Artykuł metodologiczny

Przewodnik krok po kroku po elektroantennografii komarów

DOI:

10.3791/62042

⸱

10 marca 2021

1Department of Biochemistry; The Fralin Life Science Institute; The Global Change Center; Department of Entomology and the Center for Emerging Zoonotic and Arthropod-Borne Pathogens, Virginia Polytechnic Institute and State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje krok po kroku protokół udanych i nisko stosowanych elektroantennogramów u kilku rodzajów komarów, w tym zarówno u samic, jak i u samców.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Samice komarów są najbardziej śmiercionośnymi zwierzętami na ziemi, odbierając życie ponad milionowi ludzi każdego roku z powodu patogenów, które przenoszą podczas pobierania posiłku z krwi. Aby zlokalizować żywiciela, na którym mogą się pożywić, komary polegają na szerokim zakresie sygnałów sensorycznych, w tym wizualnych, mechanicznych, termicznych i węchowych. Badanie szczegółowo opisuje technikę elektroantennografii (EAG), która pozwala naukowcom ocenić, czy komary mogą wykrywać poszczególne substancje chemiczne i mieszanki chemikaliów w sposób zależny od stężenia. W połączeniu z chromatografią gazową (GC-EAG), technika ta pozwala na wystawienie anten na działanie pełnej przestrzeni nad powierzchnią / złożonej mieszaniny i określenia, które substancje chemiczne obecne w próbce będącej przedmiotem zainteresowania komar może wykryć. Dotyczy to zapachów ciała gospodarza, a także bukietów kwiatowych roślin lub innych zapachów istotnych dla środowiska (np. substancji zapachowych z miejsc składania jaj). Tutaj opisaliśmy protokół, który pozwala na długi czas reakcji na przygotowanie i ma zastosowanie zarówno do samic, jak i samców komarów z wielu rodzajów, w tym komarów Aedes, Culex, Anopheles i Toxorhynchites. Ponieważ węch odgrywa ważną rolę w interakcjach między komarami a żywicielami i ogólnie w biologii komarów, EAG i GC-EAG mogą ujawnić związki będące przedmiotem zainteresowania dla rozwoju nowych strategii kontroli wektorów chorób (np. przynęt). Uzupełnione testami behawioralnymi można określić wartościowość (np. atraktant, repelent) każdej substancji chemicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komary są najbardziej śmiercionośnymi organizmami na ziemi, odbierają życie ponad milionowi ludzi rocznie i narażają ponad połowę światowej populacji na ryzyko narażenia na patogeny, które przenoszą, podczas gryzienia1. Owady te polegają na szerokim zakresie sygnałów (tj. termicznym, wzrokowym, mechanicznym, węchowym, słuchowym), aby zlokalizować żywiciela, na którym można się pożywić (zarówno roślinnego, jak i zwierzęcego), do krycia i składania jaj, a także aby uniknąć drapieżników zarówno w stadium larwalnym, jak i dorosłym2,3. Wśród tych zmysłów węch odgrywa kluczową rolę w wyżej wymienionych zachowaniach, w szczególności w wykrywaniu cząsteczek odorantów na średnim i długim dystansie2,3. Zapachy wydzielane przez żywiciela lub miejsce składania jaj są wykrywane przez różne specyficzne receptory węchowe (np. GRs, ORs, IRs) zlokalizowane na palpach komarów, trąbce, stępie i czułkach2,3.

Ponieważ węch jest kluczowym elementem ich zachowań związanych z poszukiwaniem żywiciela (roślinnego i zwierzęcego), godowym i składaniem jaj, stanowi więc idealny cel do badań w celu opracowania nowych narzędzi do zwalczania komarów4. Badania nad repelentami (np. DEET, IR3535, pikarydyna) i przynętami (np. BG sentinel human lurre) są niezwykle płodne5, ale ze względu na obecne wyzwania w zwalczaniu komarów (np. odporność na insektycydy, gatunki inwazyjne), konieczne jest opracowanie nowych skutecznych metod zwalczania opartych na biologii komarów.

