Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

6.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62028

⸱

19 grudnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1PHYMEDEXP, INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier

W tym artykule

Podsumowanie

Test wycieku fluorescencji to prosta metoda, która umożliwia badanie interakcji peptyd/błona, aby zrozumieć ich udział w kilku procesach biologicznych, a zwłaszcza zdolność peptydów penetrujących komórki do zakłócania dwuwarstwowych fosfolipidów podczas bezpośredniego procesu translokacji komórkowej.

Streszczenie

Peptydy penetrujące komórki (CPP) są zdefiniowane jako nośniki, które są w stanie przejść przez błonę plazmatyczną i przenieść ładunek do komórek. Jedna z głównych wspólnych cech wymaganych dla tej aktywności wynikała z interakcji CPP z błoną plazmatyczną (lipidami), a w szczególności ze składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej samej błony (siarczan heparanu). Rzeczywiście, niezależnie od bezpośredniej translokacji lub internalizacji zależnej od endocytozy, dwuwarstwy lipidowe biorą udział w procesie internalizacji zarówno na poziomie błony plazmatycznej, jak i na poziomie ruchu wewnątrzkomórkowego (pęcherzyki endosomalne). W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół opisujący różne etapy formułowania, oczyszczania, charakterystyki i zastosowania dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV) w teście nieszczelności fluorescencji w celu wykrycia możliwej destabilizacji/interakcji błony CPP i zajęcia się ich rolą w mechanizmie internalizacji. LUV o składzie lipidowym odzwierciedlającym zawartość błony plazmatycznej są wytwarzane w celu enkapsulacji zarówno barwnika fluorescencyjnego, jak i wygaszacza. Dodanie peptydów do podłoża pozapęcherzykowego i indukcja oddziaływań peptyd-błona na LUV może zatem wywołać w sposób zależny od dawki znaczny wzrost fluorescencji ujawniający nieszczelność. Przykłady przedstawiono tutaj z niedawno opracowanymi peptydami amfipatycznymi bogatymi w tryptofan (W) i argininę (R), które wykazały szybkie i wydajne dostarczanie siRNA w różnych liniach komórkowych. Na koniec omówiono naturę tych interakcji i powinowactwo do lipidów, aby zrozumieć i poprawić translokację błony i/lub ucieczkę endosomalną.

Wprowadzenie

Po ich odkryciu w latach dziewięćdziesiątych, opracowano peptydy penetrujące komórki (CPP), aby promować efektywne komórkowe dostarczanie ładunków przez błonę plazmatyczną1,2. CPP to zwykle krótkie peptydy, zwykle od 8 do 30 aminokwasów, o różnorodnym pochodzeniu. Po raz pierwszy zdefiniowano je jako nosicieli "bezpośrednio translokujących", co oznacza, że były w stanie przekroczyć błonę plazmatyczną i przenieść ładunek do komórek niezależnie od jakiegokolwiek szlaku endocytotycznego, ani zapotrzebowania na energię, ani zaangażowania receptora. Jednak dalsze badania wykazały, że te pierwsze obserwacje pochodziły głównie z przeszacowania fluorescencji spowodowanego artefaktem eksperymentalnym i/lub protokołami utrwalania przy użyciu metanolu3. Obecnie powszechnie przyjmuje się, że wychwyt CPP odbywa się zarówno przez endocytozę, jak i translokację niezależną od energii4,5,6,7 w zależności od różnych parametrów, takich jak charakter ładunku, użyte ogniwo między CPP a ładunkiem, badana linia komórkowa itp.

