Ten artykuł ma na celu pokazanie użycia partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych jako substytutu plemników do budowy półklonowanych embrionów.
Artykuł metodologiczny
Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W organizmach z rozmnażaniem płciowym, komórki rozrodcze są źródłem komórek totipotencjalnych, które rozwijają się w nowe osobniki. U myszy zapłodnienie oocytu przez plemnik tworzy totipotencjalną zygotę. Ostatnio w kilku publikacjach doniesiono, że haploidalne embrionalne komórki macierzyste (haESC) mogą być substytutem genomów gametycznych i przyczyniać się do powstawania zarodków, które rozwijają się w myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania partenogenetycznych haESC jako substytutu plemników do budowy zarodków poprzez docytoplazmatyczne wstrzyknięcie do oocytów. Protokół ten składa się z etapów przygotowania komórek haESC do wymiany plemników, wstrzyknięcia chromosomów haESC do oocytów oraz hodowli częściowo sklonowanych zarodków. Zarodki mogą dać płodne, częściowo sklonowane myszy po transferze zarodków. Wykorzystanie haESC jako zamiennika plemnika ułatwia edycję genomu w linii zarodkowej, badania rozwoju embrionalnego i badanie imprintingu genomowego.
Wprowadzenie
U ssaków gamety są jedynymi komórkami, które przekazują informacje genetyczne następnemu pokoleniu. Fuzja oocytu i plemnika tworzy diploidalną zygotę, która rozwija się w dorosłe zwierzę. Mutacje w genomach gametycznych są w ten sposób dziedziczone przez potomstwo i napędzają zmienność genetyczną w species1. Wprowadzenie mutacji w linii zarodkowej zostało zastosowane do produkcji genetycznie zmodyfikowanych zwierząt do różnych badań biologicznych, w tym do charakterystyki funkcji genów i modelowania chorób. Zarówno oocyty, jak i plemniki są terminalnie zróżnicowanymi i wysoce wyspecjalizowanymi komórkami, które przestały się namnażać. Dlatego bezpośrednia modyfikacja gamet jest technicznie trudna i opracowano specjalistyczne podejścia. Modyfikacje genetyczne można wprowadzić do linii rozrodczej myszy poprzez wstrzyknięcie genetycznie zmodyfikowanych ESC do blastocyst, gdzie integrują się z rozwijającym się zarodkiem i kolonizują linię zarodkową. Dodatkowo, genetyczna modyfikacja zygot przy użyciu metod edycji genomu, w tym systemu CRISPR/Cas9, stała się powszechnie stosowana2.
Ostatnio opisano znakomite podejście, które stosuje haESC jako substytut genomu gametycznego3,4,5,6,7,8. HaESC to linie komórek macierzystych wywodzące się z wewnętrznej masy komórkowej stadnocyst haploidalnych partenogenetycznych lub androgenetycznych i posiadają pojedynczy zestaw chromosomów4,7,9,10. Wykazano, że zarówno partenogenetyczne, jak i androgenetyczne haESC mogą przyczyniać się do genomu częściowo sklonowanych myszy po docytoplazmatycznym wstrzyknięciu do oocytów. W przeciwieństwie do innych podejść, genomy haESC mogą być bezpośrednio modyfikowane w hodowli ze względu na ich zdolność do samoodnawiania się. Wprowadzanie modyfikacji genetycznych do linii zarodkowej poprzez zastąpienie plemników hemokomórkami jest ważną metodą badań biologicznych. Daje ona możliwość oddzielnej hodowli i manipulowania genomem matki lub ojca, które pochodzą odpowiednio z partenogenetycznych lub androgenowych komórek macierzystych. HaESC mogą być następnie wykorzystywane jako zamiennik genomu gametycznego, co jest szczególnie korzystne w badaniach nad imprintingiem genomowym, ekspresją specyficzną dla alleli i procesami specyficznymi dla rodziców.
U myszy zarówno informacje genomowe matki, jak i ojca są niezbędne do prawidłowego rozwoju zarodka11. W związku z tym nie można było uzyskać donoszonych młodych, gdy wstrzyknięto partenogenetyczne hemesc (phaESC) typu dzikiego w celu zastąpienia genomu plemnika5,8. Aby przezwyciężyć blokadę rozwojową, genomowe imprinting matczynego genomu partenogenetycznych komórek macierzystych musi zostać skorygowany do konfiguracji ojcowskiej. Można to osiągnąć poprzez manipulację regionami zróżnicowanie metylowanymi (DMR). Do tej pory badano celowe delecje H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR i Rasgrf1-DMR w celu tłumienia genów wyrażanych matczyno w phaESCs3,5,8,12. Badania te wykazały, że delecje zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR są wystarczające do przekształcenia konfiguracji odcisku matczynego w ojcowską, która może zastąpić chromosomy plemników. Docytoplazmatyczne wstrzyknięcie phaESC, które przenoszą dwie delecje DMR do oocytów, dało częściowo sklonowane młode z częstością od 5,1% do 15,5% przeniesionych zarodków dwukomórkowych.
Ten protokół opiera się na zastosowaniu phaESC z delecjami zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR, które nazywamy phaESC z podwójnym nokautem (DKO-phaESC). Udostępniamy szczegółowe instrukcje dotyczące modyfikacji imprintingu genomowego w phaESC w celu ustanowienia linii DKO-phaESC, wstrzykiwania DKO-phaESC do oocytów jako substytutu genomu plemnika, hodowli częściowo sklonowanych zarodków do blastocyst oraz uzyskiwania częściowo sklonowanych myszy. Protokół ten jest punktem odniesienia dla badaczy, którzy wymagają precyzyjnej i bezpośredniej manipulacji ojcowskiego genomu i generowania częściowo sklonowanych zarodków i myszy.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone na podstawie licencji ZH152/17 zgodnie ze standardami i przepisami Kantonalnej Komisji Etyki w Zurychu oraz zakładu dla zwierząt EPIC w Instytucie Molekularnych Nauk o Zdrowiu, ETH Zurych.
UWAGA: Ten protokół zaczyna się od usunięcia H19- i IG-DMR w phaESC. Szczegółowe informacje na temat ustanawiania linii phaESC można znaleźć w opublikowanych raportach10,13. Przegląd i ramy czasowe tego protokołu (kroki 1–14) znajdują się w Rysunek 1A; pożywki, roztwory i są wymienione w tabeli 1. Procedura ustanawiania linii DKO-phaESC (kroki 1–6) jest pokazana w Rysunek 1B, a strategia konstruowania częściowo sklonowanych zarodków (kroki 7–14) jest przedstawiona w Rysunek 1C.
1. Transfekcja plazmidów w celu delecji H19-DMR i IG-DMR w phaESC
- Przygotuj plazmidy CRISPR/Cas9 do koekspresji nukleaz Cas9 i skieruj RNA do docelowych delecji H19-DMR i IG-DMR. Zwiąż cztery pary oligonukleotydów przewodnika RNA (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R wymienione w tabeli 2) do plazmidów pX330.
UWAGA: Zapoznaj się z opublikowanym protokołem dotyczącym szczegółowej procedury przygotowania tych 4 plazmidów CRISPR/Cas914. Alternatywnie, plazmidy dostępne dla ogólnych szczepów myszy są również dostępne za pośrednictwem repozytorium (Tabela materiałów). - Pokryć powierzchnię jednego dołka płytki 6-dołkowej 1 ml 0,2% roztworu żelatyny przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
- Płytka 2 × 105 fazoESC typu dzikiego na studzience pokrytej żelatyną w pożywce haESC bez antybiotyków i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 przez 1 dzień.
UWAGA: Antybiotyki są pomijane w pożywce, aby zwiększyć skuteczność późniejszej lipofekcji. Użyliśmy phaESC typu dzikiego w przejściu 10. Zalecamy korzystanie z faz wczesnego przejścia, ale z powodzeniem zastosowano różne numery pasaży8. Korelacja między liczbą pasaży a skutecznością uzyskiwania częściowo sklonowanych zarodków i myszy nie jest obecnie znana. - Transfekcja phaESC w studzience 6-dołkowej płytki (od kroku 1.3) z 6 plazmidami jednocześnie przy użyciu odczynnika lipofekcji: 50 ng plazmidu piggyBac przenoszącego transgen CAG-EGFP, 50 ng plazmidu transpozazy piggyBac i 600 ng każdego z 4 plazmidów CRISPR/Cas9 (z kroku 1.1). Zapoznaj się z protokołem producenta dotyczącym szczegółowej procedury transfekcji.
UWAGA: Dwa plazmidy piggyBac są używane do integracji transpozonu do wszechobecnej ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w genomie phaESC. Jeśli znakowanie komórek GFP nie jest wymagane, te dwa plazmidy można zastąpić plazmidem CRISPR/Cas9 w celu przejściowej ekspresji białek fluorescencyjnych (np. plazmidu pX458) zamiast jednego z plazmidów pX330. Przejściowa ekspresja EGFP może być następnie wykorzystana do sortowania transfekowanych komórek. - Dwa dni po transfekcji odessać pożywkę i dodać 800 μl trypsyny.
- Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 5 minut. Następnie dodaj 2 ml buforu do płukania, aby ugasić trypsynę i kilkakrotnie pipetować, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
- Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować probówkę o stężeniu 160 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu podtrzymującego haESC uzupełnionego 15 μg/ml Hoechst 33342.
UWAGA: Aby zmniejszyć potencjalną toksyczność Hoechst 33342, zamiast 15 μg/ml Hoechst 33342 i 50 μM werapamilu zastosowano 1 μg/ml Hoechst 3334215. - Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 15 minut. Po inkubacji przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 5 ml przez nasadkę sitka do komórek i utrzymywać probówkę w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie gotowa do użycia w następnym kroku (sekcja 2).
2. Posiewanie pojedynczych komórek transfekowanych phaESC za pomocą cytometru przepływowego
- Na jeden dzień przed sortowaniem transfekowanych faESC, napromieniowane płytki mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) na pokrytych żelatyną 96-dołkowych płytkach o gęstości 4 ×10 4 komórek/cm2 w pożywce MEF. Zazwyczaj przygotowuje się 6 płytek w celu ustanowienia linii phaESC z ukierunkowanymi delecjami. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2.
UWAGA: Napromieniowane MEF-y są dostępne w handlu. Używamy MEF pochodzących z zarodków E12.5 myszy DR4. Chociaż haESC mogą rosnąć na płytkach pokrytych żelatyną bez MEF, zalecamy MEF w celu zwiększenia żywotności posortowanych pojedynczych haESC. - W dniu sortowania należy odessać pożywkę MEF z płytek 96-dołkowych i dodać 120 μl świeżej pożywki haESC do dołka. Przechowywać płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 .
- Ustaw sorter komórek z dyszą 100 μm zgodnie z instrukcjami producenta. Laser UV o długości fali 355 nm i laser niebieski o długości fali 488 nm służą do wzbudzania fluorescencji Hoechst 33342 i EGFP.
UWAGA: Alternatywnie, Hoechst 33342 może być wykryty przez wzbudzenie z 405 nm. - Posortuj transfekowane phaESC w probówce 5 ml (od kroku 1.10) za pomocą bramki do zbierania komórek haploidalnych w fazie G1/S, które wykazują ekspresję EGFP. Umieść pojedynczą komórkę w każdym dołku z 96-dołkowych płytek z kroku 2.2.
UWAGA: Wykrywanie barwienia Hoechst 33342 na ogół rozróżnia 3 piki komórek o zawartości DNA 1n, 2n i 4n, które odpowiadają komórkom haploidalnym w fazie G1, mieszaninie komórek haploidalnych w fazie G2/M i komórkom diploidalnym w fazie G1 oraz komórkom diploidalnym w fazie G2/M, odpowiednio. Komórki haploidalne w fazie G1/S są identyfikowane jako pik o mniejszym natężeniu fluorescencji Hoechst 33342. Reprezentatywny wynik i bramkę sortowania są pokazane w Rysunek 2A. - Po posianiu inkubować 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
3. Podklonowanie transfekowanych phaESC
- Trzy dni po posiewie pojedynczych komórek można obserwować kolonie w kilku dołkach 96-dołkowych płytek pod mikroskopem. Zaznacz studnie, w których rosną tylko pojedyncze kolonie.
UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że pojedyncze kolonie zaobserwowano w 20%–40% studzienek na płytkach 96-dołkowych. - W 4 dniu po posiewie pojedynczych komórek zastąp połowę pożywki nową pożywką haESC w studzienkach z pojedynczymi koloniami.
- Na jeden dzień przed pasażowaniem (w 4 lub 5 dniu po posiewie pojedynczych komórek) napromieniować MEF-y na 96-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną o gęstości 4 × 104 komórek/cm2 w pożywce MEF. Przechowywać płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 .
- Po 5 lub 6 dniach posiewu jednokomórkowego wybrać studzienki z 96-dołkowych płytek zawierających pojedyncze kolonie o średnicy większej niż 150 μm.
UWAGA: Zaleca się wybór około 100 studzienek w celu ustanowienia linii phaESC z docelowymi delecjami DMR. - Zassać pożywkę do wybranych studzienek i dodać 30 μl trypsyny. Inkubować 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 5 minut. Następnie dodaj 30 μl buforu do płukania do każdej studzienki, aby ugasić trypsynę.
- Dodać 140 μl pożywki haESC do każdego dołka i kilkakrotnie odpipetować, aby uzyskać pojedyncze komórki.
- Odessać pożywkę MEF z dołków 96-dołkowych płytek przygotowanych w kroku 3.3.
- Przenieść phaESC z każdej studzienki z kroku 3.6 do świeżej studzienki nowej płytki 96-dołkowej z kroku 3.7.
- Inkubować 96-dołkowe płytki zawierające subklony phaESC w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
- Następnego dnia odessać całą pożywkę z każdej studzienki i dodać 120 μl nowej pożywki haESC. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
- Na dzień przed tym, jak komórki zaczną się zlewać w celu pasażowania, napromieniowane MEF-y umieścić na 24-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną o gęstości 4 × 104 komórek/cm2 w pożywce MEF. Przechowywać płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 .
- Gdy phaESC zlewają się do pasażowania, odessać pożywkę i dodać 30 μl trypsyny. Inkubować 96-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
- Dodaj 90 μl buforu do płukania do każdej studzienki, aby ugasić trypsynę. Odpipetować kilka razy, aby uzyskać pojedyncze komórki.
- Odessać pożywkę MEF z dołków 24-dołkowych płytek z kroku 3.11 i dodać 600 μl świeżej pożywki haESC.
- Przenieść 60 μl zawiesiny subklonów phaESC z każdej studzienki z kroku 3.13 do nowego dołka z płytkami 24-dołkowymi z kroku 3.14. Zachowaj pozostałą zawiesinę każdego subklonu phaESC do ekstrakcji DNA i genotypowania w kroku 4.
- Inkubować 24-dołkowe płytki z subklonami phaESC w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
- Na dzień przed osiągnięciem przez hodowle komórkowe gęstości wymagającej pasażowania, napromieniowane MEF-y należy umieścić na pokrytych żelatyną płytkach 6-dołkowych o gęstości 4 × 104 komórek/cm2 w pożywce MEF. Przechowywać płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 .
- Gdy phaESC staną się wystarczająco zlewające się do pasażowania, odessać pożywkę i dodać 250 μl trypsyny. Inkubować 24-dołkowe płytki w temperaturze 37 °C przez 5 min.
UWAGA: Po genotypowaniu w kroku 4.9 należy przejść tylko linie phaESC z delecjami zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR. - Dodaj 750 μl buforu do płukania do każdej studzienki, aby ugasić trypsynę. Odpipetować kilka razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować probówkę o sile 160 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki haESC.
- Odessać pożywkę MEF z dołków płytek 6-dołkowych z kroku 3.17. Przenieść zawiesinę phaESC z każdej probówki z kroku 3.20 do nowej studzienki. Przechowywać płytki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 .
- Rozwiń klony komórek, powtarzając kroki od 3.17 do 3.21 i zwiększając rozmiar płytki oraz objętość trypsyny, buforu do płukania i pożywki haESC. Przygotuj kolbę T25 dla każdej subklonowanej linii MEF phaESC dla kroku 5.
UWAGA: Zalecamy zamrożenie podwielokrotności każdej podklonowanej linii phaESC w 300 μl pożywki zamrażającej i przechowywanie kriomateriału w ciekłym azocie przed przejściem do kroku 5.
4. Pierwsze genotypowanie subklonowanych linii phaESC za pomocą MEFów
- Aby wyekstrahować genomowe DNA z pozostałej zawiesiny komórkowej z kroku 3.15, dodaj 200 μl buforu do lizy do każdej studzienki z 96-dołkowych płytek. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Przepłucz każdą studzienkę dodatkowymi 200 μl buforu do lizy, aby odzyskać wszystkie pozostałe komórki i zebrać w tej samej probówce o pojemności 1,5 ml.
- Inkubować probówkę o pojemności 1,5 ml w temperaturze 55 °C przez 3 godziny z mieszaniem.
- Po inkubacji dodać 460 μl izopropanolu do każdej probówki o pojemności 1,5 ml i delikatnie mieszać, aż pojawi się osad DNA.
- Odwirować probówki o ≥ 10 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Umyj granulki DNA 200 μl 70% etanolu.
- Odwirować probówki o ≥ 10 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
- Suszyć probówki na powietrzu przez 10 minut, a następnie ponownie zawiesić DNA w 20 μl wody.
- Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu termostabilnej polimerazy DNA zgodnie z protokołem producenta.
