Artykuł metodologiczny

Oznaczanie zawartości celulozy krystalicznej w biomasie roślinnej metodą Updegraff

DOI:

10.3791/62031

⸱

15 maja 2021

 ,  , 
1Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University, 2Fiber and Biopolymer Research Institute (FBRI), Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda Updegraff jest najczęściej używaną metodą szacowania celulozy. Głównym celem tej demonstracji jest dostarczenie szczegółowego protokołu Updegraff do szacowania zawartości celulozy w próbkach biomasy roślinnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celuloza jest najobficiej występującym polimerem na Ziemi generowanym przez fotosyntezę i głównym składnikiem nośnym ścian komórkowych. Ściana komórkowa odgrywa znaczącą rolę we wzroście i rozwoju roślin, zapewniając wytrzymałość, sztywność, szybkość i kierunek wzrostu komórek, utrzymanie kształtu komórki oraz ochronę przed stresorami biotycznymi i abiotycznymi. Ściana komórkowa składa się głównie z celulozy, ligniny, hemicelulozy i pektyny. Ostatnio ściany komórkowe roślin stały się celem produkcji biopaliw i bioenergii drugiej generacji. W szczególności celulozowy składnik ściany komórkowej roślin jest wykorzystywany do produkcji etanolu celulozowego. Oszacowanie zawartości celulozy w biomasie ma kluczowe znaczenie dla podstawowych i stosowanych badań ścian komórkowych. Metoda Updegraffa jest prostą, solidną i najczęściej stosowaną metodą szacowania zawartości celulozy krystalicznej w biomasie roślinnej. Nierozpuszczalna w alkoholu surowa frakcja ściany komórkowej po poddaniu działaniu odczynnika Updegraff eliminuje frakcje hemicelulozy i ligniny. Następnie frakcja celulozy odporna na odczynniki Updegraff jest poddawana obróbce kwasem siarkowym w celu hydrolizy homopolimeru celulozy do monomerycznych jednostek glukozy. Linia regresji jest opracowywana przy użyciu różnych stężeń glukozy i wykorzystywana do oszacowania ilości glukozy uwalnianej podczas hydrolizy celulozy w próbkach eksperymentalnych. Na koniec zawartość celulozy szacuje się na podstawie ilości monomerów glukozy za pomocą kolorymetrycznego testu antronowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celuloza jest głównym składnikiem nośnym ścian komórkowych, który jest obecny zarówno w pierwotnych, jak i wtórnych ścianach komórkowych. Ściana komórkowa to macierz zewnątrzkomórkowa, która otacza komórki roślinne i składa się głównie z celulozy, ligniny, hemicelulozy, pektyn i białek macierzy. Około jedna trzecia biomasy roślin to celuloza1 i odgrywa znaczącą rolę we wzroście i rozwoju roślin, zapewniając wytrzymałość, sztywność, szybkość i kierunek wzrostu komórek, utrzymanie kształtu komórki oraz ochronę przed stresorami biotycznymi i abiotycznymi. Włókno bawełniane zawiera 95% celulozy2, podczas gdy drzewa zawierają od 40% do 50% celulozy, w zależności od gatunku rośliny i typu organów3. Celuloza składa się z powtarzających się jednostek celobiozy, disacharydu reszt glukozy połączonych wiązaniami glikozydowymi β-1,44. Etanol celulozowy jest wytwarzany z glukozy pochodzącej z celulozy obecnej w ścianach komórkowych roślin5. Włókno celulozowe składa się z kilku mikrofibryli, w których każde mikrofibryl działa jako jednostka podstawowa z 500-15000 monomerów glukozy1,6. Homopolimer celulozy jest syntetyzowany przez kompleksy syntazy celulozy osadzone w błonie plazmatycznej (CSC)1,7. Poszczególne białka syntazy celulozy A (CESA) syntetyzują łańcuchy glukanu, a sąsiednie łańcuchy glukanu są połączone wiązaniami wodorowymi, tworząc krystaliczną celulozę1,8. Celuloza występuje w kilku formach krystalicznych, z dwoma dominującymi formami, celulozą Iα i celulozą Iβ jako formami natywnymi9. W roślinach wyższych celuloza występuje w postaci celulozy Iβ, podczas gdy celuloza dolna występuje w postaci Iα10,11. Ogólnie rzecz biorąc, celuloza odgrywa znaczącą rolę w nadawaniu wytrzymałości i sztywności ścianom komórkowym roślin.