CPP mogą być używane jako środki transfekcyjne zgodnie z dwiema strategiami, albo obejmującą połączenie chemiczne (strategia kowalencyjna), albo interakcje elektrostatyczne/hydrofobowe (strategia niekowalencyjna) między CPP a jego ładunkiem8,9,10,11. Chociaż obie strategie wykazały swoją skuteczność w przenoszeniu komórek kilku ładunków, zrozumienie mechanizmu internalizacji przez CPP jest nadal przedmiotem kontrowersji, a równowaga między szlakami endocytozy a bezpośrednią penetracją jest nadal trudna do zmierzenia12,13. Chociaż dostępny jest zestaw narzędzi i strategii eksperymentalnych, które wyraźnie odnoszą się do udziału procesów endocytarnych, bezpośrednia translokacja wydaje się jednak trudniejsza do scharakteryzowania, ponieważ implikuje bardziej dyskretne interakcje ze składnikami błony plazmatycznej. Błony biologiczne zwykle składają się z wielu składników, od fosfolipidów po białka błonowe, które mogą się różnić w zależności od typu komórki i/lub środowiska (warunki stresowe, podział komórek itp.). Ta różnorodność składu, a co za tym idzie brak uniwersalnego modelu błony komórkowej, nie pozwala na jednoznaczne badania. Jednak, aby obejść te ograniczenia, opracowano metody krok po kroku z wykorzystaniem sztucznej błony lub ekstraktów z błony. Od małych pęcherzyków jednowarstwowych po podejścia jednowarstwowe, każdy model był wyraźnie trafny, aby odpowiedzieć na konkretne pytania14,15. Wśród nich duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV) stanowią odpowiedni model naśladujący błonę do badania interakcji peptyd/błona jako kluczowego punktu w procesie internalizacji.

W tym kontekście, poniższy protokół opisuje badanie wpływu peptydów i interakcji peptyd/błona na integralność LUV poprzez monitorowanie zarówno anionowego barwnika fluorescencyjnego, jak i odpowiadającego mu polikationowego tłumika zamkniętego w liposomach. Narzędzie to służy do badania interakcji CPP/błona w celu zrozumienia, czy są one w stanie przeprowadzić bezpośrednią translokację błony. Chociaż zwykle stosuje się go do porównywania różnych peptydów oddziałujących z błoną, ten test nieszczelności fluorescencji LUV może być również wykorzystany do badania zarówno koniugatów CPPs-ładunek (strategia kowalencyjna), jak i kompleksów CPP: cargo (strategia niekowalencyjna).

Obecny protokół zostanie więc po raz pierwszy zilustrowany za pomocą niedawno opracowanych peptydów amfipatycznych bogatych w tryptofan (W) i argininę (R) (WRAP)16. WRAP jest w stanie tworzyć nanocząstki na bazie peptydów, aby szybko i skutecznie dostarczać małe interferujące RNA (siRNA) w kilku liniach komórkowych16. Monitorowano właściwości wycieku fluorescencji samego peptydu WRAP lub nanocząstek na bazie SIRNA na bazie WRAP w celu scharakteryzowania ich mechanizmu internalizacji komórkowej. Wykazaliśmy, że ich mechanizm internalizacji obejmował głównie bezpośrednią translokację7. W drugim przykładzie peptyd WRAP został kowalencyjnie sprzężony z peptydem interferującym białko/białko iCAL36 (WRAP-iCAL36)17, a jego zdolność do destabilizacji błon porównano w teście wycieku fluorescencji z iCAL36 sprzężonym z Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), innym CPP.

Na koniec, zalety i ograniczenia tej metody zostaną omówione zarówno z technologicznego punktu widzenia, jak i w odniesieniu do znaczenia biologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie dużych pęcherzyków jednowarstwowych (LUV)

