Przygotowanie próbki do profilowania metabolicznego przy użyciu obrazowania spektrometrii mas MALDI

Summary

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych wskazówek dotyczących przygotowania próbki podczas planowania eksperymentów z użyciem MALDI MSI, aby zmaksymalizować wykrywanie metaboliczne i molekularne w próbkach biologicznych.

Abstract

Metabolomika, badanie mające na celu identyfikację i ilościowe określenie małych cząsteczek i metabolitów obecnych w próbce eksperymentalnej, stało się ważnym narzędziem do badania aktywności biologicznej podczas rozwoju i chorób. Podejścia metabolomiczne są szeroko stosowane w badaniach nad rakiem, odżywianiem/dietą, cukrzycą i innymi stanami fizjologicznymi i patologicznymi obejmującymi procesy metaboliczne. Korzystnym narzędziem, które pomaga w profilowaniu metabolomicznym zalecanym w tym artykule, jest obrazowanie metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI MSI). Jego zdolność do wykrywania metabolitów in situ bez znakowania, modyfikacji strukturalnych lub innych specjalistycznych odczynników, takich jak te stosowane w barwieniu immunologicznym, sprawia, że MALDI MSI jest unikalnym narzędziem w rozwijaniu metodologii istotnych w dziedzinie metabolomiki. Odpowiedni proces przygotowania próbki ma kluczowe znaczenie dla uzyskania optymalnych wyników i będzie przedmiotem niniejszego artykułu.

Introduction

Metabolity, produkty pośrednie lub końcowe metabolizmu, w tym nukleotydy, aminokwasy lub kwasy organiczne, lipidy, są kluczowymi składnikami funkcji i procesów biologicznych. Metabolomika, czyli nauka o metabolitach, pozwala na badanie ich interakcji biochemicznych i zrozumienie ich roli w kontekście badań podstawowych, translacyjnych i klinicznych. Metabolity są silnie związane z fenotypami organizmów i dostarczają informacji o aktywności biochemicznej, która zachodzi podczas metabolizmu komórkowego¹. Dlatego, oprócz genomiki i proteomiki, metabolomika stała się ważnym narzędziem w zrozumieniu zarówno stanów fizjologicznych, jak i patologicznych. Na przykład metabolomika jest wykorzystywana do wyjaśniania mechanizmów stojących za istniejącymi lekami, a także ich tolerancji. W opracowywaniu leków metabolizm ksenobiotyków jest przydatny w ocenie aktywności lub toksyczności metabolitów u różnych gatunków, co później przekłada się na wspieranie medycyny spersonalizowanej². Pomimo szerokiego zastosowania metabolomiki, obrazowanie metabolitów może być trudne ze względu na reaktywność chemiczną metabolitów, niejednorodność strukturalną i szeroki zakres stężeń³. Jednak stężenia labilnych metabolitów, w tym związków wysokoenergetycznych, glukozy, mleczanu, glikolitu, szlaku zastawki pentozy i produktów pośrednich cyklu TCA, fosfolipidów, neuroprzekaźników, związków sygnałowych, mogą zmieniać się w ciągu kilku sekund i postępować w ciągu kilku minut, gdy enzymy tkankowe są aktywne podczas procedur pobierania tkanek, takich jak pośmiertne niedokrwienie podczas pobierania mózgu^4,5^,6. Aby zapewnić dokładne pozyskiwanie danych metabolomicznych, kluczowe znaczenie ma odpowiednie i staranne przygotowanie próbki^7,8. Obecnie ugruntowane platformy do pomiaru metabolitów obejmują NMR, testy enzymatyczne i spektrometrię mas (w tym chromatografię cieczową i gazową), z których ostatnia została omówiona poniżej.

MALDI-MSI to najnowocześniejsza technika, która pozwala na analizę złożonych próbek poprzez wykrywanie pojedynczych gatunków molekularnych. MALDI MSI zapewnia możliwość szybkiego i powtarzalnego pomiaru różnych związków molekularnych w próbkach biologicznych. Obrazowanie metodą spektrometrii mas pozwala ponadto na tworzenie obrazów, które reprezentują biologię tkanki w oparciu o jej złożone metabolity, przy jednoczesnym zachowaniu przestrzennego rozkładu metabolitów w próbce⁹. Zdolność MALDI do wykrywania analitów w próbce bez użycia znakowania przeciwciałami, modyfikacji strukturalnych lub innych specjalistycznych odczynników, takich jak te stosowane w barwieniu immunologicznym, w połączeniu ze zdolnością do monitorowania setek cząsteczek w jednym eksperymencie to tylko niektóre z zalet, jakie daje obrazowanie MS, jeśli chodzi o profilowanie metaboliczne^{10, 11}. Oprócz powszechnie stosowanych matryc, takich jak kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB) i 9-aminoakrydyna (9-AA), niedawno odkryta nowa matryca Dichlorowodorek N-(1-naftylo)etylenodiaminy (NEDC), która doskonale nadaje się do analiz różnych metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej, jeszcze bardziej poprawiła zastosowanie MALDI MSI w profilowaniu metabolicznym¹².

Pomimo szerokiego zastosowania MALDI MSI, wysoki koszt instrumentu i złożoność procedury eksperymentalnej uniemożliwiają jego szersze zastosowanie w poszczególnych laboratoriach badawczych. W związku z tym większość badań MALDI MSI jest wspierana przez wspólne ośrodki podstawowe. Przygotowanie próbki, w tym przygotowanie preparatu i powlekanie matrycy, jest najbardziej krytycznym etapem w MALDI MSI. Jednak przygotowanie preparatów jest zwykle przeprowadzane w laboratorium indywidualnego badacza, co stwarza potencjalne różnice w późniejszym przejęciu MALDI MSI. W tym miejscu staramy się przedstawić szczegółowy protokół przygotowania próbek biologicznych przed przystąpieniem do pomiarów MALDI MSI i użyć jako przykładu profilowania metabolomicznego rozwojowego mózgu myszy.

Protocol

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) City University of New York (CUNY) (ASRC).

1. Zbierz tkankę

1. Przygotuj aluminiową łódź. Przygotuj prostokąt aluminiowy o wymiarach 10 cm x 20 cm, złóż na środku, aby uzyskać 10 cm dwuwarstwowy kwadrat. Oznacz przykładowe informacje po jednej stronie i złóż drugą stronę, aby utworzyć łódź o dolnej powierzchni około 4 cm x 4 cm.
2. Wstępnie schłodzić łódź na ciekłym azocie (LN₂) w pudełku styropianowym.
   UWAGA: Jeśli łódź jest zbyt mała, próbka może wypaść z łodzi i zamarznąć poprzez bezpośredni kontakt z LN₂, co może spowodować fragmentację podczas kriosekcji.
3. Poddaj zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi IACUC, natychmiast wypreparuj tkankę, która jest przedmiotem zainteresowania.
   1. Utrzymuj jak najkrótszy odstęp między znieczuleniem zwierzęcym a szybkim zamrażaniem, aby zminimalizować zmiany metabolitów podczas pobierania tkanek, zwłaszcza metabolitów wargowych w mózgu z powodu pośmiertnego niedokrwienia.
      UWAGA: Perfuzja zwierzęcia solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) wydłuży czas trwania niedokrwienia, dodatkowo zmieniając stężenia labilnych metabolitów i wyolbrzymiając fałszywe wyniki. W związku z tym nie zaleca się perfuzji lub przemywania tkanki PBS, chyba że zanieczyszczenie krwi lub płynów ustrojowych jest bardziej niepokojące niż degradacja metabolitów lub wymywanie dla indywidualnego projektu.
4. Natychmiast umieść tkankę w aluminiowej łodzi unoszącej się na ciekłym azocie, zamknij pokrywę styropianowego pudełka i zamroź na 2-10 minut w zależności od wielkości tkanki: 2 min, 5 minut, 7 minut dla 1. dnia po urodzeniu (P1), odpowiednio P21, P60 mózgu myszy i 10 minut dla mózgu szczura P60.
   UWAGA: Nie zamrażaj tkanki przez dłuższy czas (np. 5 minut w przypadku mózgu myszy P1), ponieważ nadmiernie zamrożone może prowadzić do fragmentacji tkanki podczas kriosekcji.
5. Wyjmij łódkę za pomocą kleszczy, złóż folię, aby owinąć chusteczkę, przetransportuj na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze -80 °C do późniejszego użycia. Jeśli następuje natychmiastowe cięcie, przenieść próbki na suchym lodzie do kriostatu.
   UWAGA: Aby lepiej zachować metabolity, zaleca się przechowywanie próbki w nienaruszonej tkance i cięcie jej na sekcje tuż przed przystąpieniem do obrazowania MALDI. Tkanka może być przechowywana w temperaturze -80 °C do 24 miesięcy.

2. Kriosekcja tkanki

UWAGA: Proszę nosić rękawice przez cały czas pracy ze szkiełkami z tlenku indu (ITO). Unikaj bezpośredniego oddychania na szkiełko lub noś maski (opcjonalnie), aby zapobiec zanieczyszczeniu ludzkiej śliny na wycinku tkanki.

1. Przed cięciem tkanki należy zebrać żądaną liczbę szkiełek szklanych z powłoką ITO kompatybilnych z MALDI.
2. Przetestuj przewodność szkiełka za pomocą woltomierza ustawionego na rezystancję. Oznacz stronę, po której odczytywany jest pomiar rezystancji: będzie to strona, do której przylegają odcinki tkanki. Zawsze umieszczaj szkiełko na czystym ręczniku papierowym, aby uniknąć zanieczyszczenia.
3. Wstępnie schłodzić szkiełka w kriosacie ustawionym na -20 °C.
4. Jeśli próbki tkanek zostały pobrane z temperatury -80 °C, pozwól tkance zrównoważyć się w komorze kriostatu przez około 45-60 minut, w zależności od wielkości tkanki. Jeśli próbki są wyjmowane z suchego lodu, należy je równoważyć przez około 30 minut.
5. Dokładnie wyczyść kriostat 70% etanolem. Wstępnie schłodź wszystkie niezbędne narzędzia, w tym pędzel artystyczny z cienką końcówką i kleszcze w komorze kriostatu.
6. Ustaw temperaturę komory kriostatu i głowicy próbki zgodnie z typem tkanki: -14 °C dla wątroby, -20 °C dla mięśni i -25 °C dla skóry⁹.
7. Zamontuj tkankę do uchwytu za pomocą związku do zatapiania tkanek kriogenicznych OCT, unikając OCT z obszaru zainteresowania.
8. Umieść czyste ostrze w stage i zablokuj. Dostosuj położenie stolika i kąt próbki, aby uzyskać żądany kąt cięcia.
   UWAGA: Jeśli mają zostać przecięte różne typy/genotypy tkanek, należy zmienić położenie próbki tak, aby użyć czystej części ostrza lub zmienić ostrze na nowe przed cięciem następnej próbki, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
9. Kontynuuj cięcie, aż zostanie znaleziony obszar zainteresowania (np. ciało modzelowate w mózgu). Pamiętaj, aby utrzymać scenę w czystości, usuwając dodatkowe kawałki pędzlem artystycznym, który został zrównoważony w kriostacie.
10. Po ujawnieniu żądanego obszaru wytnij mniejsze odcinki o grubości 10-12 μm. Jeśli sekcja ma tendencję do łatwego łuszczenia się lub rozpadania, podnieś temperaturę kriostatu, pozostając w zakresie od -22 °C do -11 °C. Odkryliśmy, że optymalna temperatura cięcia dla tkanki mózgowej wynosi od -15 °C do -18 °C.
11. Po wycięciu dobrego odcinka przyklej go do szkiełka ITO (działaj w komorze kriostatu).
12. Przenieś jeden fragment tkanki na szkiełka ITO za pomocą końcówki pędzla artystycznego.
13. Ogrzej sekcję palcem, umieszczając palec pod suwakiem, aby rozgrzać sekcję i zapewnić bezpieczne mocowanie. Wycinek tkanki najpierw zmieni się w przezroczysty w ciągu 5-10 s, a następnie stanie się nieprzezroczysty w ciągu około 30-60 s.
14. Ostrożnie odłóż szkiełko na bok w kriostacie.
15. Powtórz te czynności dla innych próbek tkanek, upewniając się, że każda sekcja tkanki jest równomiernie umieszczona na szkiełku podstawowym i jest jak najbardziej wyrównana.
16. Ponieważ cel MALDI może pomieścić do dwóch szkiełek, umieść sekcje z wielu próbek z tej samej kohorty na jednym szkiełku lub na dwóch szkiełkach, aby zapewnić ich analizę w tym samym czasie.
17. Po zakończeniu umieść szkiełka ITO w pojemniku próżniowym i przenieś do eksykatora ze środkiem osuszającym. Suszyć próżniowo szkiełko przez 45-60 min.
    UWAGA: Jeśli eksykator próżniowy nie jest dostępny w laboratorium, należy cały czas utrzymywać szkiełka w temperaturze poniżej -20 °C, aby uniknąć pogorszenia jakości metabolitów.
18. Przechowywanie i wysyłka szkiełek: o ile próbka nie jest przygotowywana przez podstawowe urządzenia do obrazowania MALDI w celu bezpośredniego przejścia do obrazowania MALDI, należy przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C lub wysyłać do głównych obiektów lub innych laboratoriów badawczych MALDI na suchym lodzie.
19. Aby jak najlepiej zachować próbki, umieścić szkiełka w transporterze szkiełek, napełnić je azotem (opcjonalnie), uszczelnić parafolią, umieścić w woreczku strunowym, który następnie umieszcza się w innym woreczku strunowym zawierającym środek osuszający. Oznacz zewnętrzną torbę z zamkiem błyskawicznym.
20. Przechowywać w temperaturze -80 °C (do 6 miesięcy) lub transportować z odpowiednią ilością suchego lodu.

3. Przygotowanie matrycy

1. Przygotuj matrix.
   UWAGA: Wszystkie odczynniki muszą być klasy HPLC.
   1. Przygotować NEDC w stężeniu 10 mg/ml. Przygotować 10 ml matrycy rozpuszczonej w rozpuszczalniku zawierającym 70% metanol (100 mg NEDC, 7 ml metanolu, 3 ml_H2O).
   2. Dodatkowo przygotuj dodatkowe 10 ml 70% roztworu metanolowo-wodnego, aby przepłukać system opryskiwacza przed napełnieniem matrycy.
2. Po odwodnieniu szkiełek w kroku 2.17 umieść znaki "X" w pustym miejscu szkiełka podstawowego na zewnątrz sekcji tkanek za pomocą pogrubionego srebrnego markera, a następnie umieść drugi znak "x" z czarnym markerem z drobnym punktem na srebrnym "X". "X" z ostrym kontrastem na srebrnym tle (pogrubiony srebrny "X") posłuży później jako znacznik powierniczy dla późniejszej akwizycji widm masowych w instrumencie MALDI.
3. Załaduj suwak do metalowej tarczy prowadnicy MALDI. Użyj plastikowej osłony i narysuj/obrysuj miejsce, w którym znajdują się próbki na plastikowej osłonie. Uchylenie.
4. Zeskanuj obraz slajdu wraz z obiektem MALDI za pomocą skanera płaskiego. na powierzchni tarczy posłużą jako przekładka, aby zapobiec uszkodzeniu lub zanieczyszczeniu wycinka tkanki przez skaner. Wyświetl podgląd i zeskanuj wybrany obszar slajdu w 16-bitowej skali szarości i rozdzielczości 2400 dpi. Zapisz obraz do późniejszego wykorzystania w MALDI MSI.

4. Osadzanie matrycy

UWAGA: Istnieje wiele metod nakładania równej warstwy matrycy o drobnym rozmiarze kryształu na szkiełko MALDI, w tym sublimacja, druk atramentowy kropelkowy, automatyczne rozpylacz matrycy i ręczne natryskiwanie za pomocą artysty airbush⁹. W tym protokole użyjemy automatycznego opryskiwacza matrycowego jako przykładu ze względu na jego wysoką powtarzalność.

1. Uruchomienie: Włącz opryskiwacz matrycowy, upewniając się, że zawór jest ustawiony w pozycji LOAD i uruchom oprogramowanie opryskiwacza. Sprawdź, czy wentylator wyciągowy działa prawidłowo. Nie uruchamiaj pompy rozpuszczalnika, jeśli aktywne odpowietrzanie nie działa prawidłowo.
2. Upewnij się na karcie Komunikacja, że wszystko się komunikuje, a następnie uruchom pompę rozpuszczalnika z prędkością 0,1 ml/min, przy przeciwciśnieniu ~500 psi (lub 3,4 MPa).
3. Rozpocznij przepływ sprężonego powietrza do opryskiwacza matrycowego, ustawiając zbiornik azotu na 30 psi. Następnie wyreguluj regulator ciśnienia z przodu opryskiwacza na 10 psi i ustaw temperaturę dyszy opryskiwacza zgodnie z potrzebami.
   UWAGA: Jeśli ciśnienie powietrza w modlitwie jest niższe niż 5 psi, dysza opryskiwacza nie będzie w stanie nagrzać się w celu ochrony.
4. Gdy zawór jest nadal w pozycji LOAD, użyj strzykawki, aby przepłukać pętlę 7 ml 70% metanolu, a następnie napełnij pętlę 6 ml matrycy.
5. Umieść szkiełka tkanek w uchwytach w opryskiwaczu, przyklejając oba końce, aby zapobiec przesuwaniu się i zachować krawędź wolną od matrycy, aby uniknąć zanieczyszczenia metalowego zacisku na tarczy MALDI przez matrycę.
   UWAGA: Zdecydowanie zaleca się przetestowanie sprayu matrycowego na pustym szkiełku mikroskopowym przed przystąpieniem do cennych szkiełek podstawowych.
6. Sprawdź, czy natężenie przepływu i temperatura są stabilne, aby rozpocząć natryskiwanie.
7. Wybierz żądaną metodę wstępnie przetestowaną przy użyciu pustego szkiełka podstawowego.
8. Naciśnij przycisk Start. Spowoduje to ustawienie temperatury dyszy i dostosowanie natężenia przepływu pompy do wybranej metody. Przełącz zawór z pozycji Obciążenie na pozycję Natryskiwanie, a następnie potwierdź, klikając Kontynuuj.
9. Pozwól systemowi działać, co zajmie 5-20 minut na slajd w zależności od metody. Przełącz zawór z pozycji natrysku na pozycję obciążenia, a następnie potwierdź, klikając przycisk Kontynuuj po zakończeniu.
10. Wyjmij szkiełko (szkiełka) z opryskiwacza, zbadaj wzór powłoki matrycy pod mikroskopem, aby zapewnić równą warstwę drobnego kryształu matrycy.
11. Po osadzeniu matrycy umieść szkiełko (szkiełka) w metalowym uchwycie MALDI do natychmiastowego użycia. Jeśli jest tylko jeden szkiełko z próbką, dodaj kolejne puste szkiełko, aby wypełnić dwa miejsca w uchwycie MALDI.
12. Wyczyść system natychmiast po użyciu zgodnie z instrukcjami producenta, aby zapobiec zatkaniu dyszy opryskiwacza.
13. Po pokryciu szkiełka próbki matrycą, należy natychmiast udać się do urządzenia do obrazowania MALDI lub wysłać je z suchym lodem, używając tego samego preparatu z podwójnym zamkiem błyskawicznym, który opisano w kroku 2.19.
    UWAGA: W sytuacjach awaryjnych, takich jak brak możliwości natychmiastowego użycia, powlekane szkiełko należy przechowywać w warunkach próżni lub w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 24 godziny, chociaż podczas przechowywania może dojść do pogorszenia stanu niektórych metabolitów, co nie zostało dokładnie zbadane.

Results

Reprezentatywny eksperyment został przeprowadzony zgodnie z przepływem pracy pokazanym w Rysunek 1. Rozwojowe mózgi myszy typu dzikiego C57BL w 1, 21, 60 dniu po urodzeniu (dorosłe) zostały zebrane zgodnie z powyższymi wytycznymi CUNY IACUC i zamrożone odpowiednio na 2, 5 i 7 minut na aluminiowej łodzi unoszącej się na ciekłym azocie. Zamrożone tkanki poddano kriosekcji na odcinkach o grubości 10 μm w temperaturze -15 °C ustawionych zarówno dla główki próbki, jak i komory. Kriosekcje tkankowe zostały następnie delikatnie przeniesione na wstępnie schłodzoną, przewodzącą stronę szkiełek szklanych pokrytych ITO do obrazowania MALDI. Zamontowane kriosekcje na szkiełkach ITO suszono w próżni przez 45 minut w temperaturze pokojowej, a następnie osadzano matrycę za pomocą automatycznego opryskiwacza matrycowego. Do wykrycia metabolitów użyto matrycowego NEDC, a roztwór matrycy o stężeniu 10 mg/ml w metanolu/wodzie (70/30, v/v) zdeponowano przy natężeniu przepływu 0,1 ml/min i temperaturze dyszy 75 °C przez 12 cykli z 5 s suszenia między każdym cyklem. Zastosowano prędkość oprysku 1300 mm/min, rozstaw ścieżek 2 mm, ciśnienie gazu N₂ 10 psi i natężenie przepływu 3 l/min oraz wysokość dyszy 40 mm.

widma masowe MALDI zostały pozyskane w trybie jonów ujemnych za pomocą instrumentu MALDI time of flight (TOF) MSI. 0,5-1 μL emulsji czerwonego fosforu (klastry Pn z n = 1 - 90) w metanolu zostało osadzone na szkiełkach ITO, obok zamontowanych tkanek, i użyte do kalibracji przyrządu w zakresie mas 100 - 1000 m/z poprzez zastosowanie kwadratowej krzywej kalibracyjnej¹³. Średnice plamki lasera zostały zogniskowane do "średniego" modulowanego profilu wiązki dla szerokości rastrowej 50 μm. Widma w zakresie mas od m/z 50 do 1000 zostały pozyskane z częstotliwością 1000 Hz dla 500 strzałów. Zarejestrowano dane dotyczące widm masy, a obrazowanie poddano dalszej analizie za pomocą zaawansowanego oprogramowania do analizy danych MALDI MSI. Obrazy jonów zostały wygenerowane z normalizacją średniej kwadratowej (RMS) przy szerokości przedziału ±0,25 Da.

Wyniki w Rysunek 2 pokazuje obrazy wyjściowe z oprogramowania do analizy danych MALDI MSI widm m/z wybranych z każdego przedziału 100 daltonów, wyraźnie obrazując użyteczność do identyfikacji widm od drobnocząsteczkowych metabolitów do lipidów o wysokiej masie cząsteczkowej. Każdy wiersz przedstawia odpowiednie mapy cieplne jonów zawierające zarówno informacje przestrzenne, jak i spektralne o określonych gatunkach metabolitów w trzech tkankach pobranych w 1., 21. i 60. dniu po urodzeniu. Dla każdego przedstawiciela m/z można zastosować analizę regionalnego rozmieszczenia i obfitości jonów w celu porównania względnych ilości odpowiednich gatunków w różnym wieku. Mocną stroną metodologii MALDI MSI jest zdolność do rozpoznania specyfiki niektórych gatunków identyfikowanych przez m/z do kamieni milowych rozwoju lub określonych struktur anatomicznych. Zaobserwowano, że niektóre metabolity są wzbogacone w noworodki P1 (m/z 320,1), wzbogacone u dorosłych P60 (m/z 846,5) lub równomiernie rozmieszczone w różnym wieku (m/z 480,3); inne gatunki molekularne są specyficznie wzbogacone w istotę szarą (m/z 117,1; 524,3; 765,1), istotę białą (m/z 673,4; 846,5) lub płyn mózgowo-rdzeniowy / komory (m / z 239,0) (Rysunek 2A). Pokazano również rozkład przestrzenny reprezentatywnych metabolitów, w tym hipoksantyny (m/z 135,0), kwasu N-acetylo-L-asparaginowego (m/z 174,0), kwasu arachidonowego (m/z 303,2) i kilku lipidów, takich jak lizofosfatydyloetanoloamina LPE (18:1) (m/z 478,3), LPE(20:4) (m/z 500,3), LPE (22:6) (m/z 524,3), fosfatydyloetanoloamina PE (44:10) (m/z 838,5), fosfatydyloinozytol PI(38:4) (m/z 885,6) (Rysunek 2B).

Rysunek 1. Przebieg pracy obrazowania spektrometrii mas MALDI- time of flight (TOF). Zamrożona tkanka jest kironionowana w kriostacie i montowana na szkiełku ITO. → Szkiełko z przekrojami tkanek jest pokryte cienką warstwą matrycy za pomocą automatycznego opryskiwacza matrycowego. → Widma masowe zbierane są za pomocą instrumentu MALDI-TOF MSI o rastrze 20-200um. → Dane są analizowane, a obrazy generowane są za pomocą zaawansowanego oprogramowania do analizy danych MALDI MSI. Podziałka: 2 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Reprezentatywny wynik z wybranymi widmami m/z ze spektrometrii mas uzyskany w rozdzielczości bocznej 50 μm. (A) Mapa cieplna przedstawia rozmieszczenie przestrzenne określonych gatunków metabolitów wybranych z każdego przedziału 100 daltonów m/z w trzech kamieniach milowych rozwoju zidentyfikowanych w P1, P21 i P60. (B) Rozkład przestrzenny reprezentatywnych metabolitów w P1, P21 i P60, w tym: hipoksantyny, kwasu N-acetylo-L-asparaginowego, kwasu arachidonowego i różnych form lipidów, takich jak lizofosfatydyloetanoloamina (LPE), fosfatydyloetanoloamina (PE), fosfatydyloinozytol (PI). Podziałka skali, 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

MALDI-Imaging (MALDI-MSI) to bezznacznikowa technika obrazowania, która pozwala naukowcom badać rozmieszczenie różnych biomolekuł i ich modyfikacje w tkance, co stanowi molekularną podstawę patologii. Połączone zastosowanie MALDI-MSI z tradycyjnymi podejściami LC-MS do analizy tkanek zapewnia taką samą głębię molekularną, jak tradycyjne przepływy pracy omicznej, ale zachowuje również relacje przestrzenne tych sygnałów w sieci komórkowej. Przygotowanie próbki jest najbardziej krytycznym etapem w MALDI MSI i odpowiada za różnice w końcowych odczytach badań metabolomicznych przeprowadzonych w różnych laboratoriach⁴. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy, ale praktyczny protokół standaryzacji przygotowania próbek do profilowania metabolomicznego przy użyciu MALDI MSI, w nadziei, że przyniesie to korzyści szerokiej społeczności badawczej w celu wdrożenia MALDI MSI w ich obecnych i przyszłych badaniach, od biologii podstawowej po badania translacyjne.

Należy zawsze pamiętać o wszystkich środkach ostrożności, aby zminimalizować zmiany w profilach molekularnych (zarówno obfitości, jak i rozmieszczeniu przestrzennym) podczas przygotowywania próbek i unikać zanieczyszczenia. Po pierwsze, należy zminimalizować czas między eutanazją zwierząt a pobraniem tkanek, takich jak zamrożenie in situ lub podgrzanie za pomocą utrwalenia mikrofalowego w celu dezaktywacji enzymów w mózgu, aby zmniejszyć podatność na pośmiertne niedokrwienie ^4,5,6. Po drugie, krytyczny jest stan natychmiastowego zamrożenia próbki. Nieodpowiednie zamrożenie spowoduje degradację i utratę metabolitów, natomiast nadmierne zamrożenie doprowadzi do fragmentacji tkanek podczas kriosekcji. Czas zamrażania powinien być zawsze najpierw testowany zgodnie z poprzednimi raportowanymi badaniami, a badanie rozwojowego mózgu myszy przedstawione w tym artykule dostarcza punktów odniesienia dla tkanki mózgowej gryzoni. Po trzecie, wycinanie tkanek biologicznych i przenoszenie ich skrawków na preparaty ITO będzie wymagało odpowiedniej praktyki. Ważne jest, aby pamiętać, że podczas używania pędzla do podnoszenia fragmentu ze sceny, pędzla należy używać delikatnie. Pozwól, aby włosie szczoteczki stykało się tylko z krawędziami sekcji tkanki, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia i fragmentacji sekcji. Spłaszcz sekcję na zjeżdżalni tak bardzo, jak to możliwe, zapobiegnie to zwijaniu się sekcji podczas ogrzewania palcami. Po czwarte, podczas montażu na szkiełku ITO, upewnij się, że cała sekcja jest dobrze przymocowana do szkiełka ITO, ponieważ różne obszary tkanki mogą wymagać różnego czasu rozgrzania palca. Na przykład tkanka guza mózgu wymaga dłuższego czasu nagrzewania niż normalna tkanka mózgowa. Słabe mocowanie może prowadzić do oderwania i fragmentacji tkanki podczas skanowania MALDI-MS. Należy pamiętać, że ogrzewanie palca może umożliwić działanie enzymów i metabolizm, powodując sztuczne zmiany metabolitów. Po piąte, dokładne i równomierne osadzanie matrycy MALDI odgrywa ważną rolę w uzyskiwaniu dokładnych informacji przestrzennych i silnego sygnału MALDI-MS. Zaleca się przetestowanie natryskiwania matrycy na czystym szkiełku podstawowym i obserwację wzoru kryształów pod mikroskopem w celu sprawdzenia prawidłowego pokrycia, przed przystąpieniem do powlekania szkiełka z cenną próbką. I wreszcie, ponieważ pojedynczy badacz wykonuje pobieranie tkanek i przygotowanie preparatów z różną prędkością, idealnie byłoby mieć jedną osobę do przygotowania próbki dla próbki w tej samej kohorcie, aby zminimalizować różnice.

Dostarczony powyżej protokół szczegółowo opisuje standardowe procedury, które mogą być dostosowane do potrzeb poszczególnych eksperymentów. Na przykład żel do kriosekcji OCT, który jest zwykle stosowany w kriosekcji próbki, może być dalej wykorzystywany jako klej montażowy do uchwytu tkankowego (jak w badaniu opisanym powyżej). Wcześniejsze badania wykazały, że składnik polimerowy w OCT powoduje silną supresję jonów¹⁴. Jednak zatopienie próbki może być nieuniknione w przypadkach, gdy tkanka jest zbyt delikatna, aby można ją było przeciąć bez dodatkowego wsparcia w postaci żelu polimerowego. Aby zwalczyć tłumienie sygnału w takich przypadkach, może być konieczne przemycie tkanek poprzez seryjne płukanie w 70% etanolu i 95% etanolu w celu usunięcia pozostałości OCT w celu wykrycia białek lub lipidów, podczas gdy płukanie nie jest zalecane w przypadku wykrywania metabolitów drobnocząsteczkowych⁹.

MALDI MSI zyskuje coraz większe znaczenie zarówno w laboratorium badawczym, jak i w praktyce klinicznej. Na przykład MALDI MSI okazał się ostatnio przydatny w badaniach proteomicznych w celu scharakteryzowania fenotypowego statusu funkcjonalnego organizmu¹⁵ oraz w działaniu jako czynnik identyfikacji mikrobiologicznej i diagnozy późniejszej choroby¹⁶. Chociaż MALDI MSI obsługuje szeroki zakres zastosowań, istnieją pewne ograniczenia związane z poleganiem wyłącznie na tej technice, zwłaszcza jeśli chodzi o rozróżnianie podobnych gatunków lub metabolitów oraz identyfikację konkretnych celów. Kolejnym wyzwaniem jest kwantyfikacja stężenia metabolitów na podstawie sygnałów MALDI MSI. Często zakłada się, że obfitość jonów w widmach MALDI MSI i rozkład przestrzenny (lub względna obfitość) odpowiadających im gatunków molekularnych w wypreparowanych tkankach są dobrze skorelowane. Należy jednak zawsze pamiętać, że związek między intensywnością jonów a ilością odpowiadających im gatunków molekularnych jest skomplikowany przez wiele czynników, w tym między innymi skutki supresji jonów, zmiany w strukturze tkanek i reakcje jonowo-cząsteczkowe¹⁷. Techniki wykorzystujące wzorce wewnętrzne mogą być stosowane do bezwzględnej kwantyfikacji (μmol/g tkanki) w MALDI-MSI¹⁸. Te dwa wyzwania są zwykle rozwiązywane za pomocą połączonego przepływu pracy MALDI MSI z technikami tandemowej chromatografii cieczowej MS (LC-MS / MS), przy czym MALDI-MS pozwala na mapowanie obszaru zainteresowania, który jest następnie poddawany mikroekstrakcji, a LC-MS/MS w celu dostarczenia większej ilości informacji do identyfikacji metabolitu¹⁹.

Metody obrazowania oparte na stwardnieniu rozsianym zostały opracowane w ostatnich latach jako alternatywa dla poprzednich technik obrazowania metabolitów drobnocząsteczkowych. Wraz z postępem i rosnącą popularnością MALDI MSI, oczekuje się, że obrazowanie MALDI stanie się nowym standardowym narzędziem do wizualizacji małych cząsteczek. Szczególnym zainteresowaniem cieszy się obrazowanie małych cząsteczek lipidowych i endogennych (np. neuroprzekaźników i metabolitów) w kontekście biologicznym, a także obrazowanie ksenobiotyków do opracowywania nowych środków farmaceutycznych. Oczekuje się, że te trzy obszary będą miały szybki postęp dzięki zastosowaniu MALDI MSI w najbliższej przyszłości²⁰.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Andwin Naukowy  Tissue-Tek CRYO-OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Pędzel artystyczny MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE	Fisher Scientific	50-111-2302
System Autoflex MALDI-TOF MS	Bruker Daltonics Inc		Przyrząd MALDI-TOF MS
BD  Strzykawka z końcówkami Luer-Lok	Fisher Scientific	14-823-16E
BD  Vacutainer Igły strzykawkowe ogólnego zastosowania	Fisher Scientific	23-021-020
Daltoniki Bruker  SZKIEŁKA SZKLANE MALDI IMAGNG	Fisher Scientific
Drierite, ze wskaźnikiem, 8 mesh, ACROS Organics	Skaner fotograficzny Fisher Scientific	AC219095000
Epson Perfection V600	Amazon	Perfection V600
Fisherbrand  5-miejscowy Folder Pocztowy	Fisher Scientific
Marka rybacka  Cyfrowy multimetr z automatycznym zakresem	Fisher Scientific	01-241-1
FlexImaging v3.0	Bruker Daltonics Inc		Oprogramowanie do analizy obrazowania Bruker MS
Metanol klasy HPLC	Fisher Scientific
Klasa HPLC	Rybak Wodny Naukowy	Opryskiwacz W5-1
HTX M5	HTX Technologies, LLC		Automatyczny podgrzewany opryskiwacz matrycowy
Kimberly-Clark Professional  Kimtech Science Kimwipes Delikatne wycieraczki do zadań	Fisher Scientific	06-666A
MSC  Torba do zamrażania	Ziploc Fisher Scientific	50-111-3769
N-(1-naftylo)dichlorowodorek etylenodiaminy (NEDC)	Millipore Sigma Aldrich	222488
SCiLS Lab (2015b)	SCiLS Lab		Zaawansowane oprogramowanie do analizy danych MALDI MSI
Thermo Scientific  CryoStar NX50 Kriostat	Fisher Thermo Scientific	95-713-0
Thermo Scientific  Przezroczysty eksykator z poliwęglanu o klasycznym designie Nalgene	Fisher Scientific	08-642-7