Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Podsumowanie

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Streszczenie

Mitochondria są niezbędnymi organellami komórek eukariotycznych zdolnymi do oddychania tlenowego. Zawierają kolisty genom i aparat ekspresji genów. Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem białek: trzy podjednostki oksydazy cytochromu c (Cox1p, Cox2p i Cox3p), trzy podjednostki syntazy ATP (Atp6p, Atp8p i Atp9p), podjednostkę enzymu oksydoreduktazy ubichinolu-cytochromu c, cytochromu b (Cytb) i mitochondrialne białko rybosomalne Var1p. Celem opisanej tutaj metody jest specyficzne oznakowanie tych białek ³⁵S metioniną, oddzielenie ich za pomocą elektroforezy i wizualizacja sygnałów jako dyskretnych pasm na ekranie. Procedura składa się z kilku kroków. Po pierwsze, komórki drożdży są hodowane w pożywce zawierającej galaktozę, aż osiągną późny logarytmiczny etap wzrostu. Następnie leczenie cykloheksymidem blokuje translację cytoplazmatyczną i umożliwia włączenie ^{metioniny 35}S tylko do mitochondrialnych produktów translacji. Następnie wszystkie białka są ekstrahowane z komórek drożdży i rozdzielane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym. Na koniec żel jest suszony i inkubowany z sitkiem fosforowym do przechowywania. Ekran jest skanowany na luminowizorze, odsłaniając pasma. Metodę można zastosować do porównania szybkości biosyntezy pojedynczego polipeptydu w mitochondriach zmutowanego szczepu drożdży z typem dzikim, co jest przydatne do badania defektów ekspresji genów mitochondrialnych. Protokół ten dostarcza cennych informacji na temat szybkości translacji wszystkich mitochondrialnych mRNA drożdży. Wymaga to jednak kilku kontroli i dodatkowych eksperymentów, aby wyciągnąć właściwe wnioski.

Wprowadzenie

Mitochondria to organelle głęboko zaangażowane w metabolizm komórki eukariotycznej. Ich łańcuch transferu elektronów zaopatruje komórkę w ATP, główną walutę energetyczną używaną w wielu szlakach biochemicznych. Poza tym biorą udział w apoptozie, syntezie kwasów tłuszczowych i hemu oraz innych procesach. Dysfunkcja mitochondriów jest dobrze znanym źródłem chorób u ludzi¹. Może to wynikać z mutacji w genach jądrowych lub mitochondrialnych kodujących strukturalne lub regulatorowe składniki organelli². Drożdże piekarskie Saccharomyces cerevisiae są doskonałym organizmem modelowym do badania ekspresji genów mitochondrialnych z kilku powodów. Po pierwsze, ich genom jest całkowicie zsekwencjonowany³, dobrze opisany, a duża ilość danych jest już dostępna w literaturze dzięki długiej historii badań przeprowadzonych na tym organizmie. Po drugie, manipulacje ich genomem jądrowym są stosunkowo szybkie i łatwe ze względu na ich szybkie tempo wzrostu i wysoce wydajny system rekombinacji homologicznej. Po trzecie, drożdże piekarskie S. cerevisiae są jednymi z niewielu organizmów, dla których opracowywane są manipulacje genomami mitochondrialnymi. Wreszcie, drożdże piekarskie są organizmem fakultatywnym tlenowo-beztlenowym, który umożliwia izolację i badanie mutantów z wadami układu oddechowego, ponieważ mogą one rosnąć w pożywkach zawierających fermentujące źródła węgla.

Opisujemy metodę badania ekspresji genów mitochondrialnych drożdży piekarskich S. cerevisiae na poziomie translacyjnym⁴. Jego główna zasada wynika z kilku obserwacji. Po pierwsze, genom mitochondrialny drożdży koduje tylko osiem białek: trzy podjednostki oksydazy cytochromu c (Cox1p, Cox2p i Cox3p), trzy podjednostki syntazy ATP (Atp6p, Atp8p i Atp9p), podjednostkę enzymu oksydoreduktazy ubichinolu-cytochromu c, cytochromu b (Cytb) i mitochondrialne białko rybosomalne Var1p⁵. Liczba ta jest niewielka, a wszystkie z nich można oddzielić za pomocą elektroforezy na jednym żelu w odpowiednich warunkach. Po drugie, rybosomy mitochondrialne należą do klasy prokariotycznej, a nie eukariotyczne⁶, a zatem wrażliwość na antybiotyki jest inna dla rybosomów cytoplazmatycznych drożdży i mitochondriów. Pozwala na hamowanie translacji cytoplazmatycznej za pomocą cykloheksymidu, zapewniając warunki, w których znakowany aminokwas (³⁵S-metionina) jest włączony tylko do mitochondrialnych produktów translacji. W rezultacie eksperyment dostarcza informacji na temat szybkości włączania aminokwasów do białek mitochondrialnych syntetyzowanych de novo, odzwierciedlając ogólną wydajność translacji mitochondrialnej dla każdego z ośmiu produktów