  1. Przygotuj LUV do użycia jako naśladownictwo błony komórkowej do testu nieszczelności fluorescencji.
  2. Wymieszać szklaną strzykawką Hamilton fosfatydylocholinę (DOPC, 786,11 g/mol), sfingomielinę (SM, 760,22 g/mol) i cholesterol (Chol, 386,65 g/mol) w stosunku molowym 4:4:2. Roztwór lipidów otrzymuje się z roztworu podstawowego każdego lipidu rozpuszczonego w rozpuszczalniku metanol/chloroform (3/1; objętość/objętość) w stężeniu 25 mg/ml w szklanej kolbie okrągłodennej o pojemności 25 ml. Na podstawie 4 μmol DOPC, 4 μmol SM i 2 μmol Chol, roztwór lipidów otrzymuje się z roztworu podstawowego przez zmieszanie odpowiednio 126 μl, 117 μl i 31 μl.
    UWAGA: Metanol jest toksycznym i łatwopalnym rozpuszczalnikiem, a chloroform jest toksyczny i rakotwórczy. Oba powinny być obsługiwane z odpowiednią ochroną pod maską.
  3. Odparować metanol/chloroform za pomocą wyparki obrotowej w próżni przez 45-60 minut w temperaturze 60 °C, aż do powstania wysuszonego filmu lipidowego.
  4. Przygotować dwa podstawowe roztwory buforowe HEPES. Przygotować bufor HEPES 1, mieszając 20 mM HEPES (238,3 g/mol) i 75 mM NaCl (58,44 g/mol) i dostosować pH do 7,4. Przygotować bufor HEPES 2, mieszając 20 mM HEPES i 145 mM NaCl i dostosować pH do 7,4. HEPES mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
    UWAGA: Zaleca się sprawdzenie osmolarności za pomocą osmometru.
  5. Przygotować roztwór hydratacji lipidów, rozpuszczając nieprzepuszczalną dla błony parę fluorescencyjną z wygaszaczem barwników, kwas 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonowy, sól disodową w stężeniu 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) i bromek p-ksylen-bispirydyny w stężeniu 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) w roztworze buforowym HEPES. Zmieszanie ANTS z DPX prowadzi do powstania roztworu o żółtym zabarwieniu. Aby osiągnąć stężenia 12,5 mM ANTS i 45 mM DPX, rozpuść odpowiednio 21,4 mg i 76 mg w 4 ml buforu HEPES 1,
    UWAGA: Roztwór hydratujący lipidy można przechowywać przez 2 tygodnie w temperaturze 4 °C, owijając probówkę folią aluminiową.
  6. Rozpuść pęcherzyki wielopłytkowe (MLV) poprzez ponowne zawieszenie wysuszonego filmu lipidowego z 1 ml roztworu lipidowego i wirowanie aż do rozpuszczenia wysuszonego filmu lipidowego. Upewnij się, że roztwór jest całkowicie rozpuszczony, ponieważ małe agregaty lipidowe negatywnie wpłyną na poprzednie kroki. Sprawdź również ściankę szklanej kolby okrągłodennej, aby upewnić się, że nie pozostał film lipidowy.
    UWAGA: Po rozpuszczeniu roztwór będzie opalizujący i jasnożółty.
  7. Poddaj pęcherzyki pięciu cyklom zamrażania/rozmrażania, aby uzyskać pęcherzyki jednopłytkowe. Wykonaj każdy cykl, umieszczając szklaną kolbę okrągłodenną na 30 s w ciekłym azocie do etapu zamrażania, a następnie pozostawiając ją w łaźni wodnej na 2 minuty w celu etapu rozmrażania.
    UWAGA: Temperatura wody w kąpieli powinna być o 5-10°C wyższa niż temperatura topnienia lipidów.
  8. Przygotuj wytłaczarkę lipidową, wkładając dwie podpory filtracyjne wstępnie nawilżone buforem HEPES w każdym elemencie wytłaczarki z politetrafluoroetylenu (PTFE) umieszczonym w metalowym kanistrze wytłaczarki.
  9. Umieść nawilżaną membranę poliwęglanową HEPES (wielkość porów 0,1 μm, średnica 25 mm) na jednym wsporniku filtra.
  10. Zmontuj dwa metalowe kanistry wytłaczarki i przykręć je.
  11. Umieść zmontowaną wytłaczarkę w uchwycie i wprowadź strzykawkę o pojemności 1 ml do odpowiedniego otworu na końcu każdego elementu wytłaczarki z politetrafluoroetylenu. Wytłaczanie odpowiada przejściu badanej cieczy z jednej strzykawki do drugiej przez membranę poliwęglanową.
  12. Przetestuj wytłaczarkę z 1 ml buforu HEPES załadowanym do jednej ze strzykawek o pojemności 1 ml, aby upewnić się, że nie ma wycieków ani problemów.
  13. Zastąp 1 ml bufor HEPES próbką MLV.
  14. Przeprowadzić ekstruzję, przepuszczając próbkę MLV z jednej strzykawki do drugiej przez membranę poliwęglanową co najmniej 21 razy, aby uzyskać jednolite LUV o tym samym rozmiarze.
    UWAGA: Wytłaczanie powinno odbywać się w temperaturze wyższej niż temperatura topnienia mieszaniny lipidów.