Biopaliwa pierwszej generacji są głównie produkowane ze skrobi kukurydzianej, cukrów trzcinowych i cukrów buraczanych, które są źródłem żywności, podczas gdy biopaliwa drugiej generacji koncentrują się na produkcji biopaliw z materiału ściany komórkowej biomasy roślin niespożywczych12. Dokładne oszacowanie zawartości celulozy krystalicznej jest ważne nie tylko dla podstawowych badań nad biosyntezą celulozy i dynamiką ściany komórkowej, ale także dla badań stosowanych w biopaliwach i bioproduktach. Opracowano i zoptymalizowano różne metody szacowania celulozy w biomasie roślinnej, a metoda Updegraff jest najczęściej stosowaną metodą szacowania celulozy. Pierwszą opisaną metodą szacowania celulozy opracowali Cross i Bevan w 1908 roku13. Metodę oparto na zasadzie naprzemiennego chlorowania i ekstrakcji siarczanem sodu. Jednak celuloza otrzymana za pomocą oryginalnych i zmodyfikowanych protokołów metody Crossa i Bevana wykazała zanieczyszczenie małymi frakcjami ligniny oprócz znacznej ilości ksylanów i mannanów14. Pomimo kilku modyfikacji mających na celu usunięcie ligniny i hemicelulozy z frakcji celulozy, metoda Cross-Bevan zachowała znaczną ilość mannanów wraz z celulozą. Później rozwinięto metodę Kurschnera, stosując kwas azotowy i etanol do ekstrakcji celulozy15. Metoda ta wykazała, że usunięto całkowitą ligninę i 75% pentozanów, ale rzeczywiste wyniki celulozy były takie same, jak te oszacowane metodą chlorowania Crossa i Bevana. Inna metoda (Norman i Jenkins) została opracowana przy użyciu metanolu-benzenu, siarczanu sodu i podchlorynu sodu do ekstrakcji celulozy16. W metodzie tej zachowano również pewną frakcję ligniny (3%) i znaczne ilości pentozanów, co doprowadziło do dokładnego oszacowania celulozy. Później Kiesel i Semiganowsky zastosowali inne podejście do hydrolizy celulozy przy użyciu 80% stężonego kwasu siarkowego, a hydrolizowane zredukowane cukry oszacowano metodą Bertranda17. Dwie metody, Waksman's i Stevens18 i Salo14,19, które zostały opracowane w oparciu o metodę Kiesela i Semiganowsky'ego, również dały o 4-5% mniejszą zawartość celulozy w porównaniu z wcześniejszymi metodami20.

