Wykorzystanie Grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów Saccharomyces cerevisiae

Podsumowanie

Tutaj opisujemy wykorzystanie Grafix (Gradient Fixation), wirowania gradientu glicerolu w obecności środka sieciującego, do identyfikacji interakcji między czynnikami splicingowymi, które przejściowo wiążą się z kompleksem spliceosomów.

Streszczenie

Splicing pre-mRNA to bardzo dynamiczny proces, który obejmuje wiele molekularnych przegrupowań podkompleksów spliceosomów podczas składania, przetwarzania RNA i uwalniania złożonych składników. Wirowanie w gradionym gradieniu glicerolu zastosowano do rozdzielania kompleksów białkowych lub RNP (RiboNucleoProtein) do badań funkcjonalnych i strukturalnych. W tym miejscu opisujemy zastosowanie Grafix (Gradient Fixation), który został po raz pierwszy opracowany do oczyszczania i stabilizacji kompleksów makromolekularnych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek, w celu identyfikacji interakcji między czynnikami splicingowymi, które wiążą się przejściowo z kompleksem spliceosomów. Metoda ta opiera się na odwirowaniu próbek do rosnącego stężenia odczynnika utrwalającego w celu stabilizacji kompleksów. Po odwirowaniu ekstraktów drożdżowych ogółem załadowanych gradientami glicerolu, odzyskane frakcje są analizowane za pomocą dot blot w celu identyfikacji podkompleksów spliceosomów i określenia obecności poszczególnych czynników splicingowych.

Wprowadzenie

Splicing to bardzo dynamiczny proces, który wymaga powiązania i uwolnienia wielu czynników w skoordynowany sposób. Te czynniki splicingu obejmują między innymi białka wiążące RNA, ATPazy, helikazy, kinazy białkowe i fosfatazy, ligazy ubikwityny^1,2,3; aby umożliwić przegrupowania molekularne, niektóre z tych czynników wiążą się bardzo przejściowo z podkompleksami spliceosomów, co sprawia, że izolacja i identyfikacja tych kompleksów pośrednich RNP jest bardzo trudna.

Tutaj użyliśmy metody Grafix^4,5 do ustabilizowania interakcji czynnika splicingu drożdży Cwc24 z kompleksem B^act6 aby umożliwić identyfikację innych czynników związanych jednocześnie z tym podkompleksem i określić, czy ligaza ubikwityny Prp19 odgrywa jakąkolwiek rolę w wiązaniu lub uwalnianiu Cwc24 do kompleksu Nineteen (NTC) i do końca 5' intronu przed aktywacją i zachodzi pierwsza reakcja transestryfikacji. Zaletą wystawienia makrocząsteczek na rosnące stężenie środka sieciującego wzdłuż gradientu glicerolu jest to, że pozwala to uniknąć wiązań krzyżowych między kompleksami^4,5, a tym samym tworzenia agregatów.

Ta metoda została użyta jako uzupełnienie testów koimmunoprecypitacji białek i pull-down, które, mimo że pozwalają na izolację dużych kompleksów, mogą nie być wiarygodne w utrzymywaniu przejściowych interakcji w dużych kompleksach dynamicznych7^,8. Zastosowanie odczynników utrwalających w gradiacji glicerolu stabilizuje wiązanie takich czynników, pozwalając na potwierdzenie oddziaływań określonych białek z podkompleksami splicingowymi. Ponieważ wybrany środek sieciujący był chemicznie nieodwracalny, białka obecne w odzyskanych frakcjach analizowano metodą dot blot po odwirowaniu gradientowym.

Protokół

1. Przygotowanie ekstraktu drożdżowego

1. Hoduj komórki drożdży wyrażające jeden z czynników splicingowych połączonych z tagiem TAP⁹ w 1 l pożywki YNB-glu (na bazie azotu drożdżowego uzupełnionej 2% glukozy m/v) z odpowiednimi aminokwasami lub zasadami nukleinowymi, w tym przypadku adeniną (20 μg/ml), leucyną (30 μg/ml), tryptofanem (30 μg/ml), do OD₆₀₀ = 1,0.
2. Zebrać komórki z 1 l hodowli przez odwirowanie w trzech butelkach wirówkowych o pojemności 500 ml przy 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przemyć dwukrotnie 10 ml zimnej sterylnej wody.
3. Ponownie zawiesić zebrane komórki drożdży w 1/10 objętości komórki zimnego buforu A (10 mmol ^L-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 mmol ^L-1 MgCl₂, 50 mmol ^L-1 KCl, 5% v/v glicerolu, 0,5 mmol ^L-1 DTT, koktajl inhibitorów proteazy wolny od EDTA).
4. Zamrozić małe krople zawiesiny komórkowej w ciekłym azocie. Małe krople można uzyskać, pipetując zawieszony roztwór komórek i wrzucając 50 μl bezpośrednio do ciekłego azotu.
   UWAGA: Ciekły azot może spowodować obrażenia w kontakcie ze skórą lub oczami. Posługiwać się odpowiednim sprzętem ochronnym.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Zamrożone krople zawiesiny komórkowej można przechowywać w temperaturze -80 °C.
5. Przygotuj lizaty komórek drożdży, mieląc w młynie kulowym przez sześć cykli z prędkością 20 Hz/s przez 3 min.
   UWAGA: Po każdym cyklu zanurz pojemnik zawierający zamrożone komórki w ciekłym azocie, aby uniknąć stopienia. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Zamrożone ekstrakty można przechowywać w temperaturze -80 °C. Ekstrakty do splicingu drożdży można również przygotować przy użyciu homogenizatorów do lizy sferoplastów¹⁰ lub przy użyciu moździerza i tłuczka^11,12.
6. Rozpuść ekstrakt, umieszczając zawierające go probówki w wodzie o temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wstrząsając.
7. Ekstrakty wirówkowe w ilości 45 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
8. Określić ilościowo zawartość białka w oczyszczonym supernatantze metodą BCA¹³.
9. Przygotować porcje ekstraktów, szybko je zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Przygotowanie gradientu glicerolu

