Obrazowanie żywych komórek macierzy jednokomórkowych (LISCA) - wszechstronna technika ilościowego określania kinetyki komórkowej

Podsumowanie

Prezentujemy metodę pozyskiwania przebiegów czasu reporterowego fluorescencji z pojedynczych komórek za pomocą mikrowzorców. Protokół opisuje przygotowanie macierzy pojedynczych komórek, konfigurację i obsługę mikroskopii poklatkowej ze skanowaniem żywych komórek oraz narzędzie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym do automatycznej preselekcji, kontroli wizualnej i śledzenia przebiegów czasu fluorescencji zintegrowanych z komórkami na miejsce adhezji.

Streszczenie

Obrazowanie żywych komórek w układach jednokomórkowych (LISCA) to uniwersalna metoda zbierania przebiegów czasowych sygnałów fluorescencyjnych z pojedynczych komórek w wysokiej przepustowości. Ogólnie rzecz biorąc, nabywanie przebiegów czasowych pojedynczej komórki z hodowanych komórek jest utrudnione przez ruchliwość komórek i różnorodność kształtów komórek. Mikromacierze adhezyjne standaryzują warunki panujące w pojedynczych komórkach i ułatwiają analizę obrazu. LISCA łączy mikromacierze jednokomórkowe ze skaningową mikroskopią poklatkową i automatycznym przetwarzaniem obrazu. W tym miejscu opisujemy eksperymentalne etapy odbywania kursów czasu fluorescencji pojedynczej komórki w formacie LISCA. Transfektujemy komórki przylegające do mikrowzorcowej matrycy za pomocą kodowania mRNA w celu wzmocnienia białka zielonej fluorescencji (eGFP) i monitorujemy kinetykę ekspresji eGFP setek komórek równolegle za pomocą skaningowej mikroskopii poklatkowej. Stosy danych obrazowych są automatycznie przetwarzane przez nowo opracowane oprogramowanie, które integruje intensywność fluorescencji na wybranych konturach komórek w celu wygenerowania przebiegów czasu fluorescencji pojedynczej komórki. Pokazujemy, że przebiegi ekspresji eGFP po transfekcji mRNA są dobrze opisane przez prosty model translacji kinetycznej, który ujawnia tempo ekspresji i degradacji mRNA. Omówiono dalsze zastosowania LISCA do korelacji wielu markerów w czasie zdarzenia w kontekście apoptozy sygnalizacyjnej.

Wprowadzenie

W ostatnich latach stało się oczywiste znaczenie eksperymentów na pojedynczych komórkach. Dane z pojedynczych komórek pozwalają na badanie zmienności między komórkami, rozdzielczość korelacji parametrów wewnątrzkomórkowych oraz wykrywanie kinetyki komórkowej, która pozostaje ukryta w pomiarach zespołowych^1,2,3. Aby zbadać kinetykę komórkową tysięcy pojedynczych komórek równolegle, potrzebne są nowe podejścia, które umożliwią monitorowanie komórek w standardowych warunkach przez okres od kilku godzin do kilku dni, a następnie ilościową analizę danych ⁴. W tym miejscu prezentujemy obrazowanie żywych komórek macierzy jednokomórkowych (LISCA), które łączy wykorzystanie matryc mikrostrukturalnych z mikroskopią poklatkową i automatyczną analizą obrazu.

