Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62027

⸱

18 kwietnia 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Northwest Normal University, 2State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, 3Department of Bioscience, Tokyo University of Agriculture

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy prostą metodę rozdzielania komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajników danio pręgowanego, która ułatwi badania rozwoju jajników u danio pręgowanego.

Streszczenie

Danio pręgowany stał się idealnym modelem do badania rozwoju jajników kręgowców. Pęcherzyk jest podstawową jednostką jajnika, która składa się z oocytów i otaczających komórek pęcherzykowych. Niezbędne jest oddzielenie zarówno komórek pęcherzykowych, jak i oocytów do różnych celów badawczych, takich jak pierwotna hodowla komórek pęcherzykowych, analiza ekspresji genów, dojrzewanie oocytów i zapłodnienie in vitro itp. Konwencjonalna metoda wykorzystuje kleszcze do oddzielenia obu przedziałów, co jest pracochłonne, czasochłonne i powoduje duże uszkodzenie oocytu. Tutaj opracowaliśmy prostą metodę oddzielenia obu komór za pomocą ciągniętej szklanej kapilary. Pod mikroskopem stereoskopowym oocyty i komórki pęcherzykowe można łatwo oddzielić przez pipetowanie w wyciągniętej cienkiej szklanej kapilarze (średnica zależy od średnicy pęcherzyka). W porównaniu z metodą konwencjonalną, ta nowa metoda ma wysoką skuteczność w oddzielaniu zarówno oocytów, jak i komórek pęcherzykowych oraz ma niewielkie uszkodzenia oocytów. Co ważniejsze, metoda ta może być stosowana do pęcherzyków we wczesnym stadium, w tym na etapie prewitellogenezy. W ten sposób ta prosta metoda może być stosowana do oddzielania komórek pęcherzykowych i oocytów danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Danio pręgowany jest głównym organizmem modelowym do badań nad rozwojem i fizjologią kręgowców. Danio pręgowany może służyć jako dobry model do badania molekularnych mechanizmów rozwoju jajników1,2,3. Wiele cech rozwoju jajników jest w dużym stopniu zachowanych podczas ewolucji od ryb do ssaków1,2. Podobnie jak inne kręgowce, dorosłe rybki danio pręgowanego mają asynchroniczne jajniki, zawierające pęcherzyki jajnikowe wszystkich etapów rozwoju4. Pęcherzyk jest podstawowym elementem rozrodczym jajnika. Pęcherzyk składa się z oocytu, który jest otoczony jedną lub kilkoma warstwami komórek somatycznych zwanych komórkami pęcherzykowymi. Rozwój pęcherzyków zależy od dwukierunkowej komunikacji między oocytami a komórkami pęcherzykowymi5. Niezbędne jest oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów od pęcherzyków jajnikowych do różnych celów badawczych, takich jak hodowla pierwotna komórek pęcherzykowych, analiza ekspresji genów, dojrzewanie oocytów i zapłodnienie in vitro.

Tradycyjne metody separacji obejmują mechaniczne rozdzielanie za pomocą kleszczy i trawienie enzymatyczne6,7,8,9,10. Jednak mechaniczne oddzielanie za pomocą kleszczy jest czasochłonne i pracochłonne. Spowoduje to również duże uszkodzenie oocytu podczas separacji. Chociaż metoda trawienia enzymatycznego jest prosta w obsłudze i wymaga krótkiego czasu, czas leczenia i stężenie enzymu powinny zostać zweryfikowane, a integralność i przeżywalność izolowanych oocytów nie są idealne. Dlatego opracowaliśmy prostą metodę oddzielania obu przedziałów na różnych etapach rozwoju za pomocą ciągniętych szklanych rurek kapilarnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury wykonywane w eksperymentach na rybach są zgodne z przepisami Komisji Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Northwest Normal University.