2. Oczyszczanie LUV

  1. Przygotuj oczyszczanie kolumny, aby usunąć nadmiar niezamkniętych w kapsułkach ANTS i DPX.
  2. Wprowadzić usieciowany żel dekstranowy (G-50) zawieszony w środowisku wodnym z 0,01% NaN3 (65 g/mol) w kolumnie do chromatografii cieczowej (Luer Lock, bez płaszcza, 1,0 cm x 20 cm, objętość złoża 16 ml) do 1 cm poniżej górnej części bezbarwnej części kolumny.
  3. Otwórz kran i pozwól płynowi spłynąć, aby osadzić usieciowany żel dekstranowy.
  4. Przemyć kolumnę przez elucję 20 ml buforu HEPES 2 i odrzucić wyjściowy przepływ kolumny.
  5. Zamknąć kran, gdy martwa objętość rozpuszczalnika nad kolumną zostanie zminimalizowana (<100 μl), ale wystarczająca, aby uniknąć wysuszenia usieciowanego żelu dekstranowego.
  6. Umieść świeżo wytłaczane LUV (żółte) na kolumnie i pozwól im wejść do usieciowanego żelu dekstranowego.
  7. Ciągle dodawaj bufor HEPES 2 do kolumny, aby przeprowadzić oczyszczanie LUV.
  8. Eluować około 2 ml buforu HEPES 2 (nie zapomnij regularnie napełniać górnej części kolumny, aby uniknąć wysuszenia usieciowanego żelu dekstranowego): wolny żółty roztwór ANTS i DPX migruje wolniej niż liposomy.
  9. Zacznij zbierać oczyszczone LUV w probówkach (1,5 ml).
  10. Obserwuj krople eluentu z kolumny, a gdy staną się opalizujące, zawierają liposomy. Wymień probówkę, aby odzyskać frakcję zawierającą LUV.
  11. Eluty, aż krople przestaną opalizować (~1 ml). Następnie eluuj kolejne 0,5 ml w oddzielnej frakcji, a następnie przestań eluować.
    UWAGA: Wzorce są teraz dostępne w szerokim zakresie mas cząsteczkowych, jako zestawy lub indywidualne masy cząsteczkowe do kalibracji objętości elucji LUV.
  12. Owiń probówki z LUV folią aluminiową, aby uniknąć wybielania barwnika fluorescencyjnego.
  13. Przemyć kolumnę 20 ml buforu HEPES 2.
  14. LUV można następnie przechowywać przez tydzień w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ponieważ stabilność LUV może zależeć od stężenia i składu LUV, a także od siły jonowej, rozmiar LUV powinien być kontrolowany za pomocą przyrządu do dynamicznego rozpraszania światła (DLS) (patrz rozdział 4. Charakterystyka wielkości i jednorodności LUV) przed każdym badaniem.

