Hodowle wzbogacone w stożki z siatkówki zarodków kurczaka w celu zbadania interakcji komórkowych między pręcikami a czopkami

Summary

Opisujemy metodę uzyskiwania pierwotnych kultur fotoreceptorów czopków z siatkówki zarodków kurczaków i jej wykorzystanie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości.

Abstract

Ludzkie widzenie dzienne opiera się na funkcji fotoreceptorów czopków w centrum siatkówki, dołka centralnego. Pacjenci cierpiący na najczęstszą postać dziedzicznego zwyrodnienia siatkówki, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, tracą widzenie w nocy z powodu utraty fotoreceptorów pręcików spowodowanej mutacją, po której następuje postępująca utrata funkcji i śmierć czopków prowadząca do ślepoty. Genetycy zidentyfikowali wiele genów z mutacjami powodującymi tę chorobę, ale pierwsze zidentyfikowane mutacje kwestionowały mechanizmy wtórnego zwyrodnienia czopków i to, w jaki sposób dominująca mutacja w genie rodopsyny kodującym pigment wzrokowy wyrażany wyłącznie w pręcikach może wywołać zwyrodnienie czopków.

Ten wynik przeszczepów w genetycznym modelu choroby doprowadził do koncepcji interakcji komórkowych między pręcikami i czopkami oraz niekomórkowej autonomicznej degeneracji czopków we wszystkich genetycznych formach barwnikowego zwyrodnienia siatkówki.

Czopki stanowią 5% wszystkich fotoreceptorów u ludzi i tylko 3% u myszy, więc ich badanie jest trudne u tych gatunków, ale czopki przewyższają liczebnie pręciki u gatunków ptaków. Przystosowaliśmy płytki 96-dołkowe do hodowli prekursorów siatkówki z siatkówki zarodków kurczaków na etapie 29 ich rozwoju. W tych hodowlach pierwotnych czopki stanowią 80% komórek po różnicowaniu in vitro. Komórki ulegają degeneracji w ciągu jednego tygodnia przy braku surowicy. W tym miejscu opisujemy metody i ich standaryzację.

Ten system hodowli wzbogacony o stożki został użyty do identyfikacji czynnika żywotności stożków pochodzącego z nabłonka (EdCVF) poprzez badanie przesiewowe o wysokiej zawartości znormalizowanej biblioteki cDNA nabłonka siatkówki szczura. Rekombinowany EdCVF zapobiega degeneracji czopków.

Introduction

Siatkówka gatunków kręgowców jest podwójna, z fotoreceptorami pręcikowymi do widzenia w słabym świetle i fotoreceptorami czopków do widzenia światła dziennego, kolorów i ostrości. Ostrość wzroku naczelnych opiera się na obszarze w środku siatkówki, zwanym dołkiem centralnym, który jest wzbogacony w czopki, ale ogólnie czopki stanowią tylko 5% wszystkich fotoreceptorów. W związku z tym analiza czopków w siatkówce naczelnych, a zwłaszcza hodowla czopków, jest technicznie trudna. Wszystkie inne gatunki ssaków nie mają dołka centralnego, a odsetek czopków jest niski u gryzoni, które są najczęściej wykorzystywane w badaniach siatkówki. Inaczej jest w przypadku gatunków ptaków, u których czopki dominują w siatkówce tych dobrze widzących gatunków ptaków. Dinozaury, które zdominowały ekosystem, gdy ssaki pojawiły się po raz pierwszy podczas ewolucji, mają filogenetyczne pochodzenie ptaków¹. W wyniku takiej konkurencji między dinozaurami a wczesnymi ssakami, ssaki te prowadzą głównie nocny tryb życia, a siatkówki są zdominowane przez pręciki. Dopiero później, w trakcie ewolucji, dzienne widzenie niektórych gatunków ssaków, do których należą naczelne, stało się ewolucyjną przewagą. Niemniej jednak okres rodowy pozostaje atawizmem nocnego wąskiego gardła w ewolucji widzenia ssaków^2,3.

Podczas badania różnicowania komórek siatkówki, Adler i Hatlee wykazali, że fotoreceptory reprezentują około 70% zróżnicowanych komórek siatkówki w hodowlach pochodzących od kurczaka w dniu embrionalnym (ED) 6 lub etapie 29⁴. Ze względu na rozpowszechnienie czopków w siatkówce kurzej, hodowle komórek siatkówki z zarodków kurczaków ED6 zostały opracowane jako kultury wzbogacone w czopki⁵.

