Prezentujemy metodę pozyskiwania przebiegów czasu reporterowego fluorescencji z pojedynczych komórek za pomocą mikrowzorców. Protokół opisuje przygotowanie macierzy pojedynczych komórek, konfigurację i obsługę mikroskopii poklatkowej ze skanowaniem żywych komórek oraz narzędzie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym do automatycznej preselekcji, kontroli wizualnej i śledzenia przebiegów czasu fluorescencji zintegrowanych z komórkami na miejsce adhezji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie żywych komórek macierzy jednokomórkowych (LISCA) - wszechstronna technika ilościowego określania kinetyki komórkowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie żywych komórek w układach jednokomórkowych (LISCA) to uniwersalna metoda zbierania przebiegów czasowych sygnałów fluorescencyjnych z pojedynczych komórek w wysokiej przepustowości. Ogólnie rzecz biorąc, nabywanie przebiegów czasowych pojedynczej komórki z hodowanych komórek jest utrudnione przez ruchliwość komórek i różnorodność kształtów komórek. Mikromacierze adhezyjne standaryzują warunki panujące w pojedynczych komórkach i ułatwiają analizę obrazu. LISCA łączy mikromacierze jednokomórkowe ze skaningową mikroskopią poklatkową i automatycznym przetwarzaniem obrazu. W tym miejscu opisujemy eksperymentalne etapy odbywania kursów czasu fluorescencji pojedynczej komórki w formacie LISCA. Transfektujemy komórki przylegające do mikrowzorcowej matrycy za pomocą kodowania mRNA w celu wzmocnienia białka zielonej fluorescencji (eGFP) i monitorujemy kinetykę ekspresji eGFP setek komórek równolegle za pomocą skaningowej mikroskopii poklatkowej. Stosy danych obrazowych są automatycznie przetwarzane przez nowo opracowane oprogramowanie, które integruje intensywność fluorescencji na wybranych konturach komórek w celu wygenerowania przebiegów czasu fluorescencji pojedynczej komórki. Pokazujemy, że przebiegi ekspresji eGFP po transfekcji mRNA są dobrze opisane przez prosty model translacji kinetycznej, który ujawnia tempo ekspresji i degradacji mRNA. Omówiono dalsze zastosowania LISCA do korelacji wielu markerów w czasie zdarzenia w kontekście apoptozy sygnalizacyjnej.
Wprowadzenie
W ostatnich latach najwyraźniej zaznaczyła się istotna rola eksperymentów na pojedynczych komórkach. Dane pochodzące z pojedynczych komórek pozwalają na badanie zmienności międzykomórkowej, rozstrzygnięcie korelacji parametrów wewnątrzkomórkowych oraz wykrycie kinetyki komórkowej, która pozostaje ukryta w pomiarach populacyjnych1,2,3. Aby badać kinetykę komórkową tysięcy pojedynczych komórek równolegle, niezbędne są nowe podejścia umożliwiające monitorowanie komórek w standaryzowanych warunkach przez okres od kilku godzin do kilku dni, a następnie ilościową analizę danych 4. W niniejszej pracy prezentujemy metodę obrazowania żywych komórek w układach macierzowych (Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays, LISCA), która łączy zastosowanie mikrostrukturalnych macierzy z mikroskopią poklatkową i zautomatyzowaną analizą obrazu.
W literaturze opracowano i opublikowano kilka metod generowania mikrostrukturalnych macierzy pojedynczych komórek5,6. Tutaj krótko opisujemy mikroiskrową plazmową inicjację wzornictwa białkowego (µPIPP). Szczegółowy protokół wytwarzania macierzy pojedynczych komórek przy użyciu metody µPIPP znajduje się również w odniesieniu7. Zastosowanie macierzy pojedynczych komórek umożliwia wyrównanie tysięcy komórek na zestandaryzowanych punktach adhezyjnych, które zapewniają określone mikrośrodowisko dla każdej komórki, co redukuje źródło zmienności doświadczalnej (Ryc. 1A). Macierze pojedynczych komórek są wykorzystywane do monitorowania przebiegów czasowych markerów fluorescencyjnych służących do wskazywania różnych procesów komórkowych. Długoterminowa mikroskopia w trybie skanowania time-lapse pozwala na monitorowanie dużego obszaru macierzy pojedynczych komórek, a tym samym na wysokoprzepustowe próbkowanie danych z pojedynczych komórek w czasie obserwacji trwającym od kilku godzin do nawet wielu dni. Generuje to stosy obrazów w osi czasu dla każdej pozycji macierzy (Ryc. 1B). W celu zredukowania ogromnej ilości danych obrazowych i efektywnego wyodrębnienia pożądanych przebiegów czasowych fluorescencji pojedynczych komórek, wymagane jest zautomatyzowane przetwarzanie obrazu wykorzystujące pozycjonowanie komórek (Ryc. 1C).
