Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników

Podsumowanie

Ten artykuł ma na celu pokazanie użycia partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych jako substytutu plemników do budowy półklonowanych embrionów.

Streszczenie

W organizmach z rozmnażaniem płciowym, komórki rozrodcze są źródłem komórek totipotencjalnych, które rozwijają się w nowe osobniki. U myszy zapłodnienie oocytu przez plemnik tworzy totipotencjalną zygotę. Ostatnio w kilku publikacjach doniesiono, że haploidalne embrionalne komórki macierzyste (haESC) mogą być substytutem genomów gametycznych i przyczyniać się do powstawania zarodków, które rozwijają się w myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania partenogenetycznych haESC jako substytutu plemników do budowy zarodków poprzez docytoplazmatyczne wstrzyknięcie do oocytów. Protokół ten składa się z etapów przygotowania komórek haESC do wymiany plemników, wstrzyknięcia chromosomów haESC do oocytów oraz hodowli częściowo sklonowanych zarodków. Zarodki mogą dać płodne, częściowo sklonowane myszy po transferze zarodków. Wykorzystanie haESC jako zamiennika plemnika ułatwia edycję genomu w linii zarodkowej, badania rozwoju embrionalnego i badanie imprintingu genomowego.

Wprowadzenie

U ssaków gamety są jedynymi komórkami, które przekazują informacje genetyczne następnemu pokoleniu. Fuzja oocytu i plemnika tworzy diploidalną zygotę, która rozwija się w dorosłe zwierzę. Mutacje w genomach gametycznych są w ten sposób dziedziczone przez potomstwo i napędzają zmienność genetyczną w species¹. Wprowadzenie mutacji w linii zarodkowej zostało zastosowane do produkcji genetycznie zmodyfikowanych zwierząt do różnych badań biologicznych, w tym do charakterystyki funkcji genów i modelowania chorób. Zarówno oocyty, jak i plemniki są terminalnie zróżnicowanymi i wysoce wyspecjalizowanymi komórkami, które przestały się namnażać. Dlatego bezpośrednia modyfikacja gamet jest technicznie trudna i opracowano specjalistyczne podejścia. Modyfikacje genetyczne można wprowadzić do linii rozrodczej myszy poprzez wstrzyknięcie genetycznie zmodyfikowanych ESC do blastocyst, gdzie integrują się z rozwijającym się zarodkiem i kolonizują linię zarodkową. Dodatkowo, genetyczna modyfikacja zygot przy użyciu metod edycji genomu, w tym systemu CRISPR/Cas9, stała się powszechnie stosowana².

Ostatnio opisano znakomite podejście, które stosuje haESC jako substytut genomu gametycznego^3,4,5,6,7,8. HaESC to linie komórek macierzystych wywodzące się z wewnętrznej masy komórkowej stadnocyst haploidalnych partenogenetycznych lub androgenetycznych i posiadają pojedynczy zestaw chromosomów^4,7,9,10. Wykazano, że zarówno partenogenetyczne, jak i androgenetyczne haESC mogą przyczyniać się do genomu częściowo sklonowanych myszy po docytoplazmatycznym wstrzyknięciu do oocytów. W przeciwieństwie do innych podejść, genomy haESC mogą być bezpośrednio modyfikowane w hodowli ze względu na ich zdolność do samoodnawiania się. Wprowadzanie modyfikacji genetycznych do linii zarodkowej poprzez zastąpienie plemników hemokomórkami jest ważną metodą badań biologicznych. Daje ona możliwość oddzielnej hodowli i manipulowania genomem matki lub ojca, które pochodzą odpowiednio z partenogenetycznych lub androgenowych komórek macierzystych. HaESC mogą być następnie wykorzystywane jako zamiennik genomu gametycznego, co jest szczególnie korzystne w badaniach nad imprintingiem genomowym, ekspresją specyficzną dla alleli i procesami specyficznymi dla rodziców.

U myszy zarówno informacje genomowe matki, jak i ojca są niezbędne do prawidłowego rozwoju zarodka¹¹. W związku z tym nie można było uzyskać donoszonych młodych, gdy wstrzyknięto partenogenetyczne hemesc (phaESC) typu dzikiego w celu zastąpienia genomu plemnika^5,8. Aby przezwyciężyć blokadę rozwojową, genomowe imprinting matczynego genomu partenogenetycznych komórek macierzystych musi zostać skorygowany do konfiguracji ojcowskiej. Można to osiągnąć poprzez manipulację regionami zróżnicowanie metylowanymi (DMR). Do tej pory badano celowe delecje H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR i Rasgrf1-DMR w celu tłumienia genów wyrażanych matczyno w phaESCs^3,5,8,12. Badania te wykazały, że delecje zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR są wystarczające do przekształcenia konfiguracji odcisku matczynego w ojcowską, która może zastąpić chromosomy plemników. Docytoplazmatyczne wstrzyknięcie phaESC, które przenoszą dwie delecje DMR do oocytów, dało częściowo sklonowane młode z częstością od 5,1% do 15,5% przeniesionych zarodków dwukomórkowych.

Ten protokół opiera się na zastosowaniu phaESC z delecjami zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR, które nazywamy phaESC z podwójnym nokautem (DKO-phaESC). Udostępniamy szczegółowe instrukcje dotyczące modyfikacji imprintingu genomowego w phaESC w celu ustanowienia linii DKO-phaESC, wstrzykiwania DKO-phaESC do oocytów jako substytutu genomu plemnika, hodowli częściowo sklonowanych zarodków do blastocyst oraz uzyskiwania częściowo sklonowanych myszy. Protokół ten jest punktem odniesienia dla badaczy, którzy wymagają precyzyjnej i bezpośredniej manipulacji ojcowskiego genomu i generowania częściowo sklonowanych zarodków i myszy.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone na podstawie licencji ZH152/17 zgodnie ze standardami i przepisami Kantonalnej Komisji Etyki w Zurychu oraz zakładu dla zwierząt EPIC w Instytucie Molekularnych Nauk o Zdrowiu, ETH Zurych.

UWAGA: Ten protokół zaczyna się od usunięcia H19- i IG-DMR w phaESC. Szczegółowe informacje na temat ustanawiania linii phaESC można znaleźć w opublikowanych raportach^10,13. Przegląd i ramy czasowe tego protokołu (kroki 1–14) znajdują się w Rysunek 1A; pożywki, roztwory i są wymienione w tabeli 1. Procedura ustanawiania linii DKO-phaESC (kroki 1–6) jest pokazana w Rysunek 1B, a strategia konstruowania częściowo sklonowanych zarodków (kroki 7–14) jest przedstawiona w Rysunek 1C.

1. Transfekcja plazmidów w celu delecji H19-DMR i IG-DMR w phaESC

1. Przygotuj plazmidy CRISPR/Cas9 do koekspresji nukleaz Cas9 i skieruj RNA do docelowych delecji H19-DMR i IG-DMR. Zwiąż cztery pary oligonukleotydów przewodnika RNA (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R wymienione w tabeli 2) do plazmidów pX330.
   UWAGA: Zapoznaj się z opublikowanym protokołem dotyczącym szczegółowej procedury przygotowania tych 4 plazmidów CRISPR/Cas9¹⁴. Alternatywnie, plazmidy dostępne dla ogólnych szczepów myszy są również dostępne za pośrednictwem repozytorium (Tabela materiałów).
2. Pokryć powierzchnię jednego dołka płytki 6-dołkowej 1 ml 0,2% roztworu żelatyny przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
3. Płytka 2 × 10⁵ fazoESC typu dzikiego na studzience pokrytej żelatyną w pożywce haESC bez antybiotyków i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2 przez 1 dzień.
   UWAGA: Antybiotyki są pomijane w pożywce, aby zwiększyć skuteczność późniejszej lipofekcji. Użyliśmy phaESC typu dzikiego w przejściu 10. Zalecamy korzystanie z faz wczesnego przejścia, ale z powodzeniem zastosowano różne numery pasaży⁸. Korelacja między liczbą pasaży a skutecznością uzyskiwania częściowo sklonowanych zarodków i myszy nie jest obecnie znana.
4. Transfekcja phaESC w studzience 6-dołkowej płytki (od kroku 1.3) z 6 plazmidami jednocześnie przy użyciu odczynnika lipofekcji: 50 ng plazmidu piggyBac przenoszącego transgen CAG-EGFP, 50 ng plazmidu transpozazy piggyBac i 600 ng każdego z 4 plazmidów CRISPR/Cas9 (z kroku 1.1). Zapoznaj się z protokołem producenta dotyczącym szczegółowej procedury transfekcji.
   UWAGA: Dwa plazmidy piggyBac są używane do integracji transpozonu do wszechobecnej ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w genomie phaESC. Jeśli znakowanie komórek GFP nie jest wymagane, te dwa plazmidy można zastąpić plazmidem CRISPR/Cas9 w celu przejściowej ekspresji białek fluorescencyjnych (np. plazmidu pX458) zamiast jednego z plazmidów pX330. Przejściowa ekspresja EGFP może być następnie wykorzystana do sortowania transfekowanych komórek.
5. Dwa dni po transfekcji odessać pożywkę i dodać 800 μl trypsyny.
6. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 przez} 5 minut. Następnie dodaj 2 ml buforu do płukania, aby ugasić trypsynę i kilkakrotnie pipetować, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
7. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
8. Odwirować probówkę o stężeniu 160 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
9. Zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu podtrzymującego haESC uzupełnionego 15 μg/ml Hoechst 33342.
   UWAGA: Aby zmniejszyć potencjalną toksyczność Hoechst 33342, zamiast 15 μg/ml Hoechst 33342 i 50 μM werapamilu zastosowano 1 μg/ml Hoechst 33342¹⁵.
10. Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 przez} 15 minut. Po inkubacji przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 5 ml przez nasadkę sitka do komórek i utrzymywać probówkę w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie gotowa do użycia w następnym kroku (sekcja 2).

