Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Podsumowanie

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Streszczenie

Badania nad zaburzeniami neurologicznymi koncentrują się przede wszystkim na wpływie neuronów na mechanizmy chorobowe. Ograniczona dostępność modeli zwierzęcych ma poważny wpływ na badanie wpływu poszczególnych typów komórek na choroby. Co więcej, modele zwierzęce zwykle nie odzwierciedlają zmienności mutacji i przebiegu choroby obserwowanej u ludzi. Metody przeprogramowania wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) zrewolucjonizowały badania specyficzne dla pacjentów i stworzyły cenne narzędzia do badania mechanizmów chorobowych. Jednak technologia iPSC ma wady, takie jak czas, zaangażowanie pracy, selektywność klonalna i utrata markerów epigenetycznych. Niedawne modyfikacje tych metod pozwalają na bardziej bezpośrednie generowanie linii komórkowych lub określonych typów komórek, z pominięciem izolacji klonalnej lub pluripotencjalnego stanu komórek macierzystych. Opracowaliśmy metodę szybkiej bezpośredniej konwersji w celu wygenerowania indukowanych neuronalnych komórek progenitorowych (iNPC) z fibroblastów skóry przy użyciu wektorów retrowirusowych w połączeniu z pożywkami neuralizującymi. INPC można różnicować na neurony (iNs), oligodendrocyty (iO) i astrocyty (iAs). Produkcja iAs ułatwia szybkie testowanie leków i mechanizmów chorobowych, ponieważ odróżnienie od iNPC zajmuje tylko 5 dni. Co więcej, iAs są łatwe w obsłudze i są generowane w czystych populacjach w dużych ilościach. Opracowaliśmy wysoce powtarzalny test współhodowli z wykorzystaniem mysich neuronów GFP+ i iAs pochodzących od pacjenta, aby ocenić potencjalne strategie terapeutyczne dla wielu zaburzeń neurologicznych i neurodegeneracyjnych. Co ważne, testy iA są skalowalne do formatu 384-dołkowego, co ułatwia ocenę wielu małych cząsteczek na jednej płytce. Takie podejście pozwala na jednoczesną ocenę terapeutyczną wielu linii komórkowych pacjentów o zróżnicowanym pochodzeniu genetycznym. Łatwa produkcja i przechowywanie iAs oraz możliwość badania przesiewowego wielu związków w jednym teście sprawiają, że metodologia ta może zostać dostosowana do medycyny spersonalizowanej.

Wprowadzenie

Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw chorób jest kluczowe dla chorób neurologicznych, ponieważ pomaga w rozwoju potencjalnych strategii terapeutycznych. Podczas gdy modele zwierzęce były historycznie złotym standardem w badaniach nad chorobami układu nerwowego, bezpośrednie przełożenie potencjalnych terapii na warunki kliniczne często wykazuje ograniczony sukces^1,2,3. Przyczynami braku translacji są brak zmienności tła genetycznego i mutacji u myszy, niepełne przedstawienie fenotypów choroby oraz różnice w wrażliwości na leki lub dawkowaniu u ludzi, które nie są dobrze zobrazowane w wsobnych szczepach myszy. Ponadto w przypadku wielu rzadkich zaburzeń neurologicznych nie są dostępne żadne modele zwierzęce lub jest ich niewiele. Badanie mechanizmów chorobowych bezpośrednio w odpowiednich typach komórek ludzkich może ułatwić badania i usprawnić translację do celów klinicznych. W przypadku zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego pierwotne komórki ludzkie są trudne do pobrania i stanowią bardzo ograniczone źródło, ponieważ biopsje są inwazyjne lub można je pobrać dopiero po sekcji zwłok w końcowej fazie choroby. W ciągu ostatnich 15 lat rozwój technologii przeprogramowania komórkowego gwałtownie rozszerzył możliwości modelowania ludzkich chorób neurologicznych i neurodegeneracyjnych in vitro.

Tradycyjne metody przeprogramowania komórek polegają na przeprogramowaniu fibroblastów lub innych typów komórek na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) zdolne do różnicowania się na typy komórek ze wszystkich trzech listków zarodkowych⁴. Takahashi i Yamanaka jako pierwsi wykazali, że ponowna ekspresja czterech czynników transkrypcyjnych komórek macierzystych jest wystarczająca, aby przekierować komórki somatyczne do iPSCs⁵. Komórki iPS można następnie dalej różnicować w określone typy komórek. Jednak wadą tego procesu jest to, że generowanie i izolowanie stabilnych klonów komórek macierzystych jest pracochłonne i czasochłonne. Mutacje somatyczne lub specyficzne nieprawidłowości komórki macierzystej są również utrzymywane w klonie komórki macierzystej i mogą mieć wpływ na wyniki badania⁶. Ponadto coraz więcej dowodów sugeruje, że proces przeprogramowania komórek macierzystych usuwa cenne zmiany epigenetyczne, które mogą wpływać na mechanizmy chorób komórkowych^4,7,8. W ostatnich latach naukowcy skupili się na zmodyfikowanych metodach przeprogramowywania, które pozwalają na bardziej bezpośrednie generowanie różnych typów komórek przy jednoczesnym ominięciu stanu pluripotencjalnych komórek macierzystych^9,10,11,12 (recenzja w ^13,14). Początkowe przełomy ujawniły in vitro kombinatoryczne przeprogramowanie fibroblastów na kardiomiocyty¹⁵, neurons¹⁶ i hepatocytes¹⁷ poprzez ektopową ekspresję wielu czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii lub mikroRNAs¹⁸. Następnie przeprowadzono badania bezpośrednio przeprogramowujące komórki w celu modelowania zaburzeń neurologicznych^19,20. Jak wspomniano powyżej, takie protokoły bezpośredniego przeprogramowania lub konwersji mają potencjalne zalety w porównaniu z klasycznymi protokołami iPSC, w tym szybkość i ablację etapu izolacji klonalnej. Co więcej, dowody sugerują, że protokoły te pozwalają na utrzymanie większej ilości informacji epigenetycznych związanych z wiekiem pacjenta i prawdopodobnie to samo dotyczy markerów istotnych dla choroby^7,8.