Metoda Updegraff jest najczęściej używaną metodą do szacowania zawartości celulozy krystalicznej. Metoda ta została po raz pierwszy opisana przez Updegraffa do pomiaru celulozy w 1969 roku21. Metoda Updegraffa integruje metodę Kurschnera (zastosowanie kwasu azotowego), metody Kiesela i Seminowsky'ego (hydroliza celulozy do monomerów glukozy przy użyciu kwasu siarkowego) z pewnymi modyfikacjami oraz test antronowy Vilesa i Silvermana do prostego kolorymetrycznego oszacowania zawartości glukozy i celulozy krystalicznej22. Zasada działania tej metody polega na zastosowaniu kwasu octowego i kwasu azotowego (odczynnik Updegraff) w celu wyeliminowania hemicelulozy i ligniny z homogenizowanych tkanek roślinnych, co pozostawia celulozę odporną na kwas octowy/azotowy do dalszego przetwarzania i oszacowania15. Celuloza odporna na kwas octowy/azotowy jest traktowana 67% kwasem siarkowym w celu rozbicia celulozy na monomery glukozy, a uwolnione monomery glukozy są szacowane za pomocą testu antronowego21,23. Zastosowano kilka modyfikacji oryginalnej metody Updegraff, aby uprościć procedurę i oszacowanie celulozy za pomocą testu anthrone assay24. Ogólnie rzecz biorąc, metodę tę można podzielić na pięć faz. W pierwszej fazie przygotowywany jest materiał roślinny. W drugiej fazie surowa ściana komórkowa jest oddzielana od całkowitej biomasy, ponieważ celuloza jest kluczowym składnikiem ścian komórkowych roślin. Później, w trzeciej fazie, celuloza jest oddzielana od niecelulozowych składników ściany komórkowej poprzez traktowanie odczynnikiem Updegraff. W czwartej fazie celuloza odporna na kwas octowy/azotowy jest rozkładana na monomery glukozy przez obróbkę kwasem siarkowym. Obróbka celulozy kwasem siarkowym powoduje powstanie związków 5-hydroksymetylofurfuralu w wyniku reakcji monomerów glukozy z kwasem siarkowym. Wreszcie, w ostatniej fazie, antron generuje zielonkawo-niebieski kompleks poprzez gotowanie ze związkiem furfuralu wygenerowanym w poprzedniej fazie25. Ta oparta na antronie metoda kolorymetryczna została po raz pierwszy zastosowana w 1942 roku przez Dreywooda. Antron to barwnik, który identyfikuje związki furfuralu produktów odwodnionych pentozą i heksozy, takich jak 5-hydroksymetylofurfural, w warunkach kwaśnych. Reakcja z heksozą daje intensywny kolor i lepszą reakcję w porównaniu do pentozy25. Ilość związanej glukozy mierzy się za pomocą absorbancji spektrofotometru przy długości fali 620 nm, a intensywność zielonkawo-niebieskiego kompleksu jest wprost proporcjonalna do ilości cukru w próbce. Zmierzone wartości absorbancji porównano z linią regresji krzywej wzorcowej glukozy w celu obliczenia stężenia glukozy w próbce. Zmierzoną zawartość glukozy wykorzystano do oszacowania zawartości celulozy w biomasie roślinnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie eksperymentalne

  1. Zmiel wysuszony materiał roślinny na drobny proszek.
  2. Bufor do solubilizacji białek (PSB): Przygotować roztwory podstawowe 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (pH 8,0) i sterylizować je w autoklawie. Przygotować świeży bufor PSB z tych roztworów podstawowych o końcowych stężeniach 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA i 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w sterylnej wodzie.
  3. Przygotuj 100 ml 70% etanolu (v/v): 70 ml 100% etanolu i 30 ml sterylnej wody.
  4. Przygotować 100 ml metanolu: chloroformu w stosunku 1:1 (50 ml metanolu i 50 ml chloroformu).
  5. Przygotować 82,5 ml odczynnika Updegraff. Dodaj 75 ml 80% kwasu octowego do 7,5 ml kwasu azotowego, tak aby ostateczny stosunek wody: kwas octowy: kwas azotowy wynosił 2:8:1 (v/v). Aby przygotować 80% kwas octowy, rozpuść 80 ml lodowatego kwasu octowego w 20 ml sterylnej wody (v/v).
  6. Przygotuj świeży zapas roztworu glukozy o stężeniu 1 mg/ml. Rozpuścić 10 mg glukozy w 10 ml wody (w/v).
  7. Aby przygotować 100 ml 67% kwasu siarkowego (v/v), dodaj 67 ml stężonego kwasu siarkowego do 33 ml wody. Zawsze używaj szklanej butelki i powoli dodawaj kwas do wody. Ten etap jest egzotermiczny (uwalnia ciepło). Dlatego przygotuj ten roztwór na lodzie i schłodzić w lodówce przez co najmniej 2 godziny przed użyciem.
  8. Przygotować świeży 0,2% antron (w/v) dla każdej partii próbek eksperymentalnych. Odważyć 0,2 g antronu i rozpuścić w 100 ml wstępnie schłodzonego stężonego kwasu siarkowego w szklanej butelce owiniętej folią aluminiową. Przechowywać w lodówce przez 1-2 godziny przed użyciem.
    UWAGA: W dniu eksperymentu zaleca się wstępne schłodzenie stężonego kwasu siarkowego w lodówce w dniu eksperymentu oraz świeże przygotowanie antronu w celu dokładnego oszacowania zawartości glukozy.