Znaczenie ostrości wzroku za pośrednictwem stożków dla człowieka to truizm. Osoby dotknięte chorobami genetycznymi lub starzejącymi się, które zmieniają funkcję czopków, są znacznie upośledzone. Przyczyniło się to do powstania bardzo dużej liczby badań nad dziedzicznymi zwyrodnieniami siatkówki (IRD) w celu znalezienia metod leczenia tych chorób powodujących ślepotę^6,7. Pierwszy sukces, uzyskany przy użyciu rekombinowanego wektora związanego z adenowirusem (AAV) w terapii ciężkiej postaci wrodzonej ślepoty IRD Lebera (LCA), jest dowodem słuszności koncepcji terapii genowej⁸. Identyfikacja genów, których mutacje wywołują IRD, otwiera możliwość wyleczenia tych chorób za pomocą terapii genowej. Niemniej jednak choroby te wynikają z mutacji w ponad 200 różnych genach⁹. Nawet w przypadku autosomalnych recesywnych postaci IRD, kiedy ponowne wprowadzenie normalnej kopii chorobowego genu może przywrócić funkcję wzrokową, koszt ekonomiczny każdego indywidualnego rozwoju faworyzuje te najbardziej rozpowszechnione ze szkodą dla mniej powszechnych i tych, których pochodzenie genetyczne pozostaje nieznane. Fakt ten skłonił naukowców do zastanowienia się nad bardziej ogólnymi terapiami. Apoptotyczna śmierć komórek pojawiła się jako powszechny szlak i cel terapeutyczny tych chorób, które postępują poprzez degenerację fotoreceptorów, w tym dla form autosomalnych dominujących^10,11. Brakuje jednak sukcesów takiego podejścia. W przypadku najczęstszej postaci IRD, barwnikowego zwyrodnienia siatkówki (RP), wspólnym szlakiem jest wtórna utrata funkcji, po której ostatecznie następuje zwyrodnienie czopków^12,13. Zapobieganie utracie funkcji czopków pozwoli zachować centralne widzenie dołka niezależnie od mutacji sprawczych¹⁴.

We wczesnym stadium RP, utrata pręcików powoduje zmniejszenie ekspresji czynnika żywotności czopków pochodzących z pręcików (RdCVF), kodowanego przez gen NXNL1 podobny do nukleoredoksyny 1, który przerywa sygnalizację metaboliczną i redoks między pręcikami i czopkami¹⁵. Podanie rekombinowanego AAV kodującego dwa produkty genu NXNL1, czynnik troficzny RdCVF i enzym tioredoksyny RdCVFL, może teoretycznie zapobiec utracie widzenia stożków we wszystkich formach genetycznych RP¹⁶. Wykazaliśmy, że produkt genu NXNL1, RdCVFL, ulega ekspresji w kulturach wzbogaconych w szyszki kurczaka¹⁷ i gdzie pełni rolę ochronną¹⁸. RdCVF i gen NXNL1 zidentyfikowano za pomocą badań przesiewowych o wysokiej zawartości biblioteki cDNA siatkówki przy użyciu przeżycia komórek z hodowli wzbogaconej w stożki, jak to było readout¹⁹. Przebadaliśmy równowartość 210 000 indywidualnych klonów biblioteki, używając 8 równoległych testów dla każdego klonu. Stanowi to bardzo dużą liczbę badań wymagających łatwego dostępu do materiału biologicznego, jakim są siatkówki zarodków kurzych. Stwierdziliśmy, że stosunkowo łatwo jest uzyskać zarodki kurze raz w tygodniu, ponieważ są one powszechnie produkowane dla przemysłu rolnego dla kur niosek i kurcząt przeznaczonych do produkcji mięsa. Po starannej standaryzacji kultur wzbogaconych w stożki, system zapewnia łatwy, solidny i powtarzalny sposób testowania tysięcy cząsteczek pod kątem ich zdolności do zachowania żywotności stożków. Komórki te są również podatne na manipulacje genetyczne²⁰, które przynoszą korzyści w badaniach nad transdukcją sygnału i analizach biochemicznych^21,22,23.

Badacze siatkówki opracowali alternatywne metody wykorzystania linii komórek stożkowych 661W^24,25,26. Niemniej jednak tożsamość tej linii komórkowej pozostaje kontrowersyjna^27,28. Komórki o mocy 661W sklonowano z guzów siatkówki transgenicznej linii myszy, która wyraża duży antygen T SV40 pod kontrolą ludzkiego promotora białka wiążącego retinol między fotoreceptorami. Duży antygen T SV40 pośredniczy w transformacji komórkowej i nieśmiertelności. W związku z tym szlak sygnałowy zidentyfikowany za pomocą komórek o mocy 661 W musi być opisany w kontekście przekształconej i unieśmiertelnionej linii komórkowej, która pod wieloma względami różni się od czopków in situ. Pod tym względem system hodowli wzbogacony w czopki składa się z pierwotnych neuronów, czopków, które są bardziej fizjologicznie istotne.