1. Przygotowania

  1. zwierzęta
    1. Użyj dorosłej samicy danio pręgowanego o długości ciała 4-6 cm.
      UWAGA: Użyliśmy danio pręgowanego z lokalnego targu.
    2. Danio pręgowany należy przechowywać w systemie z cyrkulacją wody o 14-godzinnym cyklu świetlnym i 10-godzinnym cyklu ciemnym w temperaturze około 28 °C.
    3. Karm ryby dwa razy dziennie nowo wyklutymi krewetkami solankowymi.
  2. Ciągnięta szklana kapilara
    1. Użyj szklanej kapilary o średnicy 15 cm i umieść jej głowicę w palniku alkoholowym, aby ją podgrzać. Chwyć jeden koniec szklanej kapilary ręką, a drugi koniec przytrzymaj kleszczami.
    2. Po podgrzaniu 5-10 sekund szkło na ogniu palnika alkoholowego staje się czerwone i miękkie. Rozciągnij główkę szklanej kapilary za pomocą kleszczyków, aby otwór kapilarny miał wymaganą średnicę.
      UWAGA: Średnica zależy od średnic pęcherzyków: prewitellogenne (PV; o średnicy ok. 0,30 mm), wczesne, witellogenne (EV; o średnicy ok. 0,40 mm), midwitellogenne (MV; o średnicy ok. 0,50 mm), późno witellogenne (LV; o średnicy ok. 0,60 mm) i w pełni rozwinięte, ale niedojrzałe (FG; o średnicy ok. 0,65 mm).
    3. Rozciągnij otwór szklanej kapilary do odpowiedniej średnicy, która jest nieco mniejsza od wielkości oddzielonych pęcherzyków. Szklana kapilara z otworem znacznie większym niż rozmiar pęcherzyków jajnikowych nie może dokonać separacji, ale znacznie mniejsze pękłyby pęcherzyki podczas separacji. Przećwicz kilkakrotnie rozciąganie szklanej kapilary.
      UWAGA: Czas nagrzewania zależy od wielkości szklanej kapilary. Nie rozciągaj bezpośrednio szklanej kapilary na ogniu palnika alkoholowego. Spowoduje to rozbicie szklanej kapilary.
    4. Przeciąć szklaną kapilarnę za pomocą noża do ampułek i rozbić szklaną kapilarnę kleszczami, aby uzyskać gładkie nacięcie.
      UWAGA: Ostry lub złamany otwór szklanej kapilary uszkodziłby mieszki włosowe.
    5. Za pomocą plastikowej rurki o długości 30 cm włóż końcówkę do pipety o pojemności 1 ml z elementem filtrującym na jednym końcu, włóż ciągniętą szklaną kapilarnę na końcu pipety, a na drugim końcu podłącz końcówkę do pipety o pojemności 200 μl.