2. Posiewanie pojedynczych komórek transfekowanych phaESC za pomocą cytometru przepływowego

1. Na jeden dzień przed sortowaniem transfekowanych faESC, napromieniowane płytki mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) na pokrytych żelatyną 96-dołkowych płytkach o gęstości 4 ×^{10 4} komórek/^cm2 w pożywce MEF. Zazwyczaj przygotowuje się 6 płytek w celu ustanowienia linii phaESC z ukierunkowanymi delecjami. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2.
   UWAGA: Napromieniowane MEF-y są dostępne w handlu. Używamy MEF pochodzących z zarodków E12.5 myszy DR4. Chociaż haESC mogą rosnąć na płytkach pokrytych żelatyną bez MEF, zalecamy MEF w celu zwiększenia żywotności posortowanych pojedynczych haESC.
2. W dniu sortowania należy odessać pożywkę MEF z płytek 96-dołkowych i dodać 120 μl świeżej pożywki haESC do dołka. Przechowywać płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2
.
3. Ustaw sorter komórek z dyszą 100 μm zgodnie z instrukcjami producenta. Laser UV o długości fali 355 nm i laser niebieski o długości fali 488 nm służą do wzbudzania fluorescencji Hoechst 33342 i EGFP.
   UWAGA: Alternatywnie, Hoechst 33342 może być wykryty przez wzbudzenie z 405 nm.
4. Posortuj transfekowane phaESC w probówce 5 ml (od kroku 1.10) za pomocą bramki do zbierania komórek haploidalnych w fazie G1/S, które wykazują ekspresję EGFP. Umieść pojedynczą komórkę w każdym dołku z 96-dołkowych płytek z kroku 2.2.
   UWAGA: Wykrywanie barwienia Hoechst 33342 na ogół rozróżnia 3 piki komórek o zawartości DNA 1n, 2n i 4n, które odpowiadają komórkom haploidalnym w fazie G1, mieszaninie komórek haploidalnych w fazie G2/M i komórkom diploidalnym w fazie G1 oraz komórkom diploidalnym w fazie G2/M, odpowiednio. Komórki haploidalne w fazie G1/S są identyfikowane jako pik o mniejszym natężeniu fluorescencji Hoechst 33342. Reprezentatywny wynik i bramkę sortowania są pokazane w Rysunek 2A.
5. Po posianiu inkubować 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 .}

3. Podklonowanie transfekowanych phaESC

1. Trzy dni po posiewie pojedynczych komórek można obserwować kolonie w kilku dołkach 96-dołkowych płytek pod mikroskopem. Zaznacz studnie, w których rosną tylko pojedyncze kolonie.
   UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że pojedyncze kolonie zaobserwowano w 20%–40% studzienek na płytkach 96-dołkowych.
2. W 4 dniu po posiewie pojedynczych komórek zastąp połowę pożywki nową pożywką haESC w studzienkach z pojedynczymi koloniami.
3. Na jeden dzień przed pasażowaniem (w 4 lub 5 dniu po posiewie pojedynczych komórek) napromieniować MEF-y na 96-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną o gęstości 4 × 10⁴ komórek/^cm2 w pożywce MEF. Przechowywać płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2
.
4. Po 5 lub 6 dniach posiewu jednokomórkowego wybrać studzienki z 96-dołkowych płytek zawierających pojedyncze kolonie o średnicy większej niż 150 μm.
   UWAGA: Zaleca się wybór około 100 studzienek w celu ustanowienia linii phaESC z docelowymi delecjami DMR.
5. Zassać pożywkę do wybranych studzienek i dodać 30 μl trypsyny. Inkubować 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 przez} 5 minut. Następnie dodaj 30 μl buforu do płukania do każdej studzienki, aby ugasić trypsynę.
6. Dodać 140 μl pożywki haESC do każdego dołka i kilkakrotnie odpipetować, aby uzyskać pojedyncze komórki.
7. Odessać pożywkę MEF z dołków 96-dołkowych płytek przygotowanych w kroku 3.3.
8. Przenieść phaESC z każdej studzienki z kroku 3.6 do świeżej studzienki nowej płytki 96-dołkowej z kroku 3.7.
9. Inkubować 96-dołkowe płytki zawierające subklony phaESC w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ .
10. Następnego dnia odessać całą pożywkę z każdej studzienki i dodać 120 μl nowej pożywki haESC. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 .}
11. Na dzień przed tym, jak komórki zaczną się zlewać w celu pasażowania, napromieniowane MEF-y umieścić na 24-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną o gęstości 4 × 10⁴ komórek/^cm2 w pożywce MEF. Przechowywać płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2
.
12. Gdy phaESC zlewają się do pasażowania, odessać pożywkę i dodać 30 μl trypsyny. Inkubować 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
13. Dodaj 90 μl buforu do płukania do każdej studzienki, aby ugasić trypsynę. Odpipetować kilka razy, aby uzyskać pojedyncze komórki.
14. Odessać pożywkę MEF z dołków 24-dołkowych płytek z kroku 3.11 i dodać 600 μl świeżej pożywki haESC.
15. Przenieść 60 μl zawiesiny subklonów phaESC z każdej studzienki z kroku 3.13 do nowego dołka z płytkami 24-dołkowymi z kroku 3.14. Zachowaj pozostałą zawiesinę każdego subklonu phaESC do ekstrakcji DNA i genotypowania w kroku 4.
16. Inkubować 24-dołkowe płytki z subklonami phaESC w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 .}
17. Na dzień przed osiągnięciem przez hodowle komórkowe gęstości wymagającej pasażowania, napromieniowane MEF-y należy umieścić na pokrytych żelatyną płytkach 6-dołkowych o gęstości 4 × 10⁴ komórek/^cm2 w pożywce MEF. Przechowywać płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2
.
18. Gdy phaESC staną się wystarczająco zlewające się do pasażowania, odessać pożywkę i dodać 250 μl trypsyny. Inkubować 24-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C przez 5 min.
    UWAGA: Po genotypowaniu w kroku 4.9 należy przejść tylko linie phaESC z delecjami zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR.
19. Dodaj 750 μl buforu do płukania do każdej studzienki, aby ugasić trypsynę. Odpipetować kilka razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
20. Odwirować probówkę o sile 160 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki haESC.
21. Odessać pożywkę MEF z dołków płytek 6-dołkowych z kroku 3.17. Przenieść zawiesinę phaESC z każdej probówki z kroku 3.20 do nowej studzienki. Przechowywać płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2
.
22. Rozwiń klony komórek, powtarzając kroki od 3.17 do 3.21 i zwiększając rozmiar płytki oraz objętość trypsyny, buforu do płukania i pożywki haESC. Przygotuj kolbę T25 dla każdej subklonowanej linii MEF phaESC dla kroku 5.
    UWAGA: Zalecamy zamrożenie podwielokrotności każdej podklonowanej linii phaESC w 300 μl pożywki zamrażającej i przechowywanie kriomateriału w ciekłym azocie przed przejściem do kroku 5.