Kilka metod generowania mikrostrukturalnych tablic jednokomórkowych zostało opracowanych i opublikowanych w literaturze^5,6. W tym miejscu pokrótce opisujemy mikroskalowe wzorce białek inicjowane przez osocz (μPIPP). Szczegółowy protokół wytwarzania macierzy jednokomórkowych przy użyciu μPIPP znajduje się również w reference⁷. Zastosowanie układów jednokomórkowych umożliwia wyrównanie tysięcy komórek na standaryzowanych miejscach adhezji, prezentujących zdefiniowane mikrośrodowiska dla każdej komórki, a tym samym zmniejsza źródło zmienności eksperymentalnej (Rysunek 1A). Macierze jednokomórkowe służą do monitorowania przebiegu czasu markerów fluorescencyjnych mających na celu wskazanie różnych procesów komórkowych. Długotrwała mikroskopia w trybie skanowania poklatkowego pozwala na monitorowanie dużego obszaru macierzy pojedynczych komórek, a tym samym próbkowanie danych z pojedynczych komórek w wysokiej przepustowości przez czas obserwacji wynoszący kilka godzin, a nawet dni. Powoduje to wygenerowanie stosów obrazów na osi czasu z każdej pozycji tablicy (Rysunek 1B). W celu zmniejszenia dużej ilości danych obrazowych i efektywnego wyodrębnienia pożądanych przebiegów czasu fluorescencji pojedynczej komórki, wymagane jest zautomatyzowane przetwarzanie obrazu, które wykorzystuje pozycjonowanie komórek (Rysunek 1C).

Wyzwaniem LISCA jest dostosowanie protokołów eksperymentalnych i narzędzi obliczeniowych do stworzenia wysokoprzepustowego testu, który generuje ilościowe i powtarzalne dane o kinetyce komórkowej. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy opis poszczególnych metod i sposobu ich łączenia w teście LISCA. Jako przykład omawiamy przebieg w czasie zwiększonej ekspresji białka zielonej fluorescencji (eGFP) po dostarczeniu sztucznego mRNA. Ekspresja eGFP po dostarczeniu mRNA jest opisana za pomocą równań szybkości reakcji, modelowania translacji i degradacji mRNA. Dopasowanie funkcji modelowej dla przebiegu czasowego stężenia eGFP do odczytu LISCA intensywności fluorescencji dla każdej pojedynczej komórki w czasie pozwala uzyskać najlepsze oszacowania parametrów modelu, takich jak szybkość degradacji mRNA. Jako reprezentatywny wynik omawiamy wydajność dostarczania mRNA dwóch różnych środków transfekcyjnych na bazie lipidów oraz różnice w ich rozkładach parametrów.

Rysunek 1: Przedstawienie przepływu pracy LISCA łączącego (A) mikrowzorzyste układy pojedynczych komórek, (B) skaningową mikroskopię poklatkową i (C) automatyczną analizę obrazów zarejestrowanych serii obrazów.Macierze jednokomórkowe składają się z dwuwymiarowego wzoru kwadratów adhezyjnych z przestrzenią odpychającą komórki, prowadzącą do ułożenia komórek na mikrowzorze, jak widać na obrazie kontrastu fazowego, a także na obrazie fluorescencyjnym komórek wykazujących ekspresję eGFP (A). Cały obszar mikrostrukturalny jest obrazowany w trybie skanowania poklatkowego, wielokrotnie wykonując zdjęcia w sekwencji pozycji (B). Zarejestrowane serie obrazów są przetwarzane w celu odczytania intensywności fluorescencji na komórkę w czasie (C). Podziałka skali: 500 μm (A), 200 μm (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

Rysunek 2: Akwizycja danych łącząca mikromacierze jednokomórkowe (A) ze skaningową mikroskopią poklatkową (B).W ramach przygotowania do eksperymentu poklatkowego przygotowuje się układ jednokomórkowy z mikrowzorem 2D kwadratów adhezyjnych (1), a następnie wysiewa się komórki i ustawia komórki na mikroschemacie (2), a także podłącza system perfuzyjny do szkiełka sześciokanałowego, co umożliwia obsługę cieczy podczas pomiaru poklatkowego (3). Przeprowadza się skaningowy eksperyment poklatkowy (4), a komórki są transfekowane pod mikroskopem poprzez wstrzyknięcie roztworu lipoplexu mRNA przez system perfuzyjny podczas eksperymentu poklatkowego (5). Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Wytwarzanie mikrostrukturalnych tablic jednokomórkowych (Rysunek 2A)