2. Separacja oocytów danio pręgowanego i komórek pęcherzykowych na różnych etapach

  1. Rozwarstwienie jajnika danio pręgowanego
    1. Napełnij wiadro z lodem do 4/5 objętości lodem z gnojowicy i dodaj tyle wody dla ryb, aby gnojowica mogła unosić się na wodzie. Odczekaj 2-5 minut, sprawdź temperaturę wody i upewnij się, że temperatura wynosi 2-4 °C.
    2. Dorosłe samice należy znieczulić, umieszczając ryby w lodowatej wodzie na co najmniej 2-5 minut, aż ryby przestaną poruszać skrzelami. Odetnij głowę rybie, przecinając rdzeń kręgowy za pomocą ostrych nożyczek, aby zapewnić śmierć.
    3. Umieść rybę na płycie preparacyjnej za pomocą kleszczy.
    4. Użyj nożyczek do preparowania, aby ciąć w następujący sposób. Rozetnij od kloaki do skrzeli wzdłuż linii środkowej brzucha. Wyciąć z tyłu kloaki. Przeciąć od przedniego końca do strony grzbietowej. Delikatnie usuń skórę i mięśnie po jednej stronie ciała. Odsłoń narządy wewnętrzne i wyjmij cały jajnik za pomocą kleszczy.
    5. Natychmiast delikatnie umieścić jajniki w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm zawierającym 60% pożywki L-15 (L-15) firmy Leibovitz.
  2. Izolacja pęcherzyków jajnikowych
    UWAGA: Przyjęty przez nas system etapowania jest oparty na oryginalnej definicji Selman et al.4.
    1. Ręcznie wyizoluj mieszki włosowe na różnych etapach za pomocą pary cienkich kleszczy, jak opisano wcześniej8.
    2. Pęcherzyki jajnikowe należy podzielić na następujące etapy: PV, EV, MV, LV i FG.
  3. Oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytu od pęcherzyków jajnikowych
    1. Umieść pęcherzyki jajnikowe na różnych etapach na czystej szalce Petriego zawierającej 60% pożywki L-15.
    2. Używając wyciągniętej szklanej kapilary z kroku 1.2, zassaj mieszki włosowe do szklanej kapilary na 2-3 cm i wydmuchaj je.
      UWAGA: Gdy średnica otworu szklanych naczyń włosowatych jest odpowiednia, pęcherzyk można jednokrotnie oddzielić od oocytu przez inhalację.
      1. Jeśli warstwa komórek pęcherzykowych jest mocno przymocowana do oocytu, powtórz 2-3 razy, aby uzyskać całkowite oddzielenie. Unikaj wielokrotnych prób przepchnięcia pęcherzyka przez mniejszą naczynkę, co mogłoby uszkodzić pęcherzyk.
        UWAGA: W procesie wdychania i wydmuchiwania warstwa pęcherzykowa odpada i oddziela się od oocytu, a na końcu komórki pęcherzykowe i ogołocone oocyty są oddzielane (Ryc. 1).
    3. Połącz ogołocone, ale nienaruszone oocyty i zbierz ocalałe oocyty pozbawione do dalszych testów.
    4. Aby zbadać, czy komórki pęcherzykowe zostały oddzielone od nienaruszonych pęcherzyków, należy wybarwić nienaruszone pęcherzyki i oddzielone oocyty 4',6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI).
      1. Utrwalić próbki w 4% buforowanym paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę. Przemyć kilkakrotnie za pomocą PBS.
      2. Bejca przez DAPI w RT przez 30 min. Kilkakrotnie umyta PBS. Oglądaj i fotografuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (np. Leica DFC7000 T).
    5. Aby potwierdzić zakończoną separację, utrwal nienaruszone pęcherzyki i oddzielone oocyty w 4% buforowanym paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C i zanurz w pożywce do zamrażania tkanek (np. Leica) w temperaturze -25 °C.
      1. Wytnij utrwalone tkanki na mikrotomie i zamontuj na szkiełkach podstawowych.
      2. Umyj skrawki w PBS i uwidocznij jądra komórkowe za pomocą DAPI. Oglądaj i fotografuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.

3. Dojrzewanie in vitro (IVM) i zapłodnienie in vitro (IVF)

UWAGA: Procedura IVM in vitro została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem z drobną modyfikacją 11,12,13.