4. Pierwsze genotypowanie subklonowanych linii phaESC za pomocą MEFów

1. Aby wyekstrahować genomowe DNA z pozostałej zawiesiny komórkowej z kroku 3.15, dodaj 200 μl buforu do lizy do każdej studzienki z 96-dołkowych płytek. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Przepłucz każdą studzienkę dodatkowymi 200 μl buforu do lizy, aby odzyskać wszystkie pozostałe komórki i zebrać w tej samej probówce o pojemności 1,5 ml.
2. Inkubować probówkę o pojemności 1,5 ml w temperaturze 55 °C przez 3 godziny z mieszaniem.
3. Po inkubacji dodać 460 μl izopropanolu do każdej probówki o pojemności 1,5 ml i delikatnie mieszać, aż pojawi się osad DNA.
4. Odwirować probówki o ≥ 10 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Umyj granulki DNA 200 μl 70% etanolu.
5. Odwirować probówki o ≥ 10 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
6. Suszyć probówki na powietrzu przez 10 minut, a następnie ponownie zawiesić DNA w 20 μl wody.
7. Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu termostabilnej polimerazy DNA zgodnie z protokołem producenta.
   UWAGA: Pary starterów do PCR są wymienione w tabeli 2 i są używane w następujący sposób: H19-DMR-P1 i P3 (407 pz dla usuniętego H19-DMR); H19-DMR-P2 i P3 (623 pz dla H19-DMR typu dzikiego); IG-DMR-P1 i P3 (319 pz dla usuniętego IG-DMR); IG-DMR-P2 i P3 (492 pz dla IG-DMR typu dzikiego). Profil temperaturowy PCR dla wszystkich par starterów jest następujący: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. Długość amplifikowanych fragmentów DNA dla delecji H19-DMR i IG-DMR wykazuje pewną zmienność z powodu niehomologicznego łączenia końców związanego z edycją za pośrednictwem CRISPR/Cas9. PhaESC hodowano z MEF, które zawierają DNA H19-DMR i IG-DMR typu dzikiego. Dlatego pary starterów H19-DMR-P2/P3 i IG-DMR-P2/P3, które amplifikują fragmenty DNA typu dzikiego, nie mają charakteru informacyjnego. Jednak te pary starterów są zawarte jako kontrole i powinny dawać prążek we wszystkich reakcjach.
8. Analizuj fragmenty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Zapoznaj się z opublikowanym protokołem dotyczącym szczegółowej procedury elektroforezy¹⁶.
9. Zidentyfikuj linie komórkowe z delecjami zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR. Reprezentatywny obraz elektroforezy jest pokazany w Rysunek 2B.
   UWAGA: W naszym przypadku osiem linii komórkowych z delecjami zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR zidentyfikowano wśród 135 subklonowanych linii phaESC.

5. Oczyszczanie komórek haploidalnych subklonowanych linii phaESC

1. Gdy subklonowane kultury phaESC w kolbach T25 z kroku 3.22 staną się wystarczająco gęste do pasażowania, odessać pożywkę i dodać 1,5 ml trypsyny. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Następnie kilkakrotnie dodać 4,5 ml buforu do płukania i pipetę, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
2. Przenieść zawiesinę każdej komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować probówkę o stężeniu 160 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 400 μl buforu do konserwacji haESC uzupełnionego 15 μg/ml Hoechst 33342.
3. Inkubować zawiesiny komórkowe w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Po inkubacji przenieść zawiesiny komórek do probówki o pojemności 5 ml przez nasadkę z sitkiem do komórek. Przepłukać nasadkę sitka komórkowego dodatkowymi 400 μl buforu do konserwacji haESC i zebrać pozostałe komórki w tej samej probówce o pojemności 5 ml. Przechowywać probówkę w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie gotowa do sortowania.
4. Ustaw cytometr przepływowy z dyszą 100 μm zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Hoechst 33342 może być wykryty przez wzbudzenie przy 405 nm. W tym przypadku laser UV o długości fali 355 nm jest używany do wykrywania Hoechst 33342.
5. Ustawić zawiesinę komórek (od kroku 5.3) i nową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 2 ml buforu podtrzymującego haESC, aby zebrać posortowane komórki w cytometrze przepływowym.
6. Rozpocznij analizę i ustaw bramkę sortowania, aby zebrać haploidalne komórki w fazie G1/S. Zapoznaj się z histogramem w Rysunek 2A w celu identyfikacji populacji faz fazowych G1/S.
   UWAGA: Niektóre subklonowane linie phaESC mogą nie zawierać żadnych komórek haploidalnych z powodu całkowitej diploidyzacji lub błędnego posiewu komórek diploidalnych w kroku 2. Jeśli komórki haploidalne nie zostaną zaobserwowane w fazie G1/S, należy przejść do innej próbki bez sortowania. W naszym przypadku 5 linii komórkowych zawierało komórki haploidalne, a 3 linie komórkowe zawierały tylko komórki diploidalne z 8 subklonowanych linii phaESC.
7. Po posortowaniu komórek dodać 5 ml buforu do przemywania wzdłuż ścianki probówki zbiorczej o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o masie 160 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant.
8. Wybierz płytkę o odpowiedniej wielkości do hodowli w zależności od liczby posortowanych komórek. Użyj pojedynczego dołka z płytki 96-dołkowej, płytki 24-dołkowej i płytki 12-dołkowej do hodowli odpowiednio 1 000–40 000 komórek, 40 000–200 000 komórek i 200 000–400 000 komórek. Zawiesić osad komórkowy odpowiednio w 120 μl, 600 μl i 1,2 ml pożywki haESC.
   UWAGA: Płytki komórek o dużej gęstości, ponieważ niska konfluencja może spowodować śmierć komórek po sortowaniu. Od tego momentu phaESC są hodowane w studzienkach pokrytych żelatyną bez MEF, aby ułatwić genotypowanie w kroku 6 i późniejsze zastosowanie do iniekcji docytoplazmatycznej od etapu 9.
9. Po przeniesieniu zawiesiny komórek do studzienki pokrytej żelatyną o odpowiedniej wielkości, należy inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2
.
10. Kontynuuj rozszerzanie kultur phaESC, powtarzając kroki od 3.18 do 3.21 ze zwiększaniem rozmiarów płytek i zwiększając objętość trypsyny, buforu do przemywania i pożywki haESC. Komórki są hodowane w studzienkach pokrytych żelatyną bez MEF.
11. Dla każdej subklonowanej linii phaESC należy przygotować hodowlę w jednym dołku na płytce 24-dołkowej i w jednym dołku na płytce 6-dołkowej odpowiednio dla etapów 6 i 9.
    UWAGA: Niektóre komórki każdej subklonowanej linii phaESC należy zamrozić w 300 μl pożywki do zamrażania jako kriostock w zbiorniku do przechowywania ciekłego azotu przed przejściem do kroku 9.

6. Drugie genotypowanie subklonowanych linii phaESC bez MEFów

UWAGA: Przeprowadzana jest druga runda genotypowania, aby potwierdzić, że subklonowane linie phaESC posiadają delecje zarówno H19- jak i IG-DMR, oraz że allele typu dzikiego są nieobecne po usunięciu MEF.

1. Potwierdzić pod mikroskopem, że kultury w studzienkach płytek 24-dołkowych z kroku 5.11 są wolne od MEFs.
   UWAGA: W przypadku zaobserwowania MEF-ów konieczne jest kontynuowanie pasażowania kultur do momentu zniknięcia MEF, aby uniknąć zanieczyszczenia PCR DNA typu dzikiego z MEF.
2. Odessać pożywkę z konfluentnych kultur i dodać 400 μl buforu do lizy na dołek 24-dołkowej płytki. Po kilkukrotnym pipetowaniu przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml.
3. Inkubować probówkę o pojemności 1,5 ml w temperaturze 55 °C przez 3 godziny z mieszaniem.
4. Po inkubacji dodać 400 μl izopropanolu do probówki o pojemności 1,5 ml i delikatnie mieszać, aż pojawi się osad DNA.
5. Odwirować probówkę o ≥ 10 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Umyj osad DNA 200 μl 70% etanolu.
6. Odwirować probówkę o ≥ 10 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
7. Wysuszyć probówkę na powietrzu przez 10 minut, a następnie ponownie zawiesić DNA w 50 μl wody.
8. Wykonaj genotypowanie PCR zgodnie z krokiem 4.7 i elektroforezę żelową w kroku 4.8, aby zidentyfikować linie komórkowe, które posiadają delecje zarówno H19, jak i IG-DMR i są wolne od alleli typu dzikiego.
   UWAGA: Obraz typowej analizy drugiego genotypowania jest pokazany w Rysunek 2B w celach informacyjnych. W naszym przypadku wszystkie 5 linii komórkowych wybranych po oczyszczeniu komórek haploidalnych (krok 5) było wolnych od alleli typu dzikiego i posiadało tylko allele delecyjne H19- i IG-DMR.
9. Użyj subklonowanych linii phaESC wybranych po tym drugim genotypowaniu jako linii DKO-phaESC.

7. Superowulacja myszy

1. W celu wytworzenia oocytów MII należy rozpocząć superowulację przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 j.m. roztworu gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) do każdej samicy myszy B6D2F1 (4-5 tygodni) 63-65 godzin przed pobraniem oocytów.
   UWAGA: Szczep myszy B6D2F1 jest zalecany do tego protokołu, ponieważ oocyty B6D2F1 dobrze znoszą wstrzyknięcie docytoplazmatyczne i wykazują wysoki potencjał rozwojowy po zabiegu¹⁷.
2. Czterdzieści osiem godzin po wstrzyknięciu PMSG wstrzyknąć dootrzewnowo 5 j.m. ludzkiego roztworu gonadotropiny kosmówkowej każdej myszy.