Do tej pory, większość badań in vitro nad zaburzeniami neurologicznymi koncentrowała się głównie na neuronach. Jednak dobrze wiadomo, że inne typy komórek, takie jak astrocyty, mikroglej i oligodendrocyty, odgrywają kluczową rolę w patologii choroby i progresji zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD), stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroba Parkinsona (PD), choroba Huntingtona (HD), stwardnienie rozsiane (SM) i inne patologie neurologiczne, takie jak zespół Retta (RTT), zaburzenia snu, uzależnienie, epilepsja, lizosomalne zaburzenia spichrzeniowe, depresja, migrena i patologiczny ból^{21,22,23,24,25,26}. Astrocyty są najliczniejszym typem komórek w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i do niedawna były szeroko zaniedbywane z patologicznego punktu widzenia⁷. Obecnie wiadomo, że odgrywają one kluczową rolę we wspieraniu prawie wszystkich funkcji homeostatycznych zdrowego OUN. Dodatkowo oczywiste jest, że mają one istotny wpływ patologiczny i są bardzo cenne w zrozumieniu mechanizmu choroby i ocenie strategii terapeutycznych¹⁹.

W obecnym opisie szczegółowo opisujemy protokół bezpośredniej konwersji ludzkich fibroblastów pacjenta w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC) za pomocą wektorów retrowirusowych wyrażających czynniki przeprogramowania Yamanaka (Klf4, Oct3/4, Sox2 i c-Myc) oraz późniejszej ekspozycji na media neuralizujące. Poprzednie badania wykorzystywały różne kombinacje czynników transkrypcyjnych do bezpośredniego przeprogramowania komórek nerwowych (recenzowane w ¹⁴), ale czynniki użyte w opisanym protokole są szeroko dostępne albo jako plazmidy do własnej produkcji wektorów wirusowych, albo jako komercyjnie dostępne gotowe do użycia zestawy do przeprogramowania wirusów. Powstałe w ten sposób iNPC mogą być dalej różnicowane na indukowane neurony (iNs)²⁷, oligodendrocyty (iOs)²⁴ i astrocyty (iAS)¹⁹ w celu zbadania ich roli w chorobach neurologicznych. Nasz protokół nie wymaga czasochłonnego generowania iPSC, które większość dostępnych protokołów wykorzystuje do wyprowadzania ludzkich astrocytów²⁸. Około 98% do 100% bezpośrednio przeprogramowanych iNPC może różnicować się w astrocyty GFAP-dodatnie²⁹ w porównaniu do zaledwie 2% przy użyciu metody bezpośredniej konwersji z fibroblastów do astrocytów³⁰. Niedawne porównawcze badanie transkryptomiczne z wykorzystaniem opisanej przez nas metody przeprogramowania wykazało, że iNPC przeprogramowane z fibroblastów dawcy mogą zachować cechy starzenia na poziomie transkrypcyjnym i funkcjonalnym, podobnie jak astrocyty pośmiertne i astrocyty pierwotne o dopasowanym wieku²⁹. W związku z tym ten protokół konwersji jest potężnym narzędziem do badania mechanizmów chorobowych i oceny nowych podejść terapeutycznych w zaburzeniach neurodegeneracyjnych i neurologicznych związanych z wiekiem.

Tutaj opisujemy protokół używany do generowania iNPC i dalszego różnicowania na iAs, które są najbardziej odpowiednie do wielkoskalowych testów przesiewowych na małych molekularach. Mechanizmy chorobowe i testowanie leków za pomocą iAs można przeprowadzić przy użyciu różnych metodologii, takich jak współhodowle z neuronami lub analiza metaboliczna i biochemiczna. Zaletą tego systemu jest szybkość i łatwość utrzymania tych linii komórkowych w porównaniu z iPSC. Co więcej, iNPC mogą być zamrażane w małych porcjach w celu rozróżnienia iAs, co ułatwia testowanie narkotyków w stałych warunkach przez dłuższy czas. Ogólnie rzecz biorąc, w ten sposób możliwe staje się porównanie większej liczby próbek, co otwiera drzwi do oceny potencjału terapeutycznego związków w większej i bardziej reprezentatywnej populacji pacjentów.

Protokół

media	Odczynnik	Ilość do wymieszania	Stężenie końcowe (%)
Podłoża fibroblastów	DMEM, wysoka zawartość glukozy, GlutaMAX	500 ml	Rozdział 89
	Surowica bydlęca płodu	50 ml	10
	Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy	5 ml	1
Nośnik podstawowy	DMEM/F12 + Glutamax	500 ml	97 Rozdział 97
	N-2	5 ml	1
	B-27	5 ml	1
	Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy	5 ml	1
Media konwersji	Nośnik bazowy	50 ml	99,9
	Współczynnik FGF	1 μL	0,02 (20 ng/ml)
	EFG (EFG	1 μL	0,02 (20 ng/ml)
	heparyna	50 μL	0,1 (5 μg/ml)
Nośniki komórek progenitorowych (NPC)	DMEM/F12 + Glutamax	500 ml	96,9
	N-2	5 ml	1
	B-27	5 ml	1
	Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy	5 ml	1
	Współczynnik FGF	10 μl	0,002
Pożywka astrocytowa	DMEM, wysoka zawartość glukozy, GlutaMAX	500 ml	Rozdział 89
	Surowica bydlęca płodu	50 ml	10
	Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy	5 ml	1
	N-2	1 ml	0,2
Media muszą zostać przefiltrowane po zmieszaniu wszystkich składników. Podłoża konwersyjne (z czynnikami) muszą być przygotowywane świeże co tydzień.

pkt. ) pkt. pkt. pkt.

