Artykuł metodologiczny

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

DOI:

10.3791/62001

⸱

11 grudnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Tulsa

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteryjny system białek (Cas) związanych z CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Streptococcus pyogenes został wykorzystany przez naukowców do badania ważnych biologicznie istotnych problemów. Niezrównana moc metody edycji genomu CRISPR/Cas pozwala naukowcom na precyzyjną edycję dowolnego wybranego locus, ułatwiając w ten sposób lepsze zrozumienie funkcji genów. Kilka metod edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 zostało opisanych wcześniej. W tym miejscu omawiamy i demonstrujemy metodę, która wykorzystuje kompleksy rybonukleoproteinowe złożone in vitro i marker dpy-10 co-CRISPR do badań przesiewowych. W szczególności w tym artykule przechodzimy krok po kroku przez proces wprowadzania przedwczesnych kodonów stop do genu C. elegans rbm-3.2 poprzez naprawę ukierunkowaną na homologię przy użyciu tej metody edycji CRISPR/Cas9. Ta stosunkowo prosta metoda edycji może być wykorzystana do badania funkcji dowolnego genu będącego przedmiotem zainteresowania i pozwala na wygenerowanie homozygocznie edytowanych C. elegans za pomocą edycji CRISPR/Cas9 w czasie krótszym niż dwa tygodnie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes Technologia białka związanego z CRISPR (Cas) umożliwia efektywną edycję genomu w szerokim zakresie organizmów1,2,3,4. System CRISPR został po raz pierwszy odkryty jako część prokariotycznej przeciwwirusowej odpowiedzi immunologicznej5,6,7. System CRISPR typu II wykorzystuje endonukleazę, taką jak Cas9, transaktywujący RNA (tracrRNA) i krótki, specyficzny dla docelowego DNA 20-nukleotydowy długi przewodnik CRISPR RNA (crRNA) do rozpoznawania "NGG" Protospacer Neighbor Motif (PAM) i dokonywania dwuniciowego pęknięcia w docelowym DNA5,6,7,8,9,10,11,12. To dwuniciowe pęknięcie jest rozpoznawane jako uszkodzenie przez maszynerię naprawy komórkowego DNA. W związku z tym wygenerowane dwuniciowe pęknięcie może być naprawione przez jedną z dwóch ścieżek - i) Niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub ii) Naprawa ukierunkowana na homologię (HDR)13. NHEJ jest często podatny na błędy i dlatego, gdy ten szlak jest używany do naprawy dwuniciowego pęknięcia w docelowym DNA, często powoduje inaktywujące mutacje (insercje, delecje) w genie będącym przedmiotem zainteresowania. Z drugiej strony, dostarczając egzogenną matrycę naprawczą z homologią po obu stronach pęknięcia dwuniciowego, maszyneria naprawy DNA komórkowego może zostać skierowana do użycia HDR do naprawy break13. Metoda HDR umożliwia więc precyzyjną edycję dowolnego interesującego nas miejsca.

Dla C. elegans14,15,16,17,18,19,20. Najczęściej stosowane metody edycji CRISPR/Cas9 w C. elegans obejmują zarówno protokoły oparte na klonowaniu, jak i wolne od klonowania do generowania szablonów naprawczych dla edycji CRISPR/Cas914,15,16,17,18,19,20. Protokół ten szczegółowo omawia protokół edycji CRISPR/Cas9 bez klonowania, oparty na użyciu dpy-10 jako markera co-CRISPR do badań przesiewowych. Do tej pory jedyny szczegółowy protokół edycji wideo CRISPR/Cas9 skoncentrowany na C. elegans, który istnieje, wykorzystuje marker fluorescencyjny do screeningu21. Jednak użycie markera fluorescencyjnego do badań przesiewowych wymaga dostępu do mikroskopu fluorescencyjnego, do którego dostęp może być utrudniony dla wielu laboratoriów w małych instytucjach głównie licencjackich (PUI). Zachęcające jest to, że pozytywne wyniki korelacji uzyskano w poprzednich badaniach między robakami przenoszącymi markery fluorescencyjne a obecnością edit21,22. Konieczne są jednak dodatkowe badania, aby określić ogólną skuteczność metody przesiewowej opartej na fluorescencji do edycji szerokiej gamy loci z różnymi przewodnikami RNA i matrycami naprawczymi. Wreszcie, ponieważ plazmidy kodujące te markery fluorescencyjne tworzą macierze pozachromosomalne, zmienna fluorescencja jest często wytwarzana z tych tablic, co może utrudniać identyfikację dodatnich23. W związku z tym, chociaż metoda badań przesiewowych oparta na fluorescencji może być przydatna do przyjęcia, wyżej wymienione kwestie mogą ograniczać jej zastosowanie.

Korzystanie ze znacznika co-CRISPR, który wytwarza widoczny fenotyp, znacznie zmniejsza liczbę potomstwa, które musi zostać przebadane, aby znaleźć pozytywnie edytowanego robaka23,24,25,26,27,28. Co ważne, fenotypy, które są wytwarzane przez te markery, można łatwo wykryć pod prostym mikroskopem preparacyjnym23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Marker co-CRISPR dpy-10 jest jednym z najlepiej scharakteryzowanych i szeroko stosowanych markerów co-CRISPR do edycji genomu C. elegans CRISPR/Cas924,27. Dlatego w tym artykule omówimy metodę wykonywania edycji CRISPR/Cas9 u C. elegans przy użyciu bezpośredniego dostarczania kompleksów rybonukleoproteinowych z dpy-10 jako markerem co-CRISPR27,35. W tej metodzie przygotowana mieszanka do iniekcji edycyjnych składa się z dobrze scharakteryzowanego szablonu naprawczego dpy-10 crRNA i dpy-10, który pośredniczy w generowaniu obserwowalnego dominującego fenotypu "rolkowego" (Rol), który jest nadawany przez znaną heterozygotyczną mutację dpy-10 (cn64) w genie dpy-10 24,27,29. Mutacja dpy-10(cn64) w stanie homozygotycznym powoduje fenotyp dumpy (Dpy), który wytwarza krótsze i grubsze robaki24,29. W fenotypie Rol pośredniczy dokładna insercja dostarczonej matrycy naprawczej dpy-10 do pojedynczej kopii genu dpy-10 za pośrednictwem HDR/Cas9. W związku z tym pojawienie się Rol C. elegans wskazuje na udane wstrzyknięcie, a także na udane zdarzenie edycyjne za pośrednictwem HDR w komórkach wstrzykniętego robaka. Ponieważ crRNA i matryca naprawcza docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania znajdują się w tej samej mieszance iniekcyjnej z matrycą naprawczą dpy-10 crRNA i dpy-10, istnieje duża szansa, że zidentyfikowane robaki Rol były również jednocześnie edytowane w docelowym genie będącym przedmiotem zainteresowania. W związku z tym robaki te są następnie sprawdzane pod kątem interesującej ich edycji za pomocą technik takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) (dla edycji większych niż 50 pz) lub przez PCR, po której następuje trawienie restrykcyjne (dla edycji mniejszych niż 50 pz).