UWAGA: Pary starterów do PCR są wymienione w tabeli 2 i są używane w następujący sposób: H19-DMR-P1 i P3 (407 pz dla usuniętego H19-DMR); H19-DMR-P2 i P3 (623 pz dla H19-DMR typu dzikiego); IG-DMR-P1 i P3 (319 pz dla usuniętego IG-DMR); IG-DMR-P2 i P3 (492 pz dla IG-DMR typu dzikiego). Profil temperaturowy PCR dla wszystkich par starterów jest następujący: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. Długość amplifikowanych fragmentów DNA dla delecji H19-DMR i IG-DMR wykazuje pewną zmienność z powodu niehomologicznego łączenia końców związanego z edycją za pośrednictwem CRISPR/Cas9. PhaESC hodowano z MEF, które zawierają DNA H19-DMR i IG-DMR typu dzikiego. Dlatego pary starterów H19-DMR-P2/P3 i IG-DMR-P2/P3, które amplifikują fragmenty DNA typu dzikiego, nie mają charakteru informacyjnego. Jednak te pary starterów są zawarte jako kontrole i powinny dawać prążek we wszystkich reakcjach. - Analizuj fragmenty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Zapoznaj się z opublikowanym protokołem dotyczącym szczegółowej procedury elektroforezy16.
- Zidentyfikuj linie komórkowe z delecjami zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR. Reprezentatywny obraz elektroforezy jest pokazany w Rysunek 2B.
UWAGA: W naszym przypadku osiem linii komórkowych z delecjami zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR zidentyfikowano wśród 135 subklonowanych linii phaESC.
5. Oczyszczanie komórek haploidalnych subklonowanych linii phaESC
- Gdy subklonowane kultury phaESC w kolbach T25 z kroku 3.22 staną się wystarczająco gęste do pasażowania, odessać pożywkę i dodać 1,5 ml trypsyny. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Następnie kilkakrotnie dodać 4,5 ml buforu do płukania i pipetę, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
- Przenieść zawiesinę każdej komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować probówkę o stężeniu 160 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 400 μl buforu do konserwacji haESC uzupełnionego 15 μg/ml Hoechst 33342.
- Inkubować zawiesiny komórkowe w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Po inkubacji przenieść zawiesiny komórek do probówki o pojemności 5 ml przez nasadkę z sitkiem do komórek. Przepłukać nasadkę sitka komórkowego dodatkowymi 400 μl buforu do konserwacji haESC i zebrać pozostałe komórki w tej samej probówce o pojemności 5 ml. Przechowywać probówkę w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie gotowa do sortowania.
- Ustaw cytometr przepływowy z dyszą 100 μm zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: Hoechst 33342 może być wykryty przez wzbudzenie przy 405 nm. W tym przypadku laser UV o długości fali 355 nm jest używany do wykrywania Hoechst 33342. - Ustawić zawiesinę komórek (od kroku 5.3) i nową probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 2 ml buforu podtrzymującego haESC, aby zebrać posortowane komórki w cytometrze przepływowym.
- Rozpocznij analizę i ustaw bramkę sortowania, aby zebrać haploidalne komórki w fazie G1/S. Zapoznaj się z histogramem w Rysunek 2A w celu identyfikacji populacji faz fazowych G1/S.
UWAGA: Niektóre subklonowane linie phaESC mogą nie zawierać żadnych komórek haploidalnych z powodu całkowitej diploidyzacji lub błędnego posiewu komórek diploidalnych w kroku 2. Jeśli komórki haploidalne nie zostaną zaobserwowane w fazie G1/S, należy przejść do innej próbki bez sortowania. W naszym przypadku 5 linii komórkowych zawierało komórki haploidalne, a 3 linie komórkowe zawierały tylko komórki diploidalne z 8 subklonowanych linii phaESC. - Po posortowaniu komórek dodać 5 ml buforu do przemywania wzdłuż ścianki probówki zbiorczej o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o masie 160 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant.
- Wybierz płytkę o odpowiedniej wielkości do hodowli w zależności od liczby posortowanych komórek. Użyj pojedynczego dołka z płytki 96-dołkowej, płytki 24-dołkowej i płytki 12-dołkowej do hodowli odpowiednio 1 000–40 000 komórek, 40 000–200 000 komórek i 200 000–400 000 komórek. Zawiesić osad komórkowy odpowiednio w 120 μl, 600 μl i 1,2 ml pożywki haESC.
UWAGA: Płytki komórek o dużej gęstości, ponieważ niska konfluencja może spowodować śmierć komórek po sortowaniu. Od tego momentu phaESC są hodowane w studzienkach pokrytych żelatyną bez MEF, aby ułatwić genotypowanie w kroku 6 i późniejsze zastosowanie do iniekcji docytoplazmatycznej od etapu 9. - Po przeniesieniu zawiesiny komórek do studzienki pokrytej żelatyną o odpowiedniej wielkości, należy inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 .
- Kontynuuj rozszerzanie kultur phaESC, powtarzając kroki od 3.18 do 3.21 ze zwiększaniem rozmiarów płytek i zwiększając objętość trypsyny, buforu do przemywania i pożywki haESC. Komórki są hodowane w studzienkach pokrytych żelatyną bez MEF.
- Dla każdej subklonowanej linii phaESC należy przygotować hodowlę w jednym dołku na płytce 24-dołkowej i w jednym dołku na płytce 6-dołkowej odpowiednio dla etapów 6 i 9.
UWAGA: Niektóre komórki każdej subklonowanej linii phaESC należy zamrozić w 300 μl pożywki do zamrażania jako kriostock w zbiorniku do przechowywania ciekłego azotu przed przejściem do kroku 9.
6. Drugie genotypowanie subklonowanych linii phaESC bez MEFów
UWAGA: Przeprowadzana jest druga runda genotypowania, aby potwierdzić, że subklonowane linie phaESC posiadają delecje zarówno H19- jak i IG-DMR, oraz że allele typu dzikiego są nieobecne po usunięciu MEF.
- Potwierdzić pod mikroskopem, że kultury w studzienkach płytek 24-dołkowych z kroku 5.11 są wolne od MEFs.
UWAGA: W przypadku zaobserwowania MEF-ów konieczne jest kontynuowanie pasażowania kultur do momentu zniknięcia MEF, aby uniknąć zanieczyszczenia PCR DNA typu dzikiego z MEF. - Odessać pożywkę z konfluentnych kultur i dodać 400 μl buforu do lizy na dołek 24-dołkowej płytki. Po kilkukrotnym pipetowaniu przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml.
- Inkubować probówkę o pojemności 1,5 ml w temperaturze 55 °C przez 3 godziny z mieszaniem.
- Po inkubacji dodać 400 μl izopropanolu do probówki o pojemności 1,5 ml i delikatnie mieszać, aż pojawi się osad DNA.
- Odwirować probówkę o ≥ 10 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Umyj osad DNA 200 μl 70% etanolu.
- Odwirować probówkę o ≥ 10 000 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
- Wysuszyć probówkę na powietrzu przez 10 minut, a następnie ponownie zawiesić DNA w 50 μl wody.
- Wykonaj genotypowanie PCR zgodnie z krokiem 4.7 i elektroforezę żelową w kroku 4.8, aby zidentyfikować linie komórkowe, które posiadają delecje zarówno H19, jak i IG-DMR i są wolne od alleli typu dzikiego.
UWAGA: Obraz typowej analizy drugiego genotypowania jest pokazany w Rysunek 2B w celach informacyjnych. W naszym przypadku wszystkie 5 linii komórkowych wybranych po oczyszczeniu komórek haploidalnych (krok 5) było wolnych od alleli typu dzikiego i posiadało tylko allele delecyjne H19- i IG-DMR. - Użyj subklonowanych linii phaESC wybranych po tym drugim genotypowaniu jako linii DKO-phaESC.
7. Superowulacja myszy
- W celu wytworzenia oocytów MII należy rozpocząć superowulację przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 5 j.m. roztworu gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) do każdej samicy myszy B6D2F1 (4-5 tygodni) 63-65 godzin przed pobraniem oocytów.
UWAGA: Szczep myszy B6D2F1 jest zalecany do tego protokołu, ponieważ oocyty B6D2F1 dobrze znoszą wstrzyknięcie docytoplazmatyczne i wykazują wysoki potencjał rozwojowy po zabiegu17. - Czterdzieści osiem godzin po wstrzyknięciu PMSG wstrzyknąć dootrzewnowo 5 j.m. ludzkiego roztworu gonadotropiny kosmówkowej każdej myszy.
8. Kolekcja oocytów
- Przygotuj 4-dołkową płytkę zawierającą 700 μl pożywki hialuronidazowej w jednym dołku i 700 μl pożywki M2 w pozostałych 3 dołkach. Dodatkowo przygotuj 6-centymetrowe naczynie z 7 ml pożywki M2 oraz naczynie z dołkiem centralnym z 900 μl pożywki M16. Podgrzej talerz i naczynia w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
- W dniu wstrzyknięcia docytoplazmatycznego należy poddać eutanazji samice z owulacją (od kroku 7.2) przez zwichnięcie szyjki macicy lub wdychanie CO2 około godziny 8 rano. Wypreparuj jajowody za pomocą pęsety i nożyczek. Umieść jajowody w 6-centymetrowym naczyniu z podłożem M2.
- Uwolnij kompleksy wzgórek-oocyty (COC), rozrywając bańkę jajowodów za pomocą igły 30 G. Przenieść COC do wstępnie ogrzanej pożywki hialuronidazowej i utrzymywać w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
- Po 2-3 minutach zebrać oocyty wolne od cumulusów za pomocą pipety doustnej i umyć oocyty 3 razy, przenosząc je na świeże podłoże M2 w pozostałych 3 dołkach płytki 4-dołkowej.
