby zebrać miotuby, zbierz pożywkę i przenieś ją do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pożywka może zawierać miotuby, które się odłączyły.
  7. Przepłukać rurki myotube 5 ml PBS i przenieść PBS do probówki o pojemności 50 ml.
  8. Dodaj 3 ml 0,25% trypsyny na powierzchnię komórki. Umieść naczynie w inkubatorze na 5 minut. Sprawdź naczynie pod mikroskopem, aby zobaczyć, czy komórki są podniesione. Jeśli nie, umieść go z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 5 minut.
  9. Po odłączeniu komórek dodaj 7 ml pożywki z fibroblastami do naczynia i pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić komórki. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  10. Wirować przy 1 200 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Ostrożnie odessać płyn, nie naruszając granulatu. Przechowywać granulki w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki.

4. Barwienie immunologiczne zróżnicowanych miotub

UWAGA: Do barwienia immunologicznego, hoduj komórki w szklanych szkiełkach nakrywkowych lub szkiełkach komorowych, jak wspomniano powyżej.

  1. Gdy rurki mięśniowe są w pełni zróżnicowane, odessać pożywkę i ostrożnie przepłukać szkiełka PBS. Odessać PBS wyłączony.
  2. Dodać świeże 4% PFA (500 μl na studzienkę na płytce 12-dołkowej) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odessać PFA.
  3. Spłukać 1 ml PBS.
  4. Inkubować z 0,2 M glicyną w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odsysać glicynę.
  5. Przepuszczalność PBS 0,5% TritonX-100 (300 μl/dołek z płytki 12-dołkowej) przez 10 minut z delikatnym mieszaniem.
  6. Blokować roztworem blokującym o stężeniu 300 μl/studzienkę przez 10 minut, delikatnie mieszając.
  7. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:50 w 300 μl roztworu blokującego, przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
  8. Płukać trzykrotnie 1 ml/studzienkę PBS przez 5 minut, delikatnie wstrząsając.
  9. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:500 w 300 μl roztworu blokującego, przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Przykryj talerz folią aluminiową.
  10. Płukać trzykrotnie 1 ml/studzienkę PBS przez 5 minut, delikatnie wstrząsając.
  11. Inkubować z DAPI rozcieńczonym w PBS przez 10 minut. Spłukać trzykrotnie 1 ml/studzienkę PBS.
  12. Dodaj kroplę podłoża montażowego do szkiełka podstawowego. Usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczyków i połóż je ekranem do dołu na kropli podłoża montażowego.
  13. Odwróć szkiełko na ręczniku papierowym i delikatnie dociśnij, aby usunąć bąbelki i nadmiar podłoża montażowego.
  14. Uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazu.

5. Transfekcja oligonukleotydów antysensownych

UWAGA: Poniższy protokół dotyczy transfekcji płytki 6-dołkowej. Dostosuj odpowiednio głośność dla mniejszych lub większych płyt. Transfekcja odbywa się w 100% zlewających się mioblastach, gdy komórki są gotowe do etapu różnicowania.

  1. Odessać pożywkę wzrostową mioblastów i przepłukać komórki 1 ml PBS.
  2. Dodać 500 μl/basenik pożywki OptiMEM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Rozcieńczyć oligonukleotyd antysensowny (AON) w 100 μl OptiMEM do pożądanego stężenia końcowego (tj. 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem AON 2'ometylofosforanozanu.
  4. Wymieszać lipofektaminę z OptiMEM (końcowa objętość 100 μl), aby uzyskać końcowy stosunek 1:1 (μg DNA: μl lipofektaminy). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  5. Połączyć rozcieńczoną lipofektaminę z rozcieńczonym AON. Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić tworzenie się kompleksu. Unikaj pęcherzyków powietrza.
  6. Dodaj 200 μl lipofektaminy i mieszanki AON do odpowiednich studzienek. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  7. Następnego dnia usunąć mieszaninę do transfekcji i dodać 2 ml ciepłej pożywki różnicującej uzupełnionej doksycykliną.
  8. Komórki należy pobrać co najmniej trzy dni później w celu ekstrakcji RNA lub od siedmiu do 21 dni w przypadku analizy białka.
    UWAGA: Dni różnicowania niezbędne do wykrycia ekspresji RNA i/lub białka mogą się różnić w zależności od interesującego genu lub linii komórkowej. W przypadku DMD możliwe jest wykrycie jego mRNA w ciągu trzech dni. Wykrywanie białka dystrofiny wymaga co najmniej siedmiu dni. Będzie się to różnić w zależności od linii komórkowej. Wysokie stężenia AON i odczynnika do transfekcji mogą wpływać na transdyferencjację.