Zalety korzystania z tej metody do edycji genomu to: i) edycje CRISPR mogą być generowane ze stosunkowo wysoką wydajnością (od 2% do 70%) przy użyciu tej metody27; (ii) matryce naprawcze i przewodnikowe RNA, które są wykorzystywane w tej metodzie, nie wymagają klonowania, co skraca czas potrzebny na ich wytworzenie; iii) poprzez składanie kompleksów rybonukleoproteinowych in vitro, stężenia złożonych kompleksów edycyjnych mogą być utrzymywane na względnie stałym poziomie, poprawiając w ten sposób odtwarzalność; iv) wykazano, że niektóre przewodnikowe RNA, które nie generują edycji, gdy są eksprymowane z plazmidów, działają w edycji genomu CRISPR/Cas9, gdy są dostarczane jako transkrybowane in vitro crRNAs27; v) dołączenie markera co-CRISPR dpy-10 umożliwia łatwe badanie przesiewowe za pomocą mikroskopu preparacyjnego i zmniejsza liczbę potomstwa, które musi zostać przebadane, aby znaleźć wynik pozytywny24,27; oraz vi) Sekwencjonowanie DNA zweryfikowane przez homozygotyczne linie robaków można uzyskać tą metodą w ciągu kilku tygodni19,27.

Opublikowano doskonałe rozdziały książek dotyczące wielu różnych metod CRISPR C. elegans14,15,16,17,18,19,20,43. Jednak obecnie brakuje demonstracji metody co-CRISPR dpy-10 w formacie wideo w warunkach laboratoryjnych. W tym artykule opisujemy i demonstrujemy proces wykorzystania metody co-CRISPR dpy-10 do edycji reprezentatywnego genu docelowego o nazwie rbm-3.2, przypuszczalnego białka wiążącego RNA (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). W szczególności szczegółowo opisujemy tutaj metodę wprowadzania trzech przedwczesnych kodonów stop w obrębie genu C. elegans rbm-3.2 za pomocą in vitro zmontowano kompleksy rybonukleoproteinowe i egzogennie dostarczono liniową jednoniciową matrycę naprawczą. Badania te zakończyły się sukcesem w wytworzeniu pierwszego szczepu C. elegans CRISPR z przedwczesnymi kodonami stop w genie rbm-3.2. Ponieważ obecnie niewiele wiadomo na temat funkcji tego genu u C. elegans, szczep ten posłuży jako użyteczne narzędzie w analizie funkcji RMB-3.2. Metoda ta może być również przyjęta do dokonywania insercji, substytucji i delecji w dowolnym locus w genomie C. elegans.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół edycji genomu CRISPR/Cas9 został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu w Tulsie zgodnie z wytycznymi NIH. W całym tym protokole praktykowana była technika sterylna. Wszystkie etapy tego protokołu zostały przeprowadzone przy użyciu odczynników, które były wolne od nukleaz. Szczególną ostrożność podjęto w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu RNazą, np. rękawice do czyszczenia, a także miejsca pracy i sprzęt (np. pipety, zewnętrzna strona szkła itp.) roztworem odkażającym RNazę.

1. projekt crRNA

  1. Znajdź PAM, który umożliwia Cas9 cięcie najbliżej miejsca edycji.
    1. Stanowisko PAM to 5'-NGG-3'.
    2. Pamiętaj, że PAM może znajdować się na dowolnej nici DNA.
  2. Wybierz 20 pz na końcu 5' PAM jako sekwencję crRNA.
    UWAGA: Rzeczywista sekwencja crRNA, która jest syntetyzowana przez firmy komercyjne, jest dłuższa niż 20 pz, ponieważ ma dodatkową sekwencję generyczną, która jest automatycznie dodawana do docelowej sekwencji crRNA 20 pz przez firmę syntetyzującą. Jeśli chodzi o efekty niezamierzone, ostatnie badania nie wykazały niezamierzonych skutków Cas9 u C. elegans36,37,38,39,40. Co więcej, powstałe szczepy edytowane przez CRISPR są krzyżowane. W związku z tym nie jesteśmy zbytnio zaniepokojeni niecelowymi efektami zaprojektowanych crRNA. Jednak strony internetowe, w tym http://genome.sfu.ca/crispr/ i http://crispor.tefor.net/, mogą być używane do wyszukiwania i wybierania crRNA o najmniejszych efektach niedocelowych38,41. Przewiduje się, że crRNA, które kończą się literą G lub GG oraz te o zawartości GC większej niż 50%, będą bardziej wydajne19,23,42.
  3. Zamów co najmniej 10 nmol crRNA w firmie (np. IDT, Horizon Discovery itp.).
    1. Po dotarciu liofilizowanego crRNA należy go przechowywać w temperaturze -30°C do dnia mikroiniekcji.
    2. W dniu wykonania mikroiniekcji należy wirować liofilizowany crRNA z maksymalną prędkością (17 000 x g) przez jedną minutę i ponownie zawiesić go w 5 mM Tris-Cl (pH 7,4), aby uzyskać 8 μg/μL zapasu crRNA.
    3. Niewykorzystany zapas crRNA przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -80 °C.