Protokół

1. Przygotowanie kultur drożdży

1. Drożdże z zamrożonych kultur wywarowych rozsypać na świeżych talerzach z odpowiednią pożywką. Umieścić płytki w inkubatorze do hodowli w temperaturze 30 °C przez 24–48 godz.
   UWAGA: Pozwól mutantom wrażliwym na temperaturę rosnąć w dopuszczalnej temperaturze.
2. Zaszczepić kultury drożdży w 2 ml pożywki YPGal (2% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 2% galaktozy) ze świeżej smugi w probówkach o pojemności 15 ml i inkubować je przez noc, mieszając z prędkością 200 obr./min w temperaturze 30 °C.
3. Zmierzyć gęstość optyczną kultury przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀).
4. Pobrać objętość odpowiadającą 0,2 jednostki absorbancji w sterylnych probówkach, osadzać komórki drożdży w temperaturze 9 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
5. Umyj komórki 0,5 ml sterylnej wody, wirując przez 5 s. Komórki drożdży osadzać w temperaturze 9 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Rozcieńczyć komórki w 2 ml świeżej pożywki YPGal.
6. Inkubować mieszając przy 200 obr./min i temperaturze 30 °C, aż OD₆₀₀ osiągnie wartości 1,5–1,9.
   UWAGA: Tempo wzrostu drożdży jest różne, więc przygotuj się na czekanie. Rozsądne jest wykonanie kroków 1.3–1.6 wcześnie rano. Zwykle trwa to 4–5 godzin, ale może potrwać dłużej.

2. Włączenie izotopów promieniotwórczych

1. Przenieść objętość kultury odpowiadającą jednej jednostce optycznej w probówce do mikrowirówki. Wirować probówki o masie 3 000 x g przez 1 minutę i wyrzucić supernatant. Myć 0,5 ml sterylnej wody, wirując przez 5 s.
   1. Osadzać komórki drożdży w temperaturze 9 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki drożdży w 0,5 ml sterylnego buforu translacyjnego. Umieścić zawiesinę w probówce o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Bufor translacyjny jest roztworem zawierającym 2% galaktozy (w/v) i 50 mM fosforanu potasu o pH 6,0.
2. Dodać cykloheksymid do zawiesiny komórkowej do końcowego stężenia 0,2 mg/ml. Inkubować przez 5 minut, mieszając przy 200 obr./min i w temperaturze 30 °C, aby zahamować translację cytozolową.
   UWAGA: Roztwór cykloheksymidu (20 mg/ml, w etanolu) powinien być przygotowany świeży przed eksperymentem. Chloramfenikol może być z powodzeniem zastąpiony anizomycyną w tym samym stężeniu⁷.
3. Dodać 25–30 μCi ³⁵S-metioniny do zawiesiny komórek i inkubować przez 30 minut, mieszając przy 200 obr./min i temperaturze 30 °C.
   UWAGA: Można również zastosować mieszaninę ³⁵S-metioniny i ³⁵S-cysteiny. Czysta ³⁵S-metionina zapewnia najsilniejszy sygnał i najlepszy stosunek sygnału do szumu. Ogólnie rzecz biorąc, metionina jest bardziej skuteczna niż cysteina, ponieważ zawartość tego aminokwasu w białkach mitochondrialnych jest wyższa. Jednak mieszanina ³⁵S-metioniny i cysteiny EasyTag jest tańsza i daje porównywalne wyniki⁷.
   UWAGA: ³⁵S-metionina jest radioaktywna. Postępuj zgodnie ze zwykłymi praktykami bezpieczeństwa dotyczącymi obchodzenia się z materiałami promieniotwórczymi.
   UWAGA: Powszechnie wiadomo, że włączenie promieniotwórczości osiąga granicę, dzięki której całkowite sygnały wyrównują się w czasie. Po osiągnięciu tego limitu prawie niemożliwe jest określenie szybkości, z jaką syntetyzowane są różne produkty tłumaczeniowe. Aby przeanalizować szybkość translacji mitochondrialnej, konieczne jest przebywanie w stanie, w którym intensywność sygnału wzrasta wraz z czasem inkubacji z ³⁵S-metioniną w sposób liniowy. W przypadku powszechnych laboratoryjnych szczepów typu dzikiego, sygnał jest już nasycony dla czasów inkubacji znacznie krótszych niż 30 minut. Mutanty translacyjne mogą zachowywać się bardzo różnie. Należy przeprowadzić przebieg w czasie, aby ustalić kinetykę inkorporacji radioaktywności, a tym samym szybkość translacji, przynajmniej podczas pracy z nowym szczepem. W tym celu sugerujemy pobieranie próbek w odstępie kilku minut (np. 2,5, 5,0, 7,5, 10 i 20 minut).
4. Dodaj nieznakowaną "zimną" metioninę (końcowe stężenie powinno wynosić 20 mM) i puromycynę (końcowe stężenie powinno wynosić 1–10 μg/ml), aby zatrzymać znakowanie. Inkubować przez 10 minut, mieszając przy 200 obr./min i temperaturze 30 °C.
   UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby dać rybosomom czas na zakończenie translacji peptydów. W przeciwnym razie wszystkie polipeptydy krótsze niż pełnej długości zostaną wykryte w innym rozmiarze. Na tym etapie można przeprowadzić eksperyment z przebiegiem czasu (pogoń za impulsem) w celu określenia stabilności mitochondrialnych produktów translacji. W tym celu należy kontynuować inkubację, pobierając próbki w odstępie 30 minut (np. 30, 60, 90 i 120 minut).