8. Kolekcja oocytów

1. Przygotuj 4-dołkową płytkę zawierającą 700 μl pożywki hialuronidazowej w jednym dołku i 700 μl pożywki M2 w pozostałych 3 dołkach. Dodatkowo przygotuj 6-centymetrowe naczynie z 7 ml pożywki M2 oraz naczynie z dołkiem centralnym z 900 μl pożywki M16. Podgrzej talerz i naczynia w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 .}
2. W dniu wstrzyknięcia docytoplazmatycznego należy poddać eutanazji samice z owulacją (od kroku 7.2) przez zwichnięcie szyjki macicy lub wdychanie CO₂ około godziny 8 rano. Wypreparuj jajowody za pomocą pęsety i nożyczek. Umieść jajowody w 6-centymetrowym naczyniu z podłożem M2.
3. Uwolnij kompleksy wzgórek-oocyty (COC), rozrywając bańkę jajowodów za pomocą igły 30 G. Przenieść COC do wstępnie ogrzanej pożywki hialuronidazowej i utrzymywać w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 .}
4. Po 2-3 minutach zebrać oocyty wolne od cumulusów za pomocą pipety doustnej i umyć oocyty 3 razy, przenosząc je na świeże podłoże M2 w pozostałych 3 dołkach płytki 4-dołkowej.
5. Zebrać oocyty metafazy II (MII), które posiadają pierwsze ciała polarne, w naczyniu z dołkiem centralnym z pożywką M16 i utrzymywać płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 do} momentu użycia do wstrzyknięcia docytoplazmatycznego w kroku 12.

9. Leczenie i pobieranie DKO-phaESC

1. Przygotować posiew DKO-phaESC w studzience na 6-dołkowej płytce bez MEF przy 60–80% zbiegu na dzień przed wstrzyknięciem docytoplazmatycznym (od kroku 5.11).
2. Aby wywołać zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie M, należy całkowicie odessać pożywkę i dodać 2 ml pożywki haESC zawierającej 0,05 mg/ml demekolcyny.
3. Po 8 godzinach leczenia demekolcyną odessać pożywkę i dodać 800 μl trypsyny.
4. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ przez 5 minut, następnie dodać 2 ml buforu do przemywania w celu ugaszenia trypsyny i kilkakrotnie pipetować w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
5. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o sile 160 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
6. Zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu podtrzymującego haESC zawierającego 15 μg/ml Hoechst 33342.
7. Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 przez} 15 minut. Po inkubacji przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 5 ml przez nasadkę sitka do komórek i utrzymywać probówkę w temperaturze 4 °C do momentu sortowania komórek w kroku 10.

10. Oczyszczanie DKO-phaESC z zatrzymaną fazą M

1. Ustaw cytometr przepływowy z dyszą 100 μm zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Hoechst 33342 może być wykryty przez wzbudzenie przy 405 nm. W tym przypadku laser UV o długości fali 355 nm jest używany do wykrywania Hoechst 33342.
2. Skonfiguruj DKO-phaESC z zatrzymaną fazą M od kroku 9.7 i rozpocznij analizę. Wybrać odpowiednią bramkę sortującą do pobierania haploidalnych komórek fazy M (2n) z próbki poddanej działaniu demekolcyny.
   UWAGA: Po leczeniu demekolcyną oczekuje się 2 populacji komórek, odpowiadających haploidalnym i diploidalnym komórkom zatrzymanym w fazie M, jak pokazano na Rysunek 3B. Zatrzymanie cyklu komórkowego po leczeniu demekolcyną jest całkowite, w związku z czym nie obserwuje się haploidalnego piku 1n DNA. Jest to ważne, ponieważ haploidalne komórki fazy M i diploidalne komórki G1 mają tę samą zawartość DNA (2n) i wytwarzają nakładające się na siebie piki.
3. Ustawić probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 2 ml buforu podtrzymującego haESC w celu zebrania posortowanych komórek w cytometrze przepływowym. Rozpocznij sortowanie komórek.
4. Po posortowaniu komórek dodać 5 ml buforu do przemywania wzdłuż ścianki probówki zbiorczej. Odwirować probówkę o sile 160 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
5. Zawiesić komórki w odpowiedniej objętości buforu podtrzymującego haESC, aby uzyskać końcowe stężenie 5 x 10 5 komórek/ml.
6. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Trzymaj probówkę na lodzie do momentu, gdy będzie gotowa do wstrzyknięcia docytoplazmatycznego w kroku 12.

11. Przygotowanie pipet do trzymania i mikroiniekcji

UWAGA: Do wykonania iniekcji docytoplazmatycznej (krok 12) wymagane jest kilka pipet do przytrzymywania i mikroiniekcji (Rysunek 4A). Pipety te można zakupić na indywidualne zamówienie od dostawcy komercyjnego lub wykonać z odpowiednich szklanych kapilar za pomocą ściągacza do mikropipet i mikrokuźni.

1. Pociągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego na ściągaczu do mikropipet. Aby wyciągnąć kapilary ze szkła borokrzemianowego bez żarnika (0,78 x 1,00 x 80 mm), następujące parametry są podane dla płonącego ściągacza poziomego (tabela materiałów) jako odniesienie, ale będą się różnić dla innych przyrządów i typów kapilar szklanych: Ciepło 510 (test rampy 480), Ciągnięcie 0, Prędkość 150, Czas 175 i Ciśnienie 200 do trzymania pipet; Ciepło 510 (test rampy 480), Ciągnięcie 90, Prędkość 140, Czas 125 i Ciśnienie 200 dla pipet do mikroiniekcji.
   UWAGA: Optymalne parametry należy określić indywidualnie, ponieważ na kształt pipet iniekcyjnych może wpływać kilka czynników, w tym wilgotność, model ściągacza do mikropipet i ilość szklanych kapilarn. Należy dążyć do wydłużonego kształtu ze stopniowym zwężaniem się.
2. Przygotowanie pipet podtrzymujących
   1. Umieść jedną wyciągniętą kapilarnę przygotowaną w kroku 11.1 do mikrokuźni. Umieść kapilarnę nad szklanym koralikiem na żarniku i opuść kapilarę, aby zetknęła się ze szklanym koralikiem podczas podgrzewania żarnika.
   2. Przerwij kapilarę, wyłączając ogrzewanie i odłączając od szklanego koralika tak, aby jego zewnętrzna średnica wynosiła 60–100 μm.
   3. Ustaw końcówkę kapilary poziomo, tak aby była skierowana w stronę szklanej kulki na żarniku.
   4. Podgrzej włókno, aby wewnętrzna średnica końcówki kapilary stopiła się do średnicy 10–20 μm.
   5. Przesuń kapilatę tak, aby szklana kulka znalazła się w punkcie ~1 mm od końcówki kapilary bez kontaktu. Podgrzej żarnik, aby kapilar mógł zgiąć się pod kątem 20°. Zdemontuj kapilarę, zwaną pipetą przytrzymującą, z mikrokuźni.
      UWAGA: Aby zmierzyć rozmiar kapilary, w mikrokuźni najlepiej jest zainstalować siatkę do okularu.
3. Przygotowanie pipet do mikroiniekcji
   1. Umieść jedną wyciągniętą kapilarnę przygotowaną w kroku 11.1 do mikrokuźni. Umieść kapilarnę nad szklanym koralikiem na żarniku i opuść kapilarę, aby zetknęła się ze szklanym koralikiem podczas podgrzewania żarnika.
   2. Przeciąć kapilarę, wyłączając ogrzewanie i odłączając od szklanej kulki w pozycji, aby jej zewnętrzna średnica wynosiła 6 μm.
   3. Przesuń kapilatę tak, aby szklana kulka znalazła się w punkcie ~1 mm od końcówki kapilary bez kontaktu. Podgrzej żarnik, aby kapilara mogła zgiąć się do góry pod kątem 20°. Zdemontuj pipetę do mikroiniekcji z mikrokuźni i przechowuj ją w bezpiecznym pudełku do późniejszego użycia.
      UWAGA: Pipety do mikroiniekcji są przygotowane z następującymi specyfikacjami: średnica zewnętrzna, 6 μm; średnica wewnętrzna, 4,5–5 μm; kąt gięcia, 20°. Określenie optymalnej konstrukcji pipety do mikroiniekcji jest ważne dla powodzenia iniekcji docytoplazmatycznej. Zbyt duża średnica wewnętrzna może zapobiec pęknięciu błony plazmatycznej DKO-phESC dawcy (patrz sekcja dyskusji). Jeśli średnica wewnętrzna jest zbyt wąska, może to utrudnić płynne pipetowanie donorowych DKO-phESC. Kąt gięcia < 30° jest preferowany, ponieważ wysoki kąt gięcia utrudnia działanie impulsów piezoelektrycznych.