6. Transdukcja AAV1-U7

UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany dla płytek 6-dołkowych. Dostosuj objętości proporcjonalnie do powierzchni hodowli. Transdukcja odbywa się w 100% zlewających się mioblastach, gdy komórki są gotowe do etapu różnicowania. AAV1 jest serotypem AAV o najlepszej zdolności transdukcji spośród hodowanych mioblastów.

  1. Odessać pożywkę wzrostową mioblastów i przepłukać komórki 1 ml PBS.
  2. Rozcieńczyć 0,5-1 x 1011 cząstek wirusa AAV1-U7 w 700 μl ciepłych pożywek różnicujących uzupełnionych doksycykliną.
    UWAGA: Do określenia stężenia wirusa używamy qPCR. Ilość wirusa, która ma być użyta, może się różnić w zależności od metody oznaczania ilościowego i powinna być wcześniej określona za pomocą testu reporterowego.
  3. Dodaj mieszankę wirusową do studzienki, upuszczając ją jednorodnie.
  4. Następnego dnia dodaj 1,3 ml ciepłej pożywki różnicującej uzupełnionej doksycykliną.
  5. Zbierz komórki co najmniej trzy dni później w celu ekstrakcji RNA lub od siedmiu do 21 dni w przypadku analizy białka.

7. Ekstrakcja RNA

UWAGA: Wszystkie materiały użyte podczas tego kroku powinny być wolne od RNaz.

  1. Dodać 500 μl TRIzolu na granulkę i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby upewnić się, że komórki są jednorodnie zmielone.
  2. Przenieś lizat komórkowy do probówki o pojemności 1,5 ml i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać 100 μl chloroformu i wstrząsać ręcznie przez 15 s. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać fazę wodną (górną) i przenieść ją do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Na 1 objętość fazy wodnej dodać 1 objętość etanolu 100% i wymieszać pipetując.
    UWAGA: Zalecamy oczyszczenie i zagęszczenie kolumny.
  6. Przenieść próbkę do kolumny IC Zymo-Spin w probówce zbiorczej i odwirować przy 12 000 x g przez 30 s. Odrzucić przepływ.
  7. W celu mineralizacji DNazy I w kolumnie należy wstępnie przepłukać kolumnę buforem płuczącym RNA o pojemności 400 μl. Wirować przy 12 000 x g przez 30 s. Odrzuć przepływ.
  8. Przygotować 40 μl mieszaniny reakcyjnej DNazy na próbkę. Wymieszać 5 μl DNazy I z 35 μl buforu do trawienia DNA.
  9. Dodaj mieszankę bezpośrednio do matrycy kolumnowej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  10. Dodać 400 μl buforu przygotowawczego RNA do kolumny i odwirować przy 12 000 x g przez 30 s. Wyrzucić przepływ.
  11. Dodać 700 μl buforu płuczącego RNA do kolumny i odwirować przy 12 000 x g przez 30 s. Odrzucić przepływ.
  12. Dodać 400 μl buforu płuczącego RNA do kolumny i odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty, aby zapewnić całkowite usunięcie buforu do płukania. Ostrożnie przenieś kolumnę do probówki 1,5 ml wolnej od RNaz.
  13. Dodaj 15 μl wody wolnej od nukleaz bezpośrednio do matrycy kolumny. Inkubować przez 5 minut i wirować przy 12 000 x g przez 1 minutę.
    UWAGA: Zbierz wymyty RNA i nałóż go ponownie na kolumnę, aby zwiększyć wydajność. Wirować przy 12 000 x g przez 1 minutę.
  14. Umieść próbki na lodzie i oznacz ilościowo próbki w Nanodrop.
  15. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

8. Analiza RT-PCR

UWAGA: W tym kroku przedstawiamy propozycję odczynników do wykrywania ekspresji mRNA dystrofiny, ale można ją łatwo dostosować do innych odczynników z wyboru.