2. Przygotowanie materiału z biomasy roślinnej

  1. Próbki biomasy roślinnej należy pobrać z 2-miesięcznych linii doświadczalnych bawełny uprawianych w szklarni o tych samych warunkach wzrostu, tej samej fazie rozwoju, tej samej pozycji roślin i tym samym typie tkanki (liść/łodyga/korzeń).
    UWAGA: Zebrać co najmniej trzy kontrpróby biologiczne dla każdej próbki. Umyj je dokładnie wodą, aby usunąć cały brud z tkanki korzeniowej.
  2. Suszyć tkankę korzeniową na powietrzu przez 2 dni na ręcznikach papierowych w temperaturze pokojowej, aby usunąć zawartość wilgoci (Rysunek 1).
    UWAGA: Wysusz na powietrzu pożądaną tkankę do oceny celulozy, aby zapobiec zanieczyszczeniu grzybami.
  3. Umieść próbki korzeni w osobnych pojemnikach. Następnie oznaczyć je i wysuszyć w inkubatorze w temperaturze 49 °C przez 10 dni (tabela materiałów).
    UWAGA: Alternatywnie można użyć liofilizatora do wysuszenia tkanki roślinnej w krótszym czasie (1 lub 2 dni) bez powodowania jakichkolwiek zmian chemicznych w materiale biomasy roślinnej.
  4. Pokrój wysuszone próbki na małe kawałki, zamroź je w ciekłym azocie i zmiel na jednolity drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka, młynka zamrażającego lub młynka do biomasy (Rysunek 1).
    UWAGA: Młyn zamrażarki był używany z szybkością 10 cps przez 3 cykle.
  5. Zbierz zmieloną tkankę (Rysunek 2) i przystąp do ekstrakcji ściany komórkowej.
    UWAGA: W tym momencie proces można wstrzymać, przechowując próbki w hermetycznych pojemnikach w temperaturze pokojowej.

3. Ekstrakcja surowych ścian komórkowych z biomasy roślinnej

UWAGA: Ściany komórkowe roślin zawierają celulozę, ligninę, składniki niecelulozowe, pektyny, białka matrycy, związki fenolowe i wodę26. Ponieważ celuloza jest obecna w ścianach komórkowych, pierwszym krokiem jest oddzielenie składnika ściany komórkowej od niebędącego składnikiem ściany komórkowej rośliny biomass26.