3. Liza komórek drożdży i ekstrakcja białek

1. Zebrać komórki drożdży przez odwirowanie przy 9 000 x g przez 30 s. Umyj komórki 0,5 ml sterylnej wody, wirując przez 5 s. Komórki drożdży osadzać w 9 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
   NUTA. W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Dodać 75 μl buforu do lizy do osadu i wirować przez 5–10 s.
   UWAGA: Bufor do lizy jest roztworem 1,8 M NaOH, 1 M β-merkaptoetanolu i 1 mM PMSF w wodzie. Należy unikać nadmiernej inkubacji z buforem do lizy prowadzącej do alkalicznej hydrolizy białek. Natychmiast przejdź do kroku 3.3.
3. Dodać 500 μl 0,5 M buforu Tris-HCl o pH 6,8. Wiruj krótko.

4. Wytrącanie białek

UWAGA: Metanol i chloroform są rozpuszczalnikami organicznymi. Postępuj zgodnie ze zwykłymi praktykami bezpieczeństwa dotyczącymi obchodzenia się z substancjami organicznymi.

1. Dodać 600 μl metanolu do próbki. Wir przez 5 s.
2. Dodać 150 μl chloroformu do próbki. Wir przez 5 s.
3. Odwirowywać próbki przez 2 minuty przy 12 000 x g. Ostrożnie wyrzucić górną fazę za pomocą próbnika.
4. Dodać 600 μl metanolu do próbki. Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę.
5. Odwirowywać próbki przez 2 minuty przy 12 000 x g. Odrzucić supernatant.
6. Suszyć granulki na powietrzu przez 2 minuty w temperaturze 80 °C.
   UWAGA: Cały płyn powinien wyparować. Istnieje ryzyko nieprawidłowego oddzielenia białek w żelu, jeśli osadek został niedostatecznie wysuszony. Nie ma jednak możliwości przesuszenia granulatu, dlatego można go przechowywać nawet przez noc w temperaturze 4 °C.
7. Rozpuść wytrącone białka w 60 μl 1x buforu do próbek Laemmli.
8. Podgrzewać przez 10 min w temperaturze 40 °C.
   UWAGA: Należy unikać gotowania próbek w temperaturze 95 °C, ponieważ powoduje to agregację. Jeżeli agregaty nadal się tworzą, należy wirować próbki o masie 12 000 x g przez 2 minuty i zebrać supernatant. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