Chociaż możliwe jest uzyskanie czystej kultury fotoreceptorów za pomocą wibratomu przekroju siatkówki myszy, bardzo niski procent czopków w zewnętrznej siatkówce gryzoni sprawia, że to podejście nie nadaje się do produkcji kultur wzbogaconych w czopki²⁹. Siatkówka świni nie zawiera dołka centralnego, ale ma obszar zwany obszarem centralnym, który jest bardzo wzbogacony w stożki³⁰. Wysoki odsetek czopków u gryzoni w siatkówce, takich jak Arvicanthis ansorgei i Psammomys obsesus^31,32, oferuje możliwe rozwiązanie, ale wymaga hodowli tak egzotycznych gatunków. Dorosłe oczy świni, zebrane z lokalnych rzeźni, mogą być użyte do wytworzenia mieszanej kultury pręcików i czopków, które zostały użyte do badania przeżywalności fotoreceptorów³³. Eleganckim rozwiązaniem jest wstępne oczyszczenie czopków z siatkówki świni za pomocą płukania lektyną aglutyniny z orzeszków ziemnych (PNA), która selektywnie wiąże się z czopkami³⁴. Niemniej jednak metoda ta jest trudna do wdrożenia na dużą skalę ze względu na swoją złożoność.

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) oferują najbardziej obiecujące podejście do uzyskania populacji komórek fotoreceptorowych w kształcie czopków, które mogą być wykorzystane do przeszczepu siatkówki, ale które mogą być również dostosowane do hodowli wzbogaconej w stożki^35,36. Ponieważ czynnik transkrypcyjny NRL jest wymagany dla fotoreceptorów pręcików³⁷, mysz Nrl-/- ma siatkówkę zdominowaną przez czopki krótkofalowe (czopki S). Inaktywacja może być wykorzystana do wytworzenia preparatu wzbogaconego w stożek S poprzez różnicowanie człowieka od iPS^38,39. Innym możliwym podejściem jest promowanie różnicowania czopków za pomocą sygnalizacji hormonów tarczycy⁴⁰. Podczas gdy pojawiają się nowe metody wytwarzania kultur wzbogaconych w szyszki z ludzkich iPS, zarodki kurze stanowią obecnie sprawdzoną metodę¹⁹.

Kultura wzbogacona o stożek odegrała zasadniczą rolę w identyfikacji RdCVF przez klonowanie wyrażeń¹⁹. System ten został również z powodzeniem wykorzystany do wykazania, że RdCVF stymuluje wychwyt glukozy i jej metabolizm poprzez glikolizę tlenową²². Ponadto wykorzystano hodowlę wzbogaconą w stożki, aby potwierdzić ochronną rolę RdCVFL, drugiego produktu genu NXNL1 ²³. Niedawno system ten został wykorzystany do wykazania istnienia cząsteczek ochronnych wydzielanych przez barwnikowe komórki nabłonkowe siatkówki transdukowane za pomocą OTX2⁴¹.

Protocol

Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Pierre'a i Marii Curie oraz francuskie ministerstwo badań (Numer zezwolenia: APAFIS#1028 2015070211275177). Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone na podstawie następującego zezwolenia: "Certificat d'autorisation d'expérimenter sur les animaux vertébrés A-75-1863. Préfecture de Police de Paris (9 listopada 2011 – 8 listopada 2016)".

1. Inkubacja zapłodnionych jaj

1. Zbieraj cotygodniowe zapłodnione jaja (szczep I 657, czerwona etykieta), uzyskane w sposób naturalny, w przemysłowej wylęgarni.
2. Utrzymuj zapłodnione jaja w temperaturze 17°C (ich biologiczne zero) w laboratorium po ich "złożeniu" przez kurę.
3. Dla każdej kultury inkubować siedem zapłodnionych jaj przez 24 godziny w temperaturze 20 °C, a następnie 136 godzin w temperaturze 37 °C z przerywanym odwróceniem nachylenia jaj (postępujący ruch przez 2 godziny z jednej strony na przeciwną, cykl 4-godzinny) jaj w wilgotnej komorze.

2. Odzyskiwanie zarodków kurcząt

1. Umyj powierzchnię siedmiu jaj środkiem dezynfekującym (np. Pursept A express).
2. Aby rozbić skorupkę jajka, zrób otwór w górnej części skorupy za pomocą dużych prostych szczypiec. Następnie pokrój skorupkę, aby zdjąć kapelusz z jajka jako jajko na miękko.
3. Delikatnie pobrać każdy zarodek ze skorupki jaja za pomocą zakrzywionych kleszczyków, a następnie przenieść go na szalkę Petriego zawierającą sterylny bufor fosforanowy z solą fizjologiczną (PBS) uprzednio podgrzaną do temperatury 37 °C. Delikatnie usunąć otoczkę otaczającą zarodki (kosmówkę lub błonę kosmówkowo-omocznikową).
4. Sprawdź etap rozwoju każdego zarodka poprzez wizualne porównanie z Hamburger i Hamilton⁴².
5. Wybierz dwa zarodki w 29^etapie rozwoju (Rysunek 1). Skrzydła zginają się w łokciach. Kołnierz wyraźnie się wyróżnia. Projekt ustawy jest bardziej widoczny niż na 28. etapie.
6. Wyłuszczenie oczu tych wybranych zarodków i przeniesienie ich na pożywkę niezależną od CO₂ (technologie Life).
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby zarodek był w stadium 29, a nie w stadium 28 lub 30 (Ryc. 1); Dlatego konieczne jest wysiadywanie co najmniej 7 jaj, nawet jeśli ostatecznie zostaną wykorzystane tylko dwa. Kosmówka jest bardzo cienka, więc trudna do odróżnienia, ale znajduje się bardzo blisko zarodka, więc musi zostać usunięta bez dotykania zarodka.