  1. Oznacz i zważ pojedyncze ślepe probówki o pojemności 2 ml przed rozpoczęciem procesu ekstrakcji ściany komórkowej.
  2. Zanotuj puste odważniki probówek w zeszycie laboratoryjnym, zanim przejdziesz dalej.
  3. Zważyć 20 mg sproszkowanej tkanki z kroku 2.5 i przenieść ją do wstępnie zważonych probówek o pojemności 2 ml i oznaczyć je.
  4. Dodaj 1 ml buforu do solubilizacji białek (PSB) (50 mM buforu chlorowodorku Tris (HCl) o pH 8,8, 0,5 mM EDTA i 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) w celu rozpuszczenia białek. Wirować i wirować przy 25 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i zachować osad.
    UWAGA: Supernatant można zapisać, jeśli konieczne jest przeanalizowanie składnika białkowego.
  5. Powtórz krok 3.4 jeszcze dwa razy.
  6. Do zatrzymanej osadki dodać 1 ml wody destylowanej i odwirować. Wirować przy 25 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i usunąć supernatant.
  7. Powtórz krok 3.6 jeszcze dwa razy.
  8. Dodać 1 ml 70% etanolu do zaoszczędzonego granulatu, odwirować i podgrzewać w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę w łaźni wodnej/bloku grzewczym w celu usunięcia rozpuszczalnych składników i skrobi z próbek. Wirować i odwirowywać przy 25 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant i zachować osad.
  9. Powtórz krok 3.8 jeszcze raz.
  10. Do granulatu dodaj 1 ml 100% metanolu i wiruj. Wirować przy 25 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i usunąć supernatant.
  11. Dodać 1 ml chloroformu/metanolu (chloroform i metanol w stosunku 1:1) do osadu i odwirować. Wirować przy 25 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Dodatek metanolu i rozpuszczalnika chloroformowego rozpuszcza i usuwa frakcję lipidową z klasy biomass27.
  12. Do granulki dodaj 1 ml 100% acetonu i wiruj. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Wirować przy 25 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Aceton usuwa pigmenty, takie jak chlorofil i wolne kwasy tłuszczowe z biomasy28,29.
  13. Wysuszyć granulki w temperaturze 37 °C przez noc lub kontynuować suszenie próżniowe.
    UWAGA: Wysuszony osad to surowa ściana komórkowa używana do szacowania celulozy krystalicznej. W tym momencie proces można wstrzymać lub kontynuować za pomocą suszarki próżniowej do suszenia próbek.

4. Leczenie odczynnikiem Updegraff (kwas octowy i azotowy) w celu usunięcia składników niecelulozowych

UWAGA: Protokół obejmuje użycie kwasów i innych substancji chemicznych. Nosić środki ochrony osobistej (PPE) przez cały proces.

  1. Odmierz 5 mg wysuszonego surowego granulatu ściany komórkowej do świeżej probówki z nakrętką o pojemności 2 ml. Zwróć uwagę na dokładną wagę (Rysunek 3)30.
  2. W tym momencie należy uwzględnić kontrolę pozytywną. Użyj 2 mg bibuły filtracyjnej (tabela materiałów) jako kontroli pozytywnej, która daje 80% zawartości celulozy.
  3. Dodać 1,5 ml odczynnika Updegraff do zważonych 5 mg ekstraktu ze ściany komórkowej i kontroli dodatniej. Mieszać przez wirowanie.
    UWAGA: Począwszy od tego etapu, kontrola dodatnia powinna być przetwarzana w taki sam sposób, jak próbki doświadczalne. Ten krok należy wykonać w dygestorii przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE).
    UWAGA: Ten krok należy wykonać w rurkach z nakrętką, aby zapobiec rozpryskiwaniu próbki i pękaniu probówek. Należy uwzględnić trzy kontrpróby biologiczne z każdej próbki wraz z trzema kontrpróbami do celów kontroli dodatniej.
  4. Podgrzewać zawiesinę w temperaturze 100 °C przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej i schładzać na stole przez 10 minut. Wirować przy 25 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant przez odwirowanie i zachować osad.
    UWAGA: Wytworzone odpady należy zbierać oddzielnie dla rozpuszczalników organicznych, kwasu siarkowego i odczynnika Updegraff (kwas octowy i kwas azotowy). Odpady z kwasem octowym i kwasem azotowym powinny być przechowywane w niskich temperaturach z wentylowanymi nakrętkami i nigdy nie powinny być mieszane z innymi rozpuszczalnikami organicznymi i innymi kwasami, aby zapobiec wybuchowi.
  5. Dodaj 1 ml wody do granulki. Wirować przy 25 200 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć 500 μl supernatantu i dodać 1 ml acetonu do probówki.
  6. Wirować przy 25 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć 1 ml supernatantu, dodać 1 ml acetonu do probówki i odwirować przy 25 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Po odwirowaniu usunąć cały sklarowany osad i zawiesić osad w 1 ml acetonu. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 5 minut i wirować z prędkością 25 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Wyrzucić supernatant i zachować osad. Wysuszyć granulkę w temperaturze 37 °C przez noc (Rysunek 3).
    UWAGA: W tym momencie proces można wstrzymać lub kontynuować za pomocą suszarki próżniowej do suszenia i przejść do następnego kroku.