  1. Przygotuj świeżą pożywkę do dojrzewania (+pożywkę DHP) przed wycięciem jajników od dorosłej samicy danio pręgowanego. Aby przygotować świeżą pożywkę do dojrzewania, dodaj 9 ml pożywki L-15 firmy Leibovitz o pH 9,0 do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Dodać 10 μl 17α-20β-dihydroksy-4 pregnen-3-onu (DHP) (5 mg/ml), 490 μldH2O i 500 μl 10% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).
  2. Przygotuj wcześniej roztwór Hanka i roztwór E3. Przygotuj roztwór Hanksa zgodnie z opisem Baarsa i wsp.14. Przygotuj pożywkę E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4 i 1-5% błękitu metylenowego.
  3. Wykonaj sekcję jajnika danio pręgowanego i izolację pęcherzyków jajnikowych, jak w kroku 2.
  4. Zbierz w pełni rozwinięte pęcherzyki i użyj jako niedojrzałych oocytów. Dla każdej dorosłej samicy danio pręgowanego można wyizolować co najmniej 150-200 w pełni rozwiniętych pęcherzyków etapowych. Wybierz nienaruszone i zdrowe mieszki włosowe do IVM.
  5. Inkubuj w pełni rozwinięte pęcherzyki w pożywce +DHP na płytkach 12-dołkowych, okresowo sprawdzając, czy oocyty pozostają nienaruszone. Usunąć wszelkie lityczne oocyty za pomocą pipety Pasteura.
    UWAGA: Podczas dojrzewania oocytów oocyty stają się stopniowo przezroczyste. Większość oocytów staje się przezroczysta po leczeniu DHP przez 2 godziny. Można to zaobserwować pod mikroskopem preparacyjnym z optyką światła przechodzącego.
  6. Usunąć najbardziej zewnętrzne komórki pęcherzykowe z każdego dojrzałego oocytu, jak opisano w kroku 2.3.
  7. Przenieś ogołocone oocyty na szalkę Petriego z kilkoma kroplami pożywki hodowlanej i przystąp do zapłodnienia.
  8. Przygotuj świeży roztwór nasienia, używając jąder wyciętych od co najmniej trzech samców w 500 μl roztworu Hanksa. Umieść roztwór nasienia na lodzie, gdzie może utrzymać swoją moc zapłodnienia do 2-3 godzin.
  9. Dodać 100 μl roztworu nasienia do ogołoconych i dojrzałych oocytów na szalce Petriego. Delikatnie dodaj roztwór nasienia do jaj i zakręć plemniki i komórki jajowe razem za pomocą końcówki pipety.
  10. Natychmiast dodaj 1 ml roztworu pożywki E3, aby aktywować jaja i ponownie delikatnie zawiruj jaja i plemniki za pomocą końcówki pipety.
  11. Po około 1 minucie po zapłodnieniu (mpf) zalej płytkę roztworem pożywki E3. Pełne rozszerzanie kosmówki można zaobserwować w granicach 10-15 mpf.
  12. W przedziale 35-45 mpf wybierz zarodki, które przechodzą symetryczny podział na stadium 2-komórkowe i które są zatem zapładniane. Usuń zarodki, które nie przechodzą rozszczepienia komórek.
  13. Pozwolić zarodkom rozwinąć się na szalce Petriego w temperaturze 28 °C, przy czym limit wynosi 80 zarodków na 10 cm płytkę. Oglądaj i fotografuj rozwój zarodka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszą metodę można wykorzystać do oddzielenia komórek mieszkowych i oocytów na różnych etapach rozwoju pęcherzyków jajnikowych u danio pręgowanego. Rycina 1 przedstawia oddzielanie oocytów i komórek mieszkowych z pęcherzyków jajnikowych danio pręgowanego za pomocą szklanej rurki kapilarnej (Rycina 1). Aby sprawdzić, czy komórki mieszkowe zostały oddzielone od nienaruszonych pęcherzyków, nienaruszone pęcherzyki oraz oddzielone oocyty z pęcherzyków na różnych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisujemy tutaj nowatorską metodę prostego i szybkiego oddzielania komórek pęcherzykowych i oocytów od pęcherzyków jajnikowych danio pręgowanego. Ta metoda ma kilka zalet w porównaniu z metodą konwencjonalną. Najważniejszym z nich jest znacznie zwiększona łatwość separacji przy wysokiej wydajności i skuteczności, ponieważ wymagana jest tylko jedna i zewnętrzna manipulacja. Ten punkt zwiększa możliwość zastosowania dla badaczy, którzy nie są dobrzy w anatomii mikroskopowej. Z naszego doświadczenia wynika, że za pomocą szk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca badawcza była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin [32060170, 31601205 i 31560334], projekt naukowy wspierany przez Chińską Radę Stypendialną oraz fundusz Państwowego Kluczowego Laboratorium Ekologii Słodkowodnej i Biotechnologii [2020FB05].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
17α,20β-DHPCayman16146-5 (5 mg)
Płytka 24-dołkowaCorning3524
Obcinacz do ampułekAS ONE5-124-22 1 worek (100 sztuk)
Bezwodny Na2HPO4Kaixin Chemical500 g
Krewetki solankoweHongjie250 g
CaCl2Beichen Fangzheng500 g
Naczynie hodowlaneBiosharpBS-90-D (10PCS/PK)
DAPISolarbioS2110 (25mL)
Mikroskop preparacyjnyZEISSStemi 305
Kleszcze preparacyjneVETUSHRC30
Nożyczki preparacyjneKefu160 mm 
Stereoskop fluorescencyjny LeicaM205C
Kapilaraszklana IWAKIIK-PAS-5P (200 sztuk / opakowanie)
Hoechst 33342SolarbioC0031 (1 mg)
KClBeichen Fangzheng500 g
KH2PO4Kaixin Chemical500 g
Leibovitz' s L-15 średniGibco41300-039 (10 razy; 1L)
MgSO4• 7H2OBeichen Fangzheng500 g
Końcówki do mikropipetAxygenMCT-150-C
NaClBeichen Fangzheng500 g
NaHCO3Beichen Fangzheng500 g
Penicilia-streptomyciaGibco#15140122 (100 mL)
Mikroskop stereoskopowyZEISSOdkryj.v20