3. Rozwarstwienie siatkówki

1. Odetnij głowę i wyłuszczej wybrane zarodki za pomocą zakrzywionych kleszczy.
2. Przenieść cztery oczy do podłoża niezależnego od CO₂. Pożywka ta zawiera 0,9 mM CaCl₂ i 0,65 mM MgCl₂.
3. Ustaw oko z rogówką skierowaną w dół, nerw wzrokowy skierowany w stronę eksperymentatora. Wywierć otwór w nerwie wzrokowym za pomocą dwóch prostych kleszczy.
4. Umieść gałąź każdego kleszcza między siatkówką a nabłonkiem barwnikowym (Rysunek 2). Pociągnij za każde kleszcze i obróć oko, aby odłączyć nabłonek od siatkówki. Usuń rogówkę, a następnie soczewkę i ciało szkliste.
5. Przenieść cztery siatkówki na szalkę Petriego zawierającą pożywkę Ringera o pH 7.2,
   UWAGA: Upewnij się, że pozostała tylko siatkówka i usuń wszelkie ślady nabłonka barwnikowego ciała szklistego i pozostałego nabłonka barwnikowego siatkówki.

4. Przygotowanie zawiesiny komórek siatkówki

1. Pokrój cztery siatkówki na bardzo małe kawałki za pomocą dwóch prostych szczypiec.
2. Umyj kawałki siatkówki dwukrotnie pożywką Ringera.
3. Po drugim przepłukaniu medium Ringera pozwól kawałkom siatkówki opaść na dno rurki i usuń medium Ringera. Kawałki siatkówki traktować przez 20 minut w temperaturze 37 °C roztworem trypsyny (0,25% w/v).
4. Rozpuścić roztwór po 10 minutach przez kolejne odsysanie. Wyładować za pomocą pipety Pasteura i sprawdzić, czy kawałki siatkówki nie uległy dysocjacji. Zatrzymać reakcję, dodając pożywkę hodowlaną uzupełnioną 10% inaktywowaną płodową surowicą cielęcą.
5. Inkubować zawiesinę komórkową z 0,05 mg DNazy I. Oddzielić klastry komórek i DNA poprzez kolejne odsysanie i rozładowywanie za pomocą pipety Pasteura natychmiast po dodaniu DNazy.
6. Przepłukać zawiesinę komórek siatkówki dwukrotnie chemicznie zdefiniowaną pożywką hodowlaną (CDCM): równą objętość zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco i pożywki M199 uzupełnionej 100 μg/ml kwasu linolowego/BSA, 0,86 μM insuliny, 0,07 μM transferyny, 2,0 μM progesteronu, 0,28 μM prostaglandyny, 0,29 μM Na₂SeO₃, 182 μM putrescyna, 3 mM tauryna, 4,7 μM cytydyna 5′-difosfocholina, 2,7 μM cytydyna 5′-difosfoetanoloamina, 0,55 μM hydrokortyzon, 0,03 μM trijodotyronina, 1 mM pirogronian sodu i 20 μM gentamycyna.