- Zebrać oocyty metafazy II (MII), które posiadają pierwsze ciała polarne, w naczyniu z dołkiem centralnym z pożywką M16 i utrzymywać płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 do momentu użycia do wstrzyknięcia docytoplazmatycznego w kroku 12.
9. Leczenie i pobieranie DKO-phaESC
- Przygotować posiew DKO-phaESC w studzience na 6-dołkowej płytce bez MEF przy 60–80% zbiegu na dzień przed wstrzyknięciem docytoplazmatycznym (od kroku 5.11).
- Aby wywołać zatrzymanie cyklu komórkowego w fazie M, należy całkowicie odessać pożywkę i dodać 2 ml pożywki haESC zawierającej 0,05 mg/ml demekolcyny.
- Po 8 godzinach leczenia demekolcyną odessać pożywkę i dodać 800 μl trypsyny.
- Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 5 minut, następnie dodać 2 ml buforu do przemywania w celu ugaszenia trypsyny i kilkakrotnie pipetować w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
- Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o sile 160 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
- Zawiesić osad komórkowy w 400 μl buforu podtrzymującego haESC zawierającego 15 μg/ml Hoechst 33342.
- Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 15 minut. Po inkubacji przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 5 ml przez nasadkę sitka do komórek i utrzymywać probówkę w temperaturze 4 °C do momentu sortowania komórek w kroku 10.
10. Oczyszczanie DKO-phaESC z zatrzymaną fazą M
- Ustaw cytometr przepływowy z dyszą 100 μm zgodnie z instrukcjami producenta.
UWAGA: Hoechst 33342 może być wykryty przez wzbudzenie przy 405 nm. W tym przypadku laser UV o długości fali 355 nm jest używany do wykrywania Hoechst 33342. - Skonfiguruj DKO-phaESC z zatrzymaną fazą M od kroku 9.7 i rozpocznij analizę. Wybrać odpowiednią bramkę sortującą do pobierania haploidalnych komórek fazy M (2n) z próbki poddanej działaniu demekolcyny.
UWAGA: Po leczeniu demekolcyną oczekuje się 2 populacji komórek, odpowiadających haploidalnym i diploidalnym komórkom zatrzymanym w fazie M, jak pokazano na Rysunek 3B. Zatrzymanie cyklu komórkowego po leczeniu demekolcyną jest całkowite, w związku z czym nie obserwuje się haploidalnego piku 1n DNA. Jest to ważne, ponieważ haploidalne komórki fazy M i diploidalne komórki G1 mają tę samą zawartość DNA (2n) i wytwarzają nakładające się na siebie piki. - Ustawić probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 2 ml buforu podtrzymującego haESC w celu zebrania posortowanych komórek w cytometrze przepływowym. Rozpocznij sortowanie komórek.
- Po posortowaniu komórek dodać 5 ml buforu do przemywania wzdłuż ścianki probówki zbiorczej. Odwirować probówkę o sile 160 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
- Zawiesić komórki w odpowiedniej objętości buforu podtrzymującego haESC, aby uzyskać końcowe stężenie 5 x 10 5 komórek/ml.
- Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Trzymaj probówkę na lodzie do momentu, gdy będzie gotowa do wstrzyknięcia docytoplazmatycznego w kroku 12.
11. Przygotowanie pipet do trzymania i mikroiniekcji
UWAGA: Do wykonania iniekcji docytoplazmatycznej (krok 12) wymagane jest kilka pipet do przytrzymywania i mikroiniekcji (Rysunek 4A). Pipety te można zakupić na indywidualne zamówienie od dostawcy komercyjnego lub wykonać z odpowiednich szklanych kapilar za pomocą ściągacza do mikropipet i mikrokuźni.
- Pociągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego na ściągaczu do mikropipet. Aby wyciągnąć kapilary ze szkła borokrzemianowego bez żarnika (0,78 x 1,00 x 80 mm), następujące parametry są podane dla płonącego ściągacza poziomego (tabela materiałów) jako odniesienie, ale będą się różnić dla innych przyrządów i typów kapilar szklanych: Ciepło 510 (test rampy 480), Ciągnięcie 0, Prędkość 150, Czas 175 i Ciśnienie 200 do trzymania pipet; Ciepło 510 (test rampy 480), Ciągnięcie 90, Prędkość 140, Czas 125 i Ciśnienie 200 dla pipet do mikroiniekcji.
UWAGA: Optymalne parametry należy określić indywidualnie, ponieważ na kształt pipet iniekcyjnych może wpływać kilka czynników, w tym wilgotność, model ściągacza do mikropipet i ilość szklanych kapilarn. Należy dążyć do wydłużonego kształtu ze stopniowym zwężaniem się. - Przygotowanie pipet podtrzymujących
- Umieść jedną wyciągniętą kapilarnę przygotowaną w kroku 11.1 do mikrokuźni. Umieść kapilarnę nad szklanym koralikiem na żarniku i opuść kapilarę, aby zetknęła się ze szklanym koralikiem podczas podgrzewania żarnika.
- Przerwij kapilarę, wyłączając ogrzewanie i odłączając od szklanego koralika tak, aby jego zewnętrzna średnica wynosiła 60–100 μm.
- Ustaw końcówkę kapilary poziomo, tak aby była skierowana w stronę szklanej kulki na żarniku.
- Podgrzej włókno, aby wewnętrzna średnica końcówki kapilary stopiła się do średnicy 10–20 μm.
- Przesuń kapilatę tak, aby szklana kulka znalazła się w punkcie ~1 mm od końcówki kapilary bez kontaktu. Podgrzej żarnik, aby kapilar mógł zgiąć się pod kątem 20°. Zdemontuj kapilarę, zwaną pipetą przytrzymującą, z mikrokuźni.
UWAGA: Aby zmierzyć rozmiar kapilary, w mikrokuźni najlepiej jest zainstalować siatkę do okularu.
- Przygotowanie pipet do mikroiniekcji
- Umieść jedną wyciągniętą kapilarnę przygotowaną w kroku 11.1 do mikrokuźni. Umieść kapilarnę nad szklanym koralikiem na żarniku i opuść kapilarę, aby zetknęła się ze szklanym koralikiem podczas podgrzewania żarnika.
- Przeciąć kapilarę, wyłączając ogrzewanie i odłączając od szklanej kulki w pozycji, aby jej zewnętrzna średnica wynosiła 6 μm.
- Przesuń kapilatę tak, aby szklana kulka znalazła się w punkcie ~1 mm od końcówki kapilary bez kontaktu. Podgrzej żarnik, aby kapilara mogła zgiąć się do góry pod kątem 20°. Zdemontuj pipetę do mikroiniekcji z mikrokuźni i przechowuj ją w bezpiecznym pudełku do późniejszego użycia.
UWAGA: Pipety do mikroiniekcji są przygotowane z następującymi specyfikacjami: średnica zewnętrzna, 6 μm; średnica wewnętrzna, 4,5–5 μm; kąt gięcia, 20°. Określenie optymalnej konstrukcji pipety do mikroiniekcji jest ważne dla powodzenia iniekcji docytoplazmatycznej. Zbyt duża średnica wewnętrzna może zapobiec pęknięciu błony plazmatycznej DKO-phESC dawcy (patrz sekcja dyskusji). Jeśli średnica wewnętrzna jest zbyt wąska, może to utrudnić płynne pipetowanie donorowych DKO-phESC. Kąt gięcia < 30° jest preferowany, ponieważ wysoki kąt gięcia utrudnia działanie impulsów piezoelektrycznych.
12. Docytoplazmatyczna iniekcja DKO-phaESC
- Przed wstrzyknięciem docytoplazmatycznym (od kroku 12.2) należy przygotować roztwór poliwinylopirolidonu (PVP), dodając 5 ml pożywki M2 do 50 ml probówki zawierającej 0,6 g PVP i mieszając probówkę na kołysce w temperaturze 4 °C przez 2 dni. Po całkowitym rozpuszczeniu PVP roztwór jest sterylnie filtrowany i przechowywany w temperaturze 4 °C.
- W dniu iniekcji docytoplazmatycznej należy przygotować naczynie z dostułkiem centralnym z 900 μl pożywki KSOM i wstępnie ogrzać naczynie w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 .
- Przygotuj naczynie do mikromanipulacji, wyrównując krople 5 μl roztworu PVP i 20 μl pożywki M2 na pokrywce 10-centymetrowego naczynia umieszczonego do góry nogami. Przykryj krople olejem mineralnym i umieść naczynie na stoliku mikroskopu iniekcyjnego.
UWAGA: Zalecany układ naczynia do mikromanipulacji jest pokazany na Rysunek 4B. - Zainstaluj pipetę przytrzymującą na mikromanipulatorze. Napełnij pipetę do mikroiniekcji olejem fluorowęglowym za pomocą końcówki mikroładowarki i zamontuj ją na siłowniku piezoelektrycznym.
- Zanurz pipetę do mikroiniekcji w kropli z roztworem PVP i kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół, aby pokryć szkło PVP i sprawić, że będzie mniej lepkie. Załaduj niewielką objętość roztworu PVP do pipety do mikroiniekcji i przesuń pipetę do kropli z podłożem M2.
- Zanurz pipetę podtrzymującą w podłożu M2 i skup się na pipecie znajdującej się na dnie kropli.
- Przenieść około 2 μl zawiesiny DKO-phaESC z kroku 10.6 do kropli pożywki M2.
- Przenieś 10 oocytów MII z kroku 8.5 do tej samej kropli pożywki M2 za pomocą pipety doustnej.
- W celu wstrzyknięcia należy obrócić oocyt w kropli pożywki M2 tak, aby przestrzeń okołowitelinowa była skierowana w stronę pipety do mikroiniekcji, a płytka MII nie znajdowała się na ścieżce pipety do mikroiniekcji (Rysunek 4A). Przytrzymaj oocyt, wywierając podciśnienie przez pipetę przytrzymującą.
UWAGA: Płytka MII jest wizualnie identyfikowana jako występ ooplazmy, który jest określany jako "garb" i często znajduje się obok pierwszego ciała polarnego. Płytka MII zawiera wrzeciono mejotyczne z przyłączonymi chromosomami. Należy unikać dotykania pipety do mikroiniekcji i płytki MII, ponieważ mechaniczne uszkodzenie wrzeciona i chromosomów może zakłócić rozwój zarodka. - Załadować jeden DKO-phaESC do końcówki pipety do mikroiniekcji, stosując delikatne podciśnienie. Pęknięcie błony plazmatycznej DKO-phaESC przez pipetowanie, aby uniknąć wstrzyknięcia nienaruszonego DKO-phaESC (Rysunek 3C; patrz dyskusja).
UWAGA: W przypadku, gdy błona plazmatyczna DKO-phaESC nie zostanie rozerwana przez pipetowanie, należy wyrzucić DKO-phaESC i załadować inny DKO-phaESC. - Umieścić pipetę do mikroiniekcji w kontakcie z osłonką przejrzystą oocytu i zastosować niewielką ilość podciśnienia w pipecie do mikroiniekcji.
- Zastosuj impulsy piezoelektryczne (intensywność, 20; częstotliwość, 4), aby przebić się przez zonę, jednocześnie popychając końcówkę pipety do mikroiniekcji w kierunku przestrzeni okołoitelowej. Upewnij się, że płytka MII, zawierająca wrzeciono i chromosomy, nie znajduje się na drodze pipety do mikroiniekcji.
UWAGA: Empirycznie dostosuj ustawienie do najniższych impulsów piezoelektrycznych do wiercenia przez zonę, aby zminimalizować możliwość uszkodzenia oolemmy. - Wyrzucić fragment osłonki przejrzystej z pipety do mikroiniekcji i umieścić DKO-phaESC na krawędzi pipety.
- Wbić się do oocytu pipetą do mikroiniekcji, tak aby oolemma dotarła do przeciwnej strony.
UWAGA: Nie dotykaj płytki MII, aby zapobiec uszkodzeniu wrzeciona i chromosomów. - Zastosuj impuls piezoelektryczny (intensywność, 6; częstotliwość, 1), aby przebić oolemmę. Upewnij się, że oolemma rozluźnia się wzdłuż trzonu pipety do mikroiniekcji.
UWAGA: Empirycznie określ najniższe ustawienie impulsu piezoelektrycznego dla przerwania oolemmy, aby zminimalizować uszkodzenie oocytu. - Wstrzyknąć DKO-phaESC z minimalną objętością pożywki do ooplazmy i płynnie wyjąć pipetę do mikroiniekcji z oocytu.
- Uwolnij wstrzyknięty oocyt z pipety przytrzymującej i umieść go z boku mikrokropli w celu późniejszego pobrania.
- Powtórzyć procedurę wstrzykiwania od kroków 12.9 do 12.17 dla pozostałych oocytów MII w pożywce M2 kropli.
UWAGA: Unikaj trzymania oocytów poza inkubatorem dłużej niż 20 minut. Z naszego doświadczenia wynika, że partia 10 oocytów może być wygodnie manipulowana w ciągu 15 minut po odpowiednim treningu. - Przenieść partię wstrzykniętych oocytów z kropli pożywki M2 do wstępnie podgrzanego naczynia z dołkiem środkowym z pożywką KSOM.
- Przechowywać naczynie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 .
- Powtórz manipulację oocytami z kroków 12.5 i 12.20 z dodatkowymi grupami oocytów MII, aby uzyskać wystarczającą liczbę wstrzykniętych oocytów.
13. Aktywacja skonstruowanych częściowo sklonowanych embrionów
- Przygotować dwie szalki z dołkiem centralnym po 900 μl każda z pożywką KSOM i pożywką aktywacyjną. Przygotować płytkę 4-dołkową z 700 μl podłoża KSOM w każdym dołku. Podgrzej naczynia i talerz w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
- Po 1 godzinie w pożywce KSOM przenieść wstrzyknięte oocyty z kroku 12.21 do wstępnie podgrzanego naczynia z dołkiem centralnym z pożywką aktywacyjną.
- Przechowywać naczynie przez 6 godzin w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w celu aktywacji.
- Po aktywacji obserwuj, jak niektóre częściowo sklonowane zarodki tworzą trzy ciała polarne, które są pierwszym i drugim ciałem polarnym oocytu oraz ciałem pseudopolarnym z DKO-phaESC (Rysunek 3E).
- Umyj zarodki 3 razy, przenosząc je do nowych studzienek z pożywką KSOM na płytce 4-dołkowej.
- Przenieść zarodki do naczynia z dołkiem centralnym z pożywką KSOM i przechowywać szalkę w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w celu dalszego rozwoju.
14. Rozwój skonstruowanych półklonowanych embrionów
- Po 1 dniu hodowli na pożywce KSOM od kroku 13.6 kilka częściowo sklonowanych zarodków osiąga stadium 2-komórkowe (Rysunek 5A).
- W celu dalszego rozwoju zarodków preimplantacyjnych in vitro należy kontynuować hodowlę częściowo sklonowanych zarodków w pożywce KSOM w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2. Przenieść częściowo sklonowane zarodki na świeże podłoże KSOM w 2 dniu. W 4 dniu kilka zarodków osiągnie stadium blastocysty (Ryc. 5A).
- W celu uzyskania częściowo sklonowanych myszy należy przenieść zarodki dwukomórkowe z kroku 14.1 do jajowodów samic biorcy w pseudociąży. Zidentyfikuj samice w pseudociąży poprzez krycie z samcami po wazektomii na dzień przed transferem zarodków i wybierz je na podstawie obecności wyraźnie widocznego czopu rano w dniu transferu zarodka (0,5 dnia po stosunku (dpc)). Około 19,5 dpc, donoszone młode są naturalnie dostarczane z samic biorcy (Ryc. 5B).
Wyniki
Celem niniejszego protokołu jest zastosowanie haESC jako substytutu plemnika w celu uzyskania półklonowanych embrionów i myszy. W tym celu wygenerowano linię DKO-phaESC niosącą transgen CAG-EGFP, którą wykorzystano do wstrzyknięcia wewnątrzcytoplazmatycznego do oocytów w stadium MII. Aby uzyskać odpowiednią linię phaESC z ojcowską konfiguracją imprintingową, przeprowadzono inżynierię genetyczną z użyciem nukleaz Cas9. Haploidalna linia ESC zawiera komórki haploidalne i diploidalne, które powstają w wyniku wrodzonej tendencji haploidalnych ESC do diploidalizacji10. Haploidalny zestaw chromosomów jest warunkiem koniecznym do skutecznego zastąpienia genomu plemnika. Analiza zawartości DNA metodą cytometrii przepływowej pokazuje rozkład komórek haploidalnych i diploidalnych w fazach G0/G1, S oraz G2/M (Rycina 2A).
W celu utworzenia linii DKO-phaESC, linie phaESC typu dzikiego przetransfekowano konstruktami transpozonu piggyBac dla stabilnej transgenicznej ekspresji EGFP oraz plazmidami CRISPR/Cas9 w celu uzyskania delecji w regionach H19-DMR i IG-DMR. Aby wykluczyć diploidowe ESC i wyizolować wyłącznie haploidowe ESC wykazujące ekspresję EGFP, zdefiniowano specyficzne okno sortowania (Ryc. 2A). Pojedyncze haploidowe komórki EGFP-dodatnie wysiano następnie do poszczególnych studzienek płytek 96-dołkowych w celu uzyskania subklonów. W celu zwiększenia wydajności wysiewu i przeżywalności przetransfekowanych phaESC zastosowano komórki karmione MEF. Po namnożeniu kultur przeprowadzono pierwszą rundę genotypowania metodą PCR, aby zidentyfikować subklony posiadające delecje w obu regionach DMR. Po usunięciu komórek karmionych MEF z kultur przeprowadzono drugie genotypowanie w celu potwierdzenia braku alleli typu dzikiego w regionach H19-DMR i IG-DMR (Ryc. 2B). Z łącznej liczby 135 subklonów uzyskano 5 haploidowych linii DKO-phESC posiadających usunięte allele i pozbawionych alleli typu dzikiego zarówno dla H19-DMR, jak i IG-DMR.
Transgen CAG-EGFP wprowadzono do DKO-phaESCs, aby zbadać ich udział w embrionach półklonalnych poprzez wizualizację zielonej fluorescencji pod mikroskopem (Rysunek 3A). Do iniekcji wewnątrzcytoplazmatycznej DKO-phaESCs poddano działaniu demecolciny w celu zatrzymania ich w fazie M. W ten sposób cykl komórkowy DKO-phaESCs został zsynchronizowany z cyklem oocytów w stadium MII. Analiza cytometrii przepływowej po zastosowaniu demecolciny wykazała dwie populacje odpowiadające haploidalnym (2n) i diploidalnym (4n) komórkom zatrzymanym w fazie G2/M (Rysunek 3B). Brak piku haploidalnego 1n wskazywał, że zatrzymanie cyklu komórkowego było w dużej mierze całkowite. Następnie wyselekcjonowano haploidalne ESC w fazie M i wstrzyknięto je do oocytów. W tym celu pojedynczą komórkę DKO-phaESC pobrano do pipety do mikroiniekcji i wstrzyknięto do cytoplazmy oocytu MII (Rysunek 3C). Błona plazmatyczna DKO-phaESC została przerwana poprzez wciągnięcie komórki do końcówki pipety do mikroiniekcji.
Po iniekcji ekspresja EGFP była rzadko wykrywana w skonstruowanych embrionach półklonalnych, ponieważ cytoplazma DKO-phaESCs uległa rozproszeniu w dużej cytoplazmie oocytu (Ryc. 3D). W rzadkich przypadkach wewnątrz ooplazmy można było zaobserwować okrągłą plamkę intensywnej ekspresji EGFP. Obserwacja ta była prawdopodobnie spowodowana przypadkową iniekcją nienaruszonych DKO-phaESCs. Brak przerwania błony komórkowej DKO-phaESC jest prawdopodobnie niezgodny z dalszym rozwojem embrionu i należy go unikać. Godzinę po iniekcji embriony zostały aktywowane poprzez traktowanie chlorkiem strontu18. Sześć godzin po rozpoczęciu aktywacji pod mikroskopem zaobserwowano do 3 ciał polarnych (Ryc. 3E). Ciała polarne te odpowiadają pierwszemu i drugiemu ciałku polarnemu oocytu oraz pseudociałku polarnemu pochodzącemu z DKO-phaESC7. Dodatkowo, pod mikroskopem kontrastowym (DIC) zaobserwowano dwa pronukleusy, co przypominało stadium pronukleusowe zygot po normalnym zapłodnieniu plemnikiem.
Aby wykazać kompetencję rozwojową, embriony półklonowane hodowano do stadium blastocysty (Rysunek 5A). Ponadto, po przeniesieniu półklonowanych embrionów w stadium 2 komórek do jajowodów samicy biorczyni, uzyskano mysz rozwiniętą do pełnego terminu (Rysunek 5B). Zgodnie z oczekiwaniami, mysz pochodząca z embrionu półklonowanego była samicą, ponieważ ani oocyty, ani pochodzące z oocytów phaESCs nie posiadają chromosomu Y. Półklonowana mysz była całkowicie prawidłowa i wydała zdrowe potomstwo po skrzyżowaniu z samcem linii Swiss Webster typu dzikiego. Do chwili obecnej półklonowana mysz żyje od ponad 600 dni bez żadnych widocznych problemów zdrowotnych.
Rysunek 1: Przegląd zastosowania DKO-phaESC jako zamiennika plemników.(A) Ramowy harmonogram procedur protokołu. (B) Schemat przedstawiający etapy tworzenia linii DKO-phaESC (kroki 1–6). (C) Schemat przedstawiający etapy tworzenia zarodków półklonowanych poprzez wstrzyknięcie DKO-phaESC do oocytu w stadium MII (kroki 7–14). Skróty: DKO = double-knockout; phaESC = partenogenetyczna haploidalna komórka macierzysta embrionu; FACS = fluorescencyjna aktywowana sorterka komórek; MEF = embrionalny fibroblast mysi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Ustanowienie linii DKO-phaESC poprzez delecje H19- i IG-DMR za pomocą systemu CRISPR/Cas9.(A) Analiza cytometrii przepływowej phaESCs po transfekcji plazmidami piggyBac dla stabilnej ekspresji EGFP oraz 4 plazmidami CRISPR/Cas9. Jako kontrolę przedstawiono nietransfekowane phaESCs. Profil DNA (góra) pokazuje rozkład cyklu komórkowego komórek haploidalnych i diploidalnych. Komórki haploidalne w fazie G1/S wykazujące ekspresję EGFP są zaznaczone zielonym obszarem bramkowania (dół, prawo). (B) Genotypowanie subklonów phaESC hodowanych na MEF (pierwsze genotypowanie) oraz po usunięciu MEF (drugie genotypowanie). Subklonalne linie phaESC 1, 2, 3 i 4 reprezentują odpowiednio: komórki typu dzikiego, komórki z delecją H19-DMR, z delecją IG-DMR oraz z połączoną delecją H19- i IG-DMR. Linie DKO-phaESC 5–8 posiadają delecje zarówno H19-DMR, jak i IG-DMR i są pozbawione alleli typu dzikiego. Skróty: DKO = podwójny knockout; phaESC = partenogenetyczna haploidalna embrionalna komórka macierzysta; DMR = region o różnym stopniu zmetylowania; MEF = mysia embrionalna fibroblasta; EGFP = ulepszone zielone białko fluorescencyjne; WT = typ dziki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 3: Iniekcja zatrzymanych w fazie mitozy DKO-phaESC do oocytów w stadium MII. (A) Morfologia hodowli DKO-phaESC niosącej transgen CAG-EGFP oraz delecje DMR-ów H19- i IG-; pasek skali = 50 µm. (B) Reprezentatywna analiza cytometrii przepływowej DKO-phaESC po 8 h zatrzymania demekolcyną. Jako kontrolę przedstawiono DKO-phaESC bez traktowania demekolcyną. (C) Morfologia DKO-phaESC w pipecie do mikroiniekcji. Przedstawiono pojedynczą, nienaruszoną komórkę DKO-phaESC przed (lewo) i po (prawo) przerwaniu błony plazmatycznej poprzez pipetowanie; pasek skali = 20 µm. (D) Skonstruowane embriony 1 h po iniekcji DKO-phaESC do oocytów MII. Przedstawiono obraz z nałożoną fluorescencją EGFP i obrazem w jasnym polu. Czarne groty strzałek wskazują okrągłe punkty intensywnej ekspresji EGFP po iniekcji nienaruszonych DKO-phaESC, czego należy unikać; pasek skali = 50 µm. (E) Obraz w kontraście interferencyjnym różnicowym embrionów półklonowanych 6 h po rozpoczęciu aktywacji chlorkiem strontu. Białe groty strzałek wskazują embriony z 3 ciałkami polarnymi, w tym jednym pseudo ciałem polarnym z wstrzykniętej komórki DKO-phaESC; pasek skali = 50 µm. Skróty: DKO = double-knockout; phaESC = partenogenetyczna haploidalna embrionalna komórka macierzysta; EGFP = ulepszone zielone białko fluorescencyjne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Schemat układu do iniekcji wewnątrzcytoplazmatycznej DKO-phaESCs do oocytów. (A) Przedstawiono rozmieszczenie pipety iniekcyjnej, pipety trzymającej oraz oocytu w komorze iniekcyjnej. α, kąt zgięcia pipety do mikroiniekcji. (B) Układ kropli w szalce do mikromanipulacji przeznaczonej do iniekcji wewnątrzcytoplazmatycznej. Skróty: DKO = podwójny knockout; phaESC = partenogenetyczna haploidalna embrionalna komórka macierzysta. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rycina 5: Rozwój embrionów półklonalnych.(A) Rozwój przedimplantacyjny embrionów półklonalnych in vitro. Ekspresja EGFP jest początkowo obserwowana w embrionach w stadium czterech komórek w 2. dniu po iniekcji wewnątrzcytoplazmatycznej. W 4. dniu intensywna ekspresja EGFP jest widoczna w blastocystach; pasek skali = 100 µm. (B) Półklonalna mysz uzyskana po transferze embrionu w stadium 2 komórek do samicy biorcy. W 74 dpp mysz półklonalna (grot strzałki) urodziła pierwsze potomstwo (gwiazdka) w drodze naturalnego porodu po kojeniu z samcem dzikiego typu rasy Swiss Webster. Embriony półklonalne i mysz półklonalna przedstawione na tej rycinie są identyczne z tymi opisanymi przez Aizawę i wsp.3. Skróty: EGFP = enhanced green fluorescent protein; dpp, dni po urodzeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
| Roztwór żelatyny | |||
| Komponent | Stężenie roztworu zapasu | Objętość / masa | Stężenie końcowe |
| Woda | - | 500 mL | - |
| Żelatyna | - | 1 g | 0.2% |
| Pożywka do haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych (HaESC) | |||
| Komponent | Stężenie roztworu stokowego | Objętość / masa | Stężenie końcowe |
| NDiff 227 | - | 10 mL | - |
| CHIR 99021 | 10 mM | 3 µL | 3 µM |
| PD 0325901 | 10 mM | 1 µL | 1 µM |
| LIF | 1 x 10⁶ IU/ml | 10 µL | 1 000 IU/ml |
| Penicylina-Streptomycyna | 100x | 100 µL | 1x |
| Bufor do utrzymania HaESC | |||
| Komponent | Stężenie zapasu | Objętość / masa | Stężenie końcowe |
| pożywka HaESC | - | 1 ml | - |
| roztwór HEPES | 1 M | 20 µL | 20 mM |
| Bufor płuczący | |||
| Komponent | Stężenie roztworu zapasu | Objętość / masa | Stężenie końcowe |
| DMEM / F-12 | - | 100 mL | - |
| frakcja BSA | 7.5% | 7,1 ml | 0.5% |
| pożywka MEF | |||
| Komponent | Stężenie roztworu macierzystego | Objętość / masa | Stężenie końcowe |
| DMEM | - | 500 ml | - |
| płodowa surowica bydlęca | - | 56 ml | 10% |
| β-merkaptoetanol | 14,3 mol/L | 3.9 µL | 100 µM |
| Penicylina-streptomycyna | 100x | 5,6 ml | 1x |
| Bufor lizujący | |||
| Komponent | Stężenie zapasu | Objętość / masa | Stężenie końcowe |
| Woda | - | 8,25 ml | - |
| Tris-HCl (pH 8,5) | 1 M | 1 ml | 100 mM |
| EDTA | 0,5 M | 100 µL | 5 mM |
| roztwór SDS | 10% | 200 µL | 0.2% |
| NaCl | 5 M | 400 µL | 200 mM |
| Proteinaza K | 20 mg/ml | 50 µL | 100 µg/mL |
| Pożywka aktywacyjna | |||
| Komponent | Stężenie zapasu | Objętość / masa | Stężenie końcowe |
| KSOM | - | 1 ml | - |
| Chlorek strontu | 1 M | 5 µL | 5 mM |
| EGTA | 0,5 M, pH 8,0 | 4 µL | 2 mM |
| roztwór PVP | |||
| Komponent | Stężenie zapasu | Objętość / masa | Stężenie końcowe |
| pożywka M2 | - | 5 ml | - |
| PVP | - | 0,6 g | 12% |
| roztwór PMSG | |||
| Komponent | Stężenie zapasu | Objętość / masa | Stężenie końcowe |
| PBS | - | 450 µL | - |
| PMSG | 500 IU/ml | 50 µL | 50 IU/ml |
| roztwór hCG | |||
| Komponent | Stężenie roztworu zapasowego | Objętość / masa | Stężenie końcowe |
| PBS | - | 450 µL | - |
| hCG | 500 IU/ml | 50 µL | 50 IU/ml |
| Podłoże z hialuronidazą | |||
| Komponent | Stężenie roztworu treściwego | Objętość / masa | Stężenie końcowe |
| pożywka M2 | - | 380 µL | - |
| Hialuronidaza | 10 mg/ml | 20 µL | 0,5 mg/ml |
| Skróty: LIF = czynnik hamujący białaczmię (leukemia inhibitory factor); MEF = embrionalny fibroblast mysi (mouse embryonic fibroblast); | |||
| FBS = płodowa surowica bydlęca; DMEM = podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium); BSA = albumina surowicy bydlęcej; | |||
| EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy; SDS = dodecylosiarczan sodu; EGTA = kwas etylenoglikol-bis(aminocetrowy); | |||
| PBS = roztwór soli w soli fosforanowej; PVP = poliwinylopirolidon; hCG = ludzka gonadotropina kosmórcza; | |||
| PMSG = gonadotropina z surowicy ciężarnej klaczy. | |||
Tabela 1: Skład pożywki, buforu i roztworu.
| Nazwa | Sekwencja (5' do 3') | Zastosowanie | |
| H19-DMR-P1 | GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG | Genotypowanie | |
| H19-DMR-P2 | AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC | Genotypowanie | |
| H19-DMR-P3 | TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT | Genotypowanie | |
| IG-DMR-P1 | TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG | Genotypowanie | |
| IG-DMR-P2 | CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA | Genotypowanie | |
| IG-DMR-P3 | ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG | Genotypowanie | |
| H19-DMR-gRNA1-F | CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG | gRNA | |
| H19-DMR-gRNA1-R | AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG | gRNA | |
| H19-DMR-gRNA2-F | CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG | gRNA | |
| H19-DMR-gRNA2-R | AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA1-F | CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA1-R | AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA2-F | CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT | gRNA | |
| IG-DMR-gRNA2-R | AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG | gRNA | |
Tabela 2: Lista oligonukleotydów.
Dyskusja
Klonowanie ssaków metodą transferu jądra komórki somatycznej (SCNT) zostało zapoczątkowane w latach 90. 19,20,21. Zmiany te były następstwem badań nad klonowaniem przeprowadzonych 30 lat wcześniej na22. Znaczne opóźnienie odzwierciedla trudności w embriologii i imprintingu genomowym u ssaków. Rozwój SCNT u ssaków jest podstawą do zastosowania haESC do substytucji plemników, co zostało szczegółowo opisane w niniejszym protokole.
Synchronizacja cyklu komórkowego jest ważnym czynnikiem sukcesu SCNT23. Dotyczy to również wstrzykiwania haESC w tym protokole. Wprowadzenie genomu dawcy do biorcy wymaga dopasowania faz cyklu komórkowego, aby uniknąć pęknięcia chromosomów lub aneuploidii, które mogłyby zahamować rozwój zarodka. Częściowe klonowanie ma dodatkową złożoność polegającą na tym, że dwa genomy i cytoplast muszą być zgodne. Poprzedni raport wykazał, że wstrzyknięcie androgenowych haESC zatrzymanych w fazie M dało lepsze wskaźniki rozwoju częściowo sklonowanych zarodków niż wstrzyknięcie haESC fazy G1 do oocytów7. Ten raport sugeruje fazę M jako odpowiedni punkt synchronizacji dla częściowego klonowania. W związku z tym phaESC zostały mitotycznie zatrzymane w metafazie z demekolcyną i wstrzyknięte do ooplazmy oocytów MII, które zostały naturalnie zatrzymane w metafazie II mejozy. Co ważne, zatrzymanie fazy M można osiągnąć w mysich ESC z wysoką wydajnością, zapewniając doskonałą synchronizację między cyklami komórkowymi dawcy i biorcy.
Podczas mitozy błona jądrowa rozpada się i tworzy się wrzeciono, do którego przyczepiają się zreplikowane chromosomy. Po wstrzyknięciu M-fazowych DKO-phaESC, chromatydy siostrzane są segregowane do pseudo ciała polarnego i zygoty7 (ryc. 3E). W związku z tym pojedynczy zestaw chromosomów z DKO-phaESC przyczynia się do powstania częściowo sklonowanego zarodka. Bardzo ważne jest, aby chromatydy siostrzane chromosomów DKO-phaESC mogły być prawidłowo segregowane po wstrzyknięciu. Błona plazmatyczna nienaruszonego DKO-phaESC zapobiega segregacji do ciała pseudopolarnego. Rzeczywiście zaobserwowaliśmy rzadkie przypadki, w których błona plazmatyczna DKO-phaESC nie została przerwana, a zarodki wykazywały nienaruszone DKO-phaESC w ooplazmie po wstrzyknięciu (ryc. 3D). Z tego względu należy zachować ostrożność w celu usunięcia błony plazmatycznej DKO-phaESC za pomocą pipetowania. Podczas iniekcji równie ważne jest, aby uniknąć przerwania wrzeciona mejotycznego oocytu, co może prowadzić do defektów segregacji chromosomów i indukować aneuploidię.
U ssaków imprinting genomowy ogranicza zastosowanie phaESC jako zamiennika plemników. Partenogenetyczne haESC posiadają matczyną konfigurację odcisków genomowych, podczas gdy plemniki mają konfigurację ojcowską. W związku z tym nie doszło do powstania donoszonych młodych po wstrzyknięciu phaESC typu dzikiego w celu zastąpienia plemników. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, delecje IG- i H19-DMR są projektowane w phaESC. Modyfikacja ekspresji wdrukowanej w matczynych loci Igf2-H19 i Gtl2-Dlk1 jest wystarczająca do zmiany konfiguracji odcisków genomowych, aby umożliwić generowanie częściowo sklonowanych myszy z częstością ponad 5,1%, w oparciu o przeniesione zarodki 2-komórkowe. Obserwacje te sugerują, że celowanie w dwa wdrukowane geny przełącza genom phaESC w funkcjonalną konfigurację ojcowską, która może zastąpić plemniki u myszy. Niemniej jednak dla tej strategii wymagana jest trwała modyfikacja genetyczna phaESC. Jako alternatywną strategię można rozważyć androgenowe haESC. Androgenowe haESC pochodzą z genomu plemnika i posiadają odciski ojcowskie. Istnieją doniesienia, że androgenetyczne komórki hematogenetyczne typu dzikiego przyczyniły się do wymiany plemników w celu uzyskania donoszonych młodych z częstością od 1,3% do 1,9% przeniesionych zarodków 4,7,24. Urodzone o czasie młode uzyskano również poprzez wstrzyknięcie androgenowych haESC z delecjami IG i H19-DMR z częstością 20,2% przenoszonych zarodków dwukomórkowych24. Zwiększona skuteczność półklonowania przy użyciu zmodyfikowanych androgenowych haESC jest prawdopodobnie spowodowana tym, że odciski mogą stać się niestabilne w hodowli. Wady imprintingu są korygowane przez delecje genetyczne krytycznych DMR.
Biorąc pod uwagę trudności we wprowadzaniu modyfikacji genetycznych bezpośrednio do genomów oocytów lub plemników, hemESC są cennym narzędziem do oddzielnego manipulowania genomami rodzicielskimi. Stosowanie haESC jako substytutu plemników zapewnia niezwykłą przewagę w edycji genomu w linii rozrodczej myszy. Niedawne badanie połączyło edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 z zastosowaniem haESC do charakterystyki regionów imprintingu, które mają kluczowe znaczenie dla rozwoju embrionalnego12. W badaniu tym przeanalizowano rolę Rasgrf1-DMR w połączeniu z H19- i IG-DMR w rozwoju myszy dwumatczynych oraz funkcję 7 różnych DMR w rozwoju myszy dwuojcowskich. Metoda podstawiania plemników za hemESC stanowiła podstawę genetycznych metod przesiewowych w celu identyfikacji kluczowych aminokwasów w białku DND1 w rozwoju pierwotnych komórek rozrodczych oraz identyfikacji genów w rozwoju kości 24,25,26. Badania nad imprintingiem genomowym i genetycznymi badaniami przesiewowymi w celu zidentyfikowania kluczowych czynników rozwoju embrionalnego są znaczącymi podejściami do zastosowania haESC jako genomów gametycznych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Dr. Giulio Di Mininowi za wyprowadzenie linii phaESC oraz Dr. Remo Freimannowi za operację cytometrii przepływowej. Dziękujemy również Pani Michèle Schaffner i Panu Thomasowi M. Hennkowi za wsparcie techniczne przy transferze zarodków. Prace te były wspierane przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (grant 31003A_152814/1).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,5 mLTube | Eppendorf | 0030 125.150 | haPosiew ESC |
| 15 ml Probówka | Greiner Bio-One | 188271 | posiew haESC |
| Płytka 12-dołkowa | Thermo Scientific | 150628 | Termo Nauka Kultura haESC |
| 24-dołkowa | Thermo Scientific | 142475 | Płytka |
| 6-dołkowa | Thermo Scientific | 140675 | kultura haESC |
| Płytka 96-dołkowa | Thermo Scientific | 167008 | kultura haESC |
| β-Merkaptoetanol | Kultura haESC | Merck | M6250 |
| Frakcja BSA | Gibco | 15260-037 | haKultura ESC |
| CHIR 99021 | Axon | 1386 | haESC |
| Roztwór demekolcyny | Merck | D1925 | kultura haESC |
| DMEM | Gibco | 41965-039 | kultura haESC |
| DMEM / F-12 | Gibco | 11320-033 | kultura haESC |
| mysz DR4 Laboratorium | Jacksona | 3208 | haKultura ESC |
| EDTA | Merck | E5134 | haKultura ESC |
| FBS | biowest | S1810-500 | haKultura ESC |
| Pożywka | zamrażająca amsbio | 11897 | haESC kultura |
| żelatyna | Merck | G1890 | haPosiew |
| ESC Roztwór Hepes | Gibco | 15630-056 | haPosiew ESC |
| Napromieniowany MEF | Gibco | A34966 | haPosiew ESC |
| LIF (czynnik hamujący białaczkę) | (domowej) | - | haKultura ESC |
| Odczynnik Lipofection | Invitrogen | 11668019 | kultura |
| NDiff 227 | Takara | Y40002 | kultura haESC |
| PD 0325901 | Axon | 1408 | hodowla haESC |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | hodowla haESC |
| piggyBac plazmid przenoszący transgen CAG-EGFP | Addgene | #40973 | hodowla haESC |
| piggyTranspozaza plazmidowa | System nauk biologicznych | PB210PA-1 | hodowla |
| pX330 plazmid | Addgene | #42230 | haESC hodowla |
| plazmidu pX458 | Addgene | #48138 | haESC kultura |
| trypsyna | Gibco | 15090-046 | haESC |
| kultura polimeraza DNA | Thermo Scientific | F549S | Genotypowanie |
| dNTP Mix | Thermo Scientific | R0192 | Genotypowanie |
| etanolu | Merck | 100983 | Genotypowanie |
| Kwas solny | Merck | 100317 | Genotypowanie |
| Izopropanol | Merck | 109634 | Genotypowanie |
| Proteinaza K | Axon | A3830 | Genotypowanie |
| SDS | Merck | 71729 | Genotypowanie |
| Chlorek sodu | Merck | 106404 | Genotypowanie |
| ThermoMixer | Epeendorf | 5384000012 | Genotypowanie |
| Tris | Merck | T1503 | Genotypowanie |
| 5 ml probówka | Falcon | 352063 | Cytometria przepływowa |
| 5 ml Probówka z nasadką sitka komórkowego | Falcon | 352235 | Cytometria przepływowa |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cytometria przepływowa |
| MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | Cytometria przepływowa |
| Strzykawka 1 ml | Codan | 62.1640 | Superowulacja |
| 30-głośna igła 1/2 cala | Merck | Z192362-100EA | Superowulacja |
| B6D2F1 mysz | Jackson Laboratory | 100006 | Superowulacja |
| hCG | MSD zdrowie zwierząt | 49451 | Superowulacja |
| PBS | Gibco | 10010015 | Superowulacja |
| PMSG | Avivasysbio | OPPA1037 5000 j.m | Miska Superowulacja |
| 10 cm | Thermo Scientific | 150350 | Manipulacja zarodkami |
| 4-dołkowa płytka | Thermo Scientific | 179830 | Manipulacja zarodkami |
| Probówka 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | Manipulacja zarodkami |
| Naczynie 6 cm | Thermo Scientific | 150288 | Manipulacja |
| Miska z dołkiem centralnym | Corning | 3260 | Manipulacja zarodkami |
| Cyfrowy bujak | Thermo Scientific | 88880020 | Manipulacja zarodkami |
| EGTA | AppliChem | A0878 | Manipulacja zarodków |
| Hialuronidaza | Merck | H4272 | Manipulacja zarodkami |
| KSOM | Merck | MR-020P-5F | Manipulacja zarodkami |
| M16 średni | Merck | M7292 | Manipulacja zarodkami |
| M2 średni | Merck | M7167 | Manipulacja zarodków |
| Olej mineralny | Merck | M8410 | Manipulacja zarodkami |
| Szklana kapilara | Merck | P1049-1PAK | Manipulacja zarodkami |
| Stereoskop Nikon | SMZ745 | Manipulacja zarodkami | |
| Chlorek strontu | Merck | 13909 | Manipulacja zarodkami |
| Strzykawka 5 ml | Codan | 62.5607 | Mikroiniekcja |
| Kapsułka ze szkła borokrzemianowego | Produkt naukowy | GB100T-8P | Mikroiniekcja |
| CellTram 4r Olej | Eppendorf | 5196000030 | Mikroiniekcja |
| Fluorinert FC-770 | Merck | F3556 | mikroiniekcji |
| Instrumenty biomedyczne-Mikroiniekcja | |||
| Mikroskop odwrócony | Nikon | Eclipse Ti-U | Mikroiniekcja |
| Microforge | Narishige | MF-900 | Mikroiniekcja |
| Pipeta do mikroiniekcji | Instrumenty biomedyczne-Końcówki | mikroiniekcji | |
| Eppendorf | 5252 956.003 | Mikroiniekcja | |
| Ramiona mikromanipulacyjne | Narishige | NT-88-V3 | mikropipet do mikroiniekcji |
| Sutter Instrument | P-1000 | Mikroiniekcja | |
| PiezoXpert | Eppendorf | 5194000016 | Mikroiniekcja |
| PVP (poliwinylopirolidyna) | Merck | PVP360 | |
| Filtr strzykawkowy | SARSTEDT | 83.1826.001 | Mikroiniekcja |
Bibliografia
- Ellegren, H., Galtier, N. Determinants of genetic diversity. Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).
- Huijbers, I. J. Generating genetically modified mice: A decision guide. Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).
- Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells. PloS One. 15 (9), 0233072(2020).
- Li, W., et al. Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice. Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).
- Li, Z., et al. Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells. Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).
- Wan, H., et al. Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice. Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).
- Yang, H., et al. Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell. 149 (3), 605-617 (2012).
- Zhong, C., et al. Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection. Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).
- Elling, U., et al. Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).
- Leeb, M., Wutz, A. Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos. Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).
- Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).
- Li, Z. K., et al. Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions. Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).
- Elling, U., et al. Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells. Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Shuai, L., et al. Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection. Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).
- O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones. Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).
- Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).
- Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).
- Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).
- Gurdon, J. B. Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells. Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).
- Campbell, K. H., Alberio, R. Reprogramming the genome: role of the cell cycle. Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).
- Zhong, C., et al. CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library. Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).
- Bai, M., et al. Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development. PLoS Biology. 17 (7), 3000350(2019).
- Li, Q., et al. CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development. Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).
Przedruki i uprawnienia
