Artykuł metodologiczny

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

DOI:

10.3791/62003

⸱

10 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neowaskularyzacja jest zwykle inicjowana z istniejącego normalnego unaczynienia, a biomechaniczne mikrośrodowisko komórek śródbłonka (EC) w początkowej fazie różni się znacznie od następnego procesu neowaskularyzacji. Chociaż istnieje wiele modeli symulujących różne etapy neowaskularyzacji, nadal brakuje modelu 3D in vitro, który kapituluje początkowy proces neowaskularyzacji pod odpowiednimi stymulacjami normalnych mikrośrodowisk unaczynienia. W tym miejscu zrekonstruowaliśmy model 3D in vitro, który naśladuje początkowe zdarzenie neowaskularyzacji (MIEN). Model MIEN zawiera mikroprzepływowy chip kiełkujący i automatyczny, wysoce wydajny system cyrkulacji sterowania. Utworzono funkcjonalny, perfuzyjny mikrokanał pokryty śródbłonkiem, a proces kiełkowania symulowano w mikroprzepływowym chipie do kiełkowania. Początkowo fizjologiczne mikrośrodowisko neowaskularyzacji zostało podsumowane za pomocą mikroprzepływowego systemu sterowania, za pomocą którego EC byłyby narażone na wysokie naprężenia ścinające światło, fizjologiczny przepływ przezśródbłonkowy i różne rozkłady czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie. Model MIEN może być z łatwością zastosowany do badania mechanizmu neowaskularyzacji i jest potencjalnie obiecujący jako tania platforma do badań przesiewowych leków i zastosowań toksykologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neowaskularyzacja zachodzi w wielu normalnych i patologicznych procesach1,2,3,4, które obejmują dwa główne procesy u dorosłych, angiogenezę i arteriogenezę5. Oprócz najbardziej znanych czynników wzrostu, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF)6, stymulacje mechaniczne, w szczególności naprężenie ścinające wywołane przepływem krwi, są ważne w regulacji neowaskularyzacji7. Jak wiemy, wielkość i formy naprężeń ścinających różnią się dramatycznie i dynamicznie w różnych częściach układu krwionośnego, co ma istotny wpływ na komórki naczyniowe8,9,10,11,12. Wcześniejsze badania wykazały, że naprężenie ścinające może wpływać na różne aspekty EC, w tym zmiany fenotypowe komórek, transdukcję sygnału, ekspresję genów i komunikację z komórkami muralowymi13,14,15,16,17,xref"18,19,Dnia 20; W związku z tym reguluj neowaskularyzację21,22,23,24.

Dlatego, aby lepiej zrozumieć neowaskularyzację, ważne jest zrekonstruowanie procesu w naturalnym mikrośrodowisku komórkowym in vitro. Ostatnio powstało wiele modeli do tworzenia mikronaczyń i zapewnienia precyzyjnej kontroli mikrośrodowiska25,26,27, wykorzystując postępy w mikroprodukcji i technologii mikroprzepływowej. W tych modelach mikronaczynia mogą być generowane przez hydrożel28,29, chipy mikroprzepływowe z polidimetylosiloksanu (PDMS)30,31,32 lub biodruk 3D33,34. Niektóre aspekty mikrośrodowiska, takie jak naprężenie ścinające światło22,23,35,36, przepływ przezśródbłonkowy37,38,39,40, biochemiczny gradient czynników angiogennych41,42, strain/stretch43,44,45, i współhodowane z innymi typami komórek32,46 zostały naśladowane i kontrolowane. Zwykle do dostarczania perfundowanego medium używano dużego zbiornika lub pompy strzykawkowej. Przepływ przezśródbłonkowy w tych modelach został utworzony przez spadek ciśnienia między zbiornikiem a mikrorurką22,23,38,40. Jednak mechaniczne mikrośrodowisko było trudne do ciągłego utrzymywania w ten sposób. Przepływ przezśródbłonkowy wzrósłby, a następnie przekroczyłby poziom fizjologiczny, gdyby do perfuzji zastosowano wysokie natężenie przepływu z dużym naprężeniem ścinającym. Poprzednie badania wykazały, że w początkowym okresie neowaskularyzacji prędkość przepływu przezśródbłonkowego jest bardzo niska ze względu na nienaruszone EC i błonę podstawną, zwykle poniżej 0,05 μm/s8. Tymczasem, mimo że naprężenie ścinające światło w układzie naczyniowym jest bardzo zróżnicowane, jest stosunkowo wysokie ze średnimi wartościami 5-20 dyn/cm2,11,47. Na razie prędkość przepływu przezśródbłonkowego w poprzednich pracach była na ogół utrzymywana w granicach 0,5-15 μm/s22,38,39,40, a naprężenie ścinające światła było zwykle poniżej 10 dyn/cm2 23. Pozostaje trudnym tematem, aby stale narażać EC na wysokie naprężenia ścinające światła i fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego.