5. Hydroliza celulozy przez kwas w celu wytworzenia jednostek monomeru glukozy

  1. Do wysuszonego granulatu dodać 1 ml 67% kwasu siarkowego. Wirować, aby całkowicie wymieszać osad z kwasem.
  2. Potrząsaj probówkami w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby rozpuścić granulat celulozy w 67% kwasie siarkowym.
    UWAGA: Alternatywnie, solubilizacja osadu celulozy w 67% kwasie siarkowym może być poprawiona poprzez sonikację każdej próbki przez 10 minut po 30 minutach inkubacji w wytrząsarce. Po sonikacji próbki mogą być ponownie inkubowane w wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Jednak zaobserwowaliśmy całkowitą rozpuszczalność granulatu celulozy bez sonikacji, gdy zaczniemy od 5 mg surowego ekstraktu ze ściany komórkowej (Rysunek 3). Ta procedura działała dobrze w przypadku różnych próbek biomasy roślinnej3.

6. Pomiar zawartości glukozy za pomocą testu antronowego i szacowanie zawartości celulozy

  1. Na tym etapie celuloza występuje w postaci wolnych monomerów glukozy. Oznaczyć ilość celulozy, mierząc ilość glukozy obecnej w próbce za pomocą spektrofotometrii.
  2. Pobrać 10 μl próbki z etapu 5 i dodać ją do 490 μl sterylnej wody destylowanej, aby rozcieńczyć każdą próbkę do 500 μl. Wirować rozcieńczoną mieszaninę próbki i wody przez 10 sekund.
  3. Dodaj 1 ml 0,2% świeżo przygotowanego odczynnika antronowego do każdej probówki i natychmiast wymieszaj, wirując.
  4. Gotować próbki w temperaturze 100 °C przez 10 minut i schładzać probówki na lodzie przez 5 minut. Przenieść 200 μl każdej próbki do trzech dołków na płytce 96-dołkowej. Załaduj 96-dołkową płytkę do spektrofotometru, aby zmierzyć absorbancję przy 620 nm.
    UWAGA: Do gotowania w wysokiej temperaturze należy używać zakręcanych rurek, aby zapobiec rozpryskiwaniu szkodliwych chemikaliów i uniknąć utraty próbek.