Wyzwanie, przed którym stoi metoda LISCA, polega na dostosowaniu protokołów eksperymentalnych i narzędzi obliczeniowych w celu stworzenia wysokoprzepustowego testu, który generuje ilościowe i powtarzalne dane dotyczące kinetyki komórkowej. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy, krok po kroku opis poszczególnych metod oraz sposób ich łączenia w analizie LISCA. Jako przykład omawiamy przebieg czasowy ekspresji wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) po sztucznym wprowadzeniu mRNA. Ekspresja eGFP po dostarczeniu mRNA jest opisywana przez równania szybkości reakcji modelujące translację i degradację mRNA. Dopasowanie funkcji modelu dla przebiegu czasowego stężenia eGFP do odczytu LISCA intensywności fluorescencji dla każdej pojedynczej komórki w czasie pozwala uzyskać najlepsze szacunki parametrów modelu, takich jak szybkość degradacji mRNA. Jako reprezentatywny wynik omawiamy wydajność dostarczania mRNA dwóch różnych środków transfekcyjnych opartych na lipidach oraz różnice w rozkładach ich parametrów.
Rycina 1: Przedstawienie schematu pracy LISCA łączącego (A) mikrowzorowane macierze pojedynczych komórek, (B) skanującą mikroskopię time-lapse oraz (C) zautomatyzowaną analizę obrazów zarejestrowanych serii zdjęć. Macierze pojedynczych komórek składają się z dwuwymiarowego wzoru kwadratów adhezyjnych dla komórek z przestrzeniami między nimi odpychającymi komórki, co prowadzi do rozmieszczenia komórek na mikrowzorze, co widać na obrazie w kontraście fazowym oraz na obrazie fluorescencyjnym komórek wykazujących ekspresję eGFP (A). Cały obszar ustrukturyzowany jest obrazowany w trybie skanującego time-lapse, polegającym na wielokrotnym wykonywaniu zdjęć w sekwencji określonych pozycji (B). Zarejestrowane serie obrazów są przetwarzane w celu odczytania intensywności fluorescencji dla każdej komórki w czasie (C). Paski skali: 500 µm (A), 200 µm (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Rycina 2: Pozyskiwanie danych łączące mikrotablice jednokomórkowe (A) z mikroskopią skanującą time-lapse (B). W ramach przygotowania do eksperymentu time-lapse przygotowywana jest mikrotablica jednokomórkowa z 2D mikowzorcem kwadratów adhezyjnych (1), następnie przeprowadzany jest wysiew komórek i ich wyrównanie na mikowzorcu (2), a także podłączenie systemu perfuzji do szkiełka sześciokanałowego, co umożliwia manipulację cieczami podczas pomiarów time-lapse (3). Konfiguruje się eksperyment skanującego obrazowania time-lapse (4), a komórki są transfektowane pod mikroskopem poprzez wstrzyknięcie roztworu lipopleksu mRNA przez system perfuzji w trakcie trwania eksperymentu time-lapse (5). Paski skali: 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
1. Wytwarzanie mikrostrukturalnej matrycy jednokomórkowej (Rysunek 2A)
- Przygotuj materiały niezbędne do wykonania matrycy µPIPP.
- Przygotuj sterylną sól fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) o pH 7,4.
- Przygotuj sterylną wodę ultrapure o rezystywności co najmniej 18 MΩcm w 25 °C.
- Przygotuj roztwór roboczy PLL(20 kDa)-g[3.5] PEG(2 kDa) (PLL-PEG) o stężeniu 2 mg/mL PLL-PEG w wodzie ultrapure zawierającej 150 mM NaCl i 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES).
- Przygotuj roztwór białka macierzy zewnątrzkomórkowej do powlekania powierzchni: 1 mg/mL fibronektyny (FN) w PBS.