3. Kwantyfikacja stężenia LUV

  1. Oszacuj stężenie LUV za pomocą zestawu do kwantyfikacji fosfolipidów, który umożliwia ocenę stężenia choliny19. Test ten może być stosowany, gdy fosfolipidy z choliną zawierającą głowę polarną są znaczne (>50% LUV).
  2. Przygotować odczynnik barwiący, rozpuszczając 18 mg substratu chromogenu w 3 ml dostarczonego buforu.
  3. Załaduj kuwetę polistyrenową o wymiarach 10 x 10 x 45 mm 3 ml odczynnika barwiącyego.
  4. Użyj odczynnika o czystym kolorze jako stanu ślepej (ślepej). Dodać 20 μl próbki LUV (test) lub 20 μl roztworu wzorcowego o znanym stężeniu choliny (wzorzec).
  5. Dobrze wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C we wszystkich warunkach (ślepa próba, test i standardowa).
  6. Zmierzyć absorbancję (gęstość optyczną, OD) badanej próbki i roztworu wzorcowego za pomocą roztworu ślepej próby jako próby kontrolnej przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru.
  7. Sprawdź wartości OD, które pozwalają oszacować stężenie lipidów w LUV, C[LUV], w ekwiwalencie choliny w porównaniu ze wzorcem znanego stężenia.
  8. Obliczenia należy wykonać, korzystając z następującego równania:
    C[LUV] (mol / l) = (próbka OD / wzorzec OD) x C[Wzorzec] (mol / l)
    UWAGA: Zestaw do oznaczania ilościowego fosfolipidów zawierał roztwór wzorcowy chlorku choliny (139,6 mg / l) o stężeniu 54 mg / dl, co odpowiada stężeniu molowemu C [Standard] = 3,87 mmol / L. Próbka OD i wzorzec OD to absorbancje mierzone przy 600 nm odpowiednio dla roztworów LUV i choliny.

4. Charakterystyka wielkości i jednorodności LUV

  1. Wykonaj pomiar za pomocą przyrządu DLS w celu określenia wielkości LUV (w nm) i wskaźnika polidyspersyjności (PdI).
  2. Zaprogramuj odpowiednią "standardową procedurę operacyjną" (SOP), wskazując lepkość rozpuszczalnika/buforu i użytej kuwety.
  3. Umieścić 500 μl roztworu LUV w polistyrenowej półmikrokuwecie.
  4. Włóż polistyrenową półmikrokuwetę do instrumentu DLS.
  5. W temperaturze pokojowej należy zmierzyć rozkład wielkości pod względem średniej wielkości (Z-średniej) rozkładu cząstek i jednorodności (wskaźnik polidyspersyjności, PdI).
  6. Wszystkie wyniki uzyskano z dwóch niezależnych pomiarów wykonanych każdy w trzech powtarzających się cyklach.
    UWAGA: Standardowe wartości dla LUV będą miały średnią wielkość 137 ± 7 nm przy PdI 0,149 ± 0,041.

5. Przygotowanie roztworów peptydowych

  1. Przygotować roztwór podstawowy peptydu, który należy przeanalizować do testu nieszczelności.
  2. Rozpuść peptyd w proszku (czystość >95%) w czystej wodzie (np. 1 mg peptydu w 500 μl czystej wody).
    UWAGA: Zaleca się rozcieńczanie peptydów w czystej wodzie i unikanie rozpuszczania dimetylosulfotlenku (DMSO), które mogłoby wywołać artefakty (np. przepuszczalność błony20).
  3. Wiruj roztwór peptydowy przez 5 sekund.
  4. Sonikować roztwór peptydu w wodnej kąpieli sonizacyjnej przez 5 minut, a następnie wirować przez 5 minut przy 12,225 x g. Zebrać szwadron nad osadem w celu oznaczenia stężenia.
  5. Zmierzyć absorbancję przy 280 nm trzech niezależnych rozcieńczeń peptydów, a następnie obliczyć stężenie peptydu, korzystając z jego molowego współczynnika ekstynkcji ε (w zależności od zawartości tryptofanu i tyrozyny w sekwencji peptydowej) i reguły Beera-Lamberta.
    UWAGA: Jeśli peptyd zawiera tryptofan i tyrozynę, współczynnik ekstynkcji molowej ε oblicza się na podstawie tryptofanu ε = 5,690 M-1 cm-1 i tyrozyny ε = 1,280 M-1 cm-1. Jeśli sekwencja peptydowa nie zawiera tryptofanu ani tyrozyny, można przeprowadzić inne testy kolorymetryczne w celu zmierzenia stężenia (np. BCA lub Bradford).
  6. Rozcieńczyć roztwór peptydu w czystej wodzie do końcowego roztworu 100 μM i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W czystej wodzie podczas przechowywania w 4 °C nie dochodzi do degradacji peptydów. Jednak stężenie peptydów należy mierzyć co 2 tygodnie, aby upewnić się, że nie dojdzie do parowania wody.