  1. Odwrotna transkrypcja
    1. Rozmrozić wszystkie odczynniki i trzymać je na lodzie.
    2. Przygotuj mieszaninę z 4 μl 5x buforu reakcyjnego, 2 μl mieszanki dNTP (10 mM), 1 μl inhibitora RNazy RiboLock i 1 μl RevertAid RT.
    3. Delikatnie wymieszaj probówkę i krótko odwiruj.
    4. W probówkach PCR o pojemności 0,2 ml dodaj odpowiednią objętość RNA, aby uzyskać 1 μg na reakcję. Dodaj wodę wolną od nukleaz q.s.p. 12 μL. Dołącz jedną probówkę bez odwrotnej transkryptazy jako kontrolę ujemną i jedną probówkę z wodą wolną od nukleaz zamiast RNA.
    5. Rozprowadzić 8 μl mieszaniny reakcyjnej w probówce. Całkowita objętość wynosi 20 μL.
    6. Umieścić probówki w termocyklerze i inkubować przez 5 minut w temperaturze 25 °C, a następnie 60 minut w temperaturze 42 °C. Zatrzymać reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 5 minut.
    7. Umieść probówki na lodzie lub w temperaturze -20 °C, aby zapewnić dłuższe przechowywanie.
  2. PCR
    UWAGA: Najlepiej zaprojektować startery na połączeniach eksonów.
    1. Odczynniki należy odtworzyć i odwirować przed użyciem.
    2. Przygotuj mieszankę wzorcową, używając 0,5 μl startera do przodu (25 μM), 0,5 μl startera odwrotnego (25 μM), 12,5 μl 2x PCR Master Mix i 8,5 μl wody wolnej od nukleaz na próbkę.
    3. Podwielokrotność 22 μl roztworu wzorcowego wymieszać w probówce dla każdej próbki.
    4. Dodaj 3 μl cDNA (150 ng) do odpowiedniej probówki PCR. Dodać 3 μl wody wolnej od nukleaz do probówki kontroli ujemnej PCR.
    5. Odwiruj i odkręć probówki do PCR.
    6. Inkubować probówki w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, 95 °C przez 30 s, (Tm-5) °C przez 30 s, 72 °C przez (1 min/kb) 34 razy, w temperaturze 72 °C przez 5 minut
      UWAGA: Optymalna temperatura wyżarzania może być określona empirycznie. W przypadku sugerowanej mieszanki wzorcowej odjąć 5 °C od temperatury topnienia podkładu.
    7. Załadować 12 μl reakcji PCR na żel agarozowy i zamrozić próbki w temperaturze -20 °C.

9. Wykrywanie ekspresji dystrofiny za pomocą Western Blotting

UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem dystrofiny, dużego białka błonowego. W przypadku różnych białek mogą być potrzebne szczególne warunki.