- Przygotuj wafelek krzemowy z mikrostrukturalnym wzorem wykonanym metodą fotolitografii8, który pełni rolę wielokrotnego wzorca. Wzór składa się z kwadratów o długości krawędzi 30 µm, głębokości 12 µm i odstępie między kwadratami 60 µm, ułożonych w sześciu pasach, z których każdy ma szerokość 6 mm i wysokość 18 mm.
- Wymieszaj monomer polidimetylosiloksanu (PDMS) z 9% utwardzaczem (procent masowy), korzystając z zestawu do elastomeru silikonowego, a następnie odgazuj go przez około 30 min w desykatorze, aż do całkowitego usunięcia pęcherzyków powietrza. Odlej na wafelku krzemowym warstwę PDMS o grubości około 3-5 mm i ponownie odgazuj przez około 30 min, aż do usunięcia pęcherzyków.
- Umieść wafelek krzemowy z PDMS w piecu grzewczym w temperaturze 50 °C, aby utwardzić PDMS przez co najmniej 4 h.
- Wytnij stemple PDMS.
- Za pomocą skalpela wytnij z warstwy PDMS jedną matrycę główną zawierającą sześć pasów mikrostrukturalnych.
- Połóż matrycę główną PDMS na blacie wzorem skierowanym do góry.
- Każdy z sześciu pasów mikrostrukturalnych matrycy głównej PDMS potnij żyletką na osobne stemple PDMS. Upewnij się, że krawędzie stempli PDMS są otwarte, odcinając część obszaru z wzorem.
- Umieść stemple PDMS na szkiełku nakrywkowym szkiełka sześciościeżkowego (Rysunek 3-1).
- Użyj niepowlekanego szkiełka nakrywkowego i zaznacz pozycje kanałów szkiełka sześciościeżkowego, ostrożnie zarysowując folię ochronną szkiełka. Następnie połóż szkiełko na blacie folią ochronną skierowaną w dół.
- Za pomocą pęsety umieść stemple PDMS wzorem skierowanym w dół na szkiełku nakrywkowym w zaznaczonych pozycjach kanałów.
- Sprawdź przyleganie stempli PDMS pod mikroskopem. Jeśli stempel PDMS przylega w pełni do szkiełka nakrywkowego, kwadraty w kontakcie wydają się ciemniejsze niż przestrzenie między nimi. Przyleganie stempla PDMS do szkiełka nakrywkowego jest kluczowe dla jakości mikrostruktury.
- Umieść szkiełko nakrywkowe z sześcioma stemplami PDMS w czyszczarce plazmowej i potraktuj je plazmą tlenową (ciśnienie 0,2 mbar, ~40 W przez 3 min), aby uczynić powierzchnie między stemplami PDMS a szkiełkiem nakrywkowym hydrofilowymi (Rysunek 3-2).
- Wszystkie kolejne etapy wykonania mikrostruktury przeprowadź w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Użyj 15 µL roztworu PLL-PEG i nanieś pipetą jedną kroplę obok każdego stempla PDMS, tak aby roztwór PLL-PEG został wchłonięty do hydrofilowego wzoru stempla PDMS (Rysunek 3-3). Inkubuj PLL-PEG przez 20 min w temperaturze pokojowej.
- Przepłucz szkiełko nakrywkowe ze stemplami PDMS 1 mL wody ultrapure, a następnie usuń stemple PDMS za pomocą pęsety (Rysunek 3-4). Następnie przepłucz szkiełko nakrywkowe drugi raz 1 mL wody ultrapure i pozostaw do wyschnięcia.
- Po całkowitym wyschnięciu szkiełka nakrywkowego, przyklej do niego sześciościeżkowe szkiełko lepkie (Rysunek 3-4). Zadbaj o to, aby obszary z mikrostrukturą pokrywały się z dnem kanałów.
- Funkcjonalizuj kwadraty adhezyjne za pomocą FN.
- Wlej 40 µL PBS do każdego kanału.
- Przygotuj roztwór FN o stężeniu 100 µg/mL w PBS.
- Dodaj 40 µL roztworu FN do każdego kanału (Rysunek 3-5). Dokładnie wymieszaj roztwór FN z PBS w kanale, trzykrotnie przenosząc 40 µL z jednego zbiornika do zbiornika przeciwległego w tym samym kanale, aby uzyskać jednorodny roztwór. Inkubuj roztwór FN przez 45 min w temperaturze pokojowej.
- Przemyj każdy kanał trzykrotnie 120 µL PBS (Rysunek 3-6).
