Method Article

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

DOI:

10.3791/61993

⸱

February 5th, 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University at Buffalo, State University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda klonowania Golden Gate umożliwia szybkie składanie wielu genów w dowolnym, zdefiniowanym przez użytkownika układzie. Wykorzystuje enzymy restrykcyjne typu IIS, które wykraczają poza ich miejsca rozpoznawania i tworzą krótki zwis. Ten modułowy system klonowania (MoClo) wykorzystuje hierarchiczny przepływ pracy, w którym różne części DNA, takie jak promotory, sekwencje kodujące (CDS) i terminatory, są najpierw klonowane do wektora wejściowego. Wiele wektorów wejściowych łączy się następnie w jednostki transkrypcyjne. Następnie kilka jednostek transkrypcyjnych łączy się w plazmid wielogenowy. Strategia klonowania Golden Gate ma ogromną zaletę, ponieważ pozwala na bezbliznowaty, kierunkowy i modułowy montaż w reakcji jednogarnkowej. Hierarchiczny przepływ pracy zazwyczaj umożliwia łatwe klonowanie szerokiej gamy konstruktów wielogenowych bez potrzeby sekwencjonowania poza wektorami wejściowymi. Zastosowanie fluorescencyjnych zaników białek umożliwia łatwe wizualne badania przesiewowe. Praca ta dostarcza szczegółowego, krok po kroku protokołu składania plazmidów wielogenowych przy użyciu zestawu do modułowego klonowania drożdży (MoClo). Pokazujemy optymalne i nieoptymalne wyniki składania plazmidów wielogenowych i dostarczamy przewodnik do badań przesiewowych w kierunku kolonii. Ta strategia klonowania ma duże zastosowanie w inżynierii metabolicznej drożdży i innych sytuacjach, w których wymagane jest klonowanie plazmidów wielogenowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biologia syntetyczna ma na celu projektowanie systemów biologicznych z nowymi funkcjami przydatnymi dla przemysłu farmaceutycznego, rolniczego i chemicznego. Składanie dużej liczby fragmentów DNA w sposób wysokoprzepustowy jest podstawową technologią w biologii syntetycznej. Tak skomplikowany proces może podzielić się na wiele poziomów ze zmniejszającą się złożonością, koncepcja zapożyczona z podstawowych nauk inżynieryjnych1,2. W biologii syntetycznej fragmenty DNA zwykle łączą się hierarchicznie w oparciu o funkcjonalność: (i) Poziom części: "części" odnoszą się do fragmentów DNA o określonej funkcji, takiej jak promotor, sekwencja kodująca, terminator, początek replikacji; (ii) Poziom jednostek transkrypcyjnych (TU): TU składa się z promotora, sekwencji kodującej i terminatora zdolnego do transkrypcji pojedynczego genu; (iii) Poziom wielogenowy: plazmid wielogenowy zawiera wiele TU, często składających się z całego szlaku metabolicznego. Ten hierarchiczny montaż zapoczątkowany przez społeczność BioBrick jest fundamentalną koncepcją składania dużych zestawów DNA w biologii syntetycznej3.

W ciągu ostatniej dekady4,5,6,7, technika klonowania Golden Gate znacznie ułatwiła hierarchiczne składanie DNA2. Wiele innych wieloczęściowych metod klonowania, takich jak klonowanie Gibsona8, klonowanie niezależne od ligacji (SLIC)9, klonowanie oparte na wycinaniu uracylu (USER)10, reakcja cyklu ligazy (LCR)11 oraz rekombinacja in vivo (asembler DNA)12,13, zostały również opracowane do tej pory. Ale klonowanie Golden Gate jest idealną metodą składania DNA, ponieważ jest niezależne od sekwencji specyficznych dla genów, umożliwiając bezbliznowate, kierunkowe i modułowe składanie w reakcji jednogarnkowej. Klonowanie Golden Gate wykorzystuje enzymy restrykcyjne typu IIS, które rozpoznają sekwencję niepalindromiczną, aby utworzyć naprzemienne zwisy poza miejscem rozpoznawania2. Następnie ligaza łączy się z wyżarzonymi fragmentami DNA, aby uzyskać wieloczęściowy zespół. Zastosowanie tej strategii klonowania do systemu klonowania modułowego (MoClo) umożliwiło złożenie do 10 fragmentów DNA z ponad 90% transformantów przesiewanych, zawierających poprawnie zmontowany construct4.