5. Wysiewanie komórek siatkówki

1. Dwie czarne 96-dołkowe płytki hodowlane z przezroczystym dnem traktować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C poli-L-lizyną w temperaturze 32,25 μg/^cm2.
2. Przepłukać te płytki dwukrotnie pożywką hodowlaną M199. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml CDCM.
3. Dodać do podwielokrotności 10 μl zawiesiny komórek, trypan, błękit w celu zabarwienia żywych komórek. Dodać próbkę zawiesiny komórek do hemocytometru (komora do liczenia komórek Malasseza).
   1. Pod mikroskopem policz barwione komórki dla czterech rzędów hemocytometru (tj. 40 kwadratów), a następnie oblicz średnią liczbę komórek dla jednego rzędu. Obliczyć stężenie komórek w zawiesinie, stosując następującą metodę: liczba komórek/ml zawiesiny = średnia liczba komórek w rzędzie (10 kwadratów) x 10 całkowita liczba kwadratów hemocytometru x rozcieńczenie błękitem trypanowym x 1 000 (w celu wyrażenia wyniku w komórkach/ml).
4. Doprowadzić zawiesinę komórek do dwóch stężeń (5,6 x 10⁴ komórek/ml i 1,12 x 10⁵ komórek/ml) odpowiadających dwóm gęstościom posiewu (1 x 10⁵ komórek/^cm2 i 2 x 10⁵ komórek/^cm2) za pomocą CDCM.
5. Wysiewać 50 μl dwóch zawiesin komórkowych do dwóch wstępnie poddanych działaniu czarnych 96-dołkowych płytek hodowlanych. Rozprowadzić komórki w płytkach za pomocą pipety wielokanałowej od prawej do lewej strony płytki, homogenizując między każdą kolumną, tak aby rozkład komórek był jednorodny.
6. Dodać 50 μl biblioteki cząsteczek (np. kondycjonowanych pożywek z biblioteki cDNA, patrz poniżej), które mają być przebadane przy użyciu wstępnie zdefiniowanego wzorca (Tabela 1).
7. Inkubować płytki przez siedem dni w temperaturze 37°C w temperaturze 5% CO_{2 bez} zmiany pożywki.

6. Liczenie żywotnych komórek

1. Do każdego dołka płytki dodać 2,7 μM kalceiny AM i 0,3 mM homodimera etydyny.
   UWAGA: Kalceina wnika w komórki, które są nieprzepuszczalne dla dużych cząsteczek jako homodimer etydyny. W cytoplazmie żywych komórek kalceina jest hydrolizowana przez endogenne esterazy, staje się fluorescencyjna poprzez emisję przy 520 nm po wzbudzeniu przy 485 nm. Homodimer etydyny wiąże się z DNA na martwych komórkach. Wiązanie DNA-homodimer etydyny powoduje emisję czerwonej fluorescencji przy 635 nm po wzbudzeniu przy 520 nm.
2. Inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy braku światła.
3. Odczyt fluorescencji na automatycznym czytniku płytek składającym się z odwróconego mikroskopu wyposażonego w lampę rtęciową z dwoma filtrami wzbudzenia przy 485 i 520 nm, dwoma filtrami emisji przy 520 i 635 nm, obiektywem (x10), zmotoryzowanym stolikiem sterowanym przez procesor i kamerą ze sprzężeniem ładunkowym (CCD). Ta platforma zliczająca jest kontrolowana przez oprogramowanie Metamorph¹⁹. Umożliwia uzyskanie obrazów fluorescencyjnych żywych komórek i martwych komórek jednocześnie w każdym dołku 96-dołkowej płytki, zaczynając od studzienek A1 w kierunku dołka A12, następnie B12 w kierunku B1, C1 w kierunku C12 i tak dalej (tabela I).
4. Obliczyć średnią powierzchnię A pojedynczej komórki, korzystając z 18 studzienek kontroli ujemnych (tabela I).
5. Policz komórki w każdym dołku płytki i zastosuj następujący wzór empiryczny: A x 29 / 20,7, aby zapobiec liczeniu dubletów komórek (grupy dwóch komórek). Oceń efekt ochronny czopków według cząsteczek jako stosunek średniej liczby komórek w 4 studzienkach, w których testowaliśmy cząsteczkę, do średniej liczby komórek w 18 dołkach kontroli negatywnej (patrz tabela 1 i rysunek uzupełniający 1).
6. Połączyć wyniki płytki wysiewanej w proporcji 1 x 10⁵ komórek/^cm2 z płytką wysiewaną w proporcjach 2 x 10⁵ komórek/^cm2, aby ocenić potencjalną ochronę (współczynnik żywotności) przez każdą przesiewaną cząsteczkę.

Results

Opisujemy tutaj, jak można wykorzystać system hodowli wzbogacony w stożki do identyfikacji nowych białek chroniących stożki. Użyliśmy tego protokołu do przesiewu znormalizowanej biblioteki cDNA utworzonej z nabłonka barwnikowego naczyniówki i siatkówki z 400 oczu 8-tygodniowych szczurów Long-Evans⁴³.

Ta biblioteka zawiera 6,0 x 10⁶ niezależnych jednostek tworzących kolonie (CFU) i ma średni rozmiar sklonowanej wkładki 2,1 kilobazy (kb), z ponad 99% rekombinowanych klonów. Pule 100 klonów z tej biblioteki zostały przejściowo transfekowane (0,1 μg plazmidowego DNA) do komórek COS-1, a kondycjonowaną pożywkę (CM) COS-1 zebrano po inkubacji przez 48 godzin w DMEM bez surowicy. Błony lub egzosomy nie zostały usunięte przez ultrawirowanie. Pięćdziesiąt mikrolitrów każdego CM dodano do 4 dołków dwóch 96-dołkowych płytek: jednej wysianej w 2 x 10⁵ komórek/cm², drugiej w 4 x 10⁵ komórek/cm². CM z komórek COS-1 transfekowanych pustym wektorem pcDNA3.1 użytym do budowy biblioteki użyto jako kontroli negatywnej (Tabela 1). Łącznie oceniono 2 112 zestawów po 100 klonów, odpowiadających 211 200 pojedynczym klonom, w czterech dołkach hodowlanych i w dwóch warunkach wysiewu kultur wzbogaconych w szyszki. Te dwa warunki odpowiadają dwóm nieznacznie różnym gęstościom inokulacji, co umożliwia dokładniejszą ocenę aktywności ochronnej, dla łącznej liczby 1 689 600 dołków hodowlanych.

