Artykuł metodologiczny

Powtarzalny model endotoksyny zorientowany na oddział intensywnej terapii u szczurów

DOI:

10.3791/62024

⸱

20 lutego 2021

 , 
1Institute of Physiology, University of Zurich, 2Institute of Anesthesiology, University Hospital of Zurich

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy powtarzalny model endotoksyny zorientowany na oddział intensywnej terapii u szczurów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sepsa i wstrząs septyczny pozostają główną przyczyną zgonów na oddziałach intensywnej terapii. Pomimo znacznej poprawy w leczeniu sepsy, śmiertelność nadal waha się między 20 a 30%. Pilnie potrzebne są nowatorskie metody leczenia w celu zmniejszenia niewydolności wielonarządowej i zgonu związanej z sepsą. Solidne modele zwierzęce pozwalają na opracowanie jednego lub wielu podejść do leczenia, a także na testowanie ich wpływu na parametry fizjologiczne i molekularne. W tym artykule przedstawiono prosty model zwierzęcy.

Po pierwsze, znieczulenie ogólne jest wywoływane u zwierząt za pomocą znieczulenia lotnego lub dootrzewnowego. Po założeniu cewnika dożylnego (żyły ogonowej), tracheostomii i wprowadzeniu cewnika dotętniczego (tętnicy ogonowej) rozpoczyna się wentylacja mechaniczna. Rejestrowane są wyjściowe wartości średniego ciśnienia tętniczego krwi, wysycenia krwi tętniczej tlenem i częstości akcji serca.

Wstrzyknięcie lipopolisacharydów (1 miligram/kilogram masy ciała) rozpuszczonych w buforowanym fosforanowym roztworze soli fizjologicznej wywołuje silną i powtarzalną reakcję zapalną za pośrednictwem receptora toll-like 4. Korekty płynów, a także aplikacja noradrenaliny są wykonywane w oparciu o sprawdzone protokoły.

Model zwierzęcy przedstawiony w tym artykule jest łatwy do nauczenia i silnie zorientowany na kliniczne leczenie sepsy na oddziale intensywnej terapii z sedacją, wentylacją mechaniczną, ciągłym monitorowaniem ciśnienia krwi i powtarzalnym pobieraniem próbek krwi. Ponadto model jest wiarygodny, co pozwala na uzyskanie powtarzalnych danych na ograniczonej liczbie zwierząt zgodnie z zasadami 3R (reduce, replace, refine) w badaniach na zwierzętach. Podczas gdy eksperymenty na zwierzętach w badaniach nad sepsą nie mogą być łatwo zastąpione, powtarzalne pomiary pozwalają na zmniejszenie liczby zwierząt, a utrzymywanie zwierząt w stanie znieczulenia szamba zmniejsza cierpienie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sepsa i jej cięższa forma, wstrząs septyczny, to zespoły na podłożu infekcji, skutkujące przestrzeleniem reakcji zapalnej z uwolnieniem cytokin, prowadzące do zmian fizjologicznych i biochemicznych z osłabioną obroną immunologiczną i śmiertelnymi wynikami1,2. Ta niezrównoważona reakcja zapalna powoduje dysfunkcję narządów i niewydolność narządów w różnych ważnych narządach, takich jak płuca, nerki i wątroba. Z 37%3, sepsa jest jednym z najczęstszych powodów przyjęcia pacjenta na oddział intensywnej terapii (OIOM). Śmiertelność z powodu sepsy waha się obecnie około 20-30%4. Wczesna i skuteczna antybiotykoterapia ma ogromne znaczenie5. Resuscytacja płynem i resuscytacją wazopresyjną musi być zainstalowana wcześnie, poza tym leczenie jest czysto wspomagające6.

Sepsa jest definiowana jako udowodniona lub podejrzewana infekcja bakteriami, grzybami, wirusami lub pasożytami, której towarzyszy dysfunkcja narządów. Kryteria wstrząsu septycznego są spełnione, gdy występuje dalsza zapaść sercowo-naczyniowa niereagująca na samo leczenie płynami, a poziom mleczanu przekracza 2 milimol/litr2. Niewydolność narządowa związana z sepsą może wystąpić w każdym narządzie, ale jest bardzo powszechna w układzie sercowo-naczyniowym, mózgu, nerkach, wątrobie i płucach. Większość pacjentów cierpiących na sepsę wymaga intubacji dotchawiczej w celu zabezpieczenia dróg oddechowych pacjenta, ochrony przed aspiracją oraz zastosowania wentylacji wydechowej z dodatnim końcem z dużą frakcją wdychanego tlenu w celu zapobieżenia lub przezwyciężenia niedotlenienia. Aby tolerować rurkę dotchawiczą i wentylację mechaniczną, pacjenci zwykle wymagają sedacji.