2. Napraw projekt szablonu

  1. Pobierz oprogramowanie do manipulacji sekwencjami (np. przeglądarkę sekwencji CLC, APE, SNAPGENE, VECTOR NTI itp.). Używamy przeglądarki sekwencji CLC w wersji 8.0 (Qiagen), ponieważ jest przyjazna dla użytkownika i można ją pobrać za darmo.
  2. Wklej sekwencję docelowego DNA do przeglądarki sekwencji.
  3. Orientacja szablonu naprawy wpływa na wydajność edycji28. Aby wprowadzić sekwencję naprawczą do końca 5' PAM, zaprojektuj jednoniciową matrycę naprawczą z sekwencją DNA z tej samej nici DNA, na której znajduje się sekwencja PAM (nić protospacerowa)28. Podczas gdy w celu wstawienia sekwencji naprawczej do końca 3' PAM, zaprojektuj jednoniciową matrycę naprawczą z sekwencją DNA z nici DNA, która nie zawiera sekwencji PAM (nici dystansowej)28.
  4. Wybierz 35 par zasad sekwencji z nieprzerwaną homologią po obu stronach (na końcu 5' i 3') edycji.
  5. Zmutuj lub usuń PAM, aby zapobiec przecięciu matrycy naprawczej lub edytowanego genomowego DNA przez Cas9.
    1. Jeśli mutacja PAM nie jest możliwa, wprowadź kilka cichych mutacji w pobliżu końca 5' PAM, aby zapobiec przecięciu matrycy naprawczej lub edytowanego genomowego DNA.
    2. Upewnij się, że wprowadzasz ciche mutacje PAM tylko wtedy, gdy jest on obecny w regionie egzonicznym.
    3. Sprawdź częstotliwość użycia kodonu, aby upewnić się, że zmutowany kodon jest wprowadzany z częstotliwością porównywalną z oryginalnym niezmutowanym kodonem (np. https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). W niektórych przypadkach wprowadzenie zmutowanego kodonu z podobną częstotliwością do niezmutowanego kodonu może nie być możliwe. Jednak w przypadku mutacji kilku aminokwasów nie spodziewamy się, że poziom ekspresji zmutowanego białka ulegnie znaczącej zmianie.
  6. Jeśli edycja jest mała (np. mutacja kilku zasad), wprowadź unikalne miejsce ograniczenia w pobliżu edycji przez cichą mutagenezę. Używamy http://heimanlab.com/cut2.html do znajdowania miejsc ograniczających, które mogą zostać wprowadzone przez mutagenezę cichą.
    1. Sprawdź częstotliwość użycia kodonu, aby upewnić się, że zmutowany kodon jest wprowadzany z częstotliwością porównywalną z oryginalnym niezmutowanym kodonem. Jak wspomniano powyżej, nie zawsze jest to możliwe. Jednak w przypadku eksperymentów obejmujących mutacje kilku aminokwasów nie spodziewamy się, że poziom ekspresji zmutowanego białka ulegnie znaczącej zmianie.
  7. Zsyntetyzuj i kup liniowe jednoniciowe szablony naprawcze dla HDR jako oligonukleotydów ultramerów 4 nmol.
  8. Zawiesić liofilizowaną matrycę naprawczą oligonukleotydów w wodzie wolnej od nukleaz, aby uzyskać zapas 1 μg/μl matrycy naprawczej i przechowywać ją w temperaturze -30 °C do dalszego użycia.

3. Projekt podkładu przesiewowego

  1. Korzystając z przeglądarki sekwencji CLC lub innych podobnych aplikacji, zaprojektuj od 20 do 23 par zasad do przodu i do tyłu po obu stronach edycji, tak aby wytwarzały pasmo od 400 do 600 par zasad po amplifikacji PCR.
    1. W przypadku większych wstawek, które mają rozmiar kilku kilozasad, zaprojektuj przednią spłonkę tak, aby znajdowała się tuż poza lewym ramieniem homologii szablonu naprawczego. Zaprojektuj odwrócony podkład tak, aby znajdował się w samym szablonie naprawy. W takim przypadku produkt PCR zostanie uzyskany tylko w przypadku pozytywnie edytowanych robaków.
    2. Aby zidentyfikować homozygotyczne robaki edytowane dla dłuższych insercji, amplifikuj cały obszar insercji, projektując startery do przodu i do tyłu, które znajdują się poza połączeniami insercji.
  2. Przetestuj startery i zoptymalizuj warunki PCR za pomocą genomowego DNA typu dzikiego przed użyciem starterów do genotypowania.
    1. Upewnij się, że po amplifikacji PCR genomowego DNA powstaje pojedyncze prążki o oczekiwanej wielkości (w stosownych przypadkach).

4. Przygotowanie młodych dorosłych robaków do wstrzyknięcia

  1. Zebrać L2-L3 stadium C. elegans na świeży trawnik bakteryjny na płytce MYOB i inkubować w temperaturze 20 °C przez noc.
    UWAGA: Protokół wykonania płytek MYOB znajduje się tutaj: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/
  2. W dniu mikroiniekcji należy pobrać młode dorosłe robaki z mniej niż 10 zarodkami w macicy do wstrzyknięcia.

5. Przygotowanie mieszanki iniekcyjnej

  1. Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań w tej samej kolejności, jak pokazano w Tabeli 1, w sterylnych probówkach wolnych od nukleaz.
    UWAGA: Składniki mieszanki iniekcyjnej można zmniejszyć do uzyskania 5 μl mieszanek iniekcyjnej (zamiast 20 μl), jeśli nie przewiduje się przyszłych wstrzyknięć z tą mieszanką.
  2. Wymieszać mieszaninę do wstrzykiwań, pipetując.
  3. Inkubować mieszaninę do wstrzykiwań w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu złożenia kompleksów rybonukleoproteinowych.
  4. Mieszać mieszankę do wstrzykiwań w temperaturze 4 °C przy 17 000 x g przez 5 minut.

6. Mikroiniekcja do gonady C. elegans

  1. Wykonaj mikroiniekcję mieszanki iniekcyjnej CRISPR do gonady C. elegans, zgodnie z opisem w Iyer et al. 201943.
    1. Wstrzyknij około 30 robaków za pomocą mieszanki iniekcyjnej CRISPR. Niewykorzystana mieszanka iniekcyjna może być ponownie użyta, przechowując ją w temperaturze 4°C przez okres około 6 miesięcy bez utraty wydajności49.
    2. Jeśli to możliwe, wstrzyknąć oba ramiona gonad. Wstrzyknięte robaki są uważane za pokolenie P0.

7. Odzyskiwanie i transfer iniekcji robaka

  1. Po mikrowstrzyknięciu należy przenieść mikrowstrzyknięte robaki P0 za pomocą kilofa do płytki agarowej MYOB o średnicy 60 mm wysianej OP50 E. coli i pozostawić je do odzyskania w temperaturze pokojowej przez około godzinę.
    1. Należy pamiętać, że temperatura regeneracji będzie zależeć od genotypu wstrzykniętych robaków. Na przykład w przypadku szczepów wrażliwych na temperaturę może być konieczne odzyskiwanie robaków w innej temperaturze.
  2. Za pomocą platynowego kilofa drucianego przenieść każdego wstrzykniętego robaka na pojedynczą płytkę Petriego z agarem MYOB o średnicy 35 mm i pozostawić do złożenia jaj w temperaturze 20 °C do następnego dnia.
    1. Należy pamiętać, że niektóre robaki umrą w wyniku urazu spowodowanego zabiegiem mikroiniekcji. Wybieraj tylko te robaki, które są żywe i wykazują ruch.
  3. Po 24 godzinach należy przenieść wstrzyknięte robaki na nowe pojedyncze płytki (1 robak na płytkę).