System MoClo oferuje ogromne korzyści, które przyspieszyły cykl projektowania, budowy i testowania biologii syntetycznej. Po pierwsze, wymienne części umożliwiają klonowanie kombinatoryczne w celu szybkiego testowania dużej przestrzeni parametrów. Na przykład optymalizacja szlaku metabolicznego zwykle wymaga przełączania się przez wiele promotorów dla każdego genu, aby zrównoważyć przepływ szlaku. System MoClo z łatwością poradzi sobie z tak wymagającymi zadaniami klonowania. Po drugie, należy zsekwencjonować część plazmidu, ale zazwyczaj nie TU lub plazmidy wielogenowe. W większości przypadków badanie przesiewowe metodą PCR kolonii lub trawienie restrykcyjne jest wystarczające do weryfikacji na poziomie TU i plazmidu wielogenowego. Dzieje się tak, ponieważ klonowanie części plazmidu jest jedynym krokiem wymagającym PCR, który często wprowadza mutacje. Po trzecie, system MoClo idealnie nadaje się do budowy wielogenowych złożonych szlaków metabolicznych. Wreszcie, ze względu na uniwersalne zwisy, plazmidy częściowe mogą być ponownie wykorzystane i udostępnione całej społeczności bioinżynierów. Obecnie zestawy MoClo są dostępne dla plants14,15,5,16,17, fungi6,18,19,20,21,22, bakterie7,23,24,25,26,27, oraz animals28,29. Niedawno wprowadzono również platformę MoClo dla wielu królestw30.

Dla Saccharomyces cerevisiae, Lee et al.6 opracowali wszechstronny zestaw narzędzi MoClo, doskonały zasób dla społeczności zajmującej się biologią syntetyczną drożdży. Ten zestaw jest dostępny w wygodnym formacie 96-dołkowym i definiuje osiem typów wymiennych części DNA z różnorodną kolekcją dobrze scharakteryzowanych promotorów, białek fluorescencyjnych, terminatorów, znaczników peptydowych, markerów selekcyjnych, pochodzenia replikacji i narzędzi do edycji genomu. Ten zestaw narzędzi umożliwia złożenie do pięciu jednostek transkrypcyjnych w plazmid wielogenowy. Cechy te są cenne dla inżynierii metabolicznej drożdży, w której częściowe lub całe szlaki ulegają nadmiernej ekspresji w celu wytworzenia docelowych substancji chemicznych. Korzystając z tego zestawu, naukowcy zoptymalizowali produkcję geraniolu, linaloolu31, penicyliny32, kwasu mukonowego33, indigo34 i betalain35 w drożdżach.

Tutaj udostępniamy szczegółowy, krok po kroku protokół, który pomaga w korzystaniu z zestawu narzędzi MoClo do generowania wielogenowych ścieżek dla ekspresji episomalnej lub genomowej. Dzięki szerokiemu zastosowaniu tego zestawu odkryliśmy, że dokładny pomiar stężeń DNA jest kluczem do zapewnienia równomolowego rozkładu każdej części w reakcji Golden Gate. Zalecamy również ligazę DNA T4 zamiast ligazy DNA T7, ponieważ ta pierwsza działa lepiej przy większej liczbie zwisów36. Wreszcie, wszelkie wewnętrzne miejsca rozpoznawania BsmBI i BsaI muszą zostać usunięte lub udomowione przed montażem. Alternatywnie można rozważyć syntezę części w celu usunięcia wielu wewnętrznych miejsc i jednoczesnej optymalizacji kodonów. Pokazujemy, jak korzystać z tego zestawu narzędzi, wyrażając pięciogenowy szlak produkcji β-karotenu i likopenu w S. cerevisiae. Dalej pokazujemy, jak znokautować locus ADE2 za pomocą narzędzi do edycji genomu z tego zestawu. Te eksperymenty oparte na kolorach zostały wybrane w celu łatwej wizualizacji. Pokazujemy również, jak generować białka fuzyjne i tworzyć mutacje aminokwasów za pomocą klonowania Golden Gate.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Hierarchiczny protokół klonowania oferowany w tym zestawie narzędzi można podzielić na trzy główne kroki: 1. Klonowanie plazmidów częściowych; 2. Klonowanie jednostek transkrypcyjnych (TU); 3. Klonowanie plazmidów wielogenowych (Rysunek 1). Protokół ten rozpoczyna się od projektu startera, a kończy na zastosowaniu sklonowanego plazmidu wielogenowego.