1. Przygotuj materiały potrzebne do produkcji macierzy μPIPP.
   1. Przygotować sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) o pH 7,4.
   2. Przygotować sterylną ultraczystą wodę o rezystywności co najmniej 18 MΩcm w temperaturze 25 °C.
   3. Przygotować roztwór roboczy PLL(20 kDa)-g[3,5] PEG(2 kDa) (PLL-PEG) o stężeniu 2 mg/ml PLL-PEG w ultraczystej wodzie zawierającej 150 mM NaCl i 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES).
   4. Przygotować roztwór białka macierzy zewnątrzkomórkowej do powlekania powierzchni: 1 mg/ml fibronektyny (FN) w PBS.
   5. Przygotuj płytkę krzemową z mikrowzorem wykonanym metodą fotolitografii⁸, która pełni funkcję wzorca wielokrotnego użytku. Mikrowzór składa się z kwadratów o długości krawędzi 30 μm, głębokości 12 μm i odległości między kwadratami 60 μm, ułożonych w sześć pasków, z których każdy ma szerokość 6 mm i wysokość 18 mm.
2. Zmieszać monomer polidimetylosiloksanu (PDMS) z 9% środkiem sieciującym (% masy) za pomocą zestawu elastomerów silikonowych i odgazowywać go przez około 30 minut, aż do uzyskania pęcherzyków powietrza za pomocą eksykatora. Odlać wafel krzemowy z warstwą PDMS o grubości około 3-5 mm i ponownie odgazowywać go przez około 30 minut, aż będzie wolny od pęcherzyków.
   1. Umieść wafel silikonowy z PDMS w piecu do pieczenia w temperaturze 50 °C, aby utwardzić PDMS przez co najmniej 4 godziny.
3. Wytnij stemple PDMS.
   1. Użyj skalpela i wytnij z warstwy PDMS jedno arcydzieło PDMS, które zawiera sześć pasków mikrowzorów.
   2. Umieść arcydzieło PDMS na ławce z mikrowzorem skierowanym do góry.
   3. Wytnij każdy z sześciu pasków mikrowzoru arcydzieła PDMS za pomocą żyletki na stempel PDMS. Zadbaj o to, aby krawędzie stempli PDMS były otwarte, odcinając część wzorzystego obszaru.
4. Umieść stemple PDMS na szkiełku nakrywkowym sześciokanałowego slajdu (Rysunek 3-1).
   1. Użyj niepowlekanego szkiełka nakrywkowego i zaznacz pozycje kanałów szkiełka sześciokanałowego, ostrożnie rysując folię ochronną szkiełka nakrywkowego. Następnie połóż szkiełko nakrywkowe na ławce folią ochronną skierowaną w dół.
   2. Umieść stemple PDMS mikrowzorem skierowanym w dół na szkiełku nakrywkowym w zaznaczonych miejscach kanału za pomocą pęsety.
   3. Sprawdź mocowanie stempli PDMS pod mikroskopem. Jeśli stempel PDMS jest całkowicie przymocowany do szkiełka nakrywkowego, stykające się kwadraty wydają się ciemniejsze niż odstęp. Mocowanie stempla PDMS do szkiełka nakrywkowego ma kluczowe znaczenie dla jakości mikrowzoru.
5. Umieść szkiełko nakrywkowe z sześcioma stemplami PDMS w myjce plazmowej i potraktuj je plazmą tlenową (ciśnienie 0,2 mbar, ~40 W przez 3 minuty), aby powierzchnie między stemplami PDMS a szkiełkiem nakrywkowym stały się hydrofilowe (Rysunek 3-2).
6. Wykonaj wszystkie dalsze etapy wytwarzania mikrowzoru w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Użyj 15 μl roztworu PLL-PEG i odpipetuj jedną kroplę obok każdego stempla PDMS, tak aby roztwór PLL-PEG został wchłonięty przez hydrofilowy wzór stempla PDMS (Rysunek 3-3). Pozwól PLL-PEG inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
7. Spłucz 1 ml ultraczystej wody na szkiełku nakrywkowym ze stemplami PDMS i usuń stemple PDMS za pomocą pęsety (Rysunek 3-4). Następnie spłucz szkiełko nakrywkowe po raz drugi 1 ml ultraczystej wody i pozostaw do wyschnięcia.
8. Gdy szkiełko nakrywkowe całkowicie wyschnie, przyklej do niego sześciokanałowy szkiełko samoprzylepne (Rysunek 3-4). Zwróć uwagę, aby obszary z mikrowzorem pokrywały się z dnem kanałów.
9. Funkcjonalizuj kwadraty adhezyjne za pomocą FN.
   1. Wlej 40 μl PBS do każdego kanału.
   2. Przygotować 100 μg/ml roztworu FN w PBS.
   3. Dodaj 40 μl roztworu FN do każdego kanału (Rysunek 3-5). Dokładnie wymieszać roztwór FN z PBS w kanale, usuwając 40 μl z jednego zbiornika i dodając go do przeciwległego zbiornika tego samego kanału przez 3 razy, aby uzyskać jednorodny roztwór. Inkubować roztwór FN przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Umyj każdy kanał trzykrotnie 120 μl PBS (Rysunek 3-6).
10. Aby sprawdzić jakość wzoru, użyj fluorescencyjnie znakowanego FN w kroku 9.2. (Rysunek 4A).
    UWAGA: Zalecamy przygotowanie tablicy μPIPP nie później niż jeden dzień przed wysiewem komórek, ponieważ PLL-PEG i FN nie są kowalencyjnie związane z podłożem, a jakość wzoru może z czasem ulec pogorszeniu. Przygotowaną tablicę μPIPP należy przechowywać w lodówce.