6. Test nieszczelności fluorescencji

  1. Test nieszczelności fluorescencji mierzy się na spektrofluorometrze w temperaturze pokojowej. Długość fali wzbudzenia i emisji jest ustalona odpowiednio na Ex = 360 nm ± 3 nm i Em = 530 nm ± 5 nm.
  2. Rozcieńczyć LUV w 1 ml buforu HEPES 2 do końcowego stężenia 100 μM w kwarcowej kuwecie fluorescencyjnej. Dodaj mieszadło magnetyczne, aby homogenizować roztwór podczas eksperymentu.
  3. Zmierz same LUV w ciągu pierwszych 100 s, między t = 0 s a t = 99 s, aby uzyskać dostęp do fluorescencji tła.
    UWAGA: Podczas całego eksperymentu (15 minut) można również zmierzyć same LUV, aby uzyskać dostęp do fluorescencji tła i potencjalnych wycieków.
  4. Następnie zmierz nieszczelność jako wzrost intensywności fluorescencji po dodaniu podwielokrotności roztworu peptydu przez następne 900 s (15 min). Protokół ten przeprowadza się dla każdego stężenia badanego peptydu od 0,1 μM do 2,5 μM.
  5. Ostatecznie 100% fluorescencję osiągnięto poprzez solubilizację LUV przez dodanie 1 μl Triton X-100 (0,1%, v/v), w wyniku czego uzyskano całkowicie niewygaszoną sondę między t = 1000 s a t = 1,100 s.

