Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercach zarodków danio pręgowanego

DOI:

10.3791/62021

⸱

15 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Public Health, Soochow University, 2Toxicology, Risk Assessment and Research Division, Texas Commission on Environmental Quality

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wykorzystuje test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA wywołanych PM2.5 w wypreparowanych sercach zarodków danio pręgowanego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narażenie na drobny pył zawieszony (PM2.5) może prowadzić do toksyczności rozwojowej serca, ale mechanizmy molekularne leżące u podstaw są nadal niejasne. 8-hydroksy-2'deoksygenaza (8-OHdG) jest markerem oksydacyjnego uszkodzenia DNA, a γH2AX jest wrażliwym markerem pęknięć podwójnej nici DNA. W tym badaniu naszym celem było wykrycie indukowanych przez PM2,5 zmian 8-OHdG i γH2AX w sercu zarodków danio pręgowanego za pomocą testu immunofluorescencyjnego. Zarodki danio pręgowanego traktowano ekstrahowalnymi substancjami organicznymi (EOM) z PM2,5 w stężeniu 5 μg/ml w obecności lub braku przeciwutleniacza N-acetylo-L-cysteiny (NAC, 0,25 μM) po 2 godzinach od zapłodnienia (hpf). DMSO służył jako sterowanie pojazdem. Przy 72 hpf serca zostały wycięte z zarodków za pomocą igły strzykawki, a następnie utrwalone i przepuszczalne. Po zablokowaniu próbki badano pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko 8-OHdG i γH2AX. Próbki następnie przemyto i inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi. Uzyskane obrazy obserwowano pod mikroskopią fluorescencyjną i określano ilościowo za pomocą ImageJ. Wyniki pokazują, że EOM z PM2,5 znacznie wzmocnił sygnały 8-OHdG i γH2AX w sercu zarodków danio pręgowanego. Jednak NAC, działając jako pochłaniacz reaktywnych form tlenu (ROS), częściowo przeciwdziałał uszkodzeniom DNA wywołanym przez EOM. W tym miejscu przedstawiamy protokół immunofluorescencyjny do badania roli uszkodzenia DNA w wadach serca wywołanych PM2,5, który można zastosować do wykrywania zmian ekspresji białek wywołanych chemikaliami środowiskowymi w sercach zarodków danio pręgowanego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zanieczyszczenie powietrza jest teraz poważnym problemem środowiskowym, przed którym stoi świat. Drobny pył zawieszony w otoczeniu (PM2,5), który jest jednym z najważniejszych wskaźników jakości powietrza, może przenosić dużą liczbę szkodliwych substancji i przedostawać się do układu krwionośnego, powodując poważne szkody dla zdrowia ludzkiego1. Badania epidemiologiczne wykazały, że narażenie na PM2,5 może prowadzić do zwiększonego ryzyka wrodzonych wad serca (CHD)2,3. Dowody z eksperymentów na zwierzętach wykazały również, że PM2,5 może powodować nieprawidłowy rozwój serca u zarodków danio pręgowanego i potomstwa myszy, ale mechanizmy molekularne toksyczności rozwojowej PM2,5 dla serca są nadal w dużej mierze nieznane4,5,6.

Uszkodzenie DNA może spowodować zatrzymanie cyklu komórkowego i wywołać apoptozę, która może znacznie zniszczyć potencjał komórek progenitorowych, a w konsekwencji zaburzyć rozwój serca7). Zostało dobrze udokumentowane, że zanieczyszczenia środowiska, w tym PM2,5, mogą potencjalnie atakować DNA poprzez mechanizmy stresu oksydacyjnego8,9. Zarówno rozwój serca człowieka, jak i danio pręgowanego jest wrażliwy na stres oksydacyjny10,11,12. 8-OHdG jest markerem oksydacyjnego uszkodzenia DNA, a sygnał γH2AX jest markerem pęknięć podwójnej nici DNA. N-acetylo-L-cysteina (NAC), syntetyczny prekursor wewnątrzkomórkowej cysteiny i glutationu, jest szeroko stosowana jako związek przeciwutleniający. W tym badaniu używamy NAC do zbadania roli stresu oksydacyjnego w uszkodzeniach DNA wywołanych PM2,513.

Danio pręgowany jako modelowy kręgowiec był szeroko stosowany do badania rozwoju serca i chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, ponieważ mechanizmy rozwoju serca są wysoce konserwatywne wśród kręgowców14,15. Zalety wykorzystania danio pręgowanego jako modelu to ich niewielkie rozmiary, duża zdolność reprodukcyjna i niskie koszty karmienia. Szczególnie interesujące dla tych badań jest to, że zarodki danio pręgowanego nie są zależne od układu krążenia we wczesnym okresie rozwoju i mogą przetrwać poważne wady rozwojowe serca14. Co więcej, ich przezroczystość pozwala na bezpośrednią obserwację całego ciała pod mikroskopem. W związku z tym zarodki danio pręgowanego stanowią wyjątkową okazję do oceny mechanizmów molekularnych zaangażowanych w indukcję toksyczności rozwojowej serca w wyniku narażenia na różne chemikalia środowiskowe5,16,17. Wcześniej informowaliśmy, że stres oksydacyjny wywołany PM2,5 prowadzi do uszkodzenia DNA i apoptozy, co skutkuje wadami rozwojowymi serca u danio pręgowanego18. W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół badania uszkodzeń DNA wywołanych przez PM2,5 w sercu zarodków danio pręgowanego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany (AB) typu dzikiego (AB) użyty w tym badaniu został uzyskany z National Zebrafish Resource Center w Wuhan w Chinach. Wszystkie opisane tutaj procedury na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytut Opieki nad Zwierzętami Komisji Etyki Uniwersytetu Soochow.