Rysunek 3: Produkcja mikromacierzy jednokomórkowych przez μPIPP.(1) Stemple PDMS o trójwymiarowej strukturze mikrowzoru na powierzchni są ułożone na szkiełku nakrywkowym sześciokanałowego szkiełka. (2) Szkiełko nakrywkowe ze stemplami PDMS jest poddawane działaniu plazmy tlenowej, aby powierzchnie były hydrofilowe. (3) Dodaje się PLL-PEG. Jest absorbowany przez mikrostrukturę przez siły kapilarne i sprawia, że powierzchnie niepokryte stemplem PDMS odpychają komórki. (4) Szkiełko nakrywkowe spłukuje się wodą w celu usunięcia pozostałego PLL-PEG. Następnie stemple PDMS są usuwane, a sześciokanałowy szkiełko samoprzyklejane jest do szkiełka nakrywkowego. (5) Fibronektyna, białko macierzy zewnątrzkomórkowej, jest dodawana w celu wytworzenia obszarów bez kleju komórkowego PLL-PEG. (6) Sześciokanałowy szkiełko jest przemywane solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Seed cell (Rysunek 2A)

UWAGA: Dla następujących etapów mycia, dodaj odpowiednią ciecz do jednego zbiornika, a następnie usuń równą objętość płynu z przeciwległego zbiornika kanału.

1. Przemyć każdy kanał 120 μl w pełni uzupełnionej pożywki do wzrostu komórek w temperaturze 37 °C. Przed dodaniem zawiesiny ogniw należy upewnić się, że pożywką wypełnione są tylko kanały, ale nie zbiorniki.
2. Odłącz komórki HuH7 od kolby do hodowli komórkowej zgodnie ze standardowym protokołem pasażowania komórek i dostosuj stężenie zawiesiny komórek do 4 x 10⁵ komórek/ml.
3. Dodać 40 μl zawiesiny komórkowej i wymieszać pożywkę wzrostu komórek z zawiesiną komórkową, usuwając 40 μl z jednego zbiornika i dodając go do przeciwległego zbiornika tego samego kanału 3 razy, aby uzyskać jednorodny rozkład komórek (Rysunek 4B).
4. Usunąć 40 μl zawiesiny z kanału, tak aby tylko kanał był wypełniony zawiesiną komórek.
5. Umieść szkiełko w inkubatorze i sprawdź adhezję komórek 1 godzinę po wysiewie za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.
6. Dodać 120 μl ciepłej pożywki do wzrostu komórek o temperaturze 37 °C.
7. Ale wsuń się z powrotem do inkubatora na kolejne 3 godziny, aby umożliwić komórkową samoorganizację na mikrowzorcu (Rysunek 4C).