1. Projekt podkładu do klonowania plazmidu części (pYTK001):

  1. Zaprojektuj startery do przodu i do tyłu zawierające boczące nukleotydy TTT na końcu 5', miejsce rozpoznawania BsmBI z dodatkowym nukleotydem (CGTCTCN), zwis 4-nukleotydowy (nt) (TCGG) komplementarny do zwisu wektora wejściowego, miejsce rozpoznawania BsaI z dodatkowym nukleotydem (GGTCTCN) i zwis specyficzny dla części 4-nt, oprócz sekwencji specyficznej dla szablonu (Rysunek 2A). GoldenBraid 4.037 i GoldenMutagenesis38 to tylko niektóre z programów online, które mogą być używane do projektowania podkładów specyficznych dla Golden Gate.
  2. Jeśli miejsca rozpoznawania BsaI lub BsmBI są obecne w jakiejkolwiek części, użyj kroku udomowienia, aby zmutować te miejsca przed Golden Gate assembly39. W przypadku plazmidów integracyjnych (patrz krok 4) udomowić dowolne miejsce rozpoznawania NotI. Aby udomowić część z jednym niepożądanym miejscem rozpoznawania, podziel część na dwie podczęści w pobliżu niepożądanego miejsca (Rysunek 2A):
    1. Zaprojektuj przednią starter pierwszej podczęści w taki sam sposób, jak w kroku 1.1, ale zaprojektuj odwrotny starter z miejscem BsmBI i tylko 4-ntowym zwisem specyficznym dla genu.
    2. Zaprojektuj drugą podczęść startera do przodu z miejscem BsmBI i tylko zwisem specyficznym dla genu 4-nt, który nakłada się na odwrotny starter pierwszej podczęści. Zaprojektuj odwrócony podkład drugiej części podrzędnej w taki sam sposób, jak w kroku 1.1.
    3. Wprowadzić pożądaną mutację (mutacje) w starterze odwrotnym (dla kroku 1.2.1) lub przednim (krok 1.2.2) w regionie specyficznym dla genu startera.
      UWAGA: Alternatywnie, część wolna od BsmBI i BsaI oraz zoptymalizowana pod kątem kodonów może być zsyntetyzowana komercyjnie. W przypadku sekwencji kodujących (CDS) mutacja synonimiczna może być łatwo włączona do trzeciego nukleotydu kodonu aminokwasowego. Jednak w przypadku promotorów i terminatorów zaleca się sprawdzenie aktywności zmutowanego promotora lub terminatora za pomocą testu reporterowego39. Jeśli pod koniec sekwencji znajduje się niepożądane miejsce restrykcyjne, można je zmutować za pomocą dłuższego startera odwrotnego. Jeśli występuje wiele niepożądanych miejsc, można przeprowadzić mutagenezę skierowaną na miejsce, która pozwala na mutację wielu miejsc40.
  3. Czasami pożądane jest połączenie dwóch białek jako pojedynczej części z łącznikiem pomiędzy nimi (Rysunek 2A). Łącznik pomaga zapewnić integralność strukturalną dwóch pojedynczych białek41.
    1. Starter do przodu dla pierwszego genu jest taki sam jak w kroku 1.1. W odwrotnym starterze uwzględnij miejsce BsmBI, zwis specyficzny dla genu 4-nt i sekwencję łącznikową. Zwis 4-nt może być łącznikiem lub kilkoma pierwszymi nukleotydami drugiego genu.
    2. W przypadku drugiego genu zaprojektuj starter do przodu tak, aby miał miejsce rozpoznawania BsmBI i zwis 4-nt komplementarny do startera odwrotnego pierwszego genu. Zaprojektuj odwrotny starter drugiego genu, jak w kroku 1.1.
  4. Aby amplifikować części za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)42, użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby amplifikować części z genomowego DNA, cDNA lub plazmidu. Sprawdź produkt PCR na 1% żelu agarozowym, a następnie oczyścić żel. Zdecydowanie zaleca się stosowanie oczyszczonego DNA, jeśli oczyszczanie żelu jest pracochłonne, należy użyć co najmniej kolumny wirowej do oczyszczenia produktu PCR.