Tabela 1. Receptury pożywek dla wszystkich typów komórek zawartych w protokole. Media należy przefiltrować po zmieszaniu wszystkich składników za pomocą sterylnego systemu filtracji próżniowej dla dużych objętości lub filtrów strzykawkowych i strzykawkowych 0,2 μm. Podłoża konwersyjne (z czynnikami) muszą być przygotowywane świeże co tydzień.

1. Bezpośrednia konwersja dorosłych ludzkich fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych

UWAGA: Schematyczny harmonogram tego protokołu można przejrzeć w Meyer (2014)¹⁹.

1. Używaj pierwotnych fibroblastów ludzkiej skóry, które można uzyskać z banków komórek lub biopsji skóry³¹. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5%_CO2. Komórki pasażowe przez co najmniej 1-2 pasaże po rozmrożeniu przed użyciem w eksperymencie. Gdy komórki będą gotowe, pokryj studzienkę 6-dołkowej płytki ludzką fibronektyną (1:200 rozcieńczoną w PBS) w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut.
2. Gdy komórki są gotowe do powlekania, wyjmij fibronektynę z naczynia i natychmiast dodaj roztwór komórek lub 2 ml pożywki z fibroblastów (Tabela 1) - nie pozwól, aby naczynie wyschło przed dodaniem pożywki. W zależności od tego, jak szybko rosną komórki, umieść 150 000 (szybko rosnących) - 200 000 (wolno rosnących) fibroblastów w dwóch dołkach ludzkiej płytki 6-dołkowej pokrytej fibronektyną każdy.
   UWAGA: Komórki powinny być w około 70% zlewające się do transdukcji wirusa, aby móc utrzymać je na tej samej płytce przez kilka kolejnych dni po transdukcji. Korzystne może być wysiewanie nasion o dwóch różnych gęstościach, aby następnego dnia mieć wybór do konwersji.
3. Dzień po wysiewie sprawdź fibroblasty pod mikroskopem i sprawdź gęstość komórek (między 70-85%), a równomierny siew w całej studni, aby uzyskać optymalne wyniki.
4. Transdukuj jeden dołek ze wszystkimi czterema wektorami retrowirusowymi (Oct3/4, Klf4, Sox2 i c-Myc) - użyj wielokrotności infekcji (MOI) 10 dla szybko rosnących lub 15 dla wolno rosnących fibroblastów (wydajność transdukcji powinna przekraczać 70% lub więcej komórek dodatnich dla każdego wektora). Dodać zwykłą pożywkę fibroblastową do mieszanki wirusowej o łącznej objętości 1 ml na studzienkę i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5% CO_{2 .} Pozostawić drugi studzienek nieleczony i wstawić komórki z powrotem do inkubatora do hodowli tkankowych.
   UWAGA: Wektory retrowirusowe można zakupić u dostawcy lub wyprodukować we własnym zakresie, protokoły są dostępne online³².
5. Następnego dnia po transdukcji przemyj komórki 1x PBS i dodaj 1 ml świeżej pożywki fibroblastowej.
6. Następnego dnia zmień medium na medium konwersji. Umyj komórki 1x PBS, aby pozbyć się pozostałej pożywki fibroblastowej, a następnie dodaj 1 ml pożywki konwersyjnej. Zmień również pożywki dobrze leczone na pożywki konwersyjne.
   UWAGA: Niektóre zmiany morfologiczne można zaobserwować nawet poprzez zmianę pożywki na fibroblastach, które nie były leczone wektorem retrowirusowym, dlatego posiadanie nieleczonej studni (opcjonalnie) będzie pomocne przy określaniu efektów wektorów wirusowych. Komórki powinny zacząć zmieniać morfologię 2-4 dni po przełączeniu na pożywkę konwersyjną.
7. Obserwuj komórki pod mikroskopem i obserwuj zmiany w morfologii (Ryc. 1). Pożywki komórkowe powinny być wymieniane codziennie przez cały proces konwersji (1-2 ml pożywki konwersyjnej, Tabela 1) oraz do kolejnej hodowli iNPC. Zmień pożywkę, ostrożnie usuwając 70% pożywki ze studzienki, upewniając się, że komórki pozostają pokryte pozostałymi 30% pożywki.
   UWAGA: Pożywkę z czynnikami wzrostu należy spożyć w ciągu 1 tygodnia od przygotowania.
   1. Kontynuuj obserwację komórek i codziennie zmieniaj pożywkę (1-2 ml pożywki konwersyjnej).
   2. Niektóre linie komórkowe zaczynają tworzyć luźne, wypukłe, okrągłe formacje rosnące w kulistych strukturach lub luźnych sferach neuronalnych (Rysunek uzupełniający 1 i ^19,33). Uważaj, aby nie odłączyć tych komórek. Jeśli kulki oderwą się, można je zebrać i ponownie posiać w nowej studzience pokrytej fibronektyną na płytce 6-dołkowej.
      UWAGA: Jeśli zostaną rozprężone samodzielnie, komórki będą miały zmniejszoną różnorodność w porównaniu z początkową płytką i mogą reprezentować wyraźnie inną linię komórkową. Zalecamy połączenie tych komórek z resztą przekonwertowanych komórek w następnej rundzie dzielenia.
8. Po około 5-6 dniach w pożywce konwersyjnej (do 12 dni w przypadku trudnych linii komórkowych) lub gdy komórki staną się bardzo gęste, należy je przepuścić w stosunku 1:2 lub maksymalnie 1:3,
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby komórki utrzymywały wysoką gęstość przez cały proces konwersji.