8. Zbieranie C. elegans do badań przesiewowych

  1. 3 do 4 dni w temperaturze 20°C po wykonaniu wstrzyknięcia należy monitorować wszystkie płytki zawierające potomstwo wstrzykniętych robaków za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
  2. Zidentyfikuj płytki, które mają fenotypy potomstwa F1 wykazujące fenotypy wałeczkowe (Rol) i dumpy (Dpy). Fenotyp Dpy to sytuacja, w której robaki wydają się krótsze i grubsze niż robaki kontrolne na tym samym etapie rozwoju (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0--10). Płytki z robakami Rol i Dpy reprezentują płytki, na których potomstwo F1 zostało pomyślnie edytowane z mutacją dpy-10 (cn64), aby było obecne odpowiednio w stanie heterozygotycznym lub homozygotycznym.
  3. Wybierz talerze z największą liczbą robaków rolkowych i przysadzistych do przesiewania.
  4. Wyodrębnij od 50 do 100 robaków F1 Rol z tych płytek na ich indywidualne płytki (1 robak na płytkę) i pozwól im złożyć jaja.
    1. Pozwolić robakom F1 Rol w stadium L4 na złożenie jaj i wydanie potomstwa (F2) przez 1 do 2 dni.

9. Liza pojedynczego robaka i PCR

  1. Po wytwarzaniu F2 przez 1 do 2 dni, przenieść każdą pojedynczą matkę F1 Rol do 2,5 μl buforu do lizy (Tabela 2) z rozcieńczeniem 1:100 20 mg/ml proteinazy K.
  2. Zamrażać probówki w temperaturze -30 °C przez 20 minut. Robaki mogą być przechowywane na tym etapie przez dłuższy czas do czasu dalszej analizy.
  3. Przeprowadzić lizę pojedynczego robaka na termocyklerze PCR w następujących warunkach: 60 °C przez 1 godzinę, 95 °C przez 15 minut i utrzymać w temperaturze 4 °C.
  4. Dodaj następujące odczynniki bezpośrednio do 2,5 μl zlizowanego robaka zawierającego probówkę PCR: 12,5 μl 2x mieszanki PCR zawierającej dNTP, polimerazę DNA, MgCl2 i barwnik ładujący, 1 μL 10 μM startera do przodu, 1 μL 10 μM startera wstecznego i sterylną wodę do 22,5 μL. Całkowita objętość każdej reakcji PCR wynosi 25 μL.
    UWAGA: W przypadku przesiewania wielu robaków F1 szybciej i wygodniej jest wykonać mieszankę wzorcową PCR do wielu reakcji i dodać 22,5 μl mieszanki głównej do każdej probówki do lizy.
  5. Ustaw reakcje PCR na termocyklerze w następujących warunkach: 95 °C przez 1 minutę, 35 cykli po 95 °C przez 15 s, 55 °C przez 15 s (optymalizuj dla każdego zestawu starterów), 72 °C przez 1 minutę (optymalizuj dla każdego docelowego DNA)44. Reakcje utrzymywać w temperaturze 4 °C.

10. Trawienie restrykcyjne i elektroforeza w żelu agarozowym

UWAGA: Trawienie restrykcyjne jest konieczne tylko podczas selekcji pod kątem małych zmian (poniżej 50 pz).

  1. Przenieś 10 μl DNA PCR z kroku 9 do nowej probówki.
  2. Dodać od 2 do 4 jednostek enzymu restrykcyjnego i 1x buforu enzymu restrykcyjnego (1,5 μl 10x buforu reakcyjnego) na 15 μl reakcji.
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C (lub w innej temperaturze specyficznej dla enzymu) przez 2 godziny (w przypadku szybko działających enzymów możliwe jest krótsze czasy inkubacji).
  4. Podgrzewać, dezaktywować trawienie restrykcyjne poprzez ogrzewanie probówek PCR w temperaturze 65 °C (lub innej temperaturze specyficznej dla enzymu) przez 10 do 15 minut.
  5. Załaduj całą reakcję z każdej probówki PCR do pojedynczego dołka z 1%-2% żelem agarozowym i uruchom żel pod ciśnieniem 110 mA, aż do uzyskania odpowiedniej separacji pasm.
    UWAGA: Używamy mieszanki PCR, która ma już dołączony barwnik ładujący do wizualizacji podczas pracy na żelu agarozowym. Mieszanka ta nie zakłóca reakcji trawienia restrykcyjnego i dlatego jest wygodna w użyciu do przesiewania wielu robaków jednocześnie.

11. Zidentyfikuj pozytywnie edytowane robaki

  1. Wizualizacja żeli agarozowych w świetle UV (dla żeli bromku etydyny), aby wykryć rozmiary prążków DNA.
    UWAGA: Pozytywnie edytowane robaki będą wyświetlać dodatkowe pasmo DNA w oczekiwanym rozmiarze ze względu na edycję przy użyciu szablonu naprawczego przenoszącego miejsce restrykcji w pożądanym locus w genomie robaka. Oczekuje się, że robaki rolkowe F1 będą heterozygotyczne pod względem edycji i dlatego oczekuje się, że będą wykazywać trzy prążki (jeden niepocięty produkt PCR typu dzikiego i dwa mniejsze fragmenty z edytowanego pociętego produktu PCR). Chociaż rzadko, należy zauważyć, że homozygoty pojawiają się sporadycznie.
  2. Zachowaj wszystkie oryginalne, pozytywnie edytowane płyty do momentu, gdy obecność edycji zostanie zweryfikowana przez sekwencjonowanie Sangera.

12. Homozygozyjna edycja zainteresowania

  1. Wybierz od 8 do 12 wyglądających na dzikie robaki F2 z odpowiednich pozytywnie edytowanych płytek robaków F1 Rol i pozwól im złożyć jaja i wydać potomstwo przez 1 do 2 dni.
    UWAGA: Ponieważ C. elegans są samozapładniającymi się hermafrodytami, jeśli edytowany allel nie wpływa na żywotność lub rozwój, odsetek oczekiwanych homozygotycznych mutantów powinien wynosić około 25%. Nietoczące się robaki F2 muszą być typu dzikiego dla locus dpy-10. Wybieranie robaków, które nie toczą się, umożliwia generowanie edytowanych robaków, które utraciły mutację dpy-10 (cn64) i mają mutację tylko w interesującym Cię genie.
    1. Należy zauważyć, że gen dpy-10 jest obecny na chromosomie II. Jeśli twój gen zainteresowania jest powiązany z dpy-10, możesz nie być w stanie łatwo oddzielić mutacji dpy-10 od genu, który Cię interesuje.
  2. Wykonaj kroki od 9 do 11, aby zidentyfikować homozygotyczne linie robaków.