- Aby sprawdzić jakość wzoru, w kroku 9.2 zastosuj FN znakowaną fluorescencyjnie (Rysunek 4A).
UWAGA: Zalecamy przygotowanie matrycy µPIPP nie wcześniej niż jeden dzień przed wysiewem komórek, ponieważ PLL-PEG i FN nie są kowalencyjnie związane z podłożem i jakość wzoru może z czasem spadać. Przygotowaną matrycę µPIPP przechowuj w lodówce.
Rycina 3: Wytwarzanie mikroarray pojedynczych komórek metodą µPIPP. (1) Stemple PDMS z trójwymiarową strukturą mikrowzorca na powierzchni są rozmieszczone na szkiełku podstawnym slajdu sześciokanałowego. (2) Szkiełko podstawne ze stemplami PDMS jest poddane działaniu plazmy tlenowej w celu nadania powierzchniom właściwości hydrofilowych. (3) Dodawany jest PLL-PEG. Jest on wchłaniany do mikrostruktury siłami kapilarnymi, co sprawia, że powierzchnie niezakryte stemplem PDMS stają się odpychające dla komórek. (4) Szkiełko podstawne jest płukane wodą w celu usunięcia pozostałego PLL-PEG. Następnie usuwa się stemple PDMS i do szkiełka podstawnego przykleja się sześciokanałowy slajd przylepny. (5) Dodawana jest fibronektyna, białko macierzy zewnątrzkomórkowej, aby uczynić obszary bez PLL-PEG adhezyjnymi dla komórek. (6) Slajd sześciokanałowy jest przemywany roztworem soli fosforanowej (PBS). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
2. Wysiew komórek (Rysunek 2A)
UWAGA: W przypadku następujących etapów płukania, należy dodać odpowiedni płyn do jednego zbiornika, a następnie usunąć taką samą objętość płynu z przeciwległego zbiornika danego kanału.
- Przemyj każdy kanał 120 µL w pełni suplementowanej pożywki do wzrostu komórek o temperaturze 37 °C. Przed dodaniem zawiesiny komórkowej upewnij się, że pożywką wypełnione są jedynie kanały, a nie zbiorniczki.
- Oddziel komórki HuH7 z kolby do hodowli komórkowej zgodnie ze standardowym protokołem pasażowania komórek i dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej do 4 x 105 komórek/mL.
- Dodaj 40 µL zawiesiny komórkowej, a następnie wymieszaj pożywkę do wzrostu z zawiesiną komórkową, pobierając 40 µL z jednego zbiorniczka i przenosząc je do przeciwległego zbiorniczka tego samego kanału – powtórz tę czynność 3 razy, aby uzyskać jednorodny rozkład komórek (Rysunek 4B).
- Usuń 40 µL zawiesiny z kanału, tak aby zawiesina komórkowa wypełniała jedynie sam kanał.
- Umieść preparat w inkubatorze i po 1 h od wysiewu sprawdź adhezję komórek za pomocą mikroskopu fazokontrastowego.
- Dodaj 120 µL podgrzanej do 37 °C pożywki do wzrostu komórek.
- Włóż preparat z powrotem do inkubatora na kolejne 3 h, aby umożliwić samoorganizację komórkową na mikrowzorcu (Rysunek 4C).
Rysunek 4: Samoorganizacja komórkowa i kontrola jakości array µPIPP. (A) Mikrostrukturalna powierzchnia składa się z kwadratowych, pokrytych FN punktów adhezyjnych, zaznaczonych na czerwono i otoczonych polimerem odpychającym komórki. (B) Po wysianiu komórek, komórki HuH7 są rozmieszczone losowo i (C) przylegają głównie do punktów adhezyjnych w okresie czasu 4 h. Przedrukowano za zgodą 7. Paski skali: 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
3. System perfuzyjny (Rysunek 2A)
UWAGA: Zastosowanie systemu perfuzji jest wymagane tylko wtedy, gdy w trakcie pomiarów time-lapse konieczne jest dodawanie odczynników lub markerów fluorescencyjnych. W zależności od potrzeb można podłączyć każdy kanał do osobnego systemu perfuzji lub połączyć kilka kanałów szeregowo do jednego systemu. Liczba systemów perfuzji odpowiada liczbie niezależnych warunków eksperymentalnych. Połącz rurki w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza i unikaj wprowadzenia pęcherzyków powietrza do systemu perfuzji. Jeśli system perfuzji nie jest stosowany, dodaj odczynniki/markery w komorze z laminarnym przepływem powietrza przed rozpoczęciem pomiarów time-lapse. System perfuzji został wykonany wewnętrznie, a użyte materiały wykazano w Tabeli materiałów. Montaż systemu perfuzji został opisany wcześniej9.