2. Klonowanie części do wektora wejściowego (pYTK001) w celu utworzenia plazmidów części (Rysunek 2B)

  1. Aby ustawić mieszaninę reakcyjną Golden Gate, dodaj 20 fmol każdego produktu PCR i wektor wejściowy (pYTK001), 1 μl buforu ligazy 10X T4, 0,5 μl Esp3I (wysoce wydajny izoschizomer BsmBI) i 0,5 μl ligazy T4. Dodać ddH2O, aby uzyskać całkowitą objętość do 10 μl.
  2. Aby ustawić reakcję klonowania, uruchom następujący program w termocyklerze: 25-35 cykli w temperaturze 37 °C przez 5 minut (trawienie) i 16 °C przez 5 minut (podwiązanie), a następnie końcowe trawienie w temperaturze 50 °C przez 10 minut i inaktywacja enzymów w temperaturze 80 °C przez 10 minut
    UWAGA: W przypadku jednoczesnego klonowania wielu fragmentów DNA do wektora wejściowego zaleca się 35 cykli trawienia/ligacji, na przykład podczas klonowania genów fuzyjnych lub udomowienia genu.
  3. Przekształć całą mieszaninę reakcyjną w szczep DH5α lub równoważne komórki kompetentne chemicznie Escherichia coli poprzez szok cieplny. Zaleca się przekształcenie całego 10 μl sklonowanego produktu w 35 μl chemicznie kompetentnych komórek E. coli (2 X 105 jtk/ml, jtk oblicza się na podstawie przekształcenia 5 ng pYTK001 w 100 μl kompetentnych komórek). Rozprowadzić na talerzu bulionu lizogenicznego (LB) z 35 μg/ml chloramfenikolu (Cm). Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  4. Po 16-18 godzinach wyjąć płytkę z inkubatora i utrzymywać ją w temperaturze 4 °C przez około 5 godzin, aby umożliwić rozwinięcie się białka super zielonego białka fluorescencyjnego (sfGFP) w celu uzyskania bardziej intensywnego zielonego koloru.
  5. Aby ułatwić przesiewanie, umieść płytkę na transiluminatorze światła ultrafioletowego (UV) lub niebieskiego. Kolonie zawierające sfGFP będą fluoryzować w świetle UV.
  6. Zielone kolonie są ujemne, ponieważ zawierają nieoszlifowany pYTK001. Białe kolonie są prawdopodobnie pozytywne. Klonowanie zwykle kończy się sukcesem, jeśli istnieje ~ 30-100% białych kolonii. Przeprowadzić dalsze badania przesiewowe kilku białych kolonii za pomocą PCR kolonii lub trawienia restrykcyjnego (sugerowany enzym: BsaI-HFv2).
  7. Oczyść plazmidy z kilku potencjalnie prawidłowych kolonii i potwierdź sekwencje za pomocą sekwencjonowania Sangera.

3. Składanie plazmidów części w plazmidy "kasetowe"

UWAGA: Plazmid kasetowy zawiera zdefiniowaną przez użytkownika jednostkę transkrypcyjną (TU) składającą się z promotora, CDS i terminatora. Plazmid kasetowy umożliwia ekspresję pojedynczego genu. Jeśli plazmidy kasetowe zostaną złożone w plazmid wielogenowy, pierwszym krokiem jest określenie liczby i kolejności TU w plazmidzie wielogenowym. Określą one, które łączniki należy użyć w plazmidach kasetowych, ponieważ łączniki łączą TU w plazmidzie wielogenowym. Lewe złącze pierwszej jednostki technicznej powinno mieć wartość ConLS, a prawe złącze ostatniej jednostki technicznej powinno mieć wartość ConRE. Będą one pokrywać się z ConLS i ConRE plazmidów wielogenowych. Pozostałe łączniki powinny być w rosnącej kolejności numerycznej. Na przykład, jeśli plazmid wielogenowy zawiera cztery TU, kombinacje łączników to ConLS-TU1-ConR1, ConL1-TU2-ConR2, ConL2-TU3-ConR3 i ConL3-TU4-ConRE (Rysunek 1).