5. STRONA SDS

1. Odlewać 17,5% żel poliakryloamidowy Laemmli SDS.
   UWAGA: Do żelu można dodać 6 M mocznika, aby lepiej rozpuścić atp8 i atp9. Żele gradientowe 15%–20% mogą również zapewnić lepszą rozdzielczość.
2. Załaduj 15 μl (40–50 μg) każdej próbki do kieszeni.
   UWAGA: Nie jest konieczne mierzenie stężenia białka, jeśli wartości OD₆₀₀ były zbliżone w kroku 1.6. Jeśli nie, zmierz stężenie białka za pomocą testu z odczynnikami kompatybilnymi z detergentami.
3. Uruchom żel w chłodnym pomieszczeniu, aż niebieski barwnik osiągnie około 65% długości żelu.
   UWAGA: Dla zastosowanego systemu (np. ogniwo Protean II xi) stosujemy jeden z dwóch trybów: 16–17 godzin przy 5 V/cm lub 5 godzin przy 15 V/cm. Żadne białka nie działają szybciej niż niebieski barwnik bromofenolowy, ale długie przebiegi mogą powodować rozmycie sygnałów atp8 i atp9.
4. Zabarwić żel błękitem brylantowym Coomassie i wykonać skan lub zdjęcie, które jest wymagane jako kontrola załadunku.
   UWAGA: Alternatywnym sposobem kontroli obciążenia jest immunoblotting za pomocą przeciwciała przeciwko mitochondrialnemu genowi "porządkowania", np. porynie 1.

6. Autoradiografia

1. Wysuszyć żel w suszarce do żelu. Przechowuj go w kasecie z sitkiem luminoforowym do przechowywania przez 3–5 dni.
   UWAGA: Alternatywą dla przesiewania wysuszonego żelu jest przeniesienie białek do membrany nitrocelulozowej poprzez elektroblotting, a następnie przesiewanie. Skutkuje to silniejszymi sygnałami i ostrzejszymi pasmami.
2. Zeskanuj ekran za pomocą phosphorimager.
   UWAGA: Jako alternatywę dla obrazowania luminoforowego, film rentgenowski może być również używany do ujawniania sygnałów.

Wyniki

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, przeprowadzono analizę produktów translacji mitochondrialnej dwóch szczepów S. cerevisiae: typu dzikiego (WT) oraz mutanta z delecją genu AIM23 (AIM23Δ), kodującego mitochondrialny czynnik inicjacji translacji 3 (Tabela 1)⁸. Produkty translacji mitochondrialnej zostały znakowane radioaktywnie i rozdzielone w żelu SDS-PAAG9. Próbki pobierano co 2,5 min przed osiągnięciem nasycenia w celu opracowania przebieg...

Dyskusja

Badania nad ekspresją genów odgrywają kluczową rolę we współczesnych naukach przyrodniczych. Opracowano wiele metod zapewniających wgląd w ten złożony proces. W tym artykule opisano metodę pozwalającą na dostęp do biosyntezy białek w mitochondriach drożdży piekarskich S. cerevisiae. Zwykle stosuje się go do porównania wydajności translacji mRNA w mitochondriach zmutowanego szczepu drożdży w porównaniu z typem dzikim, aby uzyskać dostęp do konsekwencji badanej mutacji. Jest to jeden z podstawowych eksperymentów, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Akrylamid	Sigma-Aldrich	A9099
Nadsiarczan amonu	Sigma-Aldrich	A3678
Agar bakteriologiczny	Sigma-Aldrich	A5306
Miernik gęstości komórek Biowave CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
MARKOWE standardowe kuwety jednorazowe	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cykloheksymid	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galaktoza	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glukoza	Sigma-Aldrich	G7021
cyfrowy blok	grzewczy Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Metionina, 500&mikro; Ci (18.5MBq), Stabilizowany roztwór wodny	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Wirówka Eppendorf 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Ekrany fosforowe do przechowywania	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-metionina	Sigma-Aldrich	M9625
metanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetrametyloetylenodiamina	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Metylenobisakryloamid	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Inkubator	New Brunswick Scientific
Pepton z mięsa, bakteriologiczny	Millipore	91249
Fluorek fenylometanosulfonylu	Sigma-Aldrich	P7626
Zestaw do oznaczania białek Pierce 660nm	Thermo Scientific	22662
PowerPac Podstawowy zasilacz	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Dichlorowodorek puromycyny ze Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	221465
Imager luminoforowy Storm 865	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Podgrzewana próżniowo suszarka żelowa	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Ekstrakt drożdżowy	Sigma-Aldrich	Y1625