12. Docytoplazmatyczna iniekcja DKO-phaESC

1. Przed wstrzyknięciem docytoplazmatycznym (od kroku 12.2) należy przygotować roztwór poliwinylopirolidonu (PVP), dodając 5 ml pożywki M2 do 50 ml probówki zawierającej 0,6 g PVP i mieszając probówkę na kołysce w temperaturze 4 °C przez 2 dni. Po całkowitym rozpuszczeniu PVP roztwór jest sterylnie filtrowany i przechowywany w temperaturze 4 °C.
2. W dniu iniekcji docytoplazmatycznej należy przygotować naczynie z dostułkiem centralnym z 900 μl pożywki KSOM i wstępnie ogrzać naczynie w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2
.
3. Przygotuj naczynie do mikromanipulacji, wyrównując krople 5 μl roztworu PVP i 20 μl pożywki M2 na pokrywce 10-centymetrowego naczynia umieszczonego do góry nogami. Przykryj krople olejem mineralnym i umieść naczynie na stoliku mikroskopu iniekcyjnego.
   UWAGA: Zalecany układ naczynia do mikromanipulacji jest pokazany na Rysunek 4B.
4. Zainstaluj pipetę przytrzymującą na mikromanipulatorze. Napełnij pipetę do mikroiniekcji olejem fluorowęglowym za pomocą końcówki mikroładowarki i zamontuj ją na siłowniku piezoelektrycznym.
5. Zanurz pipetę do mikroiniekcji w kropli z roztworem PVP i kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby pokryć szkło PVP i sprawić, że będzie mniej lepkie. Załaduj niewielką objętość roztworu PVP do pipety do mikroiniekcji i przesuń pipetę do kropli z podłożem M2.
6. Zanurz pipetę podtrzymującą w podłożu M2 i skup się na pipecie znajdującej się na dnie kropli.
7. Przenieść około 2 μl zawiesiny DKO-phaESC z kroku 10.6 do kropli pożywki M2.
8. Przenieś 10 oocytów MII z kroku 8.5 do tej samej kropli pożywki M2 za pomocą pipety doustnej.
9. W celu wstrzyknięcia należy obrócić oocyt w kropli pożywki M2 tak, aby przestrzeń okołowitelinowa była skierowana w stronę pipety do mikroiniekcji, a płytka MII nie znajdowała się na ścieżce pipety do mikroiniekcji (Rysunek 4A). Przytrzymaj oocyt, wywierając podciśnienie przez pipetę przytrzymującą.
   UWAGA: Płytka MII jest wizualnie identyfikowana jako występ ooplazmy, który jest określany jako "garb" i często znajduje się obok pierwszego ciała polarnego. Płytka MII zawiera wrzeciono mejotyczne z przyłączonymi chromosomami. Należy unikać dotykania pipety do mikroiniekcji i płytki MII, ponieważ mechaniczne uszkodzenie wrzeciona i chromosomów może zakłócić rozwój zarodka.
10. Załadować jeden DKO-phaESC do końcówki pipety do mikroiniekcji, stosując delikatne podciśnienie. Pęknięcie błony plazmatycznej DKO-phaESC przez pipetowanie, aby uniknąć wstrzyknięcia nienaruszonego DKO-phaESC (Rysunek 3C; patrz dyskusja).
    UWAGA: W przypadku, gdy błona plazmatyczna DKO-phaESC nie zostanie rozerwana przez pipetowanie, należy wyrzucić DKO-phaESC i załadować inny DKO-phaESC.
11. Umieścić pipetę do mikroiniekcji w kontakcie z osłonką przejrzystą oocytu i zastosować niewielką ilość podciśnienia w pipecie do mikroiniekcji.
12. Zastosuj impulsy piezoelektryczne (intensywność, 20; częstotliwość, 4), aby przebić się przez zonę, jednocześnie popychając końcówkę pipety do mikroiniekcji w kierunku przestrzeni okołoitelowej. Upewnij się, że płytka MII, zawierająca wrzeciono i chromosomy, nie znajduje się na drodze pipety do mikroiniekcji.
    UWAGA: Empirycznie dostosuj ustawienie do najniższych impulsów piezoelektrycznych do wiercenia przez zonę, aby zminimalizować możliwość uszkodzenia oolemmy.
13. Wyrzucić fragment osłonki przejrzystej z pipety do mikroiniekcji i umieścić DKO-phaESC na krawędzi pipety.
14. Wbić się do oocytu pipetą do mikroiniekcji, tak aby oolemma dotarła do przeciwnej strony.
    UWAGA: Nie dotykaj płytki MII, aby zapobiec uszkodzeniu wrzeciona i chromosomów.
15. Zastosuj impuls piezoelektryczny (intensywność, 6; częstotliwość, 1), aby przebić oolemmę. Upewnij się, że oolemma rozluźnia się wzdłuż trzonu pipety do mikroiniekcji.
    UWAGA: Empirycznie określ najniższe ustawienie impulsu piezoelektrycznego dla przerwania oolemmy, aby zminimalizować uszkodzenie oocytu.
16. Wstrzyknąć DKO-phaESC z minimalną objętością pożywki do ooplazmy i płynnie wyjąć pipetę do mikroiniekcji z oocytu.
17. Uwolnij wstrzyknięty oocyt z pipety przytrzymującej i umieść go z boku mikrokropli w celu późniejszego pobrania.
18. Powtórzyć procedurę wstrzykiwania od kroków 12.9 do 12.17 dla pozostałych oocytów MII w pożywce M2 kropli.
    UWAGA: Unikaj trzymania oocytów poza inkubatorem dłużej niż 20 minut. Z naszego doświadczenia wynika, że partia 10 oocytów może być wygodnie manipulowana w ciągu 15 minut po odpowiednim treningu.
19. Przenieść partię wstrzykniętych oocytów z kropli pożywki M2 do wstępnie podgrzanego naczynia z dołkiem środkowym z pożywką KSOM.
20. Przechowywać naczynie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2
.
21. Powtórz manipulację oocytami z kroków 12.5 i 12.20 z dodatkowymi grupami oocytów MII, aby uzyskać wystarczającą liczbę wstrzykniętych oocytów.

13. Aktywacja skonstruowanych częściowo sklonowanych embrionów

1. Przygotować dwie szalki z dołkiem centralnym po 900 μl każda z pożywką KSOM i pożywką aktywacyjną. Przygotować płytkę 4-dołkową z 700 μl podłoża KSOM w każdym dołku. Podgrzej naczynia i talerz w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 .}
2. Po 1 godzinie w pożywce KSOM przenieść wstrzyknięte oocyty z kroku 12.21 do wstępnie podgrzanego naczynia z dołkiem centralnym z pożywką aktywacyjną.
3. Przechowywać naczynie przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 w} celu aktywacji.
4. Po aktywacji obserwuj, jak niektóre częściowo sklonowane zarodki tworzą trzy ciała polarne, które są pierwszym i drugim ciałem polarnym oocytu oraz ciałem pseudopolarnym z DKO-phaESC (Rysunek 3E).
5. Umyj zarodki 3 razy, przenosząc je do nowych studzienek z pożywką KSOM na płytce 4-dołkowej.
6. Przenieść zarodki do naczynia z dołkiem centralnym z pożywką KSOM i przechowywać szalkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO_{2 w} celu dalszego rozwoju.

14. Rozwój skonstruowanych półklonowanych embrionów

1. Po 1 dniu hodowli na pożywce KSOM od kroku 13.6 kilka częściowo sklonowanych zarodków osiąga stadium 2-komórkowe (Rysunek 5A).
2. W celu dalszego rozwoju zarodków preimplantacyjnych in vitro należy kontynuować hodowlę częściowo sklonowanych zarodków w pożywce KSOM w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%_CO2. Przenieść częściowo sklonowane zarodki na świeże podłoże KSOM w 2 dniu. W 4 dniu kilka zarodków osiągnie stadium blastocysty (Ryc. 5A).
3. W celu uzyskania częściowo sklonowanych myszy należy przenieść zarodki dwukomórkowe z kroku 14.1 do jajowodów samic biorcy w pseudociąży. Zidentyfikuj samice w pseudociąży poprzez krycie z samcami po wazektomii na dzień przed transferem zarodków i wybierz je na podstawie obecności wyraźnie widocznego czopu rano w dniu transferu zarodka (0,5 dnia po stosunku (dpc)). Około 19,5 dpc, donoszone młode są naturalnie dostarczane z samic biorcy (Ryc. 5B).

Wyniki

Celem tego protokołu jest zastosowanie haESC jako substytutu plemników w celu uzyskania częściowo sklonowanych embrionów i myszy. W tym celu stworzono linię DKO-phaESC przenoszącą transgen CAG-EGFP i wykorzystano ją do iniekcji docytoplazmatycznej do oocytów MII. Aby uzyskać odpowiednią linię phaESC z konfiguracją odcisku ojcowskiego, przeprowadziliśmy inżynierię genetyczną z wykorzystaniem nukleaz Cas9. Haploidalna linia ESC zawiera komórki haploidalne i diploidalne, które powstają w wyniku wrodzonej tendencji haploidalnych ESC do diploidyzacji¹⁰. Zestaw haploidalnych chromosomów jest warunkiem wstępnym pomyślnej wymiany genomu plemnika. Analiza zawartości DNA za pomocą cytometrii przepływowej pokazuje rozmieszczenie komórek haploidalnych i diploidalnych w fazach G0/G1, S i G2/M (Figura 2A).