Rysunek 4: Komórkowa samoorganizacja i kontrola jakości macierzy μPIPP.(A) Powierzchnia mikrostrukturalna składa się z kwadratowych plam adhezyjnych pokrytych FN zaznaczonych na czerwono, otoczonych polimerem odstraszającym komórki. (B) Po wysiewie komórek komórki HuH7 są losowo rozmieszczone i (C) przylegają głównie do miejsc adhezji przez okres 4 godzin. Przedruk za zgodą ⁷. Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. System perfuzji (Rysunek 2A)

UWAGA: Użycie systemu perfuzyjnego jest wymagane tylko wtedy, gdy w trakcie pomiaru poklatkowego konieczne jest dodanie odczynników lub markerów fluorescencyjnych. W zależności od potrzeb można podłączyć każdy kanał do osobnego systemu perfuzyjnego lub połączyć kilka kanałów szeregowo do tego samego systemu perfuzyjnego. Liczba układów perfuzyjnych odpowiada liczbie niezależnych warunków doświadczalnych. Podłącz probówki w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego i unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do systemu perfuzyjnego. Jeśli nie stosuje się systemu perfuzyjnego, dodaj odczynniki/markery do komory bezpieczeństwa biologicznego przed pomiarem poklatkowym. System perfuzyjny jest produkowany we własnym zakresie, użyty materiał jest wymieniony w tabeli materiałów. Montaż systemu perfuzyjnego został opisany wcześniej⁹.

1. Użyć strzykawki o pojemności 1 ml (z wymiennym spornem) i napełnić strzykawkę 1 ml pożywki do wzrostu komórek o temperaturze 37 °C.
2. Podłączyć strzykawkę do rurki wlotowej za pomocą zaworu i napełnić rurkę medium.
3. Podłącz rurkę wlotową do zbiornika kanału i upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
4. Aby podłączyć kolejny kanał szeregowo do tego systemu perfuzyjnego, podłącz złącze szeregowe do zbiornika przeciwległego do rurki wlotowej kanału prądowego. Przejdź do następnego kanału i podłącz wolny koniec złącza szeregowego do jednego z jego zbiorników.
5. Powtarzaj poprzednie kroki, aż wymagana liczba kanałów zostanie połączona szeregowo.
6. Podłącz rurkę wylotową bezpośrednio do wolnego zbiornika kanału prądowego. Napełnij podłączoną rurkę medium w celu sprawdzenia, czy system perfuzyjny nie przecieka.
7. Powtarzaj poprzednie kroki, aż wszystkie sześć kanałów szkiełka zostanie podłączonych do systemu perfuzyjnego.
8. Umieścić szkiełko z podłączonym systemem perfuzyjnym (systemami perfuzyjnymi) z powrotem w inkubatorze do czasu dalszego użycia lub umieścić je bezpośrednio w komorze grzewczej mikroskopu wstępnie ogrzanego do 37 °C w celu pomiaru poklatkowego.

4. Mikroskopia poklatkowa (Rysunek 2B)

UWAGA: Dla długoterminowych pomiarów, utrzymuj stabilną temperaturę 37 °C i stabilny poziom CO₂. Jako alternatywę dla pożywki do wzrostu komórek zależnej od CO₂ należy użyć pożywki L15, dla której nie jest wymagany system inkubacji gazu.

UWAGA: Do obrazowania ilościowego, użyj pożywki do wzrostu komórek bez czerwieni fenolowej podczas pomiaru poklatkowego, aby zredukować fluorescencję tła i użyj tych samych ustawień protokołu poklatkowego, jak również tego samego mikroskopu dla technicznych powtórzeń.