Wiele technik (np. olfaktometr, testy lądowania, elektrofizjologia) zostało użytych do oceny bioaktywności związków lub mieszanin związków u komarów. Wśród nich elektroantennografia (lub elektroantennogramy (EAG)) mogą być wykorzystane do określenia, czy substancje zapachowe są wykrywane przez czułki komarów. Technika ta została początkowo opracowana przez Schneider6 i od tego czasu jest stosowana w wielu różnych rodzajach owadów, w tym moths7,8,9, bumblebees10,11, pszczoły miodne12,13 i muszki owocowe14,15, żeby wymienić tylko kilka. Elektroantennografia została również wykorzystana przy użyciu różnych protokołów, w tym pojedynczej lub wielu anten u komarów16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

Komary to stosunkowo małe i delikatne owady o dość cienkich czułkach. Podczas gdy wykonywanie EAG na większych owadach, takich jak lub trzmiele, jest stosunkowo łatwe ze względu na ich większy rozmiar i grubsze czułki, przeprowadzanie EAG u komarów może być trudne. W szczególności utrzymanie dobrego stosunku sygnału do szumu i trwałe przygotowanie do reakcji to dwa główne wymagania dotyczące odtwarzalności i wiarygodności danych.

Proponowany tutaj przewodnik krok po kroku po EAG bezpośrednio oferuje rozwiązania tych ograniczeń i sprawia, że ten protokół ma zastosowanie do kilku gatunków komarów z różnych rodzajów, w tym Aedes, Anopheles, Culex i Toxorhynchites, i opisuje technikę zarówno dla samic, jak i mężczyzn. Elektroantennografia oferuje szybki, ale niezawodny sposób badania przesiewowego i oznaczania związków bioaktywnych, które można następnie wykorzystać w opracowywaniu przynęty po określeniu wartościowości za pomocą testów behawioralnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworu soli fizjologicznej

  1. Przygotuj sól fizjologiczną wcześniej i przechowuj w lodówce.
  2. Postępuj zgodnie z instrukcjami Beyenbach i Masia26, aby przygotować rozwiązanie.
    UWAGA: Receptura soli fizjologicznej w mM: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 glukozy, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO3, 1,7 CaCl2 i 1,0 MgCl2. pH dostosowuje się do 7,1 za pomocą 1 M NaOH. Nie należy w tym czasie dodawać glukozy ani sacharozy do preparatu, aby zwiększyć ilość przechowywaną na półce. Dodaj potrzebną ilość do soli fizjologicznej tuż przed uruchomieniem EAG (około 50 ml na eksperyment).

2. Przygotowanie i przechowywanie zapachów

  1. Mieszaniny substancji zapachowych lub rozcieńczenia pojedynczych związków chemicznych należy przygotować z wyprzedzeniem w bursztynowych fiolkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C, aby zapobiec degradacji związku.
    UWAGA: Stężenia będą zależeć od testu, który ma zostać przeprowadzony. 0,1% lub 1% są powszechnie używane do określenia, czy związek można wykryć, czy nie. Dla krzywej dawka-odpowiedź należy przygotować seryjne rozcieńczenia danej substancji chemicznej i przebadać je od najniższych do najwyższych stężeń.
  2. Przygotuj rozcieńczenia w wodzie, etanolu, heksanie, oleju parafinowym lub oleju mineralnym, w zależności od rozpuszczalności badanej substancji chemicznej.
  3. Upewnij się, że przygotowałeś kontrolny rozpuszczalnik (fiolkę zawierającą tylko rozpuszczalnik) do eksperymentu.
  4. Wyjmij substancje zapachowe z zamrażarki na 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentów, aby umożliwić ich rozmrożenie. Swirować każdą fiolkę przed użyciem, aby dobrze wymieszać substancję chemiczną i rozpuszczalnik.
  5. Pobrać pipetę 10 μl roztworu na kawałek bibuły filtracyjnej (0,5 cm x 2 cm) umieszczony wewnątrz oznakowanej szklanej strzykawki lub pipety Pasteura.
  6. Załaduj każdy związek lub mieszaninę do specjalnej pipety lub strzykawki Pasteura, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
    UWAGA: Załaduj 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentu, aby zapach mógł dyfundować w strzykawce, ale nie na dłużej, aby zapobiec degradacji. Niech pipeta lub strzykawka Pasteura pozostanie w tym czasie zakryta, aby umożliwić dobrą dyfuzję substancji chemicznej przed rozpoczęciem eksperymentu.
  7. Po każdym uruchomieniu EAG wyrzuć kawałek bibuły filtracyjnej i zastąp go nowym, aby zapobiec przesiąknięciu bibuły i ryzyku zablokowania igły. Wymieniaj igły regularnie (co 10 cykli).