  1. Przed złożeniem jednostek transkrypcyjnych zaleca się złożenie wektora pośredniego z następującymi sześcioma częściami: lewym łącznikiem, zanikiem sfGFP (pYTK047), prawym łącznikiem, markerem selekcji drożdży, pochodzeniem replikacji drożdży i częścią plazmidu z mRFP1, pochodzeniem E. coli i genem opornym na ampicylinę (pYTK083) (Rysunek 3).
    1. Oczyść powyższe sześć plazmidów. Zapisać ich stężenia za pomocą spektrofotometru UV-Vis lub testu fluorescencyjnego i rozcieńczyć każdy plazmid ddH2O, tak aby 1 μl miał 20 fmol DNA. Oblicz stężenie molowe DNA za pomocą kalkulatora online.
      UWAGA: Bardzo ważne jest dokładne zmierzenie stężeń DNA i precyzyjne pipetowanie, aby zespół działał, szczególnie w przypadku zestawów z pięcioma do siedmioczęściowymi plazmidami. Niewielkie błędy w stężeniu DNA każdego plazmidu mogą spowodować znaczny spadek wydajności klonowania.
    2. Dodaj 1 μl każdego plazmidu, 1 μl buforu ligazy 10X T4, 0,5 μl BsaI-HFv2 (wysoce wydajna wersja BsaI) i 0,5 μl ligazy T4. Uzupełnić objętość do 10 μl, dodając ddH2O.
    3. Aby ustawić reakcję klonowania, uruchom następujący program w termocyklerze: 25-35 cykli po 37 °C przez 5 min (trawienie) i 16 °C przez 5 min (podwiązanie). Pomiń końcowe etapy trawienia i inaktywacji ciepła, ponieważ miejsca BsaI muszą zostać zachowane w wektorze pośrednim (Rysunek 3).
    4. Przekształć całą mieszaninę reakcyjną w szczep DH5α lub inne kompetentne komórki E. coli. Rozprowadzić na płytce LB z 50 μg/ml karbenicyliny (Cb) lub ampicyliny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Karbenicylina jest stabilnym analogiem ampicyliny.
    5. Po 16-18 godzinach wyjmij płytkę z inkubatora. Płytka będzie zawierała zarówno bladoczerwone, jak i bladozielone kolonie (ryc. 6C i 6D). Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przez około 5 godzin, aby mRFP1 i sfGFP mogły dojrzeć. Użyj transiluminatora UV lub niebieskiego światła, aby zidentyfikować zielone kolonie, które zawierają potencjalnie prawidłowy wektor pośredni
      6. .
    6. Rozmieść zielone kolonie na płytce LB + Cb i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia ponownie rozsmarować smugi na płytce LB + Cm i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Kolonie rosnące na płytkach LB + Cm zawierają źle zmontowane plazmidy, ponieważ wektory części odporne na Cm są zachowywane.
    7. Wybierz kolonie, które nie rosną na płytce LB + Cm i wykonaj trawienie restrykcyjne (sugerowane enzymy: BsaI-HFv2, Esp3I), aby potwierdzić prawidłowo złożony plazmid. Alternatywnie użyj colony PCR do badań przesiewowych.
  2. Po pomyślnym złożeniu wektora pośredniego następnym krokiem jest złożenie jednostek transkrypcyjnych. Jest to 4-częściowy zespół składający się z następujących części: wektora pośredniego, promotora, CDS i terminatora.
    1. Oczyść czteroczęściowe plazmidy. Zapisz ich stężenia i rozcieńcz każdy z plazmidów tak, aby 1 μl miał 20 fmol DNA.
    2. Aby skonfigurować mieszaninę reakcyjną, wykonaj krok 3.1.2.
    3. Aby skonfigurować reakcję klonowania, wykonaj krok 2.2.
    4. Przekształć całą mieszaninę reakcji klonowania w komórki DH5α lub równoważne komórki E. coli i rozłożyć na LB + Cb. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    5. Po 16-18 godzinach wyjmij płytkę z inkubatora. Pojawią się białe i bladozielone kolonie (ryc. 6E i 6F). Utrzymuj płytkę w temperaturze 4 °C przez około 5 godzin, aby sfGFP dojrzał. Użyj transiluminatora UV lub niebieskiego światła, aby zidentyfikować niefluorescencyjne białe kolonie. Zawierają one potencjalnie poprawne jednostki transkrypcyjne.
    6. Wypuść i wyhoduj 8-10 białych kolonii i wykonaj PCR kolonii. Oczyść plazmidy z kolonii, które dają pozytywny wynik testu PCR na kolonie. Przeprowadzić trawienie restrykcyjne (sugerowany enzym: Esp3I), aby dodatkowo potwierdzić złożenie.
      UWAGA: Sekwencjonowanie jednostek transkrypcyjnych zazwyczaj nie jest konieczne, ponieważ klonowanie obejmuje tylko trawienie restrykcyjne i ligację. Wszystkie interesujące sekwencje zostały potwierdzone na poziomie plazmidu części.

4. Składanie plazmidów kasetowych w plazmidy "wielogenowe":

UWAGA: Plazmidy wielogenowe pozwalają na ekspresję więcej niż jednego genu. W zależności od dalszego zastosowania, plazmidy wielogenowe mogą być replikacyjne lub integracyjne. Plazmidy replikacyjne mają drożdżowe pochodzenie replikacji; Dlatego można go stabilnie utrzymać, gdy komórka drożdży się dzieli. Plazmidy integracyjne nie mają drożdżowego pochodzenia replikacji. Zamiast tego mają ramiona homologiczne 5' i 3', co pozwala na integrację wielu genów w określone loci genomu poprzez rekombinację homologiczną.