Wśród 42 pul klonów o stosunku większym niż 2, pule 0080 i 0073 mają współczynnik żywotności 16 i 14 razy wyższy po 7 dniach hodowli niż kontrola negatywna, pcDNA3.1 (Rysunek uzupełniający 1). Analiza ta jest niezbędna do zidentyfikowania puli zainteresowania. Każda wybrana pula 100 klonów została podzielona na 16 zestawów po 10 klonów z ich zapasów glicerolu. Te podpule zostały przygotowane i przetestowane zgodnie z tą samą metodą w drugiej rundzie badań przesiewowych (tj. w sumie 3200 dołków hodowlanych). Podpula 0073-09 dała najsilniejszy współczynnik żywotności (rysunek uzupełniający 2A) i została podzielona w celu wytworzenia 16 indywidualnych klonów, które zostały przetestowane w trzeciej rundzie badań przesiewowych na kulturach wzbogaconych w szyszki. Klon 0073-09-37 wyraźnie wyróżnia się na tle innych współczynnikiem żywotności równym 2,5 (rysunek uzupełniający 2B). Oś y ma inną skalę, nawet jeśli gęstość wysiewu była taka sama jak na rysunku uzupełniającym 2A. Widzieliśmy to często, gdy testy są powtarzane co tydzień przez miesiące. Po analizie wyniki te potwierdzają, że klon 0073-09-37 ma silny i powtarzalny wpływ na przeżywalność stożków. Test powtórzono niezależnie (Rysunek 3A), a następnie zsekwencjonowano wstawkę 1,8 kb (Rysunek 3B).

Analiza bioinformatyczna wykazała, że klon 0073-09-37, który nazwaliśmy czynnikiem żywotności stożka pochodzącego z nabłonka (EdCVF), zawiera trzy otwarte ramki odczytu (ORF), z których jedna najbardziej nadrzędna (ORF1) koduje 84 reszty C-końcowej części białka szczura zinc finger protein-180 (ZFP180, NP_653358) z 727 aminokwasów⁴⁴. Pozostałe dwa ORF (ORF2 i ORF3) są znacznie gorzej zachowane u myszy i nieobecne u innych ssaków. W niezależnym badaniu tylko ORF1 wywiera działanie ochronne na czopki (rysunek uzupełniający 3). ORF1 został wyprodukowany jako białko fuzyjne S-transferazy glutationowej (GST) (Figura 4A). Białko EdCVF zostało oczyszczone, a znacznik GST usunięty (Rysunek 4B). EdCVF jest w stanie zapobiec zwyrodnieniu stożków w systemie hodowli wzbogaconym w stożki (Rysunek 4C).

Rysunek 1: Kurze zarodki w 28, 29ⁱ 30^fazie rozwoju. Strzałki W: skrzydło, C: kołnierz i B: dziób. Podziałka 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza siatkówki zarodka kurczaka Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Współczynnik żywotności stożka pochodzącego z nabłonka (EdCVF), klon 0073-09-37. A. Zwiększona żywotność na kulturze wzbogaconej w szyszki. Ur. Sekwencja klonu cDNA 0073-09-37. Podkreślona sekwencja GAATTC to miejsce ograniczenia EcoRI użyte do budowy biblioteki. Dwa kodony GTG pogrubione są rzadkimi miejscami inicjacji translacji dla EdCVF pochodzącego z wektora. Analiza statystyczna za pomocą testu Studenta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Aktywność rekombinowanego EdCVF. A. Sekwencja EdCVF w fuzji z S-transferazą glutationową (GST). Ur. Oczyszczone rekombinowane białko EdCVF. C. Aktywność troficzna GST-EdCVF na stożek w hodowli. Analiza statystyczna z wykorzystaniem testu Tukeya. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Stosunek średniej liczby komórek dla puli cDNA do kontroli negatywnej, kondycjonowanej pożywki komórek COS-1 transfekowanej pustym wektorem pcDNA3.1 podczas pierwszej rundy badań przesiewowych.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Liczba żywych komórek. A. Druga runda selekcji z podpulami puli 0073. Ur. Trzecia runda badań przesiewowych z izolowanymi klonami. CN: kondycjonowana pożywka komórek COS-1 transfekowana pustym wektorem, pcDNA3.1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Aktywność troficzna trzech otwartych ramek odczytu izolowanego klonu 0073-09-37. Analiza statystyczna z wykorzystaniem testu Dunnetta. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