3. Separacja komarów

  1. Odizoluj komary w dniu eksperymentów.
  2. Użyj komarów, które mają co najmniej 6 dni w dniu eksperymentów, aby zwiększyć szanse, że samice zostaną sparowane, aby wzmocnić ich reakcję na substancje zapachowe związane z gospodarzem.
    UWAGA: Dostosuj wiek komara w czasie testu w zależności od projektu. Sprawdź i zharmonizuj stan fizjologiczny (np. karmiony krwią, głodzony, nigdy wcześniej nie karmiony itp.).
  3. Głodzić komary do 12 godzin (tj. brak dostępu do cukru), aby zwiększyć ich motywację i wrażliwość.
  4. Umieść pojemnik na komary w lodówce (4 °C), aż przestaną latać, aby można je było łatwo przelać do pojedynczych kubków za pomocą kleszczy.
    UWAGA: Gatunki o wyższej tolerancji na zimno można uśpić za pomocą podkładki na muchy CO2. Upewnij się, że komary nie pozostaną na nim przez długi czas, aby zapobiec wysuszeniu, które zmniejszyłoby reakcję preparatu EAG na komary.
  5. Przechowuj kubki zawierające pojedyncze komary w temperaturze pokojowej przed wykonaniem EAG i wyrzuć wszelkie komary, które nie mogą być używane w ciągu dnia.

4. Uchwyt elektrody i przygotowanie kapilar

  1. Ciągnięcie, przygotowanie i przechowywanie naczyń włosowatych
    1. Używaj kapilar borokrzemianowych z włóknami (ID: 0,78 mm, OD: 1 mm). Pociągnij je w zależności od sprzętu27.
      UWAGA: Przechowuj naciągnięte naczynia włosowate na szalce Petriego. Umieść szalkę Petriego na kawałkach wosku lub bezzapachowej plasteliny, aby zapobiec ich przesuwaniu się i pękaniu.
    2. Przed przeprowadzeniem eksperymentu EAG delikatnie przełam końcówkę 2 naczyń włosowatych za pomocą kleszczy pod mikroskopem.
      UWAGA: Upewnij się, że jedna z nich jest nieco większa od drugiej, aby pasowała do szyjki (większa kapilara) lub końcówek anten (mniejsza kapilara). Upewnij się, że cięcie jest czyste, bez pęknięć na ściance kapilary. Wymaga to cierpliwości i praktyki.
    3. Jeśli nadal są nienaruszone, użyj tych naczyń włosowatych ponownie po spłukaniu wodą dejonizowaną (DI) po zakończeniu eksperymentu. Usuń nadmiar wody, delikatnie przykładając chusteczkę czyszczącą do końcówki. Umieść z powrotem na szalce Petriego. Jeśli końcówka jest krzywa, wyrzuć kapilarę.
  2. Uchwyt elektrody i mocowanie kapilarne
    1. Oznacz dwa uchwyty elektrod jako "nagranie" i "odniesienie", używając kawałków taśmy laboratoryjnej w różnych kolorach. Pomoże to w montażu głowicy komara i elektrod.
    2. Upewnij się, że uchwyty elektrod są czyste w środku i że nie ma żadnych zanieczyszczeń borokrzemianowych.
    3. Chloryzacja: Namocz srebrne druty uchwytów elektrod w czystym wybielaczu na około 5 minut. Przewody zmieniają kolor z błyszczącego jasnoszarego na matowy ciemnoszary.
    4. Poluzować gumowy korek i napełnić wnętrze kapilary 10% roztworem soli fizjologicznej za pomocą igły 20 G.
    5. Napełnij kapilę borokrzemianową roztworem soli fizjologicznej za pomocą strzykawki. Upewnij się, że ani w uchwycie elektrody, ani w ciągniętej kapilarze nie ma pęcherzyków.
      UWAGA: Aby zmniejszyć ryzyko pojawienia się pęcherzyków w kapilarze, należy wpychać sól fizjologiczną do kapilary, jednocześnie delikatnie wyciągając igłę i używać naczyń włosowatych z włóknem. Możliwe jest obciążenie naczyń włosowatych roztworem złożonym z żelu elektrodowego w proporcji 1:3 i roztworu soli fizjologicznej. Może to pomóc w zapobieganiu parowaniu soli fizjologicznej i może być szczególnie przydatne podczas nauki i ćwiczenia EAG, ponieważ eksperymentator będzie potrzebował więcej czasu na wykonanie różnych kroków.
    6. Po namoczeniu srebrne druty opłucz wodą DI i włóż je do dwóch naczyń włosowatych. Upewnij się, że końcówka drutu znajduje się w odległości mniejszej niż 1 mm od końcówki kapilary. Upewnij się, że kapilara przechodzi przez gumowy pierścień wewnątrz uchwytu elektrody bez pękania. Delikatnie dokręć gumowy korek. Sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza.
    7. Użyj kapilary z szerszym otworem w uchwycie elektrody referencyjnej (szyjka) i mniejszym otworem w uchwycie elektrody rejestrującej (anteny).
    8. Pozostaw dwa zamontowane uchwyty elektrod na mokrej chusteczce do czyszczenia, aby zapobiec wysychaniu końcówki do czasu, gdy będzie gotowa do zamontowania głowicy.