  1. W przypadku plazmidów wielogenowych najpierw złóż wektor pośredni.
    1. Aby złożyć replikacyjne wektory pośrednie (Rysunek 4A), złóż następujące sześć części: lewe złącze (ConLS'-pYTK008), zanik sfGFP (pYTK047), prawe złącze (ConRE'-pYTK072), marker wyboru drożdży, drożdżowe pochodzenie replikacji i część plazmidu z mRFP1, pochodzenie replikacji E. coli i gen oporności na kanamycynę (pYTK084).
      1. W przypadku montażu wykonaj kroki od 3.1.1 do 3.1.3.
      2. Przekształć całą mieszaninę reakcji klonowania w komórki kompetentne DH5α lub równoważne E. coli i umieść na płytce LB plus 50 μg/ml kanamycyny (Km). Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
      3. W przypadku rastrowania opartego na kolorach czerwonym/zielonym wykonaj krok 3.1.5.
      4. Do przesiewania nieudanych montaży, smugi i hodowanie zielonych kolonii na płycie LB + Km. Następnie wykonaj krok 3.1.6.
    2. W przypadku integracyjnych wektorów wielogenowych (Rysunek 4B) najpierw określ interesujące nas miejsce genomu, a następnie zaprojektuj około 500 par zasad ramion homologii 5' i 3' do integracji z tym locus.
      1. Sklonuj ramiona homologii 5' i 3' z genomowego DNA drożdży do wektora wejściowego-pYTK001. Wykonaj kroki 1 i 2.
      2. Zbierz następujące siedem plazmidów: lewe złącze (ConLS'-pYTK008), odpadnięcie sfGFP (pYTK047), prawe złącze (ConRE'-pYTK072), marker selekcji drożdży, ramię homologii 3', część plazmidu z mRFP1, pochodzenie replikacji E. coli i gen oporny na kanamycynę (pYTK090) oraz ramię homologii 5'.
      3. W przypadku montażu i kontroli przesiewowej należy postępować zgodnie z krokiem 4.1.1.
  2. Montaż plazmidu wielogenowego
    1. Oczyść plazmidy wektora pośredniego uzyskanego w kroku 4.1 i plazmidy kasetowe z kroku 3. Zapisać ich stężenia za pomocą spektrofotometru UV-VIS lub testu opartego na fluorescencji. Rozcieńczyć każdy w ddH2O tak, aby 1 μl miał 20 fmol DNA.
    2. Dodaj 1 μl wektora pośredniego, 1 μl każdej jednostki transkrypcyjnej, 1 μl 10x buforu ligazy T4, 0,5 μl Esp3I i 0,5 μl ligazy T4. Doprowadzić objętość do 10 μl za pomocą ddH2O.
    3. Aby skonfigurować reakcję klonowania, wykonaj krok 2.2.
    4. Przekształć całą mieszaninę reakcji klonowania w komórki kompetentne DH5α lub równoważne E. coli i umieścić na płytce LB + Km. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
    5. Wykonaj badanie przesiewowe na zielono/biało, jak w kroku 3.2.5.
    6. Oczyść plazmidy z kilku białych kolonii i przeprowadź trawienie restrykcyjne. Stosowanie enzymu NotI-HF jest zalecane, ponieważ istnieją dwa miejsca NotI odpowiednio w części znacznika pochodzenia E. coli i znacznika selekcyjnego Km (Rysunek 4B). Jeśli zmontowany plazmid jest bardzo duży, można wybrać inne miejsce restrykcji w celu dalszego potwierdzenia. Alternatywnie, przesiewaj za pomocą PCR kolonii przed przystąpieniem do trawienia restrykcyjnego.