Endotoksyny, takie jak lipopolisacharydy (LPS) jako składnik błony bakterii Gram-ujemnych, wywołują silną reakcję zapalną za pośrednictwem receptora toll-podobnego (TLR) 47. Aktywacja zdefiniowanego szlaku zapewnia stabilną reakcję zapalną. Cytokiny, takie jak białko chemoatraktantu neutrofili indukowane cytokinami 1 (CINC-1), białko chemoatraktantu monocytów 1 (MCP-1) i interleukina 6 (IL-6) są znane jako czynniki prognostyczne dla nasilenia i wyniku w tym modelu8. Aplikacja LPS do podawania dożylnego została z powodzeniem wykorzystana do badania różnych aspektów sepsy u szczurów8,9.

Leczenie sepsy jest nadal wyzwaniem, szczególnie ze względu na brak predykcyjnych modeli zwierzęcych. To, czy endotoksemia z aktywacją ogólnoustrojowego stanu zapalnego jest odpowiednim modelem do opracowania terapii farmakologicznych, jest dyskusyjne. Jednak dzięki dobrze znanemu szlakowi TLR 4 indukowanemu przez LPS można zdobyć ważną wiedzę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty przedstawione w tym protokole zostały zatwierdzone przez Władze Weterynaryjne Kantonu Zurych, Szwajcaria (numery zatwierdzenia 134/2014 i ZH088/19). Co więcej, wszystkie etapy wykonane w tym eksperymencie były zgodne z Wytycznymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach Szwajcarskiej Akademii Nauk Medycznych (SAMS) oraz Wytycznymi Federacji Europejskich Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (FELASA).

1. Indukcja znieczulenia i monitorowanie zwierząt

  1. Samce szczurów rasy Wistar o wadze 250-300 gramów (g) należy trzymać w wentylowanych klatkach w warunkach wolnych od patogenów. Zapewnij 12-12-godzinny cykl światła/ciemności w temperaturze otoczenia 22 ± 1 °C oraz swobodny dostęp do żywności i wody.
  2. Wywołać znieczulenie ogólne albo przez lotną indukcję izofluranem (stężenie 3-5%) w pudełku do indukcji znieczulenia przez 30 sekund (Rysunek 1A) lub alternatywnie, wywołać znieczulenie za pomocą jednorazowego wstrzyknięcia ketaminy/ksylazyny (10/1 miligrama (mg) na 100 g masy ciała).
  3. Przenieś zwierzę do miejsca pracy i połóż je na macie grzewczej przez cały czas trwania eksperymentu. Utrzymuj temperaturę ciała w zakresie od 36,5 do 37 °C.
  4. Użyj stożka do nosa, aby dostarczyć tlen (600 ml / minutę). Dodaj izofluran 2-3%, jeśli do utrzymania znieczulenia wybrano znieczulenie lotne. Upewnij się, że zwierzę spontanicznie oddycha.
  5. Potwierdź poziom znieczulenia poprzez brak odruchu szczypania palca u nogi przed założeniem tracheostomii oraz cewników tętniczych i żylnych.
  6. Sprawdź wystarczające natlenienie poprzez monitorowanie obwodowego nasycenia tlenem (normalne nasycenie tlenem 98 - 100%).
  7. Użyj maści (maści z witaminą A), aby chronić oczy.
  8. Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne i cewniki na bocznym stoliku, jak pokazano w Rysunek 1B.
  9. Dodatkowo przygotuj monitorowanie ciśnienia i nasycenia tlenem, jak pokazano na Rysunek 1C.