1. Ustaw protokół poklatkowy do rejestrowania obrazu z kontrastem fazowym i obrazu fluorescencyjnego z czasami naświetlania 750 ms (w zależności od kamery), 10-minutowym odstępem czasu między kolejnymi pętlami na liście pozycji i czasem obserwacji 30 godzin, przy użyciu obiektywu 10x i odpowiednich filtrów fluorescencyjnych.
2. Umieścić sześciokanałowy szkiełko z komórkami na układach jednokomórkowych w uchwycie próbki w ciepłej komorze grzewczej o temperaturze 37 °C. Jeśli systemy perfuzyjne są podłączone do szkiełka sześciokanałowego, przymocuj rurki do stolika za pomocą taśmy, aby upewnić się, że szkiełko sześciokanałowe nie przesuwa się podczas wymiany cieczy. Włóż wolne końce rurek wylotowych przez otwór w probówce reakcyjnej o pojemności 15 ml, aby zebrać odpady płynne.
3. Ustaw listę pozycji dla skanowania pomiaru poklatkowego. Upewnij się, że liczba pozycji może być skanowana w zdefiniowanym przedziale czasu między kolejnymi pętlami na liście pozycji. W przypadku obiektywu z powiększeniem 10x można ustawić od 10 do 30 pozycji na kanał, aby zeskanować cały obszar mikrowzoru w zależności od rozmiaru chipa aparatu.
4. Rozpocznij pomiar poklatkowy. Aby uzyskać lepszą jakość obrazu z pomiarów długotrwałych, użyj automatycznego systemu korekcji ostrości.

5. Marker fluorescencyjny - transfekcja mRNA (Rysunek 2B)

UWAGA: Do transfekcji w dwóch kanałach połączonych systemem rurek, potrzebna jest całkowita objętość 600 μL mieszanki transfekcyjnej (300 μL dla jednego kanału). Wskazane objętości odnoszą się do transfekcji w dwóch połączonych kanałach.

1. Przygotować roztwór środka do transfekcji, rozcieńczając 1 μl środka do transfekcji w 200 μl pożywki o obniżonej surowicy i pozostawić roztwór do inkubacji przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Przygotuj roztwór mRNA, rozcieńczając 300 ng mRNA kodującego eGFP w 150 μl pożywki zredukowanej w surowicy.
3. Przygotować mieszaninę do transfekcji, dodając 150 μl roztworu środka do transfekcji do roztworu mRNA i dobrze wymieszać. Pozostaw mieszankę transfekcji do inkubacji przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
4. Przepłukać system przewodów 1 ml ciepłego PBS o temperaturze 37 °C za pomocą strzykawki podczas inkubacji mieszanki do transfekcji. Podczas płukania probówek upewnij się, że stolik mikroskopu się nie porusza. W razie potrzeby wstrzymaj pomiar poklatkowy.
5. Rozcieńczyć mieszaninę transfekcyjną do końcowego stężenia mRNA 0,5 ng/μl, dodając 300 μl pożywki zredukowanej surowicą.
6. Przepłukać system rurek mieszanką do transfekcji za pomocą strzykawki i pozostawić lipopleksy mRNA do inkubacji przez 1 godzinę (w razie potrzeby wstrzymać pomiar poklatkowy).
7. Przerwać inkubację transfekcji i wypłukać niezwiązane lipopleksy mRNA, przemywając 1 ml ciepłej, w pełni uzupełnionej pożywki do wzrostu komórek o temperaturze 37 °C za pomocą strzykawki (w razie potrzeby wstrzymać pomiar poklatkowy).