Aby ustalić linie DKO-phaESC, linie phaESC typu dzikiego zostały transfekowane konstruktami transpozonów piggyBac dla stabilnej transgenicznej ekspresji EGFP oraz plazmidami CRISPR/Cas9 w celu uzyskania delecji H19- i IG-DMR. Aby wykluczyć diploidalne ESC i wyizolować tylko haploidalne ESC wyrażające EGFP, zdefiniowano specyficzną bramkę sortowania (Rysunek 2A). Pojedyncze haploidalne komórki EGFP-dodatnie zostały następnie posiane w pojedynczych dołkach 96-dołkowych płytek w celu uzyskania subklonów. Podajniki MEF zastosowano w celu zwiększenia wydajności posiewu i przeżywalności transfekowanych phaESC. Po ekspansji kultur przeprowadzono wstępną rundę genotypowania metodą PCR w celu zidentyfikowania podklonów, które mają delecje obu DMR. Po usunięciu żywicieli MEF z kultur, przeprowadzono drugie genotypowanie w celu potwierdzenia braku alleli typu dzikiego w H19- i IG-DMR (Figura 2B). Z łącznej liczby 135 subklonów uzyskaliśmy 5 haploidalnych linii DKO-phESC, które przenosiły usunięte allele i były wolne od alleli typu dzikiego zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR.

Transgen CAG-EGFP został wprowadzony do DKO-phaESC w celu zbadania ich udziału w częściowo sklonowanych embrionach poprzez wizualizację zielonej fluorescencji pod mikroskopem (Rysunek 3A). W przypadku wstrzyknięcia docytoplazmatycznego DKO-phaESC traktowano demekolcyną w celu zatrzymania ich w fazie M. W ten sposób cykl komórkowy DKO-phaESC był zsynchronizowany z cyklem komórkowym oocytów MII. Analiza cytometrii przepływowej wykazała 2 populacje odpowiadające haploidalnym (2n) i diploidalnym komórkom zatrzymanym w fazie G2/M (2n) i komórkom diploidalnym (4n) po leczeniu demekolcyną (Figura 3B). Brak haploidalnego piku 1n wskazywał, że zatrzymanie cyklu komórkowego było w dużej mierze całkowite. Haploidalne ESC w fazie M zostały następnie posortowane i wstrzyknięte do oocytów. W tym celu pojedynczy DKO-phaESC załadowano do pipety do mikroiniekcji i wstrzyknięto do cytoplazmy oocytu MII (Rysunek 3C). Błona plazmatyczna DKO-phaESC została rozerwana przez pipetowanie do końcówki pipety do mikroiniekcji.

Po wstrzyknięciu, ekspresja EGFP była rzadko wykrywana w skonstruowanych częściowo sklonowanych embrionach, ponieważ cytoplazma DKO-phaESC rozproszyła się w dużej cytoplazmie oocytu (Rysunek 3D). W rzadkich przypadkach w ooplazmie można było zaobserwować okrągłą plamkę o intensywnej ekspresji EGFP. Obserwacja ta była prawdopodobnie spowodowana przypadkowym wstrzyknięciem nienaruszonych DKO-phaESC. Nieprzerwanie błony komórkowej DKO-phaESC prawdopodobnie nie jest zgodne z dalszym rozwojem zarodka i należy tego unikać. Godzinę po wstrzyknięciu zarodki aktywowano poprzez leczenie chlorkiem strontu¹⁸. Sześć godzin po rozpoczęciu aktywacji, pod mikroskopem zaobserwowano do 3 ciał polarnych (Rysunek 3E). Te ciała biegunowe odpowiadają pierwszemu i drugiemu ciału polarnemu oocytu oraz ciału pseudopolarnemu z DKO-phaESC⁷. Ponadto pod mikroskopem kontrastowym z różnicową interferencją zaobserwowano dwa przedjądrza, które przypominały stadium przedjądrowe zygot po normalnym zapłodnieniu plemnikami.

Aby wykazać kompetencje rozwojowe, częściowo sklonowane embriony zostały wyhodowane do stadium blastocysty (Rysunek 5A). Co więcej, uzyskano donoszoną mysz po przeniesieniu częściowo sklonowanych zarodków w stadium 2-komórkowym do jajowodów samicy biorczyni (Ryc. 5B). Zgodnie z oczekiwaniami, mysz pochodząca z częściowo sklonowanego zarodka była samicą, ponieważ ani oocyty, ani phaESC pochodzące z oocytów nie mają chromosomu Y. Na wpół sklonowana mysz była całkowicie normalna i wydała zdrowe potomstwo, gdy została pokryta z dzikim szwajcarskim samcem Webstera. Do tej pory półklonowana mysz żyła przez ponad 600 dni bez żadnych widocznych problemów zdrowotnych.

Rysunek 1: Przegląd zastosowania DKO-phaESC jako zamiennika plemników. (A) Ramy czasowe procedur przewidzianych w protokole. (B) Schemat przedstawia kroki prowadzące do ustanowienia linii DKO-phaESC (kroki 1–6). (C) Schemat przedstawia etapy konstruowania częściowo sklonowanych zarodków poprzez docytoplazmatyczne wstrzyknięcie DKO-phaESC do oocytu MII (kroki 7-14). Skróty: DKO = double-knockout; phaESC = partogenetyczne haploidalne embrionalne komórki macierzyste; FACS = sortowanie komórek aktywowane fluorescencją; MEF = fibroblast embrionalny myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ustanowienie linii DKO-phaESC przez delecje H19 i IG-DMR za pośrednictwem CRISPR/Cas9. (A) Analiza metodą cytometrii przepływowej phaESC po transfekcji plazmidami piggyBac w celu uzyskania stabilnej ekspresji EGFP i 4 plazmidów CRISPR/Cas9. Nietransfekowane phaESC są pokazane jako kontrola. Profil DNA (u góry) pokazuje rozkład cyklu komórkowego komórek haploidalnych i diploidalnych. Haploidalne komórki fazy G1/S wykazujące ekspresję EGFP są oznaczone zieloną bramką (na dole, po prawej). (B) Genotypowanie subklonów phaESC, które były hodowane na MEF (pierwsze genotypowanie) i po usunięciu MEF (drugie genotypowanie). Subklonowane linie phaESC 1, 2, 3 i 4 reprezentują komórki typu dzikiego, komórki z delecją H19-DMR, z delecją IG-DMR oraz z połączonymi delecjami odpowiednio H19 i IG-DMR. Linie DKO-phaESC 5-8 posiadają zarówno delecje H19-DMR, jak i IG-DMR i są wolne od alleli typu dzikiego. Skróty: DKO = double-knockout; phaESC = partogenetyczne haploidalne embrionalne komórki macierzyste; DMR = region zróżnicowanie metylowany; MEF = fibroblast embrionalny myszy; EGFP = wzmocnione białko zielonej fluorescencji; WT = typ dziki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Wstrzyknięcie mitotycznie zatrzymanych DKO-phaESC do oocytów MII. (A) Morfologia kultury DKO-phaESC, która przenosi transgen CAG-EGFP i delecje H19- i IG-DMR; Podziałka = 50 μm. (B) Reprezentatywna analiza metodą cytometrii przepływowej DKO-phaESC po zatrzymaniu demekolcyną przez 8 godzin. DKO-phaESC bez leczenia demekolcyną przedstawiono jako kontrolę. (C) Morfologia DKO-phaESC w pipecie do mikroiniekcji. Pokazano pojedynczy nienaruszony DKO-phaESC przed (po lewej) i po (po prawej) pęknięciu błony plazmatycznej przez pipetowanie; Podziałka = 20 μm. (D) Skonstruowane zarodki po 1 godzinie od wstrzyknięcia DKO-phaESC do oocytów MII. Pokazany jest scalony obraz fluorescencji EGFP i jasnego pola. Czarne groty strzałek wskazują okrągłe plamki o intensywnej ekspresji EGFP po wstrzyknięciu nienaruszonych DKO-phaESC, których należy unikać; podziałka = 50 μm. (E) Pokazano obraz kontrastu różnicowego interferencyjnego częściowo sklonowanych zarodków 6 godzin po rozpoczęciu aktywacji chlorkiem strontu. Białe groty strzałek wskazują zarodki z 3 ciałami biegunowymi, w tym jednym ciałem pseudopolarnym z wstrzykniętego DKO-phaESC; podziałka = 50 μm. Skróty: DKO = double-knockout; phaESC = partogenetyczne haploidalne embrionalne komórki macierzyste; EGFP = wzmocnione białko zielonej fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Schemat konfiguracji do docytoplazmatycznego wstrzykiwania DKO-phaESC do oocytów. (A) Pokazano układ pipety iniekcyjnej, pipety przytrzymującej i oocytu w komorze iniekcyjnej. α, kąt zgięcia pipety do mikroiniekcji. (B) Rozmieszczenie kropli w naczyniu do mikromanipulacji do iniekcji docytoplazmatycznej. Skróty: DKO = double-knockout; phaESC = partogenetyczne haploidalne embrionalne komórki macierzyste. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Rozwój częściowo sklonowanych zarodków. (A) Rozwój preimplantacyjny częściowo sklonowanych zarodków in vitro. Ekspresję EGFP obserwuje się początkowo w zarodkach czterokomórkowych w 2. dniu po wstrzyknięciu docytoplazmatycznym. W 4 dniu można zaobserwować intensywną ekspresję EGFP w blastocystach; podziałka = 100 μm. (B) Częściowo sklonowana mysz uzyskana po transferze 2-komórkowego zarodka do biorczyni płci żeńskiej. W wieku 74 dpp na wpół sklonowana mysz (grot strzały) urodziła swoje pierwsze młode (gwiazdka) przez naturalny poród po kryciu z dzikim szwajcarskim samcem Webstera. Częściowo sklonowane embriony i częściowo sklonowana mysz pokazane na tym rysunku są identyczne z tymi opisanymi w Aizawa et al.³. Skróty: EGFP = enhanced green fluorescent protein; .dpp, dni po porodzie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział: T powiedział:

Roztwór żelatyny
składnik	Koncentracja zapasów	Objętość / waga	Końcowe stężenie
Woda	-	500 ml	-
żelatyna	-	1 gramów	0,2 %
pożywka z hembrionalnych komórek macierzystych (HaESC)
składnik	Koncentracja zapasów	Objętość / waga	Końcowe stężenie
NDiff 227	-	10 ml	-
CHIR 99021	10 mM	3 μL	3 μM
PD 0325901	10 mM	1 μL	1 μM
Lif	1 x 106 j.m./ml	10 μL	1 000 j.m./ml
Penicylina-Streptomycyna	100x	100 μL	1x
Bufor konserwacyjny HaESC
składnik	Koncentracja zapasów	Objętość / waga	Końcowe stężenie
Podłoże z haESC	-	1 ml	-
Rozwiązanie HEPES	1 mln	20 μL	20 mM
Bufor do mycia
składnik	Koncentracja zapasów	Objętość / waga	Końcowe stężenie
DMEM / F-12	-	100 ml	-
Frakcja BSA	7,5%	7,1 ml	0,5 %
MEF średni
składnik	Koncentracja zapasów	Objętość / waga	Końcowe stężenie
DMEM (DMEM)	-	500 ml	-
FBS (Sieć Usługowa	-	56 ml	10%
β-merkaptoetanol	14,3 mol/l	3,9 μl	100 μM
Penicylina-Streptomycyna	100x	5,6 ml	1x
Bufor do lizy
składnik	Koncentracja zapasów	Objętość / waga	Końcowe stężenie
Woda	-	8,25 ml	-
Tris-HCl (pH 8,5)	1 mln	1 ml	100 mM
Edta	0,5 mln	100 μL	5 mM
Rozwiązanie SDS	10%	200 μL	0,2 %
Zawartość NaCl	5 mln	400 μL	200 mM
Proteinaza K	20 mg/ml	50 μL	100 μg/ml
Medium aktywacyjne
składnik	Koncentracja zapasów	Objętość / waga	Końcowe stężenie
KSOM	-	1 ml	-
Chlorek strontu	1 mln	5 μL	5 mM
EGTA (EGTA)	0,5 m, pH 8,0	4 μl	2 mM
Rozwiązanie PVP
składnik	Koncentracja zapasów	Objętość / waga	Końcowe stężenie
M2 średni	-	5 ml	-
Pvp	-	0,6 grama	12%
Rozwiązanie PMSG
składnik	Koncentracja zapasów	Objętość / waga	Końcowe stężenie
Pbs	-	450 μL	-
PMSG (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania	500 j.m./ml	50 μL	50 j.m./ml
rozwiązanie hCG
składnik	Koncentracja zapasów	Objętość / waga	Końcowe stężenie
Pbs	-	450 μL	-
hCG	500 j.m./ml	50 μL	50 j.m./ml
Podłoże hialuronidazowe
składnik	Koncentracja zapasów	Objętość / waga	Końcowe stężenie
M2 średni	-	380 μL	-
Hialuronidazy	10 mg/ml	20 μL	0,5 mg/ml
Skróty: LIF = czynnik hamujący białaczkę; MEF = fibroblast embrionalny myszy;
FBS = płodowa surowica bydlęca; DMEM = zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle Medium; BSA = albumina surowicy bydlęcej;
EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; SDS = dodecylosiarczan sodu; EGTA = kwas etyleno-bis(oksyetylenenitrylo)tetraoctowy;
PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami; PVP = poliwinylopirolidon; hCG = ludzka gonadotropina kosmówkowa;
PMSG = gonadotropina surowicy ciężarnej klaczy.

Tabela 1: Przepis na pożywkę, bufor i roztwór.

nazwa	Sekwencja (od 5' do 3')		aplikacja
H19-DMR-P1	GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG		Genotypowanie
H19-DMR-P2	AGA TGG GGT KOT TCT TTT CC		Genotypowanie
H19-DMR-P3	TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT		Genotypowanie
IG-DMR-P1	TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG		Genotypowanie
IG-DMR-P2	CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA		Genotypowanie
IG-DMR-P3	ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG		Genotypowanie
H19-DMR-gRNA1-F	CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG		gRNA
H19-DMR-gRNA1-R	AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG		gRNA
H19-DMR-gRNA2-F	CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG		gRNA
H19-DMR-gRNA2-R	AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT		gRNA
IG-DMR-gRNA1-F	CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC		gRNA
IG-DMR-gRNA1-R	AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG		gRNA
IG-DMR-gRNA2-F	CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT		gRNA
IG-DMR-gRNA2-R	AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG		gRNA

Tabela 2: Lista oligonukleotydów.

Dyskusja

Klonowanie ssaków metodą transferu jądra komórki somatycznej (SCNT) zostało zapoczątkowane w latach 90. 19,20,21. Zmiany te były następstwem badań nad klonowaniem przeprowadzonych 30 lat wcześniej na²². Znaczne opóźnienie odzwierciedla trudności w embriologii i imprintingu genomowym u ssaków. Rozwój SCNT u ssaków jest podstawą do zastosowania haESC do substytucji plemników, co zostało szczegółowo opisane w niniejszym protokole.

Synchronizacja cyklu komórkowego jest ważnym czynnikiem sukcesu SCNT²³. Dotyczy to również wstrzykiwania haESC w tym protokole. Wprowadzenie genomu dawcy do biorcy wymaga dopasowania faz cyklu komórkowego, aby uniknąć pęknięcia chromosomów lub aneuploidii, które mogłyby zahamować rozwój zarodka. Częściowe klonowanie ma dodatkową złożoność polegającą na tym, że dwa genomy i cytoplast muszą być zgodne. Poprzedni raport wykazał, że wstrzyknięcie androgenowych haESC zatrzymanych w fazie M dało lepsze wskaźniki rozwoju częściowo sklonowanych zarodków niż wstrzyknięcie haESC fazy G1 do oocytów⁷. Ten raport sugeruje fazę M jako odpowiedni punkt synchronizacji dla częściowego klonowania. W związku z tym phaESC zostały mitotycznie zatrzymane w metafazie z demekolcyną i wstrzyknięte do ooplazmy oocytów MII, które zostały naturalnie zatrzymane w metafazie II mejozy. Co ważne, zatrzymanie fazy M można osiągnąć w mysich ESC z wysoką wydajnością, zapewniając doskonałą synchronizację między cyklami komórkowymi dawcy i biorcy.

Podczas mitozy błona jądrowa rozpada się i tworzy się wrzeciono, do którego przyczepiają się zreplikowane chromosomy. Po wstrzyknięciu M-fazowych DKO-phaESC, chromatydy siostrzane są segregowane do pseudo ciała polarnego i zygoty⁷ (ryc. 3E). W związku z tym pojedynczy zestaw chromosomów z DKO-phaESC przyczynia się do powstania częściowo sklonowanego zarodka. Bardzo ważne jest, aby chromatydy siostrzane chromosomów DKO-phaESC mogły być prawidłowo segregowane po wstrzyknięciu. Błona plazmatyczna nienaruszonego DKO-phaESC zapobiega segregacji do ciała pseudopolarnego. Rzeczywiście zaobserwowaliśmy rzadkie przypadki, w których błona plazmatyczna DKO-phaESC nie została przerwana, a zarodki wykazywały nienaruszone DKO-phaESC w ooplazmie po wstrzyknięciu (ryc. 3D). Z tego względu należy zachować ostrożność w celu usunięcia błony plazmatycznej DKO-phaESC za pomocą pipetowania. Podczas iniekcji równie ważne jest, aby uniknąć przerwania wrzeciona mejotycznego oocytu, co może prowadzić do defektów segregacji chromosomów i indukować aneuploidię.