13. Potwierdź edycję przez sekwencjonowanie

  1. Po zidentyfikowaniu homozygotycznych robaków wykonaj lizę i PCR zgodnie z opisem w kroku 9.
    1. Ustaw co najmniej 3 reakcje PCR dla każdej linii homozygotycznej, która ma zostać zsekwencjonowana.
  2. Oczyść reakcje PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
  3. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru nanokropli.
  4. Wyślij próbkę z odpowiednim starterem do przodu do sekwencjonowania Sangera. Upewnij się, że starter do przodu jest zaprojektowany tak, aby był oddalony o co najmniej 50 zasad od edycji, która ma być sekwencjonowana.
  5. Przeanalizuj wyniki sekwencjonowania za pomocą oprogramowania do analizy sekwencji, aby potwierdzić obecność edycji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

rbm-3.2 to przypuszczalnie wiążące RNA białko, które ma homologię do ludzkiego czynnika stymulacji rozszczepienia podjednostki 2 tau (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). Białko RBM-3.2 zostało zidentyfikowane jako partner wiążący fosfatazę białkową 1 (GSP-1) i jej regulatory Inhibitor-2 (I-2SZY-2) i SDS-22 w poprzednim badaniu, które zidentyfikowało te białka jako nowe regulatory duplikacji centrioli C. elegans (dane nie pokazane)45. Obecnie bardzo niewiele wiadomo na temat funkcji genu rbm-3.2 u C. elegans. W związku z tym, aby dokładniej zbadać biologiczną rolę genu rbm-3.2 C. elegans, allel rbm-3.2-null rbm-3.2 (ok688) uzyskano z Caenorhabditis Genetics Center (CGC).

Niestety, oprócz delecji całego genu rbm-3.2, allel rbm-3.2(ok688) powoduje również częściową delecję nakładającego się genu, rbm-3.1, komplikując tym samym analizę genetyczną. Dlatego, aby dokładnie zbadać rolę genu rbm-3.2 w C. elegans, użyliśmy edycji CRISPR/Cas9, aby wprowadzić trzy przedwczesne kodony stop bardzo blisko początku regionu kodującego rbm-3.2 C. elegans, pozostawiając nakładający się gen rbm-3.1 nienaruszony.

Aby wprowadzić te przedwczesne kodony stop do genu C. elegans rbm-3.2, zaprojektowaliśmy crRNA z motywem PAM, który znajdował się na przeciwległej nici (nici matrycowej) DNA (Rysunek 1A). Miejsce przecięcia Cas9 znajdowało się 6 zasad od kodonu startowego rbm-3.2 ATG. Aby wprowadzić przedwczesne kodony stop do genu rbm-3.2, zaprojektowaliśmy szablon naprawczy o następujących pięciu głównych cechach: 1) 35 zasad nieprzerwanej homologii do RBM-3.2 przed kodonem start RBM-3.2 (lewe ramię homologii) 2) Krótki odcinek zasad zawierających motyw PAM został usunięty 3) Miejsce ograniczenia EcoRI zostało wprowadzone natychmiast po kodonie start do badań przesiewowych 4) Drugi i trzeci kodon rbm-3.2 zostały usunięte, a po piątym kodonie RBM-3.2 wprowadzono trzy kodony stop, aby zatrzymać translację mRNA rbm-3.2 5) 35 zasad nieprzerwanej homologii do pierwszego intronu RBM-3.2 zostało włączonych poniżej edycji (prawe ramię homologii) (Rysunek 1B).

Mieszanka iniekcyjna do tego eksperymentu CRISPR została przygotowana zgodnie z tabelą I. Mieszaninę iniekcyjną inkubowano w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu złożenia kompleksów rybonukleoproteinowych. Mieszaninę następnie odwirowano i załadowano do wyciągniętej igły do mikroiniekcji. Mikroiniekcję do gonady C. eleganprzeprowadzono zgodnie z opisem w Iyer et al. 201943.

Rysunek 2 przedstawia eksperymentalny harmonogram generowania edytowanych C. elegans przy użyciu tego protokołu. Chociaż zazwyczaj wstrzykujemy 30 robaków do każdego eksperymentu CRISPR, niektóre laboratoria wstrzykują mniej robaków (od 10 do 20) do każdego eksperymentu CRISPR. Ponieważ wstrzykiwanie większej liczby robaków zwiększa prawdopodobieństwo znalezienia pozytywnych zmian, wolimy wstrzyknąć większą liczbę robaków. Wiele laboratoriów wybiera do badań przesiewowych lęgi "jackpot" (płytki z ponad 50% potomstwa Rol i Dpy). Z naszego doświadczenia po przeprowadzeniu kilku eksperymentów CRISPR, chociaż lęgi jackpot pojawiają się sporadycznie, w większości przypadków robaki Rol, które są wybierane do badań przesiewowych, często pochodzą z wielu różnych płytek P0, z których każda składa się z kilku potomków Rol. W tym eksperymencie nie uzyskano żadnych lęgów jackpotów.

W sumie przebadaliśmy genomowe DNA 73 robaków F1 Rol, które uzyskano z 7 wstrzykniętych robaków P0 pod kątem obecności edycji. Sekwencje starterów przesiewowych i ich położenie w odniesieniu do kodonu start genu rbm-3.2 są przedstawione w Rysunek 3A. Z naszej analizy wynika, że 7 z 73 robaków F1 jest pozytywnych dla edycji (9,5%) (Rysunek 3B). Nieedytowane robaki wykazywały pojedynczy fragment DNA o wartości 445 pz po trawieniu EcoRI. Natomiast robaki niosące przedwczesny kodon stop w genie rbm-3.2 wykazywały dwa fragmenty odpowiednio 265 pz i 166 pz po trawieniu EcoRI. Heterozygotyczne robaki wykazywały trzy fragmenty po trawieniu EcoRI: jeden nieedytowany fragment DNA typu dzikiego o długości 445 pz i dwa fragmenty DNA o długości odpowiednio 265 pz i 166 pz ze zmodyfikowanej kopii genu rbm-3.2.

Aby zidentyfikować robaki z homozygotycznymi edycjami, przenieśliśmy 12 robaków F2 ze zidentyfikowanych dodatnich heterozygot F1 na nowe indywidualne płytki i pozwoliliśmy im wydać potomstwo (F3). Robaki F2 zostały następnie przebadane pod kątem homozygotyczności, jak opisano wcześniej. 6 z 12 (50%) przebadanych robaków okazało się homozygotycznych dla naszej interesującej nas edycji (Rysunek 4A). Genomowe DNA zidentyfikowanej homozygotycznej linii robaków wykorzystano do wywołania reakcji sekwencjonowania DNA. Analiza sekwencjonowania DNA potwierdziła obecność edycji w stanie homozygotycznym (Figura 4B). Ogólnie rzecz biorąc, korzystne jest sekwencjonowanie wielu homozygotycznych linii robaków, aby upewnić się, że wszystkie homozygotyczne linie robaków wykazują ten sam fenotyp (jeśli mutacja zerowa wytwarza określony fenotyp). Co więcej, może być również konieczna walidacja nokautów genów za pomocą testu opartego na ekspresji, takiego jak western blotting lub RT-PCR, lub poprzez analizę fenotypu. Dzieje się tak dlatego, że możliwe jest, że pomimo wprowadzenia przedwczesnych kodonów stop na początku genu, alternatywny ATG może być obecny poniżej przedwczesnych kodonów stop. Ten ATG może być użyty do zainicjowania ekspresji białka, w wyniku czego powstanie częściowo funkcjonalne białko skrócone.