6. Analiza obrazu i odczyt fluorescencji

1. Uruchamiając analizę obrazu po raz pierwszy, zainstaluj wersję 0.1.6 oprogramowania open source "Automated Microstructure Analysis in Python" (PyAMA) z podanej lokalizacji^{10 zgodnie z} podanymi tam instrukcjami.
2. Upewnij się, że kanały obrazu (kontrast fazowy i fluorescencja) są dostępne jako 16-bitowe pliki TIFF z wieloma obrazami. W razie potrzeby przekonwertuj je odpowiednio.
3. Uruchom PyAMA i kliknij Otwórz stos..., aby otworzyć obrazy do analizy.
4. Dla każdego pliku TIFF z wieloma obrazami, który chcesz otworzyć, kliknij Otwórz i wybierz plik tak, aby był wyświetlany na liście załadowanych plików po lewej stronie okna dialogowego (Rysunek 5-1).
5. Zaznacz kanały, które mają zostać uwzględnione w analizie. Dla każdego kanału wykonaj następujące kroki.
   1. Z listy załadowanych plików wybierz plik TIFF zawierający kanał.
   2. W sekcji Dodaj nowy kanał wybierz indeks kanału w pliku TIFF. Indeksowanie jest liczone od zera; Pierwszy kanał ma indeks 0, drugi kanał ma indeks 1 i tak dalej.
   3. Wybierz typ kanału. Wybierz Kontrast fazowy lub Fluorescencja dla odpowiednich kanałów obrazu i Segmentacja dla kanału binarnego wskazującego kontury komórek.
   4. Opcjonalnie wprowadź etykietę kanału, aby rozróżnić różne kanały fluorescencyjne: eGFP i DAPI.
   5. Po skonfigurowaniu kanału kliknij przycisk Dodaj.
6. Gdy wszystkie dodane kanały zostaną wyświetlone na liście kanałów po prawej stronie okna dialogowego, kliknij OK, aby załadować stos.
7. Aby przeprowadzić segmentację przy użyciu wbudowanego algorytmu segmentacji PyAMA do rozpoznawania komórek na podstawie obrazów kontrastu fazowego (Rysunek 5-2), przejdź do Narzędzia | Binaryzuj... i wprowadź nazwę pliku NumPy z binaryzowanym kanałem.
   UWAGA: W obecnej wersji wczytywanie kanału binaryzowanego wymaga ponownego załadowania wszystkich kanałów.
8. Aby wykonać korekcję tła¹¹ na kanale fluorescencji (Rysunek 5-3), upewnij się, że kanał fluorescencji i kanał segmentacji są załadowane. Jeśli nie jest załadowany żaden kanał segmentacji, upewnij się, że załadowany jest kanał kontrastu fazowego do automatycznej segmentacji. Przejdź do "Narzędzia > Korekcja tła..." i wybierz nazwę pliku dla wynikowego pliku TIFF z poprawionym kanałem fluorescencji.
   UWAGA: W obecnej wersji wczytywanie kanału z pokoracją tła wymaga ponownego załadowania wszystkich kanałów.
9. Sprawdź wstępnie wybrane komórki ( Rysunek 5-4) i ich zintegrowany sygnał fluorescencyjny ( Rysunek 5-5), przewijając ramy czasowe, przeglądając kanały wymienione w menu kanałów po lewej stronie i klikając komórki, aby podświetlić ich przebiegi czasu fluorescencji ( Rysunek 1C). Użyj wyboru komórek, aby wykluczyć komórki, które nie są żywotne, nie są ograniczone do miejsca adhezji lub nie są przyłączone do innej komórki z dalszej analizy. Przełącz wybór komórek do odczytu, naciskając Shift i klikając komórkę lub podświetlając komórkę i naciskając Enter.
10. Zapisz przebiegi czasowe pojedynczej komórki dla obszaru komórki i zintegrowanej fluorescencji (Rysunek 5-6), klikając Plik | Zapisz i wybierz katalog, w którym chcesz zapisać.

