Method Article

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/62020

⸱

April 11th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University, 2Institute of Functional Genomics, M.V. Lomonosov Moscow State University, 3National Research Centre "Kurchatov Institute"

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria są niezbędnymi organellami komórek eukariotycznych zdolnymi do oddychania tlenowego. Zawierają kolisty genom i aparat ekspresji genów. Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem białek: trzy podjednostki oksydazy cytochromu c (Cox1p, Cox2p i Cox3p), trzy podjednostki syntazy ATP (Atp6p, Atp8p i Atp9p), podjednostkę enzymu oksydoreduktazy ubichinolu-cytochromu c, cytochromu b (Cytb) i mitochondrialne białko rybosomalne Var1p. Celem opisanej tutaj metody jest specyficzne oznakowanie tych białek 35S metioniną, oddzielenie ich za pomocą elektroforezy i wizualizacja sygnałów jako dyskretnych pasm na ekranie. Procedura składa się z kilku kroków. Po pierwsze, komórki drożdży są hodowane w pożywce zawierającej galaktozę, aż osiągną późny logarytmiczny etap wzrostu. Następnie leczenie cykloheksymidem blokuje translację cytoplazmatyczną i umożliwia włączenie metioniny 35S tylko do mitochondrialnych produktów translacji. Następnie wszystkie białka są ekstrahowane z komórek drożdży i rozdzielane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Na koniec żel jest suszony i inkubowany z sitkiem fosforowym do przechowywania. Ekran jest skanowany na luminowizorze, odsłaniając pasma. Metodę można zastosować do porównania szybkości biosyntezy pojedynczego polipeptydu w mitochondriach zmutowanego szczepu drożdży z typem dzikim, co jest przydatne do badania defektów ekspresji genów mitochondrialnych. Protokół ten dostarcza cennych informacji na temat szybkości translacji wszystkich mitochondrialnych mRNA drożdży. Wymaga to jednak kilku kontroli i dodatkowych eksperymentów, aby wyciągnąć właściwe wnioski.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria to organelle głęboko zaangażowane w metabolizm komórki eukariotycznej. Ich łańcuch transferu elektronów zaopatruje komórkę w ATP, główną walutę energetyczną używaną w wielu szlakach biochemicznych. Poza tym biorą udział w apoptozie, syntezie kwasów tłuszczowych i hemu oraz innych procesach. Dysfunkcja mitochondriów jest dobrze znanym źródłem chorób u ludzi1. Może to wynikać z mutacji w genach jądrowych lub mitochondrialnych kodujących strukturalne lub regulatorowe składniki organelli2. Drożdże piekarskie Saccharomyces cerevisiae są doskonałym organizmem modelowym do badania ekspresji genów mitochond....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie kultur drożdży

  1. Drożdże z zamrożonych kultur wywarowych rozsypać na świeżych talerzach z odpowiednią pożywką. Umieścić płytki w inkubatorze do hodowli w temperaturze 30 °C przez 24–48 godz.
    UWAGA: Pozwól mutantom wrażliwym na temperaturę rosnąć w dopuszczalnej temperaturze.
  2. Zaszczepić kultury drożdży w 2 ml pożywki YPGal (2% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 2% galaktozy) ze świeżej smugi w probówkach o pojemności 15 ml i inkubować je przez noc, mieszając z prędkością 200 obr./min w temperaturze 30 °C.
  3. Zmierzyć gęstość optyczną kultury przy długości fali 600 nm (OD600).
  4. Pobrać objętość odpow....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, przypisaliśmy produkty translacji mitochondrialnej dwóm szczepom S. cerevisiae: dzikiemu typowi (WT) i mutantowi z delecją genu AIM23 (AIM23Δ), kodując czynnik inicjacji translacji mitochondrialnej 3 (Tabela 1)8. Produkty translacji mitochondrialnej znakowano radioaktywnie i rozdzielano w SDS-PAAG9. Próbki były pobierane co 2,5 minuty przed nasyceniem, aby zbudować przebieg czasowy (Rysu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad ekspresją genów odgrywają kluczową rolę we współczesnych naukach przyrodniczych. Opracowano wiele metod zapewniających wgląd w ten złożony proces. W tym artykule opisano metodę pozwalającą na dostęp do biosyntezy białek w mitochondriach drożdży piekarskich S. cerevisiae. Zwykle stosuje się go do porównania wydajności translacji mRNA w mitochondriach zmutowanego szczepu drożdży w porównaniu z typem dzikim, aby uzyskać dostęp do konsekwencji badanej mutacji. Jest to jeden z podstawowych eksperymentów, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania zostały sfinansowane przez Rosyjską Fundację Badań Podstawowych, numer grantu 18-29-07002. P.K. był wspierany przez Państwowy Przydział Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej, numer grantu AAAA-A16-116021660073-5. M.V.P. był wspierany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej, numer grantu 075-15-2019-1659 (Program Centrum Badań Genomu im. Kurczatowa). Prace zostały częściowo wykonane na sprzęcie zakupionym w ramach Programu Rozwoju Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego. I.C., S.L. i M.V.B. otrzymały dodatkowe wsparcie z grantu Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego "Wiodąca Szkoła Naukowa Arka Noego".

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
AkrylamidSigma-AldrichA9099
Nadsiarczan amonuSigma-AldrichA3678
Agar bakteriologicznySigma-AldrichA5306 
Miernik gęstości komórek Biowave CO8000BIOCHROM US BE80-3000-45
MARKOWE standardowe kuwety jednorazoweSigma-AldrichZ330361
chloroformSigma-Aldrich288306 
cykloheksymidSigma-AldrichC1988 
D-(+)-GalaktozaSigma-AldrichG5388 
D-(+)-GlukozaSigma-AldrichG7021 
cyfrowy blokgrzewczy Thermo Scientific88870001
EasyTag L-[35S]-Metionina, 500&mikro; Ci (18.5MBq), Stabilizowany roztwór wodnyPerkin ElmerNEG709A500UC
Wirówka Eppendorf 5425Thermo Scientific13-864-457
GE Ekrany fosforowe do przechowywaniaSigma-AldrichGE29-0171-33
L-metioninaSigma-AldrichM9625 
metanolSigma-Aldrich34860 
N,N,N′,N′-TetrametyloetylenodiaminaSigma-AldrichT9281
N,N′-MetylenobisakryloamidSigma-AldrichM7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker InkubatorNew Brunswick Scientific
Pepton z mięsa, bakteriologicznyMillipore91249 
Fluorek fenylometanosulfonyluSigma-AldrichP7626 
Zestaw do oznaczania białek Pierce 660nmThermo Scientific22662
PowerPac Podstawowy zasilaczBio-Rad1645050
Protean II xi cellBio-Rad1651802
Dichlorowodorek puromycyny ze Streptomyces albonigerSigma-AldrichP8833
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich221465
Imager luminoforowy Storm 865GE Healthcare
Trizma baseSigma-Aldrich93352 
Podgrzewana próżniowo suszarka żelowaCleaver ScientificCSL-GDVH
Ekstrakt drożdżowySigma-AldrichY1625 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
  2. Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
  3. G....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial Gene ExpressionYeast MitochondriaProtein BiosynthesisSaccharomyces CerevisiaeRadioactive LabelingPolyacrylamide GelCycloheximide TreatmentMitochondrial TranslationPhosphorimager AnalysisMitochondrial Proteins

Related Articles