Bibliografia

  1. Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
  2. Ge, W. Intrafollicular paracrine communication in the zebrafish ovary: the state of the art of an emerging model for the study of vertebrate folliculogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 237, 1-10 (2005).
  3. Li, J., Ge, W. Zebrafish as a model for studying ovarian development: Recent advances from targeted gene knockout studies. Molecular and Cellular Endocrinology. 507, 1-19 (2020).
  4. Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. Journal of Morphology. 218, 203-224 (1993).
  5. Matzuk, M. M., Burns, K. H., Viveiros, M. M., Eppig, J. J. Intercellular communication in the mammalian ovary: oocytes carry the conversation. Science. 296, 2178-2180 (2002).
  6. Liu, L., Ge, W. Growth differentiation factor 9 and its spatiotemporal expression and regulation in the zebrafish ovary. Biology of Reproduction. 76, 294-302 (2007).
  7. Zhou, R., Tsang, A. H., Lau, S. W., Ge, W. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and its receptors in the zebrafish ovary: evidence for potentially dual roles of PACAP in controlling final oocyte maturation. Biology of Reproduction. 85, 615-625 (2011).
  8. Li, J., Liu, Z., Wang, D., Cheng, C. H. K. Insulin-like growth factor 3 is involved in oocyte maturation in zebrafish. Biology of Reproduction. 84, 476-486 (2011).
  9. Pang, Y., Thomas, P. Role of G protein-coupled estrogen receptor 1, GPER, in inhibition of oocyte maturation by endogenous estrogens in zebrafish. Developmental Biology. 342, 194-206 (2010).
  10. Peyton, C., Thomas, P. Involvement of epidermal growth factor receptor signaling in estrogen inhibition of oocyte maturation mediated through the G protein-coupled estrogen receptor (Gper) in zebrafish (Danio rerio). Biology of Reproduction. 85, 42-50 (2011).
  11. Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., F, P. Functional manipulation of maternal gene products using in vitro oocyte maturation in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (122), e55213(2017).
  12. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics. 242, 44-52 (2013).
  13. Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135, 285-292 (2008).
  14. Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with heat shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments. , e54492(2016).
  15. Xie, S. L., et al. A novel technique based on in vitro oocyte injection to improve CRISPR/Cas9 gene editing in zebrafish. Scientific Reports. 6, 34555(2016).
  16. Li, J., Bai, L., Liu, Z., Wang, W. Dual roles of PDE9a in meiotic maturation of zebrafish oocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Męczewniki jajnika danio pręgowanegoseparacja komórek pęcherzykowychizolacja oocytówwyciągnięta kapilara szklanatechnika stereomikroskopowadojrzewanie oocytówzapłodnienie in vitrooocyty odpozbawione komórekhodowla komórek pęcherzykowychstadia rozwoju pęcherzyków jajnikowych
Oddzielenie komórek pęcherzykowych i oocytów w pęcherzykach jajnikowych danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.