2. Dostęp dożylny

  1. Załóż opaskę uciskową na bliższy ogon szczura, aby ułatwić dostęp żylny (Rysunek 2A).
  2. Zdezynfekuj ogon 3 razy alkoholem.
  3. Wprowadzić cewnik dożylny G26 do jednej z dwóch bocznych żył ogonowych.
    UWAGA: Z naszego doświadczenia łatwiej jest umieścić dostęp dożylny w dystalnej części ogona szczura, ponieważ żyła w tym miejscu znajduje się bliżej skóry. Ponadto, w przypadku nieudanej kaniulacji, jest wystarczająco dużo miejsca, aby poruszać się proksymalnie.
  4. Bezwzględnie unikaj wtrysku powietrza.
  5. Rozwiąż opaskę uciskową po umieszczeniu cewnika dożylnego.
  6. Zamocuj cewnik dożylny za pomocą taśmy klejącej (Rysunek 2B).
  7. Podłączyć pompy strzykawkowe do dostępu dożylnego w celu ciągłego podawania płynów i leków.
  8. Używaj 3-drogowych zaworów odcinających do płynu w bolusie, aplikacji leków i pobierania próbek krwi żylnej.

3. Tracheostomia

  1. Ogol przednią część szyi zwierzęcia.
  2. Zdezynfekuj ogoloną skórę 3 razy roztworem jodu prowidonu.
  3. Wykonaj około 2 cm podłużne nacięcie za pomocą skalpela (z ostrzem nr 10).
  4. Cofnij skórę za pomocą jedwabnych szwów 2-0.
  5. Tępo przygotuj krtań i tchawicę nożyczkami chirurgicznymi (Rysunek 3A).
  6. Upewnij się, że otwierasz tchawicę mikronożyczkami chirurgicznymi przy 3-5zapięciu tchawicy.
  7. Włóż sterylną kaniulę tchawicy do tchawicy. Bądź ostrożny, nie wkładaj kaniuli zbyt głęboko, aby uniknąć jednostronnej wentylacji.
  8. Zamocuj kaniulę na miejscu za pomocą jedwabnego szwu 2-0.
  9. Podłącz kaniulę do respiratora, aby uzyskać wentylację z kontrolowanym ciśnieniem lub objętością (Rysunek 3B).

4. Dostęp tętniczy

  1. Zdezynfekuj ogon szczura 3 razy roztworem jodu powidonu.
  2. Przeciąć skórę za pomocą skalpela (z ostrzem nr 10) około 1 cm wzdłuż po stronie brzusznej.
  3. Uważaj, nie tnij zbyt głęboko, aby uniknąć uszkodzenia tętnicy ogonowej.
  4. Użyj mikroskopu chirurgicznego, aby dokładnie odsłonić tętnicę. Przetnij powięź otaczającą tętnicę za pomocą mikronożyczek chirurgicznych.
  5. Podwiązać dystalną część tętnicy za pomocą jedwabnego szwu 6-0.
  6. Przygotuj proksymalny szew jedwabny 6-0, ale nie zaciskaj jedwabiu (Rysunek 4A).
  7. Wprowadzić cewnik G-26 do tętnicy między dystalnym i proksymalnym szwem jedwabnym.
  8. Gdy cewnik znajdzie się w tętnicy, zaciśnij proksymalny szew jedwabny i zamocuj cewnik na miejscu (Rysunek 4B).
  9. Podłącz cewnik do przetwornika ciśnienia, aby zapewnić ciągły pomiar ciśnienia tętniczego (normalne średnie ciśnienie tętnicze: 60 - 100 mmHg) (Rysunek 4C).
  10. Dodatkowo należy umieścić 3-kierunkowy kran między cewnikiem podłączonym do przetwornika ciśnienia a cewnikiem G-26 w celu pobrania próbki krwi tętniczej.