5. Zastosowanie plazmidów wielogenowych do ekspresji genów chromosomalnych lub plazmidowych

  1. Integracja plazmidu wielogenowego z genomem drożdży w celu ekspresji genów chromosomalnych (Rysunek 5)
    1. Zaprojektuj przewodnik RNA (gRNA) dla żądanego locus. Zaleca się korzystanie z wielu zasobów online, takich jak Benchling, CRISPRdirect43 i CHOPCHOP44, w celu określenia maksymalnej swoistości dla celu.
    2. Sklonuj zsyntetyzowane 20-nt gRNA do plazmidu pCAS class45 przez klonowanie Gibsona. Linearyzuj plazmid pCAS metodą PCR przy użyciu odwróconej pary starterów wiążącej odpowiednio z 3' rybozymu HDV i 5' tracrRNA (Figura 5). Alternatywnie, sklonuj gRNA do plazmidu dropout sgRNA (pYTK050) i złóż plazmid dropout w plazmid kasetowy z łącznikami. Następnie zmontuj Cas9 TU z plazmidem części Cas9 (pYTK036). Na koniec złóż Cas9 TU i sgRNA TU w replikacyjny plazmid wielogenowy.
    3. Linearyzować 5-15 μg integracyjnego plazmidu wielogenowego z 1 μl enzymu NotI-HF przez noc. Przekształć 1 μg pCAS-gRNA i zlinearyzowany integracyjny plazmid wielogenowy w S. cerevisiae. Przygotuj kompetentne komórki, korzystając z dostępnego na rynku zestawu do transformacji drożdży lub zgodnie z protokołem Geitza i Schiestl, 200746.
      UWAGA: Nie ma potrzeby oczyszczania zlinearyzowanego plazmidu wielogenowego po trawieniu NotI.
    4. Po odzyskaniu otoczkować ogniwa, wyrzucić supernatant, przemyć równą objętością wody. Płytki komórek drożdży na kompletnej pożywce syntetycznej (CSM) lub płytce z pożywką z dekstrozy peptonowej (YPD) z ekstraktem drożdżowym z antybiotykami, w zależności od markera selektywnego drożdży. Inkubować w temperaturze 37 °C przez dwa dni, aby powstały kolonie. W przypadku braku kolonii należy inkubować przez dodatkowy jeden do dwóch dni w temperaturze 30°C.
    5. Przesiewanie kolonii drożdży pod kątem integracji przez kolonię PCR47.
    6. Aby wyleczyć pCAS, należy usunąć kolonię z prawidłową integracją na nieselektywnej płytce YPD. Rośnie w temperaturze 30 °C przez noc. Przenieś jedną kolonię z płytki YPD na świeżą płytkę YPD. Ponownie rośnie w temperaturze 30 °C przez noc. Prążkować kolonię od drugiej płytki YPD do YPD plus 100 μg/ml nourseotrycyny, markera selekcyjnego pCAS. Udane utwardzenie następuje, gdy komórki drożdży nie rosną na selektywnej płytce.
      UWAGA: Jeśli plazmid pCAS nie zostanie utwardzony w dwóch rundach nieselektywnego YPD, ponownie nałóż smugę na świeży YPD przez kolejne 1-2 rundy.
  2. Transformacja replikacyjnego plazmidu wielogenowego w celu ekspresji genów opartej na plazmidzie
    1. Przekształć 100 ng-1 μg czystego plazmidu wielogenowego w kompetentne komórki S. cerevisiae.
    2. Umieść komórki drożdży na płytce natychmiast po przemianie na płytce CSM lub płytce YPD plus antybiotyk, w zależności od użytego markera selekcji drożdży. Inkubować w temperaturze 30°C przez 2-3 dni, aby powstały kolonie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj wyniki czterech replikacyjnych plazmidów wielogenowych do produkcji β-karotenu (żółty) i likopenu (czerwony). Skonstruowano jeden integracyjny plazmid wielogenowy do zakłócania locus ADE2, którego kolonie są czerwone.

Klonowanie CDS do wektora wejściowego (pYTK001)
ERG20 amplifikowano z genomu drożdży i trzech genów karotenoidowych crtE, crtYB, crtI z plazmi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zestaw do klonowania oparty na MoClo opracowany przez Lee i in. stanowi doskonałe źródło do szybkiego składania od jednej do pięciu jednostek transkrypcyjnych w plazmid wielogenowy w celu replikacji lub integracji z genomem drożdży. Zastosowanie tego zestawu eliminuje czasochłonne wąskie gardło klonowania, które często występuje w przypadku ekspresji wielu genów u drożdży.