5. Przygotowanie platformy EAG (Rysunek 1)

  1. Upewnij się, że stół powietrzny jest podniesiony, że w linii lotniczej nie ma blokady. Upewnij się, że zbiornik z powietrzem medycznym jest nadal pełny, aby uniknąć jego wymiany w trakcie eksperymentu. Upewnij się, że w nawilżaczu są bąbelki.
  2. System dostarczania powietrza i impulsów
    1. Włączyć zbiornik z gazem medycznym.
    2. Sprawdź poziom dwóch przepływomierzy.
      UWAGA: Przepływomierz sterujący głównym prądem powietrza kąpiącego preparat podczas całego eksperymentu powinien mieć wartość 140 ml/min, a drugi związany z impulsem zapachowym powinien wskazywać 15 mL/min.
  3. Jeśli wykonujesz GC-EAD, włącz maszynę, zbiorniki z gazem i utwórz/załaduj plik/metodę.
  4. Włącz komputery, aplikacje, zasilanie zaworu i sprawdź połączenie internetowe, aby aplikacja działała.
    1. Aplikacja programowa: Można napisać krótki skrypt, aby dostarczyć impuls.
    2. Oprogramowanie EAG: użyj dowolnego oprogramowania do elektrofizjologii.
    3. Zaimplementuj parametry w oprogramowaniu (np. wzmacniacz, czas trwania nagrania, czas trwania impulsów itp.).
  5. Dostarcz impuls sterujący, aby sprawdzić, czy zawór dostarczający impulsy działa.
  6. Ustaw zasilanie na 5,2 V. Sprawdź parametry wzmacniacza.
    UWAGA: Parametry użyte do przedstawionych tutaj danych to: dolny filtr odcinający 0,1 Hz; wysoki filtr odcinający 500 Hz; Zysk x100.