7. Kwantyfikacja wycieku

  1. Pomijaj wartości uzyskane po t = 1,090 s, aby zachować tę samą liczbę punktów dla każdego badanego warunku.
  2. Obliczyć minimalną fluorescencję, Fmin, uzyskując średnią z 50 punktów między t = 0 s a t = 49 s (same LUV).
  3. Obliczyć maksymalną fluorescencję, Fmax, uzyskując średnią z 50 punktów między t = 1,041 s a t = 1,090 s (LUV z Triton X-100).
  4. Obliczyć procent wycieku (%Leak) w każdym punkcie czasowym (t = x), zgodnie z następującym równaniem:
    %Leak(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100
  5. Obliczyć średnią i odchylenie standardowe dla wartości uzyskanych przy różnym przygotowaniu LUV (n ≥ 2) dla tego samego stanu.
  6. Wykreślić procent wycieku, %Leak(t=x), w funkcji czasu (s).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zasada testu wycieku fluorescencji została przedstawiona na Rysunku 1. Szczegółowo: duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUVs) zawierające barwnik fluorescencyjny i wygaszacz (brak sygnału fluorescencji) poddaje się działaniu badanej biomolekuły. W wyniku oddziaływania peptydu z błonami lipidowymi, co może prowadzić do zmiany przepuszczalności błony, jej reorganizacji lub nawet przerwania, barwnik fluorescencyjny i wygaszacz są uwalniane z LUVs. Następujące rozcie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony test nieszczelności fluorescencji jest prostą i szybką metodą radzenia sobie z destabilizacją błony przez peptyd penetrujący komórki. Łatwe do wykonania, umożliwia również pośrednie porównanie różnych peptydów oddziałujących z błoną lub innych cząsteczek oddziałujących z błoną. Jeśli chodzi o krytyczne etapy protokołu, ponieważ test ten zapewnia względne wartości między linią bazową (same LUV) a maksymalnym uwalnianiem fluorescencji (warunek Trytona), zwykle oceniamy stężenie LUV za pomocą zestawu do kwanty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Emilie Josse za krytyczną recenzję manuskryptu. Prace te były wspierane przez fundację "La Ligue contre le Cancer", "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" oraz "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szklana kolba okrągłodenna 25 mlPyrex
Kwas 8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfonowy, sól disodowa (ANTS)InvitrogenA350Chronić przed światłem 
Chloroform Sigma-Aldrich288306
CholesterolSigma-AldrichC8667
DOPC (dioleoylfosfatydylocholina)Avanti Polar850375PChronić przed dostępem powietrza
WytłaczarkaAvanti Polar610000
FluorymetrPTI Serlabo
50 µ Szklana strzykawka LHamilton705N
HEPESSigma-AldrichH3375
Test laboratoryjny Fosfolipid WAKO 296-63801
kolumna do chromatografii cieczowejSigma-Aldrich
MetanolCarlo Erba414902
Membrana poliwęglanowa Nuclepore (0,1 &mikro; m Rozmiar porów, średnica 25 mm)Kuweta polistyrenowa Whatman800309
, 10 x 10 x 45 mmGrener Bio-One614101
polistyrenowa półmikrokuweta, DLSFisher ScientificFB55924
bromek p-ksylenu i bispirydyniowy (DPX)InvitrogenX1525Chronić przed światłem 
kwarcowa kuweta fluorescencyjnaHellma109.004F-QS
rotavapor HeidolphZ334898
Sephadex G-50 żywicaAmersham17-0042-01
Azydek sodu (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Kąpiel Sonicator USC300TVWR142-6001
SphingomyelinAvanti Polar860062PChronić przed dostępem powietrza
Triton X-100 Eromedex2000-B
Zetaziser NanoZS MalvernZEN3500

Bibliografia

  1. Langel, U. Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , CRC Press. (2006).
  2. Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).
  3. Richard, J., et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. The Journal of Biological Chemistry. , (2003).
  4. Jones, A., Sayers, E. Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).
  5. Tünnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
  6. Jiao, C. -Y., et al. Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization. Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).
  7. Deshayes, S., et al. Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252(2020).
  8. Konate, K., et al. Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide. International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).
  9. Lehto, T., et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).
  10. Hoyer, J., Neundorf, I. Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids. Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).
  11. Milletti, F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
  12. Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).
  13. Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs. Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).
  14. Maget-Dana, R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).
  15. Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).
  16. Konate, K., et al. Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).
  17. Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).
  18. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
  19. Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).
  20. Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).
  21. Konate, K., et al. Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).
  22. Vaissière, A., et al. A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34(2017).
  23. Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, Ü, Divita, G., Deshayes, S. Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).
  24. Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).
  25. Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation. FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).
  26. Mishra, A., et al. Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).
  27. Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).
  28. Bartlett, G. R. Phosphorus assay in column chromatography. Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).
  29. Stewart, J. C. M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).
  30. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571(2012).
  31. Wimley, W. C. Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity. Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).
  32. Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo. FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).
  33. van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism. PloS One. 5 (12), 14292(2010).
  34. Hassane, F. S., et al. Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).
  35. Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291(2012).
  36. Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. Electrophysiological characterization of membrane transport proteins. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test wycieku fluorescencjipeptydy przenikaj ce przez b ony kom rkowewyciek z liposom wdu e p cherzyki jednowarstwoweoddzia ywanie peptyd w z b ondynamiczne rozpraszanie wiat aucieczka z endosom wlipidowa dwuwarstwatranslokacja peptyd w
Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.