U ssaków imprinting genomowy ogranicza zastosowanie phaESC jako zamiennika plemników. Partenogenetyczne haESC posiadają matczyną konfigurację odcisków genomowych, podczas gdy plemniki mają konfigurację ojcowską. W związku z tym nie doszło do powstania donoszonych młodych po wstrzyknięciu phaESC typu dzikiego w celu zastąpienia plemników. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, delecje IG- i H19-DMR są projektowane w phaESC. Modyfikacja ekspresji wdrukowanej w matczynych loci Igf2-H19 i Gtl2-Dlk1 jest wystarczająca do zmiany konfiguracji odcisków genomowych, aby umożliwić generowanie częściowo sklonowanych myszy z częstością ponad 5,1%, w oparciu o przeniesione zarodki 2-komórkowe. Obserwacje te sugerują, że celowanie w dwa wdrukowane geny przełącza genom phaESC w funkcjonalną konfigurację ojcowską, która może zastąpić plemniki u myszy. Niemniej jednak dla tej strategii wymagana jest trwała modyfikacja genetyczna phaESC. Jako alternatywną strategię można rozważyć androgenowe haESC. Androgenowe haESC pochodzą z genomu plemnika i posiadają odciski ojcowskie. Istnieją doniesienia, że androgenetyczne komórki hematogenetyczne typu dzikiego przyczyniły się do wymiany plemników w celu uzyskania donoszonych młodych z częstością od 1,3% do 1,9% przeniesionych zarodków ^4,7,24. Urodzone o czasie młode uzyskano również poprzez wstrzyknięcie androgenowych haESC z delecjami IG i H19-DMR z częstością 20,2% przenoszonych zarodków dwukomórkowych²⁴. Zwiększona skuteczność półklonowania przy użyciu zmodyfikowanych androgenowych haESC jest prawdopodobnie spowodowana tym, że odciski mogą stać się niestabilne w hodowli. Wady imprintingu są korygowane przez delecje genetyczne krytycznych DMR.

Biorąc pod uwagę trudności we wprowadzaniu modyfikacji genetycznych bezpośrednio do genomów oocytów lub plemników, hemESC są cennym narzędziem do oddzielnego manipulowania genomami rodzicielskimi. Stosowanie haESC jako substytutu plemników zapewnia niezwykłą przewagę w edycji genomu w linii rozrodczej myszy. Niedawne badanie połączyło edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 z zastosowaniem haESC do charakterystyki regionów imprintingu, które mają kluczowe znaczenie dla rozwoju embrionalnego¹². W badaniu tym przeanalizowano rolę Rasgrf1-DMR w połączeniu z H19- i IG-DMR w rozwoju myszy dwumatczynych oraz funkcję 7 różnych DMR w rozwoju myszy dwuojcowskich. Metoda podstawiania plemników za hemESC stanowiła podstawę genetycznych metod przesiewowych w celu identyfikacji kluczowych aminokwasów w białku DND1 w rozwoju pierwotnych komórek rozrodczych oraz identyfikacji genów w rozwoju kości 24,25,26. Badania nad imprintingiem genomowym i genetycznymi badaniami przesiewowymi w celu zidentyfikowania kluczowych czynników rozwoju embrionalnego są znaczącymi podejściami do zastosowania haESC jako genomów gametycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,5 mLTube	Eppendorf	0030 125.150	haPosiew ESC
15 ml Probówka	Greiner Bio-One	188271	posiew haESC
Płytka 12-dołkowa	Thermo Scientific	150628	Termo Nauka Kultura haESC
24-dołkowa	Thermo Scientific	142475	Płytka
6-dołkowa	Thermo Scientific	140675	kultura haESC
Płytka 96-dołkowa	Thermo Scientific	167008	kultura haESC
β-Merkaptoetanol	Kultura haESC	Merck	M6250
Frakcja BSA	Gibco	15260-037	haKultura ESC
CHIR 99021	Axon	1386	haESC
Roztwór demekolcyny	Merck	D1925	kultura haESC
DMEM	Gibco	41965-039	kultura haESC
DMEM / F-12	Gibco	11320-033	kultura haESC
mysz DR4 Laboratorium	Jacksona	3208	haKultura ESC
EDTA	Merck	E5134	haKultura ESC
FBS	biowest	S1810-500	haKultura ESC
Pożywka	zamrażająca amsbio	11897	haESC kultura
żelatyna	Merck	G1890	haPosiew
ESC Roztwór Hepes	Gibco	15630-056	haPosiew ESC
Napromieniowany MEF	Gibco	A34966	haPosiew ESC
LIF (czynnik hamujący białaczkę)	(domowej)	-	haKultura ESC
Odczynnik Lipofection	Invitrogen	11668019	kultura
NDiff 227	Takara	Y40002	kultura haESC
PD 0325901	Axon	1408	hodowla haESC
Pen Strep	Gibco	15140-122	hodowla haESC
piggyBac plazmid przenoszący transgen CAG-EGFP	Addgene	#40973	hodowla haESC
piggyTranspozaza plazmidowa	System nauk biologicznych	PB210PA-1	hodowla
pX330 plazmid	Addgene	#42230	haESC hodowla
plazmidu pX458	Addgene	#48138	haESC kultura
trypsyna	Gibco	15090-046	haESC
kultura polimeraza DNA	Thermo Scientific	F549S	Genotypowanie
dNTP Mix	Thermo Scientific	R0192	Genotypowanie
etanolu	Merck	100983	Genotypowanie
Kwas solny	Merck	100317	Genotypowanie
Izopropanol	Merck	109634	Genotypowanie
Proteinaza K	Axon	A3830	Genotypowanie
SDS	Merck	71729	Genotypowanie
Chlorek sodu	Merck	106404	Genotypowanie
ThermoMixer	Epeendorf	5384000012	Genotypowanie
Tris	Merck	T1503	Genotypowanie
5 ml probówka	Falcon	352063	Cytometria przepływowa
5 ml Probówka z nasadką sitka komórkowego	Falcon	352235	Cytometria przepływowa
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cytometria przepływowa
MoFlo Astrios EQ	Beckman Coulter	B25982	Cytometria przepływowa
Strzykawka 1 ml	Codan	62.1640	Superowulacja
30-głośna igła 1/2 cala	Merck	Z192362-100EA	Superowulacja
B6D2F1 mysz	Jackson Laboratory	100006	Superowulacja
hCG	MSD zdrowie zwierząt	49451	Superowulacja
PBS	Gibco	10010015	Superowulacja
PMSG	Avivasysbio	OPPA1037 5000 j.m	Miska Superowulacja
10 cm	Thermo Scientific	150350	Manipulacja zarodkami
4-dołkowa płytka	Thermo Scientific	179830	Manipulacja zarodkami
Probówka 50 ml	Greiner Bio-One	227261	Manipulacja zarodkami
Naczynie 6 cm	Thermo Scientific	150288	Manipulacja
Miska z dołkiem centralnym	Corning	3260	Manipulacja zarodkami
Cyfrowy bujak	Thermo Scientific	88880020	Manipulacja zarodkami
EGTA	AppliChem	A0878	Manipulacja zarodków
Hialuronidaza	Merck	H4272	Manipulacja zarodkami
KSOM	Merck	MR-020P-5F	Manipulacja zarodkami
M16 średni	Merck	M7292	Manipulacja zarodkami
M2 średni	Merck	M7167	Manipulacja zarodków
Olej mineralny	Merck	M8410	Manipulacja zarodkami
Szklana kapilara	Merck	P1049-1PAK	Manipulacja zarodkami
	Stereoskop Nikon	SMZ745	Manipulacja zarodkami
Chlorek strontu	Merck	13909	Manipulacja zarodkami
Strzykawka 5 ml	Codan	62.5607	Mikroiniekcja
Kapsułka ze szkła borokrzemianowego	Produkt naukowy	GB100T-8P	Mikroiniekcja
CellTram 4r Olej	Eppendorf	5196000030	Mikroiniekcja
Fluorinert FC-770	Merck	F3556	mikroiniekcji
	Instrumenty biomedyczne-Mikroiniekcja
Mikroskop odwrócony	Nikon	Eclipse Ti-U	Mikroiniekcja
Microforge	Narishige	MF-900	Mikroiniekcja
Pipeta do mikroiniekcji	Instrumenty biomedyczne-Końcówki		mikroiniekcji
	Eppendorf	5252 956.003	Mikroiniekcja
Ramiona mikromanipulacyjne	Narishige	NT-88-V3	mikropipet do mikroiniekcji
	Sutter Instrument	P-1000	Mikroiniekcja
PiezoXpert	Eppendorf	5194000016	Mikroiniekcja
PVP (poliwinylopirolidyna)	Merck	PVP360
Filtr strzykawkowy	SARSTEDT	83.1826.001	Mikroiniekcja