2. Procedura konwersji i podziału iNPC

1. Podgrzej roztwór do oddzielania komórek (np. Accutase) i pokryj odpowiednią liczbę studzienek 6-dołkowej fibronektyną (1:200 w PBS, 1 ml objętości powłoki) przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej. Powłoka fibronektyny może być dłuższa bez negatywnego wpływu, ale należy uważać, aby nie skrócić czasu powlekania.
2. Ostrożnie umyj komórki PBS, nie odrywając żadnych komórek (użyj ścianki studzienki, aby delikatnie nałożyć PBS na komórki). Ostrożnie usunąć PBS za pomocą pipet lub przez aspirację.
3. Dodać 0,5 ml roztworu do oddzielania komórek i inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych. Sprawdź pod mikroskopem, czy większość komórek się odłączyła. Jeśli wszystkie komórki odpadły, dodaj 2 ml świeżej pożywki konwersyjnej i delikatnie pipetuj w górę i w dół 2-3 razy, aby rozdzielić grudki (jeśli to konieczne).
4. Zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml i dodać dodatkowe 3 ml pożywki, aby jeszcze bardziej rozcieńczyć roztwór do oddzielania komórek. Najpierw umyj studzienkę dodatkowym podłożem, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane.
5. Wirować przez 4 minuty przy 200 x g w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Komórki konwertujące lub iNPC są niezwykle wrażliwe na obecność roztworu oddzielającego komórki w pożywce. Bezwzględnie konieczne jest usunięcie pozostałości enzymu przez odwirowanie i wycofanie supernatantu.
6. Usunąć supernatant z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej pożywki. Delikatnie pipetuj w górę i w dół 2-3 razy, aby usunąć grudki komórek. Usuń fibronektynę z powlekanych 6 dołków i natychmiast dodaj 1 ml świeżej pożywki do każdej studzienki (nie pozwól, aby fibronektyna wyschła). Aby uzyskać proporcję podziału 1:2, dodaj 0,5 ml zawiesiny komórek do jednego dołka, a drugi 0,5 ml do drugiego dołka.
   1. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.
7. Rozprowadź komórki, delikatnie potrząsając 6-dołkiem w kierunku północ-południe-wschód-zachód (nie okrężnie) i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych.
8. Następnego dnia obserwuj komórki pod mikroskopem i zmień pożywkę (1-2 ml). Zmieniaj nośniki codziennie, aż komórki będą gotowe do ponownego podziału.
   UWAGA: W tym momencie proliferacja komórek powinna zacząć przyspieszać, a komórki powinny być gotowe do drugiego podziału w ciągu 2-3 dni (4 dni w przypadku bardzo wolno rosnących linii).
   1. Przy tym nowym podziale zasiej jedną studzienkę komórek w pożywce konwersyjnej, a drugą studzienkę w pożywce NPC zawierającej tylko FGF w zwiększonym stężeniu bez EGF / heparyny (Tabela 1).
      UWAGA: Niektóre linie komórkowe osiągają stan stagnacji w pożywkach konwersyjnych po około 10 dniach, a przejście na pożywki NPC może pomóc we wzroście komórek. Ponadto, NPC mają bardziej specyficzny, mniejszy kształt, gdy są uprawiane w NPC media¹⁹. W tym momencie iNPC są gotowe do różnicowania i dalszego użycia.
9. Codziennie zmieniaj pożywki (1-2 ml) iNPC.
   1. Rozbuduj NPC do 10-centymetrowych naczyń, łącząc dwie lub trzy zlewające się studzienki z 6 dołkami. Objętość podłoża dla naczyń o średnicy 10 cm wynosi zwykle 12-15 ml.
   2. Przy następnym podziale należy dalej rozszerzać te komórki do trzech lub czterech 10-centymetrowych szalek (12-15 ml pożywki) dla pokoleń dużej liczby zapasów komórek. Szalki o średnicy 10 cm są zwykle dzielone w stosunku 1:3 lub 1:4 co 3-4 dni, w zależności od tempa proliferacji.

3. Generowanie indukowanych astrocytów z NPC

1. Aby wytworzyć astrocyty ze świeżych iNPC, należy wysiać iNPC (w 10 cm płytkach pokrytych fibronektyną) bezpośrednio w 10 ml pożywki astrocytowej (Tabela 1), tak aby następnego dnia osiągnęły około 10% zbieżności. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5% CO_{2 .}
   UWAGA: Zalecana gęstość wysiewu to zwykle 50 μl respiny komórek 10 cm naczynia NPC, pod warunkiem, że są one rozcieńczone do końcowej objętości w oparciu o ich stosunek podziału (np. 3 ml dla podziału 1:3, 4 ml dla podziału 1:4 itp.).
2. Zmienić pożywkę (10 ml pożywki astrocytowej) iAs trzy dni po posiewie. Utrzymuj różnicowanie komórek przez 5-7 dni.
   UWAGA: Nie tolerują dobrze wielokrotnych pasaży, dlatego lepiej jest tworzyć świeże astrocyty za każdym razem, gdy dzielisz NPC.
3. Aby wysiać do eksperymentów, podziel astrocyty za pomocą trypsyny lub roztworu do odrywania komórek, jak opisano w krokach 2.1-2.7. Zalecane gęstości wysiewu podano w tabeli 2.

szt. szt. szt. szt.