7. Przygotowanie krzywej wzorcowej glukozy

  1. Aby przygotować wzorzec glukozy, przygotuj świeży zapas 1 mg/ml glukozy, rozpuszczając 10 mg glukozy w 10 ml sterylnej wody destylowanej. Dodaj ten roztwór podstawowy 1 mg/ml w odstępach co 20 μl (0, 20, 40, 60, 80,100,120,140, 160, 180 μl) do sterylnej wody destylowanej (całkowita objętość 1 ml), aby przygotować wzorce glukozy w zakresie od 0 μg do 180 μg/ml (Rysunek 3). Odwiruj każdy wzorzec glukozy po dodaniu sterylnej wody.
  2. Z tych 10 różnych stężeń należy przelać 500 μl każdego stężenia glukozy do świeżej probówki z zakrętką o pojemności 2 ml.
  3. Dodaj 1 ml świeżo przygotowanego 0,2% antronu do każdej probówki i natychmiast wymieszaj, wirując. Inkubować na lodzie i gotować w temperaturze 100 °C przez 10 minut, a następnie inkubować na lodzie przez 5 minut23.
  4. Przenieść 200 μl każdego wzorca do trzech dołków w 96-dołkowej mikropłytce miareczkowej dla trzech kontrprób technicznych i zmierzyć absorbancję przy 620 nm (Rysunek 3).
  5. Opracuj standardową krzywą glukozy, wykreślając różne stężenia glukozy (od 0 do 180 μg/ml) w stosunku do znormalizowanych wartości absorbancji przy 620 nm (ryc. 7). Za pomocą linii regresji Y= mx+c wygenerowanej na podstawie wartości absorbancji należy obliczyć zawartość celulozy w przygotowanych próbkach.
    UWAGA: Wzorce glukozy muszą być świeżo przygotowane dla każdego zestawu eksperymentów. Stężenie glukozy należy zwiększyć, jeśli wartości OD są zbyt wysokie/niskie, tak aby wartości te mieściły się w zakresie wartości absorbancji krzywej wzorcowej. Linia regresji generuje różne wartości m i c w oparciu o wzorce glukozy stosowane dla każdej partii próbek. Wymieszaj rurki natychmiast po dodaniu anthrone23. Antron, rozcieńczone próbki i przygotowane wzorce były zawsze przechowywane w niskiej temperaturze do czasu przeprowadzenia testu antronowego ze względu na egzotermiczny charakter tej reakcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tego badania wybrano rośliny bawełny uprawiane w szklarni. Do analizy porównawczej zawartości celulozy wybrano dwie różne linie eksperymentalne bawełny. Dla każdej linii doświadczalnej tkankę korzeniową pobrano z trzech powtórzeń biologicznych. W sumie 500 mg tkanki poddano homogenizacji, a 20 mg użyto do surowej ekstrakcji ściany komórkowej. Później 5 mg surowego ekstraktu ze ściany komórkowej użyto do leczenia odczynnikiem Updegraff w celu usunięcia hemicelulozy i ligniny z celulozy. Oczyszczoną celulozę hydrolizowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Włókna bawełniane to włókna naturalne produkowane z nasion bawełny. Włókno bawełniane to pojedyncza komórka o zawartości ~95% celulozy2 o wysokiej zawartości celulozy krystalicznej o szerokim zastosowaniu w przemyśle tekstylnym31. Ponieważ włókno bawełniane zawiera ~95% celulozy, użyliśmy tkanek korzeniowych bawełny do wykazania oceny zawartości celulozy krystalicznej. Tkanki korzeniowe bawełny są umiarkowanie bogate w celulozę krystaliczną i stanowią powszechnie dostępną b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Departamentowi Nauk o Roślinach i Glebie oraz Cotton Inc. za częściowe wsparcie tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AcetonFisher ChemicalA18-500Stosowany w protokole
AnthroneSigma Aldrich90-44-8Do testu kolorymetrycznego
WirówkaEppendorf5424Do wirowania
ChloroformMallinckrodt67-66-3Stosowany w protokole
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma Aldrich6381-92-6Używany w protokole
EtanolMillipore SigmaEM-EX0276-4SUżywany w protokole
Bibuła filtracyjnaWhatman1004-090Kontrola pozytywna
Lodowaty kwas octowySigmaSKU A6283Używany w protokole
Blok grzewczy/ ThermoMixer F1.5Eppendorf13527550Do kontrolowanych temperatur
InkubatorFisherbrand150152633Służy do suszenia próbki roślinnej
Skala pomiarowaMettler Toledo30243386Dla określonych ilości
Metanol 100 %Fisher ChemicalA412-500Używany w protokole
Mikropłytka (96 dołków)Evergreen Scientific222-8030-01FDo testu antronowego
Kwas azotowySigma Aldrich695041Użyte w protokole
Mikrofiolki polipropylenowe (2 ml) / probówki z nakrętkąBioSpec Products10831Do wysokich temperatur
Spektrofotometr (detektor wielomodowy)Beckmancoulter DTX8801000814Do pomiaru absorbancji
Spex SamplePrep 6870 Zamrażarka / MłynSpex Sample Prep68-701-15Do mielenia tkanek roślinnych na drobny proszek
Kwas siarkowyJ.T.Baker02-004-382Stosowany w protokole
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma Aldrich151-21-3buforowych PSB
(2 ml)Fisher Scientific05-408-138Stosowany w protokole
Tris ChlorowodorekSigma Aldrich  1185-53-1Stosowany w buforze PSB
Ultraczysta woda destylowanaInvitrogen10977Używany w protokole
Suszarka próżniowa (vacufuge plus)Eppendorf22820001Do suszenia próbek
Mieszalnik wirowyFisherbrand14-955-151Do mieszania
Kąpiel wodnaThermoscientificTSGP02PM05Do warunków kontrolowanych temperaturą w określonym kroki
Papier do ważeniaFisher Scientific09-898-12AUżywany w protokole
Stosowany w probówkach