6. Przygotowanie i montaż głowy komara (Rysunek 2)

  1. Umieść aluminiową płytkę na lodzie i połóż na niej kawałek mokrej chusteczki do czyszczenia.
  2. Umieść małą porcję żelu elektrodowego w rogu.
  3. Umieść kubek na komara na lodzie i pozwól komarowi ostygnąć przez kilka minut lub do momentu, gdy przestanie latać.
    UWAGA: Niektóre gatunki są odporne na zimno i mogą wymagać szybkiego znieczulenia przez podkładkę przeciwmuchową CO2 w dół. Im przynajmniej komar pozostanie na którymkolwiek z nich, tym lepiej.
  4. Połóż komara na plecach i przypnij końcówkę każdej anteny (tylko niewielką część ostatniego segmentu) mikronożyczkami.
  5. Użyj kleszczy, aby przeciągnąć komara obok porcji żelu elektrody i delikatnie zanurz końcówkę każdej anteny w żelu. Unikaj zanurzania w żelu elektrody więcej niż tylko ostatniego segmentu.
  6. Za pomocą kleszczy wyciągnij czułki komarów, trzymając je obok siebie. Niech wyjdą razem z żelu. Upewnij się, że anteny nie dotykają powierzchni chusteczki czyszczącej, ponieważ mogą się rozdzielić.
  7. Połóż komara na boku i posiekaj głowę za pomocą mikronożyczek lub żyletki.
    UWAGA: Po odcięciu głowy przejdź szybko do kolejnych kroków i do zestawu EAG, aby rozpocząć nagrywanie. Preparat powinien utrzymywać się w czasie reakcji przez około 30 minut.
  8. Weź elektrodę odniesienia i delikatnie zanurz końcówkę w żelu. Utrzymuj kontakt z tkankami szyi i pozwól, aby głowa się do niej przykleiła.
  9. Przesuń uchwyty elektrod pod mikroskopem EAG i view przez mikroskop, aby umieścić elektrodę głowicową (tj. referencyjną) na mikromanipulatorze. Upewnij się, że anteny znajdują się pośrodku.
  10. Chwyć elektrodę nagrywającą, umieść ją przed końcówkami anten. Przesuń i wyrównaj go jak najbliżej końcówek za pomocą mikromanipulatora. Za pomocą mikroskopu przesuń końcówkę elektrody rejestrującej w kierunku anten.
  11. Podłącz oba uchwyty elektrod do amplifier przed włożeniem końcówek, aby zapobiec ich przesuwaniu się po włożeniu.
  12. Włóż końcówki anten do elektrody rejestrującej. Upewnij się, że stykają się one tylko z solą fizjologiczną i żelem elektrodowym i są widoczne przez przezroczystość przez kapilarę. Antena wchodzi przez "efekt ssania".
  13. W razie potrzeby wyreguluj pozycję głowy i końcówek za pomocą kleszczyków pod mikroskopem.
  14. Umieść rurkę powietrzną w pobliżu preparacji głowy komara (odległość: 1 cm).
    UWAGA: Jeśli głowa odpadnie, wróć do stacji preparacyjnej i ponownie zamontuj głowę lub przygotuj nową, jeśli została zgubiona lub jeśli od odcięcia głowy minęło więcej niż 5 minut. Dobre połączenie między kapilarą a szyjką/czułkami jest niezbędne dla niskiego poziomu szumów i niezawodnego nagrywania. Idealnie, końcówki anten powinny znajdować się w odległości mniejszej niż 1 mm od przewodu elektrody rejestrującej po włożeniu.
  15. Wyłącz źródło światła, jeśli jest używane.
  16. Umieść przewód podciśnieniowy w pobliżu przygotowania głowicy komara (odległość: 20 cm) i wyrównaj z głównym przewodem powietrznym.
    UWAGA: Próżnia pomoże usunąć substancje chemiczne otaczające głowicę po bodźcu, co może prowadzić do reakcji EAG po zastosowaniu impulsów.

7. Nagrania

  1. Po włożeniu końcówek anten należy włączyć wzmacniacz i reduktor szumów. Obserwuj sygnał linii podstawowej i upewnij się, że nie jest głośny.
    UWAGA: Obserwuj, czy występują duże oscylacje sygnału elektrycznego. W razie potrzeby dostosuj położenie końcówek głowicy i anten, aż sygnał będzie czysty. Użyj zacisków krokodylkowych, aby uziemić wszystko, co wprowadza hałas do klatki Faradaya lub stołu powietrznego. Sygnał podstawowy o amplitudzie mniejszej niż 0,01 mV jest idealny do wykrywania i rozróżniania minutowych odpowiedzi EAG.
  2. Gdy poziom hałasu jest zadowalający, włóż pierwszą strzykawkę do pomiaru zapachu w celu przetestowania w otworze w przewodzie powietrznym.
  3. Zamknij klatkę Faradaya. Nie należy stawać przed preparatem, aby zmniejszyć hałas.
  4. Kliknij Nagrywaj w oprogramowaniu EAG.
  5. Dostarczyć impuls(y) za pomocą aplikacji.
    UWAGA: Liczba i czas trwania impulsów będą się różnić w zależności od eksperymentów. W tym przypadku zastosowano pojedyncze 1 s. impulsy na nawaniacz. Substancje zapachowe były oddalone od siebie o 45 s.
  6. Zwróć uwagę na reakcję czułków komarów w zeszycie laboratoryjnym.
    UWAGA: Jeśli nawaniacz zostanie wykryty przez czułki komarów, obserwuje się wyraźne odchylenie sygnału (patrz Rysunek 3A).
  7. Przejdź do następnego zapachu lub stężenia. Nie należy zapominać o losowym doborze postaci substancji zapachowych, chyba że zostanie przeprowadzona krzywa dawka-odpowiedź.
    UWAGA: W doświadczeniach należy stosować kontrolę ujemną i kontrolę dodatnią. Zapewni to, że zaobserwowane reakcje są rzeczywiście reakcjami węchowymi, a nie wynikającymi z hałasu mechanicznego lub elektrycznego.
  8. Na końcu nagrania zastosuj kontrolę pozytywną, aby sprawdzić, czy anteny nadal reagują.
    UWAGA: Użyj 0,1% lub 1% benzaldehydu, ponieważ wszystkie testowane do tej pory gatunki komarów reagowały na ten związek.
  9. Kontynuuj następny preparat na komary.