Typ płyty	Astrocyty na studzienkę
384-studniowy	2500
96-dołkowy	10000
24-dołkowy	40000
6-dołkowy	150000

Tabela 2. Zalecana gęstość wysiewu iAs na powierzchnię płytki. Typowa liczba iAs wysiewanych w celu wytworzenia monowarstwy na najpopularniejszych płytkach do hodowli tkankowych.

4. Przygotowanie i rozmrażanie porcji do odróżniania astrocytów od zamrożonych NPC (alternatywa dla kroku 3)

UWAGA: Jako alternatywa dla utrzymywania iNPC w hodowli, astrocyty mogą być również produkowane bezpośrednio z zamrożonego bulionu. Aby to zrobić, iNPC są zamrażane w mniejszych porcjach. Tabela 3 przedstawia sugerowane objętości zamrażania i rozmrażania porcji, które mają być rozmrożone w 10-centymetrowym naczyniu zawierającym 10 ml pożywki Astrocyte.

szt. szt. szt. szt. szt. szt.

Wielkość porcji	Zawiesina komórek (μL)	Środki do zamrażania (μl)	Całkowita objętość (μL)	Rozmraża się do
4x	400	400	800	Dwie 10-centymetrowe szalki
2x	200	200	400	Jedno naczynie 10 cm

Tabela 3. Instrukcje, jak porcjować iNPC w celu wygenerowania iAs. Proporcja zawiesiny iNPC i pożywki do zamrażania w celu wytworzenia porcji. Należy pamiętać, że końcowe stężenie DMSO wynosi 10%, gdy zawiesina komórek jest mieszana z pożywką do zamrażania.

1. Aby zrobić astrocyty z zamrożonych zapasów iNPC, wyjmij fiolkę z porcjami zapasu ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu i szybko rozmroź w temperaturze 37 °C. Jak tylko komórki zostaną rozmrożone, pipetować roztwór komórek w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki astrocytowej.
2. Wirować przez 4 minuty w temperaturze 200 x g i temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml świeżej pożywki dla astrocytów.
3. Dodaj 9 ml świeżej pożywki astrocytowej do 10-centymetrowego naczynia pokrytego fibronektyną i dodaj 1 ml roztworu komórkowego. Delikatnie rozprowadzające komórki w ruchu północ-południe-wschód-zachód. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5%_CO2
.

Wyniki

Ten protokół pozwala na szybkie i łatwe generowanie iNPC bezpośrednio z ludzkich fibroblastów skóry przy użyciu retrowirusów zawierających czynniki Yamanaka. Metoda ta pozwala ominąć stan komórek macierzystych i potrzebę selekcji klonalnej, unikając w ten sposób zmienności klonalnej. Ważnymi krokami, o których należy pamiętać, gdy komórki przechodzą proces konwersji, są gęstość wysiewu fibroblastów, pH pożywki i utrzymywanie komórek w optymalnym zlewie. Przykłady optymalnego podziału, zbiegowiska i zmian morfologicznych podczas procesu konwersji można znaleźć w Rysunek 1.

Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy procesu konwersji po dodaniu retrowirusowej mieszanki czynników Yamanaka. Fibroblasty zostały zasiane i transdukowane dwadzieścia cztery godziny później za pomocą czynników Yamanaka. Dwa dni po wirusie (DPV) media zostały zmienione na nośniki konwersji. Komórki hodowano w pożywkach konwersyjnych, aż były gotowe do przejścia (13 DPV). Komórki wysiewano po pasażu, aby następnego dnia osiągnąć 80% konfluencji (14 DPV). Kolejne pasaże utrzymywały tę gęstość do momentu, gdy neuronalne komórki progenitorowe zaczęły się szybko dzielić. Podziałka wynosi 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po zakończeniu procesu konwersji, NPC będą wykazywać znacznie obniżoną ekspresję lub brak ekspresji markerów fibroblastów i morfologii, a także wyrażać markery komórkowe specyficzne dla NPC (Rysunek 2). Co więcej, mogą być również używane do generowania różnych linii komórkowych, takich jak iNs, iO i iAs.

Rysunek 2. Komórki, które przechodzą proces konwersji, wyrażają markery specyficzne dla komórki. Fibroblasty pacjenta (A), indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC) (B) i indukowane komórki astrocytów (iAs (C) wysiewano na szklanych szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowej płytce poddanej działaniu hodowli tkankowej. Komórki wybarwiono immunologicznie pod kątem: markerów komórkowych specyficznych dla fibroblastów (A), wimentyny (zielony) i TE7 (czerwony), markera komórkowego specyficznego dla iNPC (B), nestyny (czerwonej) i markera komórkowego iAs (C), GFAP (fioletowy) i markera iNPC Nestin (zielony). Podziałka wynosi 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Z naszego doświadczenia, iAs w szczególności są bardzo cenne do testowania leków i mechanizmów chorobowych, ponieważ mogą być generowane w czystych populacjach (98% lub więcej komórek GFAP dodatnich²⁹) przy odtwarzalnych dużych liczbach. iAs można odróżnić od iNPC, pobierając małą porcję komórek podczas podziału lub wcześniej zamrożoną porcję iNPC i bezpośrednio posiewając w pożywce astrocytów. Ważnymi kwestiami podczas tego procesu są utrzymanie początkowej gęstości wysiewu iNPC na niskim poziomie (Rysunek 3 i Rysunek 4), ponieważ wykazano, że wysoka gęstość utrudnia proces różnicowania (Rysunek 4) oraz zwrócenie dodatkowej uwagi na pH pożywki, ponieważ zakwaszenie może aktywować nawet zdrowe astrocyty.