W niniejszym badaniu opisujemy model 3D in vitro, który naśladuje początkowe zdarzenie neowaskularyzacji (MIEN). Opracowaliśmy chip mikroprzepływowy i automatyczny, wysoce wydajny system cyrkulacji do tworzenia mikrorurek perfuzyjnych i symulacji procesu kiełkowania48. W modelu MIEN najpierw podsumowuje się mikrośrodowisko EC stymulowane w początkowym okresie neowaskularyzacji. EC mogą być stymulowane przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i różny rozkład VEGF jednocześnie. Szczegółowo opisujemy etapy tworzenia modelu MIEN i kluczowe punkty, na które należy zwrócić uwagę, mając nadzieję, że dostarczymy odniesienia dla innych badaczy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie wafla

UWAGA: Ten protokół jest specyficzny dla negatywnego fotorezystu SU-8 2075 używanego podczas tych badań.

  1. Wyczyść płytkę krzemową 3 do 5 razy metanolem i izopropanolem na powlekarce wirowej w następujący sposób: najpierw wiruj przez 15 s przy 500 obr./min, a następnie wiruj przez 60 s przy 3,000 obr./min.
  2. Przenieś wafel silikonowy na płytę grzejną, która jest podgrzana do 180 °C i piecz wafel przez 10 minut.
  3. Wyjmij wafel silikonowy z płyty grzejnej i ostudź go do temperatury pokojowej. Ponownie wyczyść wafel sprężonym powietrzem przed przystąpieniem do powlekania wirowego. Nałóż 4 ml fotorezystu SU-8 2075 na środek płytki.
  4. Uzyskać wysokość elementu 70 μm na powlekarce wirowej w następujący sposób: najpierw wirować przez 12 s przy 500 obr./min, a następnie wirować przez 50 s przy 2.100 obr./min.
  5. Na miękko upiecz wafel na płycie grzejnej w następujący sposób: najpierw piecz przez 8 minut w temperaturze 65 °C, a następnie piecz przez 20 minut w temperaturze 95 °C. Następnie wyjmij wafel krzemowy z płyty grzejnej i ostudź go do temperatury pokojowej przed litografią.
  6. Umieść fotomaskę na folii fotorezystu. Naświetlić płytkę za pomocą sprzętu litograficznego, aby uzyskać całkowitą ekspozycję 200 mJ/cm2,
    UWAGA: Fotomaska zawiera dziewięć zestawów wzorów chipa, dzięki czemu może za każdym razem wytwarzać dziewięć mikroprzepływowych chipów kiełkujących.
  7. Po wyeksponowaniu wafla na płycie grzejnej w następujący sposób: najpierw piecz przez 5 minut w temperaturze 65 °C, a następnie piecz przez 20 minut w temperaturze 95 °C. Następnie wyjmij wafel krzemowy z płyty grzejnej i ostudź go do temperatury pokojowej przed wywołaniem.
  8. Przenieś wafel na szklaną szalkę Petriego wypełnioną wywoływaczem SU-8 (PGMEA), aby rozpocząć opracowywanie.
    UWAGA: Wywoływacz działa drażniąco na oczy i drogi oddechowe. Wykonaj wywoływanie w dygestorium. Podczas operacji należy nosić gogle przeciwbryzgowe, rękawice nitrylowe i maskę lotniczą.
  9. Delikatnie potrząśnij naczyniem wzdłuż kierunku kanału przepływowego i zmień wywoływacz po 10 minutach.
  10. Powtórz krok 1.9 3-5 razy, aż będzie można wyraźnie zaobserwować wzory.
    UWAGA: Upewnij się, że na płytce nie pozostały żadne pozostałości fotorezystu, w przeciwnym razie ponownie wypłucz wafel w wywoływaczu.
  11. Przełóż wafel na rozgrzaną płytę grzejną ustawioną na 120 °C i piecz go przez 30 minut.
  12. Odmierzyć pipetę 35 μl silanu na szkiełko nakrywkowe, a następnie umieścić szkiełko nakrywkowe wraz z waflem w eksykatorze i wprowadzić próżnię. Uszczelnij eksykator i pozostaw płytkę w próżni na 4 godziny w celu silanizacji płytki, aby zapobiec przywieraniu PDMS podczas procesów miękkiej litografii.
    UWAGA: Silan jest toksyczny. Aby zapobiec zatruciu, należy przeprowadzić silanizację w dygestorium i nosić rękawice nitrylowe podczas obsługi.
  13. Uwolnić podciśnienie z eksykatora. Wyjmij silanizowaną wafel na rozgrzaną płytę grzejną i piecz w temperaturze 65°C przez 2 godziny.
  14. Przechowuj wafel na czystej szalce Petriego, aż będzie potrzebny.

2. Wytwarzanie mikroprzepływowych chipów do kiełkowania

  1. Połączyć 20 g środka bazowego i 2 g utwardzacza (w stosunku 10:1) w plastikowej zlewce i dokładnie wymieszać je za pomocą pręta mieszającego.
  2. Umieścić zlewkę w eksykatorze i podciągnąć próżnię przez 1 godzinę, aby usunąć pęcherzyki powietrza z mieszaniny PDMS.
  3. Wlać mieszaninę PDMS na wafel na szalce Petriego i umieścić szalkę Petriego z powrotem w eksykatorze, odgazowując przez kolejne 30 minut.
    UWAGA: Pomocne jest użycie dwustronnej taśmy klejącej do przyklejenia wafla do dna szalki Petriego, aby zapewnić, że wafel jest utrzymywany poziomo podczas odgazowywania i utwardzania.
  4. Wyjąć szalkę Petriego z eksykatora i umieścić ją w suchym piekarniku o temperaturze 80 °C na 3 godziny do utwardzenia.
  5. Ostrożnie oddziel warstwę PDMS od wafla i pokrój warstwę na dziewięć wiórów skalpelem zgodnie ze wzorem.
    UWAGA: Po rozdzieleniu trzymaj element stroną z funkcją do góry.
  6. Wybij dwa porty do wstrzykiwań hydrożelu i cztery porty do wstrzykiwań mediów z każdego chipa za pomocą stempla biopsyjnego odpowiednio 1 mm i 3,5 mm.
  7. Oczyść dziurkowane wióry taśmą bez pozostałości, aby usunąć pozostałości PDMS. Umieść wióry i dziewięć szklanych szkiełek nakrywkowych w myjce plazmowej i traktuj je plazmą tlenową przez 30 sekund, aby utworzyć wiązanie kowalencyjne na powierzchni.
  8. Wyjmij wióry i szkiełka nakrywkowe. Przymocuj stronę ozdobną wiórów do szkiełek nakrywkowych.
  9. Umieść dołączone wióry w suchym piekarniku o temperaturze 80 °C na 1 godzinę, aby zintensyfikować wiązanie.
  10. Autoklaw chipy przed użyciem i utrzymuj je w sterylności do końca zabiegu.

3. Modyfikacja powierzchni i iniekcja hydrożelu

  1. Na każdy chip odpipetuj 40 μl 1 mg/ml poli-D-lizyny (PDL) i wstrzyknij ją do kanałów w chipie z portu wtrysku hydrożelu.
    UWAGA: Upewnij się, że PDL wypełnia kanały, szczególnie w wąskich kanałach w pobliżu portów.
  2. Inkubować wióry w temperaturze 37 °C przez 4 godziny w celu modyfikacji powierzchni PDMS.
  3. Odpipetuj 200 μl sterylnej wody i wstrzyknij ją do kanałów w chipie z portu iniekcyjnego hydrożelu, aby wypłukać PDL.
  4. Wyjmij frytki do suchego piekarnika o temperaturze 120 °C na 3 godziny, aby przywrócić hydrofobowość.
  5. Umieścić na lodzie sterylną probówkę i obliczyć objętość kolagenu typu I, który ma być użyty, zgodnie z następującym równaniem.
    Końcowa objętość (50 μl) x końcowe stężenie kolagenu (3 mg/ml w tym badaniu) / Stężenie w butelce = objętość kolagenu do dodania
  6. Obliczyć objętość NaOH, która ma być użyta jako następujące równanie.
    (objętość kolagenu do dodania) x 0,023 = objętość 1 N NaOH
  7. Przygotować 50 μl hydrożelu w probówce zgodnie z następującym protokołem: dodać 5 μl 10x PBS, 0,5 μL czerwieni fenolowej, obliczoną objętość 1 N NaOH, 4 μL 1 mg / ml fibronektyny, obliczoną objętość kolagenu typu I po kolei. Dodać odpowiednią ilośćdH2O, aby całkowita objętość osiągnęła 50 μL. Dokładnie wymieszać całą zawartość w probówce.
    UWAGA: Wszystkie operacje wykonuj na lodzie. Użyj czerwieni fenolowej jako wskaźnika na bazie kwasu, aby pomóc w wizualnym określeniu pH hydrożelu. Końcowy hydrożel kończy się na pomarańczowo, gdy pH wynosi około 7,4, a sztywność wynosi około 15 kPa49.
  8. Odpipetuj 2-3 μl hydrożelu na każdy chip i powoli wstrzyknij go do centralnego kanału hydrożelowego z portu iniekcyjnego hydrożelu.
  9. Inkubować wiórki w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby umożliwić żelowanie.
    UWAGA: Zamknij chipsy w szczelnie zamkniętym pudełku z 1 ml sterylnej wody, jeśli nie zostaną natychmiast użyte. Zgrzebne wióry można przechowywać w temperaturze 37 °C maksymalnie przez 24 godziny.

4. Rozsiewanie komórek

  1. Odpipetować 20 μl 125 μg/ml fibronektyny do jednego portu iniekcyjnego pożywki w kanale hodowli komórkowej.
  2. Odetnij nożyczkami końcówkę pipety, aby dopasować ją do portu kanału hodowli komórkowej.
  3. Włóż końcówkę pipety do drugiego portu iniekcyjnego pożywki w kanale hodowli komórkowej. Następnie odpipetuj powietrze z kanału hodowli komórkowej, aby wypełnić go fibronektyną.
  4. Inkubować wiórki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  5. Przed wysiewem komórek odpipetować 20 μl pożywki ECM do każdego portu iniekcyjnego pożywki i inkubować wióry w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  6. Następnie odpipetuj wszystkie media we wszystkich portach wstrzykiwania mediów.
  7. Następnie odpipetować 5 μl zawiesiny komórkowej do jednego portu iniekcyjnego pożywki w kanale hodowli komórkowej. Następnie komórki śródbłonka szybko rozprzestrzeniają się po całym kanale pod wpływem różnicy ciśnień hydrostatycznych.
    UWAGA: Przygotować zawiesinę komórkową poprzez trypsynizację ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) z kolby hodowlanej i odwirowanie ich przy 400 x g. Następnie ponownie zawieś komórki do 107 komórek/ml w probówce.
  8. Dodaj około 4-6 μl nośnika ECM do drugiego portu, aby wyregulować ciśnienie hydrostatyczne i zatrzymać ruch komórki.
  9. Wyjąć wióry do inkubatora komórkowego. Następnie obracaj chipsy co 30 minut, aż komórki śródbłonka pokryją się wokół wewnętrznej powierzchni kanału hodowli komórkowej 2 godziny później (Rysunek 1).
    UWAGA: Aby odwrócić wiór do góry nogami, odpipeuj trochę wody na odwrocie szkiełka nakrywkowego. Następnie chip można przymocować do pokrywy szalki Petriego.
  10. Za pomocą końcówki pipety bardzo ostrożnie usunąć przyczepione komórki w portach iniekcyjnych.
  11. Następnie włóż cztery żeńskie adaptery Luer z zadziorami do portów wtrysku mediów i napełnij je nośnikiem ECM.
    UWAGA: Adaptery mogą pełnić funkcję zbiorników płynu, aby zapewnić składniki odżywcze komórkom w kanale.
  12. Wyjmij wióry do inkubatora komórkowego. Wymieniaj nośniki ECM w adapterach Luer co 12 godzin.

5. Pomiar przepuszczalności dyfuzyjnej FITC-dekstranu

UWAGA: Aby ocenić funkcję bariery mikronaczynia, oceniana jest przepuszczalność dyfuzyjna kanału hodowlanego EC z lub bez wyściółki komórkowej.

  1. Wyjmij mikroprzepływowy chip do kiełkowania z wstrzykniętym hydrożelem.
  2. Powtórz kroki 4.1-4.6.
  3. Wyjmij wszystkie adaptery Luer i odpipetuj wszystkie media z czterech portów wtrysku mediów.
  4. Umieść chip na konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym.
  5. Odpipetować 5 μl pożywki hodowlanej zawierającej 500 μg/ml 40 kDa FITC-dekstranu do jednego portu kanału hodowli komórkowej.
    UWAGA: 40 kDa FITC-dekstran ma podobną wielkość cząsteczkową do VEGF-165 (39-45 kDa).
  6. Rób zdjęcia co 3 s przez 30 s. W ten sposób mierzona jest przepuszczalność dyfuzyjna bez wyściółki komórkowej.
  7. Wyjmij mikroprzepływowy chip do kiełkowania po tym, jak HUVEC zbiegną się w kanale hodowli komórkowej.
  8. Powtórz kroki 5.3-5.5.
  9. Rób zdjęcia co 3 s przez 30 s. W ten sposób mierzona jest przepuszczalność dyfuzyjna z wyściółką komórkową.
  10. Oblicz przepuszczalność dyfuzyjną, określając ilościowo zmiany intensywności fluorescencji w czasie, korzystając z następującego zmodyfikowanego równania50.
    Pd= (I2- I1) / ((I1- Ib)·Δt) ·S/d
    gdzie, Pd jest współczynnikiem przenikalności dyfuzyjnej, I1 jest średnim natężeniem w początkowym punkcie czasowym, I2 jest średnim natężeniem po czasie delta (Δt), Ib jest natężeniem tła, S jest obszarem kanału na obrazach fluorescencyjnych, a d jest całkowitym przedziałem mikropostów w obrazach fluorescencyjnych. W niniejszej pracy Δt jest ustawione jako 9 s.
    UWAGA: Obecne równanie różni się nieco od oryginalnego50, ze względu na kierunek dyfuzji fluorescencji w chipie tylko od kanału EC do kanału hydrożelowego, co nie jest jak okrągła rurka dyfuzująca we wszystkich kierunkach promieniowym.

6. Konfiguracja systemu sterowania mikroprzepływowego

UWAGA: System kontroli mikroprzepływowej w niniejszym badaniu składa się z pompy mikro-strzykawkowej, elektromagnetycznego zaworu zaciskowego, chipa pułapki bąbelkowej, chipa mikroprzepływowego, pompy mikroperystaltycznej i zbiornika. Każda część systemu może zostać zastąpiona alternatywnymi rozwiązaniami zdolnymi do pełnienia tej samej funkcji.

  1. Produkcja chipów pułapki bąbelkowej
    UWAGA: Chip pułapki bąbelkowej służy do usuwania pęcherzyków powietrza w obiegu. Układ składa się z trzech warstw PDMS. Górna warstwa jest zbudowana przy użyciu miękkiej litografii, aby utworzyć strukturę siatki jako komorę cieczy. Każdy kanał struktury siatki ma szerokość 100 μm. Dolna warstwa to kawałek PDMS z otworem. Pomiędzy dwiema warstwami układana jest folia PDMS o grubości 100 μm.
    1. Powtórz krok 1, aby przygotować wafel na chip pułapki bąbelkowej.
    2. Powtórz kroki 2.1-2.5, aby wytworzyć górną i dolną warstwę chipa pułapki bąbelkowej.
      UWAGA: Fotomaska górnej warstwy zawiera trzy zestawy wzorów, więc przytnij warstwę PDMS do trzech wiórów zgodnie ze wzorem.
    3. Przebij sześć otworów na końcu kanałów wlotowych i wylotowych górnej warstwy za pomocą stempla do biopsji 3.5 mm.
    4. Przebić dwa otwory w odpowiednim miejscu dolnej warstwy za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy 6 mm zgodnie ze wzorem na górnej warstwie.
    5. Powtórz kroki 2.1-2.2, aby przygotować 10 g mieszaniny PDMS i wylać ją na środek oczyszczonej płytki krzemowej.
    6. Stwórz folię PDMS o grubości 100 μm, stosując następujący protokół wirowania: wiruj przez 15 s przy 500 obr./min, zwiększ prędkość wirowania do 1 300 obr./min i przytrzymaj przez 45 s.
    7. Przełóż wafel na rozgrzaną płytę grzejną ustawioną na 180 °C i piecz przez 30 minut.
    8. Oczyść wykrawane warstwy taśmą bez pozostałości, aby usunąć pozostałości PDMS. Umieść górne warstwy i wafel w czyszczalni plazmowej i traktuj je plazmą tlenową przez 30 sekund, aby utworzyć wiązanie kowalencyjne na powierzchni.
    9. Wyjmij wierzchnie warstwy i wafel. Przymocuj stronę cechową górnych warstw do folii PDMS.
    10. Ostrożnie przeciąć folię wzdłuż krawędzi górnych warstw za pomocą igły.
    11. Powoli oddziel folię od wafla i odwróć wióry, aby po rozdzieleniu folia była stroną do góry.
    12. Umieść dolne warstwy i dołączone wióry w czyszczalni plazmowej i ponownie potraktuj je plazmą tlenową przez 30 sekund.
    13. Wyjmij dolne warstwy i dołączone wióry. Przymocuj dolne warstwy do folii PDMS, a wióry pułapki bąbelkowej są gotowe.
      UWAGA: Podczas mocowania wyrównaj otwory na dolnej warstwie z wzorami na górnej warstwie.
    14. Umieść frytki w suchym piekarniku o temperaturze 80 °C na 1 godzinę, aby zintensyfikować wiązanie.
  2. Zmontuj mikroprzepływowy układ sterowania
    UWAGA: Wszystkie części systemu, takie jak chip pułapki bąbelkowej, zbiornik, rurki i złącza, są używane po sterylizacji w autoklawie, z wyjątkiem sprzętu elektronicznego. Zamontuj system sterowania mikroprzepływowego na czystym stole.
    1. Aby zmontować układ sterowania mikroprzepływowego, przygotuj dwie rurki z politetrafluoroetylenu, dwie krótkie rurki silikonowe, trzy długie rurki silikonowe, jeden żeński adapter Luer z zadziorem, jedno złącze typu Y i trzy złącza typu L.
      UWAGA: Zaletą rurki z politetrafluoroetylenu jest niska elastyczność, dlatego w rurociągu potrzeba mniej mediów. Z kolei rurka silikonowa ma wysoką elastyczność, dlatego nadaje się do zaworu zaciskowego i pompy perystaltycznej.
    2. Napełnić strzykawkę 10 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) podłoża ECM.
      UWAGA: Podgrzewanie pomaga medium uwolnić rozpuszczony gaz.
    3. Podłączyć rurkę z politetrafluoroetylenu do strzykawki za pomocą żeńskiego adaptera Luer z zadziorami. Następnie podłącz drugi koniec rurki z politetrafluoroetylenu do złącza typu Y.
    4. Następnie podłącz dwie długie rurki silikonowe do pozostałych dwóch końców złącza typu Y, przy czym jedna rurka łączy się ze zbiornikiem, a druga rurka łączy się z chipem pułapki bąbelkowej.
    5. Podłącz kolejną długą silikonową rurkę do zbiornika.
    6. Następnie użyj dwóch krótkich silikonowych rurek, aby połączyć wszystkie otwory wlotowe i wylotowe w górnej warstwie chipa pułapki bąbelkowej. Podłącz rurkę z politetrafluoroetylenu do tylnej części chipa.
    7. Następnie przymocować strzykawkę do pompy mikrostrzykawkowej.
    8. Wciśnij dwie długie silikonowe rurki do elektromagnetycznego zaworu zaciskowego.
    9. Następnie przełącz elektromagnetyczny zawór zaciskowy, aby otworzyć rurociąg między strzykawką a zbiornikiem. Wstrzyknąć pożywkę do zbiornika za pomocą pompki mikrostrzykawkowej w celu odprowadzenia powietrza z rurki.
    10. Następnie ponownie przełącz zawór, aby otworzyć rurociąg między strzykawką a chipem pułapki bąbelkowej. Wstrzyknąć pożywkę, aby napełnić komorę cieczy i tylną rurkę chipa pułapki bąbelkowej.

7. Test kiełkowania śródbłonka

UWAGA: W niniejszym badaniu użyto inkubatora z mikroskopem kontrastu fazowego, który obserwuje proces kiełkowania w czasie rzeczywistym. Inkubator górny może utrzymywać temperaturę, wilgotność i kontrolę CO2 na stolikach mikroskopowych, będąc dobrym do obrazowania żywych komórek. Ale sprzęt nie jest niezbędny do testu. Przedstawione tutaj protokoły mogą być również stosowane w podstawowym inkubatorze komórkowym.

  1. Wyjmij chipy do kiełkowania śródbłonka z inkubatora komórkowego.
  2. Następnie usuń adaptery Luer po stronie hodowli komórkowej. Włóż dwie zatyczki rurowe do portów iniekcji hydrożelu mikroprzepływowego chipa do kiełkowania.
    UWAGA: Zatyczki mogą przekształcać się z igieł, a ich główną funkcją jest zapobieganie rozlewaniu się mediów.
  3. Podłącz rurkę tylną chipa pułapki bąbelkowej do jednego portu kanału hodowli komórkowej.
    UWAGA: Przed podłączeniem upewnij się, że w rurce nie ma pęcherzyków.
  4. Włóż złącze typu T do drugiego portu i podłącz je do długiej silikonowej rurki połączonej ze zbiornikiem.
  5. Przypnij długą silikonową rurkę do pompy mikroperystaltycznej.
  6. Następnie włóż filtr powietrza do zbiornika.
  7. Następnie zmontuj mikroprzepływowy chip do kiełkowania w inkubatorze znajdującym się na górze sceny.
  8. Następnie podłącz pompę próżniową do otworów w dolnej warstwie chipa pułapki bąbelkowej za pomocą rurki TPU.
  9. Ustaw objętość cyrkulacji i natężenie przepływu w niestandardowym programie, który jednocześnie steruje pompą mikrostrzykawkową i elektromagnetycznym zaworem zaciskowym ( Rysunek 2).
    UWAGA: Natężenie przepływu przez kanał hodowli komórek śródbłonka oblicza się zgodnie z klasycznym równaniem.
    τ = 6μQ / Wh2
    gdzie τ to naprężenie ścinające (dyn/cm2), μ to lepkość podłoża (8,8 x 10-4 Pa•s), Q to natężenie przepływu przez kanał hodowli komórek śródbłonka (ml / s), h to wysokość kanału (70 μm), a W to szerokość kanału (1 000 μm). Lepkość medium mierzy się za pomocą współosiowego lepkościomierza rotacyjnego typu cylindrycznego. Wysokość i szerokość kanału są z góry określone i ręcznie potwierdzone za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym przy 4-krotnym powiększeniu. Objętość krążenia wynosi 5 ml, a natężenie przepływu 85 μl/min (średnio 0,2 m/s w kanale hodowli komórkowej) dla naprężenia ścinającego 15 dyn/cm2 zgodnie z obliczeniami.
  10. Następnie ustaw natężenie przepływu pompy mikroperystaltycznej.
    UWAGA: Natężenie przepływu pompy mikroperystaltycznej jest nieco wyższe niż pompy mikrostrzykawkowej, aby zapobiec rozlaniu się mediów.
  11. Włączyć pompę mikrostrzykawkową. Następnie ustanawiany jest system sterowania obiegiem.

8. Analiza danych

UWAGA: Aby określić ilościowo kiełki, obliczono znormalizowany obszar kiełkowania, średnią długość kiełków i najdłuższą długość kiełków. Wyniki reprezentują średnią ± SEM uzyskaną z trzech niezależnych badań. Istotność statystyczna (P < 0,05) jest oceniana za pomocą testu t-Studenta.

  1. Utrwal komórki i kiełki w mikroprzepływowym chipie do kiełkowania po eksperymentach z 4% paraformaldehydem w PBS przez 15 minut. Zabarwić jądra dichlorowodorkiem 4′,6-dimidino-2-fenyloindolu (DAPI; 1: 1000; Sigma-Aldrich) przez 10 minut, a następnie wybarwić cytoszkielet falloidyną TRITC (P5285, 1: 100; Sigma-Aldrich) przez 1 godz. Przemyć komórki PBS trzy razy w odstępach 5 minut między każdym etapem.
  2. Zrób konfokalne obrazy chipów w trybie kafelkowania i zszyj je za pomocą oprogramowania do edycji obrazu.
  3. Policz liczbę pikseli fluorescencyjnych obrazów projekcji Z za pomocą niestandardowego kodu w oprogramowaniu do programowania, aby określić ilościowo znormalizowany obszar kiełkowania (patrz plik uzupełniający).
  4. Ręcznie zidentyfikuj i oznacz każdy wierzchołek kiełków na obrazach projekcji Z i oblicz odległości między końcówkami kiełków do błony podstawnej EC przy użyciu innego niestandardowego kodu, aby określić ilościowo średnią długość kiełków i najdłuższą długość kiełków (patrz plik uzupełniający).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model 3D in vitro do naśladowania początkowego zdarzenia neowaskularyzacji (MIEN) prezentowany tutaj składał się z mikroprzepływowego chipa do kiełkowania i mikroprzepływowego systemu kontroli. Mikroprzepływowy układ do kiełkowania został zoptymalizowany w stosunku do poprzednich publikacji22,23,37,40,51,52,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez długi czas obserwacja neowaskularyzacji w czasie rzeczywistym stanowiła problem. Ostatnio opracowano kilka podejść do tworzenia perfundowanych naczyń wyściełających EC i przylegających do macierzy zewnątrzkomórkowej w celu kiełkowania 22,32,40,46,54, ale mikrośrodowisko mechaniczne jest nadal trudne do stałego utrzymania. Pozostaje trudnym tematem do naś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (granty nr 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 i 32071311), Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (granty nr 2016YFC1101101 i 2016YFC1102202), Projekt 111 (B13003) oraz Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (4194079).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna-EDTAGenviewGP3108
Kolagen I, ogon szczuraCorning354236
DAPISigma-AldrichD9542
Elektromagnetyczny zawór zaciskowyWokun TechnologyWK02-308-1/3
Pożywka dla komórek śródbłonka (ECM)Sciencell1001
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Każdy zielonyNA
FibronectinCorning354008
FITC-dekstranMiragen60842-46-8
Graficzne środowisko programowaniaLab ZOBACZNA
Oprogramowanie do edycji obrazówPhotoShopNA
Program do przetwarzania obrazówImageJNA
IsopropanolSigma-Aldrich91237
Sprzęt litograficznyInstytut Optyki i Elektroniki, Chińska Akademia NaukURE-2000/35
MetanolSigma-Aldrich82762
Pompa mikroperystaltycznaPłyn ołowiowyBT101L
Pompa mikrostrzykawkowaPłyn ołowiowyTYD01
Plazma tlenowaMING HENGPDC-MG
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148
PBS (10x)BeyotimeST448
Trwały fotorezystor epoksydowy ujemnyMicrochemSU-8 2075
Sól sodowa czerwieni fenolowejSigma-AldrichP5530
Polidimetylosiloksan (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Bromowodorek poli-D-lizyny (PDL)Sigma-AldrichP7886
Politetrafluoroetylen-teflonNA
Oprogramowanie programoweMATLABNA
Rekombinowany ludzki VEGF-165StemImmune LLCHVG-VF5
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-Aldrich1.06498
Inkubator górnyTokai HitNA
SU-8 wywoływaczMicrochemNA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silanSigma-Aldrich448931
TRITC PhalloidinSigma-AldrichP5285

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261(1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249(2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209(2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869(2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56(2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737(2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880(2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092(2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657(2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046(2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863(2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial "vessels" for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64(2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443(2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), Pt 2 188(1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mechanizm neowaskularyzacjikom rki r db onkamikrofluidyczny chip do badania kie kowanianapr enie cinaj ceprzep yw transendotelialnyczynnik wzrostu r db onka naczyniowegoperfuzowalny mikrokanatest kie kowania r db onkaplatforma do przesiewania lek w

Powiązane artykuły