- Użyj strzykawki 1 mL (z wymiennym tłokiem) i napełnij ją 1 mL pożywki do hodowli komórek o temperaturze 37 °C.
- Podłącz strzykawkę do rurki doprowadzającej za pomocą zaworu i wypełnij rurkę pożywką.
- Podłącz rurkę doprowadzającą do zbiornika kanału i upewnij się, że nie pozostały w niej pęcherzyki powietrza.
- Aby podłączyć kolejny kanał szeregowo do tego systemu perfuzyjnego, podłącz łącznik szeregowy do zbiornika przeciwległego do rurki doprowadzającej w aktualnym kanale. Przejdź do następnego kanału i podłącz wolny koniec łącznika szeregowego do jednego z jego zbiorników.
- Powtarzaj poprzednie kroki, aż zostanie podłączona wymagana liczba kanałów szeregowo.
- Podłącz rurkę odprowadzającą bezpośrednio do wolnego zbiornika aktualnego kanału. Wypełnij podłączoną rurkę pożywką, aby sprawdzić, czy system perfuzyjny nie przecieka.
- Powtarzaj poprzednie kroki, aż wszystkie sześć kanałów preparatu zostanie podłączonych do systemu perfuzyjnego.
- Umieść preparat z podłączonym systemem (systemami) perfuzyjnym z powrotem w inkubatorze do czasu dalszego użycia lub umieść go bezpośrednio w komorze grzewczej mikroskopu, uprzednio rozgrzanej do 37 °C, w celu przeprowadzenia pomiarów time-lapse.
4. Mikroskopia time-lapse (Ryc. 2B)
UWAGA: W przypadku pomiarów długoterminowych należy utrzymywać stabilną temperaturę 37 °C oraz stabilny poziom CO2. Jako alternatywę dla pośrodka hodowlanego zależnego od CO2, można zastosować pośrodek L15, który nie wymaga systemu inkubacji gazowej.
UWAGA: W przypadku obrazowania ilościowego, podczas pomiaru time-lapse należy użyć pożywki do wzrostu komórek bez czerwieni fenolowej, aby zredukować fluorescencję tła, a do powtórzeń technicznych stosować te same ustawienia protokołu time-lapse oraz ten sam mikroskop.
- Skonfiguruj protokół time-lapse do rejestracji obrazów w kontraście fazowym i fluorescencyjnych z czasem ekspozycji 750 ms (zależnie od kamery), 10 min odstępu czasowego między kolejnymi cyklami przejścia przez listę pozycji oraz czasem obserwacji 30 h, używając obiektywu 10x i odpowiednich filtrów fluorescencyjnych.
- Umieść preparat sześciokanałowy z komórkami na matrycach jednokomórkowych w uchwycie na próbki w komorze grzewczej rozgrzanej do 37 °C. Jeśli do preparatu sześciokanałowego podłączone są systemy perfuzji, przymocuj rurki do stolika za pomocą taśmy, aby upewnić się, że preparat nie przesunie się podczas wymiany cieczy. Wprowadź wolne końce rurek odpływowych przez otwór w probówce reakcyjnej o pojemności 15 mL, aby zbierać odpady ciekłe.
- Ustaw listę pozycji dla skanującego pomiaru time-lapse. Upewnij się, że liczba pozycji pozwala na przeprowadzenie skanowania w określonym odstępie czasowym między kolejnymi cyklami przejścia przez listę pozycji. Przy użyciu obiektywu 10x można ustawić od 10 do 30 pozycji na kanał, aby przeskanować całkowity obszar mikrowzorca, w zależności od rozmiaru matrycy kamery.
- Rozpocznij pomiar time-lapse. Aby uzyskać lepszą jakość obrazu w pomiarach długoterminowych, zastosuj zautomatyzowany system korekcji ostrości.
5. Transfekcja mRNA markera fluorescencyjnego (Rysunek 2B)
UWAGA: W przypadku transfekcji w dwóch kanałach połączonych systemem rurek wymagana jest całkowita objętość 600 µL mieszaniny do transfekcji (300 µL na jeden kanał). Wskazane objętości odnoszą się do transfekcji w dwóch połączonych kanałach.