  1. Ekstrakcja białek
    1. Po 7-21 dniach różnicowania zbierz komórki z 5 ml PBS ze 100 μl 0,5 M EDTA i 50 μl inhibitorami proteazy. Inkubować w temperaturze 37 °C aż do oderwania komórek. Wirować przy 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad przez zanurzenie probówki w ciekłym azocie. Przechowywać granulki w temperaturze -80 °C lub przejść do etapu lizy.
    2. Przygotuj bufor do lizy, dodając 1% digitoniny, 1% inhibitora proteazy, 10% inhibitora fosfatazy i buforu zasady do całkowitej objętości (60 μl na osad komórki).
    3. Dodać 60 μl buforu do lizy do osadu komórkowego na lodzie. Sonikuj przez 5 s. Odstawić na lód na 8 sekund. Powtórz kroki sonikacji i odpoczynku dwukrotnie.
    4. Próbki inkubować na lodzie przez 30 minut.
    5. Wirować przy 14 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Przenieść supernatant do czystych probówek.
    7. Określić ilościowo próbki za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    8. Wymieszać roztwór białkowy z odpowiednią objętością buforu Laemmli. Wykonać podwielokrotności 100 μg. W razie potrzeby dostosować objętość do 25 μl za pomocą buforu do lizy zasady. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Western blotting (zachodnia plama)
    1. Rozmrozić próbki na lodzie.
    2. Denaturować próbki w temperaturze 100 °C przez 5 minut, następnie schłodzić je w lodzie i odwirować.
    3. Rozcieńczyć 20X tris-octan SDS w 200 mldH 2O i dodać 500 μl przeciwutleniacza.
    4. Przygotować 3-8% żel poliakryloamidowy Tris-acetate, wyjmując grzebień i spłukującdH2O. Zbierz żel w aparacie do elektroforezy. Napełnij komorę wewnętrzną buforem do biegania.
    5. Załadować do żelu 5 μl drabinki białkowej i 25 μl próbki. Napełnij komorę zewnętrzną działającym buforem.
    6. Praca pod napięciem 80 V przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie przy 120 V przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    7. Przygotować 3 l buforu transferowego 1X ze 150 ml metanolu 20X, 150 ml buforu transferowego 20X i 2700 mldH2O. Schłodzić do temperatury 4 °C.
    8. Wytnij 4 kawałki bibuły filtracyjnej i jeden kawałek membrany nitrocelulozowej. Namocz filtr papierowy i membranę w tacy z buforem transferowym.
    9. Delikatnie wyjmij żel z etui i zmontuj go w aparacie transferowym za pomocą bibuły filtracyjnej, membrany i gąbek. Żel umieszcza się po stronie ujemnej, a membranę po stronie dodatniej.
    10. Przeprowadzić transfer przy 300 mA, mieszając, w temperaturze 4 °C, przez noc.
    11. Zablokować membranę w 10 ml buforu blokującego na 1 godzinę z delikatnym mieszaniem, w temperaturze pokojowej.
    12. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego z 10 ml buforu blokującego i 50 μl przeciwciała dystrofiny (1:200).
    13. Odrzuć bufor blokujący i dodaj pierwszorzędowy roztwór przeciwciała. Inkubować z delikatnym mieszaniem przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    14. Przepłukać membranę trzykrotnie 0,1% Tween PBS przez 5 minut, delikatnie mieszając.
    15. Przygotować roztwór przeciwciał drugorzędowych, używając 10 ml roztworu blokującego, 2 μl przeciwciała przeciw królikowi (1:5000) i 20 μl 0,2% Tween.
    16. Dodaj drugorzędowy roztwór przeciwciała do membrany. Inkubować przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem, przykryć folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.
    17. Wyrzuć roztwór przeciwciał i przepłucz membranę 3 razy 0,1% Tween PBS, przez 5 minut z delikatnym mieszaniem, chroniąc przed światłem.
    18. Naświetlanie i obrazowanie membrany na urządzeniu do obrazowania.
    19. Zabarwić błonę w celu uzyskania całkowitego białka za pomocą barwnika Revert 700 Total Protein, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Wykrywanie dystrofiny za pomocą western blot zależy od wieku/mutacji pacjenta i zdolności komórki do łączenia się i pozostawania przywiązanym wystarczająco długo, aby zgromadzić wystarczającą ilość dystrofiny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół pokazuje, jak prowadzić hodowle fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry oraz jak przekształcać je w mioblasty, a następnie w zróżnicowane miotuby. Tego rodzaju linia komórkowa jest niezwykle użyteczna w badaniu schorzeń nerwowo-mięśniowych oraz w testowaniu potencjalnych terapii in vitro.

Schematyczny przebieg konwersji fibroblastów przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2A przedstawia fragment skóry oraz w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby uzyskać linie komórkowe FM o dobrej jakości, niektóre kroki są krytyczne. Im szybciej zostanie przeprowadzona biopsja skóry, tym większe są szanse na uzyskanie zdrowych fibroblastów. Istotna jest również liczba pasaży kultur fibroblastów. Komórki pierwotne mają ograniczoną zdolność proliferacyjną i po wielu przejściach wchodzą w starzenie replikacyjne. Dlatego lepiej jest mieć zapas fibroblastów o niskiej liczbie pasażów i przekształcać komórki jak najwcześniejszym pasażem.