Przetestowaliśmy pięć różnych warunków dla cykli trawienia/ligacji klonowania Golden Gate za pomocą ligazy DNA T4. Stwierd...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Badawczą Uniwersytetu Stanowego w Nowym Jorku (Nagroda #: 71272) oraz Nagrodę IMPACT Uniwersytetu w Buffalo (Nagroda #: 000077).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Koraliki szklane 0,5 mmProdukty badawcze RPI9831Do lizy komórek drożdży
Bacto AgarBD & Firma214010Składnik drożdży kompletnej pożywki syntetycznej (CSM)
Bacto PeptoneBD& Firma211677Składnik pożywki z dekstrozy peptonowej (YPD)
BsaI-HFv2New England BiolabsR3733Swysoce wydajna wersja enzymu restrykcyjnego BsaI
KarbenicylinaFisher Bioodczynniki4800-94-6Antybiotyk do badań przesiewowych na poziomie jednostki transkrypcyjnej
ChloramfenikolFisher Bioreodczynniki56-75-7Antybiotyk do badań przesiewowych w poziom wektora wejściowego
CSM-HisSunrise Sciences1006-010Suplement aminokwasowy drożdży kompletne podłoże syntetyczne (CSM)
DekstrozaFisher ChemicalD16-500Źródło węgla drożdży kompletne podłoże syntetyczne (CSM)
Difco Drożdże Azot Baza bez aminokwasówBD i Firma291940Źródło azotu drożdży kompletna pożywka syntetyczna (CSM)
dNTP mixPromegaU1515dNTP do PCR
Esp3INew England BiolabsR0734Swysoce wydajny izoschizomer BsmBI
Mrożone-EZ Zestaw do trasformacji drożdży IIZymo ResearchT2001Do przemiany drożdży
HeksanyFisher ChemicalH302-1Do ekstrakcji karotenoidów z komórek drożdży
KanamycynaOdczynniki Fishera25389-94-0Antybiotyk do badań przesiewowych na poziomie plazmidu wielogenowego
LB Agar, MillerFisher BioreagentsBP1425-2Lizogeniczne podłoże agarowe do hodowli E. coli
bulionu LB, MillerFisher BioreagentsBP1426-2Lizogeniczne płynne podłoże dla E. coli hodowla
chemikaliów likopenuna KajmanachNC1142173Do oznaczania ilościowego likopenu
MoClo YTKAddgene1000000061Laboratorium deponujące: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BiolabsT1010LDo oczyszczania plazmidu z E.coli
Nanodrop SpektrofotometrThermo ScientificND2000cDo pomiaru dokładnych stężeń DNA
NotI-HFNew England BiolabsR3189SEnzym restrykcyjny do integratywnej wielogenowej linearyzacji plazmidu
Siarczan nourseotrycynyGoldbioN-500-100Marker wyboru antybiotyku dla plazmidu pCAS użytego w tym badaniu
Bufor reakcyjny Phusion HF (5X)New England BiolabsB0518SBufor do PCR przy użyciu polimerazy Phusion
Polimeraza DNA o wysokiej wierności PhusionNew England BiolabsM0530SPolimeraza o wysokiej wierności dla wszystkich reakcji PCR
pLM494Addgene100539Plazmid używany do amplifikacji crtI, crtYB i crtE użytych w tym badaniu
Kuweta kwarcowaThermo Electron10050801Do ilościowego oznaczania karotenoidów
Ligazy T4New England BiolabsM0202SLigaza dla złotego Termocykler do klonowania bramek
BIO-RAD1851148Do wykonywania wszystkich reakcji PCR i klonowania
Homogenizator tkankowyBullet BlenderModel: BBX24Do homogenizacji komórek drożdży
Spektrofotometr UV-VisThermo ScientificGenesys 150Do ilościowego oznaczania karotenoidów Ekstrakt drożdżowy
Odczynniki FisherBP1422-500Składnik pożywki z dekstrozy peptonowej (YPD)
i beta;-karotenuAlfa AesarAAH6010603Do oznaczania ilościowego β-karotenu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
  2. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553(2009).
  3. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5(2008).
  4. Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
  5. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622(2011).
  6. Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
  7. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892(2018).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  10. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55(2007).
  11. de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16(2009).
  13. Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
  14. Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  15. Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185(2018).
  16. Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
  17. Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
  18. Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
  19. Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
  20. Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123(2017).
  21. Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
  22. Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
  23. Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
  24. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  25. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
  26. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  27. Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
  28. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  29. Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
  30. Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131(2019).
  31. Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965(2018).
  32. Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker's yeast. Nature Communications. 8, 15202(2017).
  33. Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
  34. Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
  35. Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
  36. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  37. Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
  38. Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932(2019).
  39. Engler, C., Sylvestre, M. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. 1116, Humana Press. Ch. 9 119-131 (2014).
  40. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91(2008).
  41. Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
  42. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, Pt 1 263-273 (1986).
  43. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
  44. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
  45. Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
  46. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  47. Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
  48. Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931(2018).
  49. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  50. Jones, E., et al. The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast 181(1982).
  51. Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
  52. Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Golden Gate CloningModular CloningMulti Gene AssemblyYeast MoClo KitType IIS EnzymesEntry Vector CloningTranscription Unit AssemblyFluorescent Protein ScreeningDH5 Alpha TransformationUV Transilluminator Screening

Related Articles