- Przygotować roztwór czynnika transfekcyjnego poprzez rozcieńczenie 1 µL czynnika transfekcyjnego w 200 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy i inkubować roztwór przez 5 min w temperaturze pokojowej.
- Przygotować roztwór mRNA poprzez rozcieńczenie 300 ng mRNA kodującego eGFP w 150 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy.
- Przygotować mieszaninę do transfekcji, dodając 150 µL roztworu czynnika transfekcyjnego do roztworu mRNA, a następnie dokładnie wymieszać. Inkubować mieszaninę do transfekcji przez 20 min w temperaturze pokojowej.
- Podczas inkubacji mieszaniny do transfekcji przepłukać układ rurek za pomocą strzykawki, używając 1 mL podgrzanego do 37 °C PBS. Podczas płukania rurek należy upewnić się, że stolik mikroskopu pozostaje nieruchomy. W razie potrzeby wstrzymać pomiar time-lapse.
- Rozcieńczyć mieszaninę do transfekcji do końcowego stężenia mRNA wynoszącego 0,5 ng/µL, dodając 300 µL pożywki z obniżoną zawartością surowicy.
- Przepłukać układ rurek za pomocą strzykawki, używając mieszaniny do transfekcji, i inkubować lipopleksy mRNA przez 1 h (w razie potrzeby wstrzymać pomiar time-lapse).
- Zakończyć inkubację transfekcyjną i usunąć niezwiązane lipopleksy mRNA, przepłukując układ za pomocą strzykawki 1 mL podgrzanej do 37 °C pełnej pożywki do wzrostu komórek (w razie potrzeby wstrzymać pomiar time-lapse).
6. Analiza obrazów i odczyt fluorescencji
- Przy pierwszym uruchamianiu analizy obrazu zainstaluj wersję 0.1.6 oprogramowania open-source „Automated Microstructure Analysis in Python” (PyAMA) z podanej lokalizacji10, zgodnie z zamieszczonymi tam instrukcjami.
- Upewnij się, że kanały obrazu (kontrast fazowy i fluorescencja) są dostępne w formie wielostronicowych 16-bitowych plików TIFF. W razie potrzeby dokonaj odpowiedniej konwersji.
- Uruchom PyAMA i kliknij Open stack…, aby otworzyć obrazy do analizy.
- Aby otworzyć każdy wielostronicowy plik TIFF, kliknij Open i wybierz plik, tak aby pojawił się on na liście załadowanych plików po lewej stronie okna dialogowego (Rysunek 5-1).
- Zaznacz kanały, które mają zostać uwzględnione w analizie. Dla każdego kanału wykonaj następujące kroki:
- Wybierz na liście załadowanych plików plik TIFF zawierający dany kanał.
- W sekcji Add new channel wybierz indeks kanału w pliku TIFF. Indeksowanie zaczyna się od zera; pierwszy kanał ma indeks 0, drugi kanał ma indeks 1 i tak dalej.
- Wybierz typ kanału. Wybierz Phase contrast lub Fluorescence dla odpowiednich kanałów obrazu oraz Segmentation dla kanału binarnego wskazującego kontury komórek.
- Opcjonalnie wprowadź etykietę kanału, aby rozróżnić poszczególne kanały fluorescencji: np. eGFP i DAPI.
- Po skonfigurowaniu kanału kliknij Add.
- Gdy wszystkie dodane kanały zostaną wyświetlone na liście kanałów po prawej stronie okna dialogowego, kliknij OK , aby załadować stos obrazów.
- Aby przeprowadzić segmentację przy użyciu wbudowanego w PyAMA algorytmu segmentacji do rozpoznawania komórek na podstawie obrazów kontrastu fazowego (Rysunek 5-2), przejdź do Tools | Binarize… i wprowadź nazwę pliku NumPy dla zbinaryzowanego kanału.
UWAGA: W aktualnej wersji załadowanie zbinaryzowanego kanału wymaga ponownego załadowania wszystkich kanałów. - Aby przeprowadzić korekcję tła11 w kanale fluorescencyjnym (Rysunek 5-3), upewnij się, że załadowano kanał fluorescencyjny oraz kanał segmentacji. Jeśli nie załadowano kanału segmentacji, upewnij się, że załadowano kanał kontrastu fazowego w celu automatycznej segmentacji. Przejdź do „Tools > Background correction…” i wybierz nazwę pliku TIFF dla wynikowego obrazu z poprawionym kanałem fluorescencyjnym.