	1	cyfra arabska	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
ZA	1	1	1	1	cyfra arabska	Nc	cyfra arabska	cyfra arabska	cyfra arabska	3	3	Nc
W	Nc	3	3	4	4	4	Nc	4	5	5	5	5
Z	6	Nc	6	6	6	7	7	Nc	7	7	8	8
D	8	8	Nc	9	9	9	9	10	Nc	10	10	10
E	11	11	11	Nc	11	12	12	12	12	Nc	13	13
Z	13	13	14	14	Nc	14	14	15	15	15	Nc	15
Z	16	16	16	16	17	Nc	17	17	17	Rozdział 18	Rozdział 18	Nc
H	Rozdział 18	Rozdział 18	Rozdział 19	Rozdział 19	Rozdział 19	Rozdział 19	Nc	20	20	20	Nc	20
NC kontrole ujemne
1-20 pozycji basenów testowanych w poczwórnym duplikacji

Tabela 1: Plan płytki 96-dołkowej do badań przesiewowych o wysokiej zawartości

Discussion

Wśród wielu parametrów, które mogą ograniczać produkcję kultury wzbogaconej w szyszki z zarodków kurcząt, pierwszym krytycznym krokiem jest dokładne określenie etapu rozwoju zarodków w wyklutych jajach. Zaobserwowano, że hodowla komórek z siatkówki zarodków w ED8 (34^{. stadium)} wytwarza tylko 35% fotoreceptorów, a pozostałe 65% jest zbudowane z innych neuronów4. Bez względu na logistykę zastosowaną w celu uzyskania wyklutych jaj, konieczne jest precyzyjne dostrojenie temperatury i czasu inkubacji oraz dokładne zbadanie zarodków w porównaniu ze zdjęciami referencyjnymi dla wszystkich etapów rozwoju ^42,45.

Pierwotnie, system hodowli wzbogacony w szyszki został opracowany przy użyciu szczepu White Leghorn⁴. Biały kolor jaj tego szczepu nie jest szczególnie ceniony we Francji, dlatego użyliśmy szczepu kurczaka, który produkuje brązowe jaja. Użyliśmy szczepu I 657, który powstaje przez skrzyżowanie kogutów I 66 z kurami JA57⁵. Udało nam się odtworzyć cechy charakterystyczne pierwotnych kultur. Pokazuje to, że tło genetyczne kurczaka nie jest krytyczne dla uzyskania kultur wzbogaconych w szyszki.

Nie testowaliśmy wpływu indywidualnego usuwania suplementów w pożywce hodowlanej, ale zaobserwowaliśmy, że insulina odgrywa kluczową rolę zgodnie z wpływem insuliny na przeżycie czopków u myszy rd1 , modelu autosomalnego recesywnego RP⁴⁶. Trójjodotyronina (T3) może również uczestniczyć w różnicowaniu komórek prekursorowych siatkówki zarodka kurczaka w czopki, zgodnie z rolą receptora hormonu tarczycy w losie komórek siatkówki podczas rozwoju⁴⁰. W związku z tym system hodowli wzbogacony w stożki nie może być używany do identyfikacji insuliny poprzez klonowanie ekspresji⁴⁶.

System hodowli wzbogacony w stożki opiera się na hodowli neuronów pierwotnych i jest znacznie bardziej odpowiedni niż metody polegające na użyciu unieśmiertelnionych komórek jako linii komórkowej 661W 24,25,26.

Opisana tutaj metoda może być modyfikowana poprzez wykonanie wcześniejszej elektroporacji plazmidowym DNA²⁰. Przed przygotowaniem zawiesiny komórek siatkówki całą siatkówkę umieszcza się w komorze specjalnie wykonanego elektroporatora ze 120 μL 0,5 μg/μL plazmidowego DNA w 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA. Stosuje się pięć impulsów 15 V przez 50 ms każdy, oddzielonych odstępem 950 ms²². Próby dostarczenia interferującego RNA (RNAi) za pomocą retrowirusów RCAS (replication competent avian splice) do kultur wzbogaconych w czopki zakończyły się niepowodzeniem⁴⁷. Wynika to z pewnością z faktu, że przy braku surowicy i w hodowlach o niskiej gęstości komórki prekursorowe siatkówki nie są replikacyjne, co jest niezbędne do namnażania się retrowirusów.