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Somerville, C. Cellulose synthesis in higher plants. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).
  2. Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development. Scientific Reports. 6, 34309(2016).
  3. Mendu, V., et al. Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production. Biotechnology for Biofuels. 4, 43(2011).
  4. Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets. Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).
  5. Jordan, D. B., et al. Plant cell walls to ethanol. Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).
  6. Brett, C. T. Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall. International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).
  7. Li, S., et al. Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).
  8. Polko, J. K., Kieber, J. J. The regulation of cellulose biosynthesis in plants. The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).
  9. Brown, R. M. The biosynthesis of cellulose. Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).
  10. Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. A review on systematic study of cellulose. Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).
  11. Coughlan, M. P. Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview. Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).
  12. Robak, K., Balcerek, M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass. Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).
  13. Cross, C. F., Bevan, E. J. Cellulose and chemical industry. Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).
  14. Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. A method for cellulose determination. Agricultural and Food Science. 34, (1962).
  15. Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).
  16. Norman, A. G., Jenkins, S. A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials. Biochemical Journalournal. 27, (1933).
  17. Kiesel, A., Semiganowsky, N. Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung. Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).
  18. Waksman, S. A. S., et al. A system of proximate chemical analysis of plant materials. Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).
  19. Salo, M. -L. Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions. Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).
  20. Giger-Reverdin, S. Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants. Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).
  21. Updegraff, D. M. Semimicro determination of cellulose inbiological materials. Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).
  22. Viles, F. J., Silverman, L. Determination of starch and cellulose with anthrone. Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).
  23. Scott, T. A., Melvin, E. H. Determination of dextran with anthrone. Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).
  24. Kumar, M., Turner, S. Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 11, 46(2015).
  25. Yemm, E. W., Willis, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone. Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).
  26. Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions. Frontiers in Plant Science. 7, (2016).
  27. Jiang, G., et al. Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates. Polymers. 10, 731(2018).
  28. Li, T., et al. A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock. Marine Drugs. 14, 162(2016).
  29. Wiltshire, K. H., Boersma, M., Möller, A., Buhtz, H. Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae). Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).
  30. Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates. Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).
  31. Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research. Frontiers in Plant Science. 3, (2012).
  32. Spirk, S., Nypelö, T., Kontturi, E. Editorial: Biopolymer thin films and coatings. Frontiers in Chemistry. 7, (2019).
  33. Long, L. -Y., Weng, Y. -X., Wang, Y. -Z. Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects. Polymers. 10, 623(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ciana kom rkowahydroliza kwasowametoda antronukrzywa wzorcowa glukozyekstrakcja ciany kom rkowejprodukcja biopaliw

Powiązane artykuły