UWAGA: W aktualnej wersji załadowanie kanału z korygowanym tłem wymaga ponownego załadowania wszystkich kanałów. - Obejrzyj wstępnie wybrane komórki (Rysunek 5-4) oraz ich zintegrowany sygnał fluorescencji (Rysunek 5-5), przełączając klatki czasowe, przeglądając kanały wymienione w menu kanałów po lewej stronie i klikając w komórki, aby wyróżnić ich przebiegi czasowe fluorescencji (Rysunek 1C). Skorzystaj z wyboru komórek, aby wykluczyć z dalszej analizy komórki nieżywe, niezwiązane z punktem adhezji lub przyłączone do innej komórki. Zmieniaj zaznaczenie komórek do odczytu, naciskając klawisz Shift i klikając w komórkę lub zaznaczając komórkę i naciskając Enter.
- Zapisz pojedyncze przebiegi czasowe dla pola komórki i zintegrowanej fluorescencji (Rysunek 5-6), klikając File | Save i wybierając katalog zapisu.
Rysunek 5Zautomatyzowane przetwarzanie serii obrazów time-lapse przy użyciu PyAMA. (1) Importowane są serie obrazów w kontraście fazowym i fluorescencyjnych dla każdej pozycji obrazowania. (2) Kontury komórek są wyznaczane poprzez segmentację stosu obrazów w kontraście fazowym. (3) Do obrazów fluorescencyjnych stosowana jest korekcja tła. (4) Kontury komórek są śledzone w czasie i wstępnie wybrane do eksportu. (5) Intensywność fluorescencji jest całkowana na podstawie śledzonych konturów komórek. (6) Analizie poddawane są obszary poszczególnych komórek oraz całkowite intensywności fluorescencji, a następnie eksportowane są przebiegi czasowe dla każdej komórki. Paski skali: 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
- Aby przeanalizować kinetykę translacji po transfekcji mRNA, dopasuj do każdego pojedynczego przebiegu czasowego w komórce model translacji oparty na biochemicznych równaniach szybkości, zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej przez Reiser et al.12. Dane i kod wykorzystane w tym badaniu są ogólnodostępne13.
- Dla każdego pojedynczego przebiegu czasowego w komórce wyznacz oszacowane parametry dopasowania modelu translacji, które reprezentują szybkość degradacji mRNA oraz moment rozpoczęcia translacji. Przykładowy zestaw danych został omówiony w sekcji reprezentatywnych wyników.
- Przeprowadź dalszą analizę rozkładów najlepszych oszacowań parametrów dla różnych warunków eksperymentalnych, aby zbadać zmienność międzykomórkową w obrębie populacji komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Podejście LISCA umożliwia efektywne gromadzenie przebiegów czasowych fluorescencji z pojedynczych komórek. Jako reprezentatywny przykład przedstawiamy sposób zastosowania metody LISCA do pomiaru ekspresji eGFP w pojedynczych komórkach po transfekcji. Dane z eksperymentu LISCA są wykorzystywane do oceny kinetyki dostarczania mRNA, co jest istotne dla opracowania skutecznych leków opartych na mRNA.
W szczególności wykazujemy różny wpływ dwóch lipidowych systemów dostarczania mRNA na moment rozpo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu opisaliśmy LISCA jako wszechstronną technikę śledzenia kinetyki komórkowej wewnątrzkomórkowych znaczników fluorescencyjnych na poziomie pojedynczej komórki. Aby przeprowadzić udany eksperyment LISCA, każdy z opisanych kroków w sekcji protokołu musi być ustalony indywidualnie, a następnie wszystkie kroki muszą zostać połączone. Każdy z trzech głównych aspektów LISCA obejmuje kluczowe kroki.