Opracowaliśmy system hodowli wzbogacony w szyszki w celu identyfikacji czynników troficznych, które sprzyjają przetrwaniu stożków za pomocą klonowania ekspresji¹⁹. Aby było to wykonalne, przeprowadziliśmy pierwszy etap przesiewania wysokiej zawartości przy użyciu kondycjonowanej pożywki z puli 100 klonów. Nawet jeśli cDNA z biblioteki ulegają ekspresji pod kontrolą silnego promotora CMV po transfekcji komórek COS-1, nie daje to gwarancji, że wszystkie białka kodowane przez poszczególne cDNA osiągną stężenie wystarczające do uzyskania dodatniego wyniku w teście żywotności. Jest to poważne ograniczenie. W tym sensie wszelkie badania przesiewowe nie są tak naprawdę wyczerpujące. Ponadto, nawet jeśli białka błoniaste nie zostały usunięte z kondycjonowanej pożywki, konfiguracja testu jest niekorzystna dla identyfikacji czynników niedyfuzyjnych. Alternatywą byłoby badanie przesiewowe poszczególnych klonów po uzyskaniu sekwencji cDNA w celu uniknięcia duplikacji w oznaczaniu wielokrotnie tego samego białka kandydującego. Zostało to zainicjowane przez sekwencjonowanie bibliotek cDNA siatkówki, których użyliśmy⁴³. Takie podejście, choć racjonalne, ma też swoje ograniczenia. Bioinformatyczna analiza sekwencji cDNA nieodparcie narzuci, oprócz zmniejszenia redundancji, priorytetowe traktowanie niektórych klonów w oparciu o wiedzę. Nie będzie to ze szkodą, jeśli w końcu cała biblioteka zostanie prześwietlona, nawet jeśli czas potrzebny na to zostanie znacznie wydłużony. Ale niezmiennie tożsamość sekwencji będzie miała wpływ na nasz sposób patrzenia na wyniki. Nie będzie to neutralne, ponieważ interpretacja sekwencji będzie oczywiście konkurencyjna z danymi eksperymentalnymi.

Identyfikacja EdCVF pokazuje również, że selekcja o wysokiej zawartości pociąga za sobą ograniczenia techniczne. Na podstawie pierwszej rundy badań przesiewowych zidentyfikowaliśmy dwie pule o wysokiej aktywności (rysunek uzupełniający 1). Pula 0073 doprowadziła do pomyślnej identyfikacji EdCVF, podczas gdy pula 0080 nie doprowadziła do takiego ustalenia. Nie rozwiązaliśmy problemu, który mógł wynikać z utraty aktywnego klonu podczas przygotowywania podpul. Alternatywnie nie jest wykluczone, nawet jeśli nie jest to statystycznie korzystne, że wśród cDNA z puli 0080 dwa białka działały synergistycznie i ich aktywności nie można było zaobserwować jako pojedynczych klonów.

Identyfikacja cząsteczek chroniących czopki poprzez badania przesiewowe małych cząsteczek jest przyszłościowym zastosowaniem systemu hodowli wzbogaconej w stożki. Takie cząsteczki będą nieocenione w leczeniu patologii siatkówki, dla których terapia genowa nie jest najodpowiedniejszym podejściem, jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 czarnych płytek (Przezroczysty przycisk z pokrywką Hodowla tkankowa poddana obróbce)	Corning	3603
Calcein AM	Thermo-Fisher scientific	C1430
CCD Camera	Fotometria	CoolSnap  FX HQ
CDPC (Cytydyna 5&-difosfocholina sól sodowa dwuwodna)	Sigma-Aldrich	C0256
CO2 Niezależny	Thermo-Fisher scientific	18045-054
Kleszcze zakrzywione	Dutscher	005093
DMEM Media	Thermo-Fisher scientific	41966-029
DNAse	Sigma-Aldrich	D4263
Inkubator do jaj	FarmLine	M08 01 3100
Ethidium Homodimer	Thermo-Fisher scientific	E1169
Fœ surowica bydlęca	Thermo-Fisher scientific	10270-098
Gentamycyna	Thermo-Fisher scientific	15710-049
Hydrokortyzon	Sigma-Aldrich	H0880
ITS (insulina Transferine selenium)	Sigma-Aldrich	I1884
duże szczypce proste	Dutscher	005074
Kwas	linolowySigma-Aldrich	L8384
M199 średni	Thermo-Fisher scientific	31150-022
Oprogramowanie Metamorph	Metamorph
	NIKON	Eclipse TE2000
Stopień zmotoryzowany	Martzauzer	Mutlicontrol 2000
Przełącznik filtra optycznego	Shutter Instrument firmy	Lambda 10-2
PBS 1X	Thermo-Fisher scientific	14190-086
Poly-L-lizyna	Sigma-Aldrich	P6282
Progesteron	Sigma-Aldrich	P7556
Pursept A express	Fisher	11814110
Putriscine	Sigma-Aldrich	P5780
Pirogronian sodu	Sigma-Aldrich	S8636
kleszcze proste	Dutscher	005092
Tauryna	Sigma-Aldrich	T8691
Trijodotyronina	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan niebieski	Thermo-Fisher scientific	15250-061
Trypsyna 0,25 %	Thermo-Fisher scientific	25200-056