5. Pomiar linii bazowej, indukcja sepsy i pomiary uzupełniające

  1. Gdy zwierzę osiągnie stan stacjonarny, wstrzyknąć LPS.
  2. Pobieraj próbki krwi po osiągnięciu stanu stacjonarnego (zwykle po 15-30 minutach).
  3. Zastąp ubytek płynu z próbek krwi roztworem Ringera w stosunku 1:4.
  4. W celu wywołania sepsy należy wstrzyknąć LPS w bolusie lub w postaci ciągłego podawania LPS.
  5. W przypadku podania w bolusie należy wstrzyknąć 1 mg LPS/kilogram masy ciała (kg) rozpuszczonej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w stężeniu 1 mg/ml.
  6. W przypadku aplikacji ciągłej wstrzykiwać 300 μg LPS/kg/godzinę przez cały czas trwania eksperymentu za pomocą pompy strzykawkowej (roztwór podstawowy LPS: 1 mg/ml w PBS).
  7. Należy zawsze unikać wstrzykiwania powietrza, aby zapobiec zatorowości powietrznej.
  8. Zdefiniuj protokoły wymiany płynów, protokoły stosowania leków zwężających naczynia krwionośne i kryteria aborcji (na przykład niedociśnienie zdefiniowane jako średnie ciśnienie tętnicze krwi poniżej 50 mmHg przez ponad 30 minut pomimo wymiany płynów) przed rozpoczęciem eksperymentu.
    UWAGA: Sugerujemy ciągły wlew roztworu Ringera z szybkością 10 ml/kg/godzinę.
  9. Odejmij wszelkie ciągłe podawanie płynów (np. w przypadku ciągłego stosowania LPS) od ilości podawanej w infuzji, tak aby wyniki były porównywalne z wynikami w grupach kontrolnych.
    UWAGA: Pod koniec eksperymentu, a przed pobraniem jakichkolwiek narządów, takich jak wątroba, nerki lub śledziona, do dalszych analiz, takich jak badanie histologiczne lub biochemiczne, zwierzęta mogą zostać poddane eutanazji poprzez nacięcie żyły głównej dolnej. Zalecaną metodą eutanazji jest doprowadzenie zwierząt do znieczulenia chirurgicznego przed nacięciem żyły głównej dolnej i wstrzyknięciem lodowatej soli fizjologicznej do lewego serca, zwłaszcza jeśli mają być oceniane markery stanu zapalnego w narządach. Upewnij się, że przestrzegasz wymagań prawnych i lokalnych wytycznych. Aby zweryfikować niewydolność narządową związaną z sepsą, można przeanalizować marker proapoptozy, taki jak kaspaza-3, a także α1-mikroglobulinę w celu sprawdzenia uszkodzenia kanalików w nerkach. Specyficzna dla narządu analiza markerów, takich jak CINC-1, MCP-1 i IL-6, może również dostarczyć informacji o specyficznej dla narządu odpowiedzi zapalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony system pozwala na endotoksemię u zwierząt stabilnych hemodynamicznie, jak opisano wcześniej9. Podczas gdy średnie ciśnienie tętnicze pozostaje stabilne u zwierząt ze stymulacją LPS i bez niej, u zwierząt leczonych LPS rozwijają się cechy sepsy, takie jak ujemny nadmiar zasady i silna reakcja zapalna mierzona cytokinami osocza (6 godzin po aplikacji), takimi jak CINC-1 (867 ng/ml), MCP-1 (5027 ng/ml) i IL-6 (867 ng/mL)8, Rysunek 5.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół pozwala na wysoce powtarzalny, a jednocześnie prosty do opanowania model sepsy, który można dostosować do pytania badawczego. Podstawowe dane in vivo odnoszące się do funkcji narządów, takie jak tętno, ciśnienie krwi i nasycenie tlenem tętnic obwodowych, mogą być zbierane w sposób ciągły, a pobieranie krwi może być wykonywane wielokrotnie przez cały czas trwania eksperymentu. Ponadto można zainstalować modyfikacje w odniesieniu do protokołów wymiany płynów i wsparcia dla wazopresorów. Biorąc pod uw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów w odniesieniu do prezentowanego badania. Martin Schläpfer złożył wniosek patentowy mający na celu złagodzenie negatywnych skutków zabiegu chirurgicznego i/lub znieczulenia u pacjentów stosujących gazy medyczne, w szczególności tlen (O2) i dwutlenek węgla (CO2). Otrzymał nieograniczone granty badawcze od Sedana Medical w Szwecji i z Roche w Szwajcarii, niezwiązane z tą pracą.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Beatrice Beck-Schimmer (MD) i Erikowi Schadde (MD) za ich krytyczną analizę i cenny wkład w ten manuskrypt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-0 jedwabne szwyEthicon, Sommerville, NJK833Standardowy
chirurgiczny cewnik dożylny 26Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ391349Standardowy sprzęt do znieczulenia
6-0 LOOK pleciony jedwabSurgical Specalities Corporation, Wyomissing, PASP114Standardowa
chirurgiczna pompa strzykawkowa AlarisBencton Dickinson
BetadineMundipharma, Bazylea, Szwajcaria7.68034E+12Numer GTIN
Zakrzywione mikrokleszczyki z cienkimi końcówkamiŚwiatowe instrumenty precyzyjne (WPI), Sarasota, FL504513Ułatwia przygotowanie naczyń krwionośnych
Mikrokleszcze z cienkimi końcówkamiŚwiatowe instrumenty precyzyjne (WPI), Sarasota, FL501976Końcówki należy regularnie polerować
Monitorowanie znieczulenia Infinity Delta XLDraeger, Lü beck, Niemcy
Isoflurane, butelki 250 mlAttane, Piramal, Bombaj, IndieLDNI 22098Standardowe wyposażenie weterynaryjne
Ketamina (Ketalar)Pfitzer, Nowy Jork, NY
Lipopolisacharyd (LPS) od Escherichia coli, serotyp 055:B5Sigma, Buchs, Szwajcaria
Końcówki Q małeCarl Roth GmbH, Karlsruhe, NiemcyEH11.1Standardowy chirurgiczny
RingerfundinBbraun, Melsungen, Niemcy
Waporyzator izofluoranowy Tec-3Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, ILnie jest już dostępnyStandardowe wyposażenie weterynaryjne
Ksylazyna (Xylazin Streuli)Streuli AG, Uznach, Szwajcaria