1. Pobieranie próbek PM2,5 i ekstrakcja związków organicznych

UWAGA: PM2.5 został zebrany w obszarze miejskim w Suzhou w Chinach w dniach 1-7 sierpnia 2015 roku, jak opisano wcześniej5.

  1. Piecz filtry z membraną kwarcową o średnicy 47 mm w piecu muflowym o temperaturze 500 °C przez 2 godziny, aby usunąć składniki organiczne.
  2. Umieścić filtr w próbniku PM2,5 na 24 godziny nieprzerwanego pobierania próbek.
  3. Wyjmij filtr i susz przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Określ ilościowo filtr za pomocą wagi analitycznej.
  5. Ekstrakcja składników organicznych z filtra przez ekstrakcję Soxhleta przy użyciu dichlorometanu jako rozpuszczalnika19.
  6. Wysuszyć EOM przez obrotowe odparowanie w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C i przepływ azotu. Rozpuścić EOM w DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Pobieranie i leczenie zarodków danio pręgowanego

  1. Utrzymać danio pręgowanego w temperaturze 28,5 ± 0,5 °C w systemie akwakultury z recyrkulacyjnym cyklem fotoperiodycznym trwającym 14 godzin w świetle i 10 godzin.
  2. Umieść zdrowego dorosłego danio pręgowanego w zbiorniku w stosunku 2: 1 samca do samicy.
  3. Następnego dnia zbierz zarodki i umyj je wodą systemową (tj. wodą hodowlaną danio pręgowanego).
  4. Wybierz i losowo podziel zarodki danio pręgowanego wykazujące prawidłowy rozwój (jednolita wielkość, pełne ziarna i brak krzepnięcia jaj) na 4 grupy na indywidualnych szklanych szalkach Petriego o średnicy 7 cm (około 50 zarodków na szalkę).
  5. Traktować zarodki PM2,5 (5 mg/l) w obecności lub bez NAC w stężeniu 0,25 μM od 2 hpf do 72 hpf. Stosować DMSO jako kontrolę nośnika do końcowego stężenia 0,1% (v/v).

3. Obserwacja morfologiczna zarodków danio pręgowanego i sekcja serca

  1. Przy 72 hpf przenieś zarodki do szklanych szkiełek i obserwuj pod mikroskopem stereoskopowym. Rejestruj wady rozwojowe serca, takie jak obrzęk osierdzia, zmienione pętle i zmniejszony rozmiar.
  2. Oblicz wskaźniki wad rozwojowych (odsetek zarodków z wadami serca w stosunku do wszystkich żyjących zarodków) i przeanalizuj różnice między grupami za pomocą jednoczynnikowej ANOVA, a następnie tureckiego testu wielokrotnego porównania (p < 0,05 = statystycznie istotne).
  3. Znieczulić zarodki 0,6 mg/ml MS-222 w celu unieruchomienia ich na szkiełkach podstawowych.
  4. Rejestruj bicie serca przez 30 s i określaj ilościowo tętno za pomocą oprogramowania ImageJ5,20.
  5. Wypreparuj serca z zarodków danio pręgowanego za pomocą jednorazowej igły strzykawkowej pod mikroskopem stereoskopowym. Uwaga: Unikaj niszczenia kształtu serca.