Wytwarzanie mikromacierzy jednokomórkowych
Jakość mikromacierzy ma kluczowe z...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z Niemieckiej Fundacji Naukowej (DFG) dla Collaborative Research Center (SFB) 1032. Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie ze strony niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji, Badań Naukowych i Technologii (BMBF) w ramach wspólnego projektu 05K2018-2017-06716 Medisoft oraz dotację z Bayerische Forschungsstiftung. Anita Reiser otrzymała stypendium DFG Fellowship za pośrednictwem Graduate School of Quantitative Biosciences Munich (QBM).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Inżynieria polimerowa Adtech Mikrorurki PTFE | Piec | 10178071 | |
| Binder | 9010-0190 | ||
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| Eksykator | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Żeńskie złącze Luer do rurki | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronectin | Yo Proteins | 663 | |
| Zestaw filtrów eGFP | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand Przezroczysta rurka silikonowa utwardzana platyną | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Inkubator | Okolab | OKO-H201 | |
| Binder | 9040-0012 | ||
| L-15 bez czerwieni fenolowej | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | ||
| Męski Luer | wyprodukowany we własnym zakresie, składający się z teflonu | ||
| Męskie złącze Luer do rurki | MEDNET | MTLS210-6005 | alternatywa dla męskich luerów produkowanych we własnym zakresie |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| Zawór bezigłowy do męskiego złącza Luer | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Oprogramowanie do obrazowania Wersja 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Szybkoutwardzalny klej optyczny do montażu systemu rur |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO PCO | |||
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) | przygotowana we własnym zakresie | ||
| Myjka plazmowa | Diener Femto | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| wafel krzemowy z mircorstrukturami | własnym zakresie produkowany | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| lepki suwak VI 0,4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Mä RZHÄ użytkownik | 00-24-626-0000 | |
| Ultraczysta woda | przygotowana | ||
| przez nas niepowlekane szkiełka nakrywkowe | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 ml | Omilab | 9166017V | z zamiennikiem sporn |
Bibliografia
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- El-Ali, J., Sorger, P. K., Jensen, K. F. Cells on chips. Nature. 442 (7101), 403-411 (2006).
- Segerer, F. J., et al. Versatile method to generate multiple types of micropatterns. Biointerphases. 11 (1), 011005(2016).
- Piel, M., Théry, M. Micropatterning in cell biology, part A/B/C. , Elsevier. (2014).
- Reiser, A., Zorn, M. L., Murschhauser, A., Rädler, J. O. Cell-Based Microarrays: Methods and Protocols. Ertl, P., Rothbauer, M. , Springer. New York. 41-54 (2018).
- Picone, R., Baum, B., McKendry, R. Methods in cell biology. 119, Elsevier. 73-90 (2014).
- Reiser, A. Single-cell time courses of mRNA transport and translation kinetics. , Ludwig-Maximilians University. PhD thesis (2019).
- Woschée, D. Softmatter LMU-Raedler Group. , Available from: https://github.com/SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama (2020).
- Schwarzfischer, M., et al. MIAAB, 29262. , Available from: https://push-zb.helmholtz-muenchen.de/frontdoor.php?source_opus=6773 (2020).
- Reiser, A., et al. Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection. Integrative Biology. 11 (9), 362-371 (2019).
- Reiser, A., Woschée, D., Mehrotra, N., Krzysztoń, R. S., Strey, H. H., Rädler, J. O. Supplementing data and code for: "Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection". Zenodo. , Version 1.0 (2019).
- Ferizi, M., et al. Stability analysis of chemically modified mRNA using micropattern-based single-cell arrays. Lab on a Chip. 15 (17), 3561-3571 (2015).
- Fröhlich, F., et al. Multi-experiment nonlinear mixed effect modeling of single-cell translation kinetics after transfection. NPJ systems biology and applications. 4 (1), 1-12 (2018).
- Krzysztoń, R., et al. Single-cell kinetics of siRNA-mediated mRNA degradation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 21, 102077(2019).
- Röttgermann, P. J., Alberola, A. P., Rädler, J. O. Cellular self-organization on micro-structured surfaces. Soft Matter. 10 (14), 2397-2404 (2014).
- Röttgermann, P. J., Dawson, K. A., Rädler, J. O. Time-resolved study of nanoparticle induced apoptosis using microfabricated single cell arrays. Microarrays. 5 (2), 8(2016).
- Murschhauser, A., et al. A high-throughput microscopy method for single-cell analysis of event-time correlations in nanoparticle-induced cell death. Communications Biology. 2 (1), 1-11 (2019).
- Chatzopoulou, E. I., et al. Chip-based platform for dynamic analysis of NK cell cytolysis mediated by a triplebody. Analyst. 141 (7), 2284-2295 (2016).
- Sztilkovics, M., et al. Single-cell adhesion force kinetics of cell populations from combined label-free optical biosensor and robotic fluidic force microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