Rysunek 5: Automatyczne przetwarzanie obrazów poklatkowych za pomocą PyAMA.(1) Importowane są serie obrazów z kontrastem fazowym i fluorescencją dla każdej pozycji obrazowania. (2) Kontury komórek są określane przez segmentację na stosie obrazów z kontrastem fazowym. (3) Do obrazów fluorescencyjnych stosowana jest korekcja tła. (4) Kontury komórek są śledzone w czasie i wstępnie wybierane do eksportu. (5) Intensywność fluorescencji jest integrowana na podstawie śledzonych konturów komórek. (6) Ocenia się obszary komórek jednokomórkowych i zintegrowane intensywności fluorescencji, a następnie eksportuje się przebiegi czasowe dla każdej komórki. Podziałka skali: 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Aby przeanalizować kinetykę translacji po transfekcji mRNA, dopasuj model translacji oparty na równaniach szybkości biochemicznej do każdego przebiegu czasu pojedynczej komórki, jak opisano wcześniej przez Reisera i wsp.¹². Dane i kod użyte w tym badaniu są publicznie dostępne¹³.
2. Dla każdego przebiegu czasowego pojedynczej komórki pobierz szacowane parametry dopasowania modelu translacji, które reprezentują szybkość degradacji mRNA i punkt czasowy początku translacji. Przykładowy zestaw danych omówiono w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych.
3. Przeprowadzić dalszą analizę rozkładów najlepszych oszacowań parametrów dla różnych warunków eksperymentalnych w celu zbadania zmienności między komórkami w obrębie populacji komórek.

Wyniki

Podejście LISCA umożliwia efektywne zbieranie przebiegów czasu fluorescencji z pojedynczych komórek. Jako reprezentatywny przykład przedstawiamy, w jaki sposób metoda LISCA jest stosowana do pomiaru ekspresji eGFP w pojedynczej komórce po transfekcji. Dane z eksperymentu LISCA są wykorzystywane do oceny kinetyki dostarczania mRNA, co jest ważne dla opracowania skutecznych leków mRNA.

W szczególności pokazujemy różny wpływ dwóch systemów dostarczania mRNA opartych na lipidach w odniesieniu do p...

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy LISCA jako wszechstronną technikę śledzenia kinetyki komórkowej wewnątrzkomórkowych znaczników fluorescencyjnych na poziomie pojedynczej komórki. Aby przeprowadzić udany eksperyment LISCA, każdy z opisanych kroków w sekcji protokołu musi być ustalony indywidualnie, a następnie wszystkie kroki muszą zostać połączone. Każdy z trzech głównych aspektów LISCA obejmuje kluczowe kroki.

Wytwarzanie mikromacierzy jednokomórkowych
Jakość mikromacierzy ma kluczowe z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inżynieria polimerowa Adtech Mikrorurki PTFE	Piec	10178071
	Binder	9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10x	Nikon	MRH20100
Eksykator	Roth	NX07.1
Eclipse Ti-E	Nikon
eGFP mRNA	Trilink	L-7601
Żeńskie złącze Luer do rurki	MEDNET	FTL210-6005
Płodowa surowica bydlęca	Thermo Fisher	10270106
Fibronectin	Yo Proteins	663
Zestaw filtrów eGFP	AHF	F46-002
Fisherbrand  Przezroczysta rurka silikonowa utwardzana platyną	Fisher Scientific	11768088
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630080
Inkubator	Okolab	OKO-H201
	Binder	9040-0012
L-15 bez czerwieni fenolowej	Thermo Fisher	21083027
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher
Męski Luer			wyprodukowany we własnym zakresie, składający się z teflonu
Męskie złącze Luer do rurki	MEDNET	MTLS210-6005	alternatywa dla męskich luerów produkowanych we własnym zakresie
NaCl (5 M)	Thermo Fisher	AM9760G
Zawór bezigłowy do męskiego złącza Luer	MEDNET	NVFMLLPC
NIS Elements	Nikon		Oprogramowanie do obrazowania Wersja 5.02.00
NOA81	Thorlabs	NOA81	Szybkoutwardzalny klej optyczny do montażu systemu rur
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO PCO
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)			przygotowana we własnym zakresie
Myjka plazmowa	Diener Femto	Pico-BRS
PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa)	SuSoS AG
wafel krzemowy z mircorstrukturami			własnym zakresie produkowany
Sola Light Engine	Lumencor
lepki suwak VI 0,4	ibidi	80608
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning	1673921
Tango 2	Mä RZHÄ użytkownik	00-24-626-0000
Ultraczysta woda			przygotowana
przez nas niepowlekane szkiełka nakrywkowe	ibidi	10813
Injekt-F Solo, 1 ml	Omilab	9166017V	z zamiennikiem sporn