Rysunek 3. Reprezentatywne obrazy procesu generowania iAs z iNPC. iNPC są wysiewane w pożywkach astrocytów (Tabela 1) przy niskiej gęstości wysiewu. Dobra gęstość wysiewu wynosi około 10% w pierwszym dniu po wysiewie (DPS) (po lewej); Jednak gęstość tę można dostosować do tempa wzrostu komórek. Typową morfologię iAs można zaobserwować po 5 DPS (środek). W niektórych przypadkach można zaobserwować nieprawidłową morfologię astrocytów, z długimi, kolczastymi przedłużeniami. Ta zmiana wskazuje na aktywację astrocytów i może być wtórna do stanu chorobowego lub nieprawidłowych technik hodowli (po prawej). Podziałka wynosi 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Gęstość wysiewu iNPC wpływa na efektywność różnicowania iAs. Kontrolne linie iNPC wysiewano przy niskiej (A) i wysokiej (B) gęstości w pożywkach astrocytów, aby wykazać wpływ gęstości wysiewu na różnicowanie. 5 DPS, linia o niskiej gęstości wyrażała markery specyficzne dla astrocytów, podczas gdy linia o dużej gęstości wykazuje mieszaninę markerów iNPC i iAs z wyraźną morfologią podobną do iNPC. Podziałka wynosi 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1. Dodatkowe dane liczbowe przedstawiające proces konwersji po dodaniu retrowirusowej mieszanki czynników Yamanaka. Obrazy procesu konwersji przy 12 DPV (1 dzień przed przejściem) i 19 DPV (6 dni po przejściu). Zwróć uwagę na różnicę w morfologii między komórkami przed i po pasażu, przy 12 komórkach DPV ma morfologię struktury kulistego. Po przejściu i kilku dniach na pożywce konwersyjnej (tabela 1) komórki zaczynają wykazywać morfologię podobną do NPC. Podziałka wynosi 200 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Podsumowując, bezpośrednia konwersja jest szybką i łatwą metodą generowania indukowanych neuronalnych komórek progenitorowych z fibroblastów skóry pacjenta. Ta metoda jest korzystna ze względu na jej szybkość, a także dużą liczbę generowanych komórek, które są łatwe w utrzymaniu. Co więcej, coraz więcej dowodów sugeruje, że metody bezpośredniego przeprogramowania usuwają mniej znaczników epigenetycznych w porównaniu z klasyczną technologią przeprogramowania iPSC, pozostawiając w ten sposób środowisko chorobowe bardziej nienaruszone ^4,7,8. Różnicowanie iNPC do astrocytów jest bardzo proste i wysoce powtarzalne nawet między wieloma niezależnymi laboratoriami 19,29,33. iNPC mogą być zamrażane w małych porcjach i rozmrażane bezpośrednio w celu różnicowania, co pomaga zmniejszyć różnice między eksperymentami, ponieważ liczby pasaży mogą być podobne. Astrocyty odgrywają kluczową rolę w postępie choroby w wielu chorobach neurologicznych i dlatego są interesującym typem komórek do pracy. Astrocyty mogą być wykorzystywane do badań mechanistycznych, metabolicznych lub testów leków i są zwykle hodowane jako monowarstwy. Co więcej, astrocyty można łączyć w systemach kohodowlanych z neuronami myszy lub ludzi, aby ocenić wpływ astrocytów na przeżycie i morfologię neuronów, które są dobrymi odczytami dla testów narkotykowych³⁴.

Aby z powodzeniem korzystać z tego protokołu, należy pamiętać o kilku punktach i potencjalnych ograniczeniach. Na przykład fibroblasty ludzkiej skóry różnią się znacznie pod względem szybkości podziałów komórkowych, a także odpowiedzi na wektory wirusowe. Ponieważ nie są to ustandaryzowane linie komórkowe, są tak zmienne jak sama ludzkość, każda linia jest inna. Podobnie jak w przypadku wielu metod przeprogramowywania, łatwiej jest przeprogramować fibroblasty, które mają umiarkowane lub szybkie tempo podziału komórek, w porównaniu z komórkami, które ledwo się replikują. Na szybkość replikacji może mieć wpływ jakość biopsji skóry i samo przetwarzanie, liczba pasaży fibroblastów, a także obchodzenie się z nimi. Podczas pracy z pierwotnymi fibroblastami skóry ważne jest, aby nie dopuścić do zbytniego zagęszczenia komórek, aby uniknąć indukcji starzenia. Jeśli fibroblasty nie rosną dobrze, najlepiej jest wypróbować nowy zapas lub dolne pasaże, chociaż w niektórych przypadkach sama choroba może również odgrywać rolę. Podział komórek można czasami poprawić, stosując 15% lub 20% FBS w pożywce fibroblastów w porównaniu ze standardowymi 10%.