Kolejnym ważny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nationwide Children's Hospital udzielił Audentes Therapeutics licencji na opisany tutaj program pomijania eksonu 2. K.M.F. i N.W. otrzymały opłaty licencyjne w wyniku tej licencji.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Dr. Vincentowi Mouly za podzielenie się swoją wiedzą na temat tego modelu w przeszłości. Prace te były wspierane przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (R01 NS043264 (K.M.F. i R.B.W.)), amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N. i N.W.). N.W. otrzymał wsparcie stypendialne od Ohio State University/Nationwide Children's Hospital Muscle Group oraz Fundacja Philippe'a. Prace te były również wspierane przez wewnętrzne fundusze uznaniowe, a część prac nad pomijaniem eksonu 2 była również wspierana przez CureDuchenne (K.M.F.) i Association Francaise Contre Les Myopathies. Numer IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 oraz IBCSC#: IBS00000123.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie 100 mmCorning430167
0,25% Trypsyna-EDTA, czerwień fenolowaThermo Fisher2500056
10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Fisher ScientificBP3994
Płytka 12-dołkowaCorning3513
20X Bufor transferowyThermo FisherNP00061
20X Tris-acetate SDS Bufor biegowyThermo FisherLA0041
3-8% Tris-Acetate żelThermo FisherEA0378BOX
75 cm2 kolbaCorning430641U
Antybiotykowo-Antymikotyczny 100XThermo Fisher15240062
Anty-miozyna łańcuch ciężki, przeciwciało sarkomeroweBadania rozwojowe Hybridom BankMF20 supernatantRozcieńczenie 1:50
PrzeciwutleniaczThermo FisherNP0005
Test białka BCAThermo Fisher23227
ChloroformSigma-AldrichC2432
DAPIThermo FisherD3571Rozcieńczenie 1:1000
DigitoninaMillipore Sigma300410250MG
DimetylosulfotlenekSigma-AldrichD2438
DMEM, Suplement GlutaMAX o wysokiej zawartości glukozy, PirogronianThermo Fisher10569044
zestaw DNAzy I (250U)Zymo Research CorporationE1010
Chlorowodorek doksycyklinyFisher ScientificBP2653-5
Dup2 ludzkie starteryFw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG
TTTCTC 3'Rv_5		CTTTTGGCAGTTTTTGCC
CTGT 3'Dystrofina
przeciwciałoAbcamab15277Rozcieńczenie 1:200
Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher16000
GlicynaSigma-AldrichG8898
Kozia anty-mysza, Alexa Fluor 488Thermo FisherA11001Rozcieńczenie 1:1000
Halt Koktajl inhibitorów proteazy 100XThermo Fisher78430
HemocytometrHausser Scientific3100
Hygromycyna BThermo Fisher 10687010
IRDye 680RD kozia anty-królicza IgG (H+L)Li-Cor926-68071Rozcieńczenie 1:5000
System prowadnic komorowych Lab-Tek II CC2Thermo Fisher15852
LaemmliBioworld105700201
Lipofectamina 3000 Odczynnik do transfekcjiThermo FisherL3000008
Matrigel GFR matrycamembranowa Corning354230
MetanolFisher ScientificA412P-4
Mr. Frosty Pojemnik do zamrażaniaThermo Fisher51000001
Membrana nitrocelulozowa 0,45 i mikro; mGE Healthcare Life Sciences10600002
Normalna kontrola surowicy koziejThermo Fisher10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)Li-Cor927-40003Bufor blokujący do Western blot
Opti-MEM I Zredukowana surowica MediumThermo Fisher11058021
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
PCR master mixThermo FisherK0172
Inhibitor fosfatazyThermo FisherA32957
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio Rad1610374
PuromycinThermo FisherA1113803
Revert 700 Total Protein Stain do normalizacji Western BlotLi-Cor926-11021
RevertAid zestawThermo FisherK1691
RNA Clean & Concentrator-25Zymo Research CorporationR1018
SkalpeleAspen Surgical372611
Medium do różnicowania komórek mięśni szkieletowychPromocellC23061
Pożywka do wzrostu komórek mięśni szkieletowychPromocellC23060
Triton X-100Acros Organics215682500
odczynnikTRIzolThermo Fisher15596026
Tween 20Fisher ScientificBP337500
Zamrażarka niskotemperaturowaThermo Scientific7402
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher15575020
Vectashield anti blaknięcie podłożemontażowe Vector LabsH1000
'

Bibliografia

  1. Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
  2. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
  3. Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
  4. Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43(2016).
  5. Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
  6. Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
  7. Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
  8. Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5(2019).
  9. Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
  10. De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
  11. Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
  12. Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
  13. Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
  14. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  15. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).
  16. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Reprogramowanie fibroblast wr nicowanie mioblast wtransdukcja lentiwirusowaunie miertelnianie hTERTindukcja MYODtraktowanie doksycyklintworzenie pr kowanych w kien mi niowychbiopsja sk ry

Powiązane artykuły