8. Sprzątanie

  1. Wyłącz wzmacniacz, reduktor szumów, linię lotniczą i komputer.
  2. Włóż substancje zapachowe z powrotem do zamrażarki.
  3. Wyjmij bibułę filtracyjną ze szklanych strzykawek i wyczyść 100% etanolem, jeśli na ściankach widoczne są pozostałości. Pozostaw do wyschnięcia na noc na chusteczce czyszczącej.
  4. Wyczyść uchwyty elektrod wodą DI, aby usunąć wszelkie możliwe ślady soli. Wysuszyć, delikatnie nakładając na kawałek chusteczki czyszczącej.
  5. Umieść resztki komarów w zamrażarce i wyrzuć 24 godziny później.
    UWAGA: Jeśli pracujesz z zakażonymi komarami, postępuj zgodnie z wymogami bezpieczeństwa w swojej instytucji.

9. Analizy danych

  1. Mierz odpowiedzi EAG ręcznie lub automatycznie.
    UWAGA: W tym miejscu mierzona jest amplituda EAG (-mV). Uśrednioć, jeśli dla każdego związku zastosowano wiele impulsów. W zależności od zastosowanego oprogramowania, EAG mogą być automatycznie wykrywane i mierzone. Konieczne jest jednak indywidualne zbadanie każdej odpowiedzi w celu zweryfikowania jej kształtu i oceny ewentualnego przeniesienia, opóźnionej odpowiedzi itp. Idealna reakcja EAG jest dopasowana do pulsu, wykazuje wyraźne odchylenie i jest powtarzalna między preparatami na komary (Rysunek 3).
  2. Przedstaw surowe dane, aby pokazać minimalną zmienność, niski poziom szumów sygnału i jasne odpowiedzi (Rysunek 3B).
    UWAGA: Dane można również znormalizować (np. Z-score). Wartość kontroli ujemnej (np. olej mineralny) (tj. poziom bazowy) można odjąć od odpowiedzi, a jeżeli tak nie jest, należy ją przedstawić na rysunkach. Należy również przedstawić kontrolę dodatnią.
  3. Wykonuj analizę statystyczną za pomocą dowolnego oprogramowania statystycznego28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroantennografia to potężne narzędzie do określenia, czy antena na owady wykryje substancję chemiczną lub mieszaninę substancji chemicznych. Może być również wykorzystany do określenia progu wykrywania dla danej substancji chemicznej przy użyciu stopniowego zwiększania stężenia (tj. odpowiedzi krzywej dawki, Rysunek 4B). Ponadto przydatne jest przetestowanie wpływu repelentu na reakcję na zapachy związane z gospodarzem 29.

Kontrole pozyty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na zachowania węchowe wpływa wiele czynników, w tym fizjologicznych (np. wiek, pora dnia) i środowiskowych (np. temperatura, wilgotność względna)30. W związku z tym podczas przeprowadzania EAG konieczne jest wykorzystanie owadów, które są w tym samym stanie fizjologicznym (tj. monitorowanie wieku, głodzenie, krycie)31 , a także utrzymanie ciepłego i wilgotnego środowiska wokół preparatu, aby uniknąć wysuszenia. Temperatura około 25 °C jest idealna i wilgotność od 60% do 80%...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jestem wdzięczny dr Clément Vinauger i dr Jeffreyowi Riffellowi za pomocne dyskusje. Następujące odczynniki zostały uzyskane za pośrednictwem BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Szczep STE2, MRA