Jakość przeprogramowania wektorów wirusowych ma duże znaczenie dla sukcesu. W naszych rękach wektory retrowirusowe były bardziej skuteczne w porównaniu z wektorami lentiwirusowymi lub innymi wirusami nieintegrującymi; Może to jednak zależeć od jakości i czystości wektora wirusowego. Komercyjne zestawy wektorów retrowirusowych zwykle określają stężenie wektora wirusowego, a często także wielokrotność infekcji dla określonej linii komórkowej. Ważne jest, aby pamiętać, że pierwotne fibroblasty różnią się od linii komórkowej używanej przez firmy do określania wychwytu wektora wirusowego. Co więcej, nawet przy zamawianiu tego samego zestawu komercyjnego różnice między partiami są powszechne. Co więcej, wychwyt wektorów wirusowych różni się również między liniami komórkowymi fibroblastów. Niektóre linie mogą być bardziej wrażliwe i dlatego transdukowane komórki mogą umrzeć, podczas gdy inne linie komórkowe mogą być bardziej odporne na wychwyt wirusa. W związku z tym określenie wydajności transdukcji dla danej linii komórkowej może być ważne, zwłaszcza jeśli linia komórkowa rośnie powoli lub poprzednie próby konwersji nie powiodły się. W naszych rękach najlepszym sposobem oceny, ile określonego wektora retrowirusowego jest potrzebne do konwersji, jest wykonanie barwienia immunofluorescencyjnego kilkoma rozcieńczeniami wektora wirusowego. Następnie można policzyć liczbę komórek wykazujących ekspresję transgenu dla każdego wektora, mając na celu uzyskanie wydajności transdukcji na poziomie 70% lub wyższym. Z naszego doświadczenia wynika, że podobne MOI mogą być stosowane dla większości linii komórkowych, jednak MOI można dostosować w razie potrzeby.

Podczas procesu konwersji bardzo ważne jest, aby nie dzielić komórek zbyt wcześnie. Czas, w którym komórki są gotowe do podziału, zależy od wielu czynników, w tym pierwotnej linii komórkowej i jej charakterystyki, jakości użytego wektora wirusowego i jakości pożywki. Co ważne, wskaźnik powodzenia konwersji jest znacznie wyższy, gdy komórki są utrzymywane w dużej gęstości. Nawet jeśli komórki zaczną zmieniać morfologię, lepiej jest pozostawić komórki w pierwszej studni dłużej niż je przedwcześnie podzielić. Jeśli podział nastąpi zbyt wcześnie, konwersja może zatrzymać swój postęp i doprowadzić komórki do różnicowania się z powrotem do kształtu i zachowania przypominającego fibroblasty. Co więcej, ich zbyt wczesne rozcieńczenie może skutkować bardziej wydłużonymi ciałami komórkowymi w porównaniu z obserwowanymi wcześniej małymi i zwartymi ciałami komórkowymi NPC. Dlatego pierwsze podziały powinny być zawsze konserwatywne; Lepiej jest utrzymywać komórki zbyt gęste z podziałem 1:1 lub 1:2 niż je zbyt mocno rozcieńczać. Po początkowym podziale spodziewana jest pewna śmierć komórki. Warto zauważyć, że komórki zawsze wyglądają gorzej (bardziej płasko) pierwszego dnia po rozszczepieniu, co jest normalne. Najlepszą ocenę kształtu komórki należy podjąć 2-3 dni później. Co ważne, kluczowa jest również jakość czynników wzrostu i składników pożywki. Ważne jest, aby przygotować niewielkie ilości pożywki zawierającej czynniki wzrostu, tak aby w pełni przygotowane podłoża były używane maksymalnie przez 5-7 dni. Nie przechowuj mediów w temperaturze pokojowej lub 37°C przez dłuższy czas. Używaj szybko i wstaw do lodówki, gdy tylko zostanie wykonana zmiana nośnika. Ponadto utrzymywanie objętości pożywki na niskim poziomie 1 ml zamiast 2 ml może pomóc, szczególnie w przypadku linii komórkowych, które są bardziej odporne na konwersję. Jeśli komórki szybko zużywają pożywkę, co można zaobserwować po zmianie koloru pożywki z czerwonego na żółty (szybkość zakwaszenia), dostosuj objętość pożywki do 2 ml. Szybka konsumpcja mediów jest pozytywnym znakiem i często obserwuje się ją na późniejszych etapach konwersji wraz ze zwiększoną proliferacją.

NPC są również bardzo wrażliwe na obecność akutazy w pożywce i bardzo ważne jest, aby czas inkubacji akutazy był krótki. Zalecamy okres inkubacji wynoszący 2-4 minuty, często sprawdzaj komórki pod mikroskopem, aby zobaczyć, kiedy się odłączyły. Konieczne jest odwirowanie komórek po rozszczepieniu w celu usunięcia mieszaniny enzymów z pożywki. Ważne jest również, aby pamiętać o liczbie pasaży, ponieważ linie komórkowe mogą się zmieniać po przedłużeniu hodowli, co prowadzi do zmiany profili ekspresji. Dlatego ważne jest, aby zamrozić wiele zasobów komórkowych we wczesnych pasażach. Komórki należy zamrozić w 10% pożywkach DMSO i 90% NPC i przechowywać przez długi czas w ciekłym azocie. Ze względu na brak surowicy w tym pożywce bardzo ważne jest, aby zapewnić powolne zamrażanie za pomocą komór zamrażania, a po zamrożeniu przez noc natychmiast przenieść do ciekłego azotu. Chociaż w tym protokole nie przeprowadza się selekcji klonalnej, możliwe jest, że przedłużona hodowla i pasażowanie prowadzi do naturalnej selekcji początkowej populacji komórek o korzystnym wskaźniku wzrostu i przeżycia. Dlatego ważne jest, aby podczas przeprowadzania eksperymentów pamiętać o numerze przejścia i obsłudze. Do eksperymentów wolimy używać dolnych pasaży, jeśli to możliwe, nie przekraczamy pasażowania linii komórkowych więcej niż 20 razy. Ponieważ NPC szybko się rozwijają, duża liczba zapasów może zostać zamrożona w dolnych przejściach w celu przeprowadzenia eksperymentów. Linie komórkowe o szczególnie wysokich wskaźnikach wzrostu są bardziej narażone na zakwaszenie pożywki. W związku z tym, ponieważ linie komórkowe rosną z różną prędkością, może być konieczne dostosowanie ilości pożywki w zależności od proliferacji. Jeśli komórki są stale pozostawione w silnie zakwaszonym podłożu, może to wpływać na zdrowie zarówno kontrolnych, jak i chorobowych linii komórkowych. Powoduje to, że nawet zdrowe astrocyty stają się reaktywne, co wpływa na ich wykorzystanie w dalszym różnicowaniu i eksperymentach.