4. Test immunofluorescencyjny

  1. Aby użyć testu immunofluorescencyjnego do wykrycia uszkodzenia DNA wywołanego PM2,5 w sercu zarodków danio pręgowanego, użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby narysować okrąg na czystej szklanej stronie.
  2. Dodaj 50 μl 4% paraformaldehydu do 1,25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby uzyskać roztwór utrwalający.
  3. Umieść 3 wypreparowane serca w jednym hydrofobowym okręgu barierowym i inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Zdekantować roztwór pod mikroskopem i suszyć próbki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 minut, tak aby serca całkowicie przylegały do szkiełek podstawowych.
  5. Umyj szkiełka trzy razy w PBS z 0,1% Tween 20 (PBST) przez 5 minut na pranie.
  6. Dodać 50 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 1000 μl PBST, aby otrzymać 5% roztwór BSA i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w celu zablokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał.
  7. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBST przez 5 minut na przemycie.
  8. Rozcieńczyć 2 μl mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko 8-OHdG i 2 μl króliczego przeciwciała poliklonalnego przeciwko γH2AX w 296 μl PBST, aby otrzymać działający pierwszorzędowy roztwór koktajlu przeciwciał.
  9. Próbki serca inkubować z 50 μl pierwszorzędowego roztworu koktajlu przeciwciał przeciwko 8-OHdG i γH2AX w wilgotnej komorze przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C (inkubacja przez noc może zwiększyć intensywność sygnału).
  10. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBST przez 5 minut na przemycie.
  11. Rozcieńczyć 1 μl znakowanego FITC koziego przeciwciała anty-mysiego i 1 μl koziego przeciwciała wtórnego przeciwko królikowi cy3 w 498 μl PBST w celu otrzymania działającego roztworu koktajlu przeciwciał drugorzędowych i inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi (1:500 w PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  12. Zdekantować roztwór i przemyć próbki trzykrotnie PBS przez 5 minut na płukanie, chroniąc je przed światłem.
  13. Dodać 20 μl DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol) do próbek w celu barwienia jądrowego przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  14. Nałóż szkiełko nakrywkowe, aby przesunąć i uszczelnić lakierem do paznokci, aby zapobiec wysuszeniu i przemieszczaniu się. Następnie zobrazuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym i określ ilościowo sygnał fluorescencyjny obszaru serca za pomocą oprogramowania ImageJ. Obliczyć względne zmiany za pomocą średniej próbek kontrolnych DMSO. Określ istotność statystyczną danych jak w kroku 3.2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten test immunofluorescencyjny jest czułą i specyficzną metodą pomiaru zmian ekspresji białek w sercach zarodków danio pręgowanego narażonych na działanie chemikaliów środowiskowych.

W tej reprezentatywnej analizie, zarodki narażone na PM2.5 przy braku lub obecności przeciwutleniacza NAC zostały ocenione pod kątem obecności wad rozwojowych serca (Rysunek 1). Jak zaobserwowano, EOM z PM2,5

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż danio pręgowany jest doskonałym modelem kręgowców do badania toksyczności rozwojowej serca chemikaliów środowiskowych, ze względu na mały rozmiar serca zarodka, trudno jest uzyskać wystarczającą ilość białka do analizy western blot. W związku z tym przedstawiamy czułą metodę immunofluorescencyjną do ilościowego określania poziomów ekspresji białek biomarkerów uszkodzeń DNA w sercach zarodków danio pręgowanego narażonych na PM2,5.

Podczas sekcji ważne jest, aby zachować integ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk o Naturze Chin (numer grantu: 81870239, 81741005, 81972999) oraz Priorytetowy Program Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało 8-OHdGSanta Cruz Biotechnology, USAsc-66036Przeciwciało pierwszorzędowe
Waga analitycznaSartorius, ChinyBSA124S
BSASolarbio, Pekin, ChinySW3015Do blokowania
DAPIAbcam, USAab104139Do barwienia jądrowego.
DMSOSolarbio, Pekin, ChinyD8371
Mikroskop fluorescencyjnyOlympus, JaponiaIX73Do obrazowania sygnałów fluorescencyjnych /
Koza Anti-Rabbit IgG Cy3Carlsbad, USACW0159Przeciwciało drugorzędowe
Koza Anty-królicze IgG FITCCarlsbad, USARS0003Przeciwciało drugorzędowe
N-acetylo-L-cysteina (NAC)Adamas-Beta, Szanghaj, Chiny616-91-1
Wytrząsarka orbitalnaQILINBEIER, ChinyTS-1
ParaformaldehydSigma, ChinyP6148Wytwarza 4% paraformaldehydu do utrwalania.
Hyklon soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, USASH30256.01Przygotuj 0,1% Tween w PBS do prania.
Próbnik PM2.5TianHong, Wuhan, ChinyTH-150CDo 24-godzinnego nieprzerwanego pobierania próbek PM2.5.
Recyrkulacyjny system akwakulturyHaiSheng, Szanghaj, ChinyDanio pręgowany był w nim utrzymywany.
Ekstraktor SoxhletaZhengQiao, Szanghaj, ChinyBSXT-02Do ekstrakcji składników organicznych.
Mikroskop stereoskopowyNikon, KanadaSMZ645Do wycinania serca z zarodków danio pręgowanego.
Metanosulfonian trikainy (MS222)Sigma, ChinyE10521Do znieczulania zarodków danio pręgowanego
Tween 20Sigma, ChinyP1379
i gamma; Przeciwciało H2AXAbcam, USAab26350Przeciwciało pierwszorzędowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
  2. Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).
  3. Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
  4. Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
  5. Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
  6. Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
  7. Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
  8. Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
  9. Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
  10. Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
  11. Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
  12. Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46(2014).
  13. Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
  14. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
  15. Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
  16. Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
  17. Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
  18. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).
  19. van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
  20. Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
  21. Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
  22. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  23. Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza immunofluorescencyjnaekspozycja na PM2 5zarodki rybek zebrafishwady rozwojowe sercaoksydacyjne uszkodzenia DNAdetekcja 8 OHdGekspresja gamma H2AXmikroskopia fluorescencyjnaprzeciwutleniacz NAC

Powiązane artykuły