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathophysiology and treatment of sepsis. New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
  2. Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).
  3. Vincent, J. L., et al. Assessment of the worldwide burden of critical illness: the intensive care over nations (ICON) audit. Lancet Respiratory Medicine. 2 (5), 380-386 (2014).
  4. Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
  5. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  6. Gotts, J. E., Matthay, M. A. Sepsis: pathophysiology and clinical management. British Medical Journal. 353, (2016).
  7. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
  8. Urner, M., et al. Insight into the beneficial immunomodulatory mechanism of the sevoflurane metabolite hexafluoro-2-propanol in a rat model of endotoxaemia. Clinical and Experimental Immunology. 181 (3), 468-479 (2015).
  9. Beck-Schimmer, B., et al. Which Anesthesia Regimen Is Best to Reduce Morbidity and Mortality in Lung Surgery?: A Multicenter Randomized Controlled Trial. Anesthesiology. 125 (2), 313-321 (2016).
  10. Deitch, E. A. Animal models of sepsis and shock: a review and lessons learned. Shock. 9 (1), 1-11 (1998).
  11. Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (10), 854-865 (2005).
  12. Perretti, M., Duncan, G. S., Flower, R. J., Peers, S. H. Serum corticosterone, interleukin-1 and tumour necrosis factor in rat experimental endotoxaemia: comparison between Lewis and Wistar strains. British Journal of Pharmacology. 110 (2), 868-874 (1993).
  13. Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29 (5), 572-576 (2008).
  14. Thiemermann, C., Ruetten, H., Wu, C. C., Vane, J. R. The multiple organ dysfunction syndrome caused by endotoxin in the rat: attenuation of liver dysfunction by inhibitors of nitric oxide synthase. British Journal of Pharmacology. 116 (7), 2845-2851 (1995).
  15. Osuchowski, M. F., et al. Minimum quality threshold in pre-clinical sepsis studies (MQTiPSS): an international expert consensus initiative for improvement of animal modeling in sepsis. Intensive Care Medicine Experimental. 6 (1), 26(2018).
  16. Fink, M. P., Heard, S. O. Laboratory models of sepsis and septic shock. Journal of Surgical Research. 49 (2), 186-196 (1990).
  17. Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: Setting the stage. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (10), 854-865 (2005).
  18. Balls, M. The principles of humane experimental technique: timeless insights and unheeded warnings. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 144-148 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model sepsymodel szczurzywstrzykni cie lipopolisaryduwentylacja mechanicznakaniulacja t tnicymonitorowanie ci nienia t tniczegopomiar cytokinzasady dobrostanu zwierz t

Powiązane artykuły