1. Przygotować dwa roztwory glicerolu w buforze A, jeden zawierający 10% v/v, a drugi zawierający 30% v/v glicerolu.
2. Dodaj środek sieciujący aldehyd glutarowy do 0,1% v/v w roztworze glicerolu 30% v/v i wymieszaj do homogenizacji.
   UWAGA: Z aldehydem glutarowym należy obchodzić się wewnątrz dygestoria przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego.
3. Dodać 6 ml zimnego roztworu glicerolu o stężeniu 10% v/v na dno probówki wirówkowej o pojemności 12 ml (14 x 89 mm).
4. Dodać 6 ml zimnego roztworu glicerolu o stężeniu 30% v/v uzupełnionego aldehydem glutarowym za pomocą strzykawki przymocowanej do długiej igły dostarczonej z urządzeniem Gradient Master na dnie probówki, tuż pod 10% v/v roztworem glicerolu.
   UWAGA: Alternatywnie, 10% v/v roztwór glicerolu można ostrożnie odpipetować na wierzchu 30% v/v roztworu glicerolu/aldehydu glutarowego.
5. Użyj urządzenia Gradient Master, aby wygenerować ciągły gradient gęstości.
   UWAGA: W urządzeniu Gradient Master rurki umieszcza się w odpowiednim stojaku i krótko obraca, postępując zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi określania parametrów (czas/kąt/prędkość). W tej pracy użyliśmy: 2:25 min/81,5°/11 rpm.
6. Ostrożnie dodaj 200 μl 7% v/v glicerolu/buforu Poduszka A na wierzchu tuż przed dodaniem ekstraktów komórkowych.
   UWAGA: Stężenie glicerolu w poduszce musi być niższe niż mniej stężony roztwór glicerolu użyty do utworzenia gradientu liniowego.

3. Odwirowanie ekstraktów

1. Załaduj około 2 mg białka całkowitego na wierzch każdego 12 ml liniowego gradientu glicerolu 10%-30% aldehydu glutarowego z poduszką.
2. Umieść rurki we wstępnie schłodzonym wirniku z kubełkiem obrotowym.
   UWAGA: Z probówkami należy obchodzić się delikatnie, aby uniknąć mieszania przed ultrawirowaniem.
3. Wirować przy 194 000 x g przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
4. Każdą probówkę o pojemności 12 ml podzielić na dwadzieścia cztery frakcje o pojemności 500 μl za pomocą dostosowanego EconoSystem lub ostrożnie pipetując.
   UWAGA: Dostosowany system EconoSystem składa się z pompy perystaltycznej, detektora UV i kolektora frakcji podłączonego do urządzenia perforującego rurkę. Profil sedymentacji można monitorować poprzez pomiar absorbancji przy 280 nm.
5. Użyj roztworu glicerolu 40% v/v przez pompę perystaltyczną, aby przepchnąć glicerolu o gradiacji 10%-30% z rurki do kolektora frakcji.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Frakcje należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
6. Załadować 50 μl każdej frakcji bezpośrednio na membrany nitrocelulozowe za pomocą urządzenia do robienia kropek lub plam szczelinowych. Wykryj białko za pomocą immunoblot za pomocą przeciwciała przeciwko CBP (1:6 000, w celu wykrycia części CBP znacznika TAP) i anty-króliczej IgG sprzężonej z peroksydazą chrzanową (1:15 000) jako przeciwciałem drugorzędowym.

Wyniki

Aby przeanalizować profil sedymentacji Cwc24-TAP i ustalić, czy metoda Grafix była skuteczna w stabilizowaniu jej wiązania z podkompleksami splicingowymi, rozdzieliliśmy całkowite ekstrakty drożdżowe komórek wyrażających Cwc24-TAP poprzez wirowanie na gradientach glicerolu, w obecności lub bez aldehydu glutarowego jako środka sieciującego. Próbki dwudziestu czterech frakcji o pojemności 500 μl analizowano następnie za pomocą slot blot z przeciwciałem przeciwko części CBP znacznika TAP. Wyniki pokazują, że przy braku środ...

Dyskusja

Oddziaływania białko-białko i kwasy rybonukleinowe-białko można stabilizować za pomocą środków sieciujących. Ważne jest, aby powstały kompleks był stabilny, aby wytrzymać ultrawirowanie na gradiencie glicerolu. Ponadto warunki bufora powinny zezwalać na interakcję, ale być na tyle rygorystyczne, aby uniknąć niespecyficznego powiązania. W przedstawionych tutaj eksperymentach użyliśmy roztworu buforowego już ustalonego dla reakcji splicingu in vitro¹⁵.

Szybkość i czas wir...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Epitop białka wiążącego anty-kalmodulinę	Millipore	07-482
ECL anty-królicze IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Zastosowane części EconoSystem: pompa perystaltyczna, detektor UV i kolektor frakcji
Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA	Roche	11873580001
System odzyskiwania frakcji	Beckman Coulter	270-331580	Urządzenie do perforacji rury, które było połączone z częściami EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Młyn mieszający MM 200	Retsch	207460001	Młyn kulowy
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Wirówka	Sorvall RC 6 PlusThermo Scientific	36-101-0816
Obrotowy wirnik kubełkowy P40ST	Ultrawirówka Hitachi
CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-przezroczyste probówki wirówkowe (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059