Odczynnikkoncentracja Wolumin do dodania
Białko Cas9 w wodzie wolnej od nukleaz z 20% glicerolem2 μg/μL5 μL
tracrRNA w 5 mM Tris-Cl pH 7,54 μg/μL5 μL
dpy-10 crRNA w 5 mM Tris-Cl pH 7,58 μg/μL0,4 μl
rbm-3,2 crRNA w 5 mM Tris-Cl pH 7,58 μg/μL1 μL
Matryca naprawcza DPY-10 w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz500 ng/μL0,55 μl
Szablon naprawczy RBM-3.2 w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz1 μg/μL2,2 μl
KCl w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz1 mln0,5 μL
sterylna woda wolna od nukleaz-5,35 μl

Tabela 1: Składniki mieszanki iniekcyjnej do edycji CRISPR/Cas9 przy użyciu kompleksów rybonukleoproteinowych i dpy-10 jako markera współ-CRISPR. Używaj sterylnych technik i odczynników wolnych od RNaz podczas przygotowywania mieszanki iniekcyjnej. Należy pamiętać, że do przygotowania mieszanki iniekcyjnej użyto sterylnej, wolnej od nukleaz wody niepoddanej działaniu DEPC.

powiedział: .
OdczynnikkoncentracjaWolumin do dodania
Kcl1 mln5 ml
Tris-HCl pH 8,31 mln1 ml
MgCl21 mln250 μL
NP-40 (lub IGEPAL CA-630)W 100%450 μL
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)W 100%450 μL
żelatyna2 proc500 μL
Woda-92,35 ml

Tabela 2: Przepis na bufor do lizy robaków. Bufor do lizy ślimaków może być wytwarzany luzem, autoklawowany, filtrowany i porcjowany do długotrwałego przechowywania (UWAGA: bufor do lizy może być przechowywany przez ponad rok w temperaturze pokojowej). Dodać rozcieńczenie 20 mg/ml proteinazy K w stosunku 1:100 do buforu do lizy robaków tuż przed każdym użyciem.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat przedstawiający projekt szablonu crRNA i naprawy dla rbm-3.2 przedwczesnego zatrzymania CRISPR. A. Schemat przedstawiający nici kodujące i matrycowe genu rbm-3.2 z sekwencją crRNA i sekwencją motywu PAM zlokalizowanymi na nici matrycowej. B. Schemat przedstawiający różne cechy matrycy naprawczej, która została zsyntetyzowana w celu wprowadzenia trzech przedwczesnych kodonów stop do genu rbm-3.2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Eksperymentalny harmonogram generowania homozygotycznych edytowanych C. elegans za pomocą edycji CRISPR/Cas9 przy użyciu wstępnie złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i dpy-10 jako markera co-CRISPR. Podział dzień po dniu kroków, które należy wykonać, aby wygenerować homozygotyczne edytowane C. elegans przy użyciu tej metody edycji CRISPR/Cas9. Krótko mówiąc, 30 robakom wstrzyknięto mieszankę edycyjną CRISPR za pomocą mikroiniekcji i posegregowano na indywidualne płytki MYOB wysiane OP50 E. coli. Po 24 godzinach wstrzyknięte robaki P0 przeniesiono na świeże nowe płytki MYOB i pozwolono im kontynuować składanie jaj. W 3 i 4 dniu po mikroiniekcji płytki badano pod kątem obecności robaków Rol F1. Wybrano płytki z maksymalną liczbą robaków Rol i Dpy F1, a następnie 73 robaki F1 Rol (zwykle wybieramy od 50 do 100 robaków F1 Rol na eksperyment CRISPR) wyodrębniono na nowych pojedynczych płytkach MYOB (1 robak na płytkę) i pozostawiono do złożenia jaj przez około 2 dni. W dniu 6 po mikrowstrzyknięciu przygotowano lizaty robaków z robaków F1, które wydały potomstwo (F2) i przebadano je pod kątem obecności edycji za pomocą PCR, a następnie trawienie restrykcyjne za pomocą EcoRI i elektroforezy w żelu agarozowym. W dniu 7 12 robaków F2 non-Rol, non-Dpy przeniesiono z płytek dodatnich na nowe pojedyncze płytki i pozwolono im na wytworzenie potomstwa (F3). W dniu 9 robaki F2 zostały przebadane pod kątem homozygotyczności edycji, jak opisano wcześniej. W dniu 10 przeprowadzono lizę robaków, PCR i czyszczenie PCR dla homozygotycznych robaków F3, a stężenie DNA zmierzono za pomocą spektrofotometru NanoDrop. W dniu 11 reakcje sekwencjonowania Sangera ustawiono dla próbek dodatnich, a reakcje wysłano do sekwencjonowania DNA. W dniu 12 wyniki sekwencjonowania zostały przeanalizowane, a obecność edycji zweryfikowano za pomocą oprogramowania do analizy sekwencji (np. przeglądarki sekwencji CLC). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Badanie przesiewowe w kierunku C. elegans, które są heterozygotyczne pod kątem przedwczesnych kodonów stop rbm-3.2.Obrazy elektroforezy w żelu agarozowym genomowego DNA PCR C. elegans trawionego za pomocą EcoRI. 73 pojedyncze robaki F1 zostały zgenotypowane i przebadane pod kątem obecności edycji RBM-3.2. Czerwone liczby i gwiazdki oznaczają pozytywnie edytowane robaki. Wszystkie 7 zidentyfikowanych pozytywnie edytowanych C. elegans było heterozygotycznych pod względem edycji, ponieważ wykazywały jeden nieedytowany fragment DNA typu dzikiego o długości 445 pz i dwa fragmenty DNA o długości odpowiednio 265 pz i 166 pz ze zmodyfikowanej kopii genu rbm-3.2 po trawieniu EcoRI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Identyfikacja i weryfikacja homozygotycznych edycji C. elegans z przedwczesnymi kodonami stop rbm-3.2. A.Badania przesiewowe w kierunku C. elegans, które są homozygotyczne pod względem kodonów przedwczesnego stopu rbm-3.2. Obrazy elektroforezy w żelu agarozowym genomowego DNA C. elegans trawionego za pomocą EcoRI. 12 pojedynczych robaków F2 z płytek dodatnich zostało zgenotypowanych i przebadanych pod kątem homozygotyczności edycji RBM-3.2. Czerwony: robaki edytowane przez homozygotę. 6 z 12 przebadanych robaków F2 (50%) było homozygotycznych pod względem kodonów przedwczesnego stopu rbm-3.2. Brak produktu PCR dla robaka 7. Ur. Potwierdzenie insercji przedwczesnych kodonów stop w rbm-3.2 poprzez sekwencjonowanie DNA. Schemat przedstawiający porównanie sekwencji DNA i białek homozygot nieedytowanych i edytowanych. Analiza wyników sekwencjonowania DNA genomowego DNA od homozygotycznych robaków edytowanych potwierdziła obecność trzech przedwczesnych kodonów stop w genie rbm-3.2 po edycji CRISPR/Cas9. Wszystkie wynikowe zmiany aminokwasów po edycji CRISPR/Cas9 są oznaczone czerwonymi literami lub czerwonymi gwiazdkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy powyższego protokołu do edycji kilku genów oprócz rbm-3.2. Nasza skuteczność edycji dla różnych loci, przewodnikowych RNA i matryc naprawczych (jednoniciowych i dwuniciowych) wahała się od 2% do 58% (dane nie pokazane). Zaobserwowana wydajność edycji jest porównywalna z poprzednio zgłaszanymi wydajnościami edycji od 2% do 70% dla tego protokołu27. Odnieśliśmy również sukces w zastosowaniu tej techniki do tworzenia delecji genów. Za pomocą dwóch crRNA zastąpiliśmy gen o długości bliskiej 6 kb sekwencją kodującą białko zielonej fluorescencji (GFP) (dane nie pokazane). W tym eksperymencie stwierdzono, że około 14% analizowanych robaków RolF 1 było dodatnich pod względem delecji genu i zastąpienia go GFP (dane nie pokazane). Wymagane są jednak dodatkowe eksperymenty w celu określenia maksymalnej długości delecji i wymiany genów, które można przeprowadzić przy użyciu tej techniki.

Ta technika może być używana do wykonywania wstawek o długości około 1,6 kb19. Niedawne badanie wykazało, że w przypadku wykonywania insercji o długości ponad 1,6 kb przy użyciu tego protokołu, wygenerowanie dwóch dwuniciowych pęknięć i użycie szablonów naprawczych z dłuższymi ramionami homologicznymi może umożliwić wstawienie znacznie większych fragmentów DNA (~10 Kb)28. Alternatywnie, można wykonać wiele rund edycji genów za pomocą tego protokołu, aby wygenerować większe edycje. Inne protokoły edycji genów CRISPR/Cas9 oparte na plazmidach C. elegans mogą być również przyjęte do eksperymentów CRISPR obejmujących insercję fragmentów DNA większych niż 1,6 kb 46,47,48.

Przed zastosowaniem tego protokołu do edycji genów konieczne jest upewnienie się, że gen będący przedmiotem zainteresowania nie jest połączony z locus dpy-10 na chromosomie II. W przypadku, gdy gen docelowy jest powiązany z dpy-10, może być problematyczne oddzielenie mutacji dpy-10 od interesującej Cię edycji. W związku z tym, w przypadku, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania jest połączony z locus dpy-10, można zastosować inne markery co-CRISPR, takie jak unc-58 (chromosom X), unc-22 lub zen-4 (chromosom IV) oraz ben-1 lub pha-1 (chromosom III), które znajdują się na różnych chromosomach 24,25,26,28. Dane z laboratorium Meyera pokazują, że mutacje ben-1 i zen-4 mogą być wykorzystywane jako skuteczne markery co-CRISPR do badań przesiewowych tą metodą28. Należy jednak zauważyć, że użycie zen-4 i pha-1 jako markerów co-CRISPR wymaga przeprowadzenia eksperymentu CRISPR na tłach zen-4 (cle10ts) lub pha-1 (e2123ts) odpowiednio typu dzikiego26,28. Co więcej, eksperymenty CRISPR z udziałem niektórych markerów co-CRISPR, takich jak ben-1, mogą wymagać przygotowania specjalnych płytek (np. płytek zawierających benzimidazol)28. Z powodzeniem użyliśmy markera co-CRISPR unc-58 do badań przesiewowych pod kątem pozytywnych edycji genu, który jest powiązany z dpy-10 przy użyciu tej metody (dane nie pokazane). Mutacja unc-58 (e665) nadaje widoczny fenotyp (paraliż), który może być skutecznie wykorzystany do badań przesiewowych w kierunku pozytywnie edytowanych robaków24. Alternatywnie, jeśli dostępny jest dostęp do mikroskopu fluorescencyjnego, znakowany fluorescencyjnie gen gtbp-1 może być również użyty jako marker co-CRISPR dla tego protokołu19.

Aby uzyskać wysoką wydajność edycji podczas korzystania z tej metody edycji genomu, miejsce edycji musi znajdować się w odległości od 10 do 30 zasad od miejsca cięcia Cas9. Jeśli miejsce edycji jest oddalone o ponad 30 baz od miejsca cięcia Cas9, wydajność edycji drastycznie spada 19,35,37. Jednak niedawne badanie przeprowadzone w laboratorium Meyera wykazało, że utworzenie dwóch dwuniciowych przerw w pewnej odległości od siebie może umożliwić wstawianie edycji daleko od miejsca cięcia Cas9 przy użyciu tego protokołu28.

W obecnym protokole szablon naprawy został zaprojektowany tak, aby wszystkie trzy wstawione kodony stop pojawiały się w tej samej ramce odczytu. Jednak alternatywną strategią tworzenia mutantów zerowych byłoby użycie uniwersalnej kasety STOP-IN o długości 43 zasad, która została opisana wcześniej50. Co ważne, ta kaseta ma kodony stop we wszystkich trzech możliwych ramkach odczytu i powoduje mutacje przesunięcia ramki. Jest to szczególnie przydatna strategia generowania mutantów zerowych, gdy w miejscu edycji wystąpi nieprawidłowa lub niekompletna naprawa.

Podsumowując, ze względu na krótki czas trwania i ostatnie postępy w tej metodzie, jest to doskonała metoda do rutynowych eksperymentów laboratoryjnych polegających na dodawaniu krótkich immunogennych znaczników epitopowych, znaczników fluorescencyjnych, dokonywaniu delecji genów, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez fundusze start-upowe Uniwersytetu w Tulsie (TU) oraz Letnie Stypendium Rozwoju Wydziału TU przyznane Jyoti Iyer. Chcielibyśmy podziękować Chemistry Summer Undergraduate Research Program (CSURP) oraz Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) za przyznanie stypendiów studentom zaangażowanym w to badanie. Chcielibyśmy podziękować Pani Caroline Dunn za jej pomoc techniczną. Na koniec chcielibyśmy podziękować doktorom Jordanowi Wardowi, Aimee Jaramillo-Lambert, Annie Allen, Robertowi Sheaffowi, Williamowi Potterowi i Saili Moghe za ich krytyczne komentarze na temat tego manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do sekwencjonowania DNA z kodami kreskowymiEurofins GenomicsSimpleSeq Kit PremixedN/A
białko Cas9PNA BioCP01Liofilizowane białko Cas9 zawieszono w 20% glicerolu zawierającym wodę wolną od nukleaz, podano i przechowywano w temperaturze -80 & stopni; C
crRNAHorizon Discovery/ GE DharmaconN/ALiofilizowane crRNA zawieszono w 5 mM Tris-Cl pH 7,5, podano i przechowywano w temperaturze -80 ° C
EcoRINew England BiolabsR3101SPrzechowywany w temperaturze -30 stopni; C
Zestaw do oczyszczania Minelute PCRQiagen28004Kolumny wirowe przechowywane w temperaturze 4 stopni; C
MyTaq RedmixMeridian BioscienceBIO-25043Przechowywany w temperaturze -30 & deg; C
StarteryIDTN/AStandardowe oligonukleotydy 20 nmol zsyntetyzowano, ponownie zawieszono w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz i przechowywano w temperaturze -30 & stopni; C
Proteinaza KGold BioP-480-SL4przechowywana w temperaturze -30 & deg; C
Szablon naprawczy oligonukleotydówIDTN/A4 nmol Oligonukleotydy ultramerów zsyntetyzowano, ponownie zawieszono w sterylnej wodzie wolnej od nukleaz i przechowywano w temperaturze -30 & stopni; C
tracrRNAHorizon Discovery/ GE DharmaconU-002005-50Liofilizowany tracrRNA zawieszono w 5 mM Tris-Cl pH 7,5, podano na porcję i przechowywano w temperaturze -80 & stopni; Z

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  2. Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annual Review of Biochemistry. 83, 409-439 (2014).
  3. Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of Programmable Nucleases for Genome Engineering. Journal of Molecular Biology. 428 (5), 963-989 (2016).
  4. Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
  5. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  6. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
  7. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  8. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Almendros, C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology. 155 (3), 733-740 (2009).
  9. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  10. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  11. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  12. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. CRISPR, Methods in Molecular Biology. 1311, Humana Press. New York, NY. 7-75 (2015).
  13. Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
  14. Frøkjær-Jensen, C. Exciting prospects for precise engineering of Caenorhabditis elegans genomes with CRISPR/Cas9. Genetics. 195 (3), 635-642 (2013).
  15. Waaijers, S., Boxem, M. Engineering the Caenorhabditis elegans genome with CRISPR/Cas9. Methods. 68 (3), 381-388 (2014).
  16. Xu, S. The application of CRISPR-Cas9 genome editing in Caenorhabditis elegans. Journal of Genetics and Genomics. 42 (8), 413-421 (2015).
  17. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  18. Nance, J., Frøkjær-Jensen, C. The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox. Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).
  19. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121, 86-93 (2017).
  20. Kim, H. M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in Caenorhabditis elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106(2019).
  21. Prior, H., MacConnachie, L., Martinez, J. L., Nicholl, G. C., Beg, A. A. A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins. Journal of Visualized Experiments. (134), e57518(2018).
  22. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly efficient, rapid and Co-CRISPR-independent genome editing in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (11), 3693-3698 (2017).
  23. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
  24. Arribere, J. A., Bell, R. T., Fu, B. X., Artiles, K. L., Hartman, P. S., Fire, A. Z. Efficient marker-free recovery of custom genetic modifications with CRISPR/Cas9 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (3), 837-846 (2014).
  25. Kim, H., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).
  26. Ward, J. D. Rapid and precise engineering of the Caenorhabditis elegans genome with lethal mutation co-conversion and inactivation of NHEJ repair. Genetics. 199 (2), 363-377 (2015).
  27. Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).
  28. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
  29. Levy, A. D., Yang, J., Kramer, J. M. Molecular and genetic analyses of the Caenorhabditis elegans dpy-2 and dpy-10 collagen genes: a variety of molecular alterations affect organismal morphology. Molecular Biology of the Cell. 4 (8), 803-817 (1993).
  30. Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55 (4), 555-565 (1988).
  31. Schnabel, H., Schnabel, R. An organ-specific differentiation gene, pha-1, from Caenorhabditis elegans. Science. 250 (4981), 686-688 (1990).
  32. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Research. 22 (9), 1762-1763 (1994).
  33. Chalfie, M., Thomson, J. N. Structural and functional diversity in the neuronal microtubules of Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 93 (1), 15-23 (1982).
  34. Severson, A. F., Hamill, D. R., Carter, J. C., Schumacher, J., Bowerman, B. The aurora-related kinase AIR-2 recruits ZEN-4/CeMKLP1 to the mitotic spindle at metaphase and is required for cytokinesis. Current Biology. 10 (19), 1162-1171 (2000).
  35. Paix, A., Schmidt, H., Seydoux, G. Cas9-assisted recombineering in C. elegans: genome editing using in vivo assembly of linear DNAs. Nucleic Acids Research. 44 (15), 128(2016).
  36. Chiu, H., Schwartz, H. T., Antoshechkin, I., Sternberg, P. W. Transgene-free genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas. Genetics. 195 (3), 1167-1171 (2013).
  37. Paix, A., et al. Scalable and versatile genome editing using linear DNAs with microhomology to Cas9 Sites in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1347-1356 (2014).
  38. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  39. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nature Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
  40. Friedland, A. E., Tzur, Y. B., Esvelt, K. M., Colaiácovo, M. P., Church, G. M., Calarco, J. A. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
  41. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  42. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PloS One. 9 (5), e98186(2014).
  43. Iyer, J., DeVaul, N., Hansen, T., Nebenfuehr, B. Using microinjection to generate genetically modified Caenorhabditis elegans by CRISPR/Cas9 editing. Microinjection, Methods in Molecular Biology. 1874, 431-457 (2019).
  44. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  45. Peel, N., Iyer, J., Naik, A., Dougherty, M. P., Decker, M., O'Connell, K. F. Protein phosphatase 1 down regulates ZYG-1 levels to limit centriole duplication. PLoS Genetics. 13 (1), 1006543(2017).
  46. Dickinson, D. J., Pani, A. M., Heppert, J. K., Higgins, C. D., Goldstein, B. Streamlined genome engineering with a self-excising drug selection cassette. Genetics. 200 (4), 1035-1049 (2015).
  47. Norris, A. D., Kim, H. M., Colaiácovo, M. P., Calarco, J. A. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans with a toolkit of dual-marker selection cassettes. Genetics. 201 (2), 449-458 (2015).
  48. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  49. Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA Donor Molecules Greatly Improves Precision Genome Editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (2), (2020).
  50. Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3607-3616 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Genom C elegansnaprawa kierowana homologitechnika mikroiniekcjiprzesiewanie fenotypu rollerelektroforeza w elu agarozowymsekwencjonowanie DNAprzedwczesny kodon stop

Powiązane artykuły