Dla różnicowania astrocytów ważne jest, aby utrzymywać komórki o niskiej gęstości, ponieważ wysoka gęstość uniemożliwi różnicowanie się komórek i będą się one rozmnażać w szybszym tempie. W związku z tym gęstość wysiewu należy dostosować do każdej linii komórkowej w zależności od tempa ich proliferacji. Zalecamy wypróbowanie różnych gęstości wysiewu i wykonanie barwień/RT-PCR z markerami astrocytów, aby zapewnić prawidłowe różnicowanie. Jakość IAs można oceniać wraz ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej za pomocą testów współhodowlanych z neuronami. Pod warunkiem, że patologia choroby nie prowadzi do reaktywnego fenotypu, neurony powinny pozostać żywotne w kontakcie z iAs przez kilka dni. Morfologia astrocytów może się znacznie różnić między poszczególnymi liniami komórkowymi i może mieć na nią wpływ fenotyp choroby. Co więcej, w chorobach, w których astrocyty są silnie dotknięte, mogą wykazywać reaktywny fenotyp z dużymi, wydłużonymi przedłużeniami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynie w stylu 100 mm x 2 mm, poddane hodowli komórkowej, niepirogenne	Corning	430167	Hodowla tkankowa
15 ml stożkowe probówki wirówkowe z zakrętką, kopolimer polipropylen	USA Scientific	1475-1611	Służy do podnoszenia i wirowania komórek
50 ml stożkowe probówki wirówkowe	USA Scientific	1500-1811	Przygotowanie pożywki
Antybiotyk-Antybiotyk (100X)	Gibco	15240062	Antybiotyk o działaniu przeciwgrzybiczym do preparatu pożywki
B-27  Suplement (50X), bez surowicy	Invitrogen	17504044	Dla NPC i pożywek bazowych
Fiolki kriogeniczne  1.2ML	Corning	CLS430658-500EA	Do zamrażania zapasów komórkowych
DMEM, wysoka glukoza, GlutaMAX  Suplement, pirogronian	Gibco	10569010	Do pożywki z fibroblastami i astrocytami
DMEM/F-12, GlutaMAX  suplement	Gibco	10565042	Dla NPC i podłoża bazowego
DMSO	Sigma	D2438-50ML	Do zamrażania zapasów komórek
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Gibco	14190136	Określany w protokole jako PBS. Do rozcieńczania fibronektyny i mycia komórek
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit	ALSTEM	RF101	Retrovirus zawierający czynniki Yamanaka. Wirus może być również wytwarzany we własnym zakresie.
Surowica bydlęca płodu, certyfikowana	Gibco	16000-036	Określana w protokole jako FBS . Do pożywek fibroblastów i astrocytów
Fisherbrand Sterylne strzykawki do jednorazowego użytku	Fisher	14-955-461	Media filtracyjne (50 ml)
Heparyna sól sodowa z błony śluzowej jelit świń	Sigma	H3149-10KU	Określane w protokole jako heparyna. Używany w mediach konwersji. Proszek rozcieńczony w ultraczystej wodzie. Końcowe stężenie zapasów 5000X
Fibronektyna z ludzkiego osocza Oczyszczone białko	Millipore Sigma	FC010-10MG	Określane w protokole jako Fibronektyna, stosowane w rozcieńczeniu 1:200 do powlekania.
Izopropanol (klasa techniczna)	Fisher Scientific	S25372A	Do zamrażania zapasów komórek
Mr. Frosty	Thermo Fisher	5100-0001	Do zamrażania zapasów komórek
Suplement N-2 (100X)	Gibco	17502048	Dla astrocytów, NPC i pożywek zasadowych
Rekombinowany ludzki EGF Preprotech		AF-100-15	Określany w protokole jako EGF, używany w mediach konwersji. Proszek rozcieńczony w PBS, końcowe stężenie 1 mg / ml, przechowywany w małych zamrożonych podwielokrotnościach
Rekombinowany ludzki FGF-basic	Preprotech	100-18B	Określany w protokole jako FGF, stosowany w NPC i pożywkach konwersyjnych. Proszek rozcieńczony w PBS, końcowe stężenie 1 mg / ml, przechowywany w małych zamrożonych podwielokrotnościach
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco	A1110501	Określany w protokole jako Accutase. Służy do podnoszenia podczas procesu konwersji i NPC.
Stericup Quick Release-GP Sterylny system filtracji próżniowej	Millipore Sigma	S2GPU05RE	Filtracja mediów
Płytka do hodowli tkankowej, 6 dołków, Płaskie dno z pokrywką o niskiej parowaniu	Fisher	08-772-1B	Hodowla tkankowa
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa	Invitrogen	25300062	Lifting fibroblastów i astrocytów
Filtry strzykawkowe Whatman Puradisc 25, 0,2 i mu; m, PES sterylne	Millipore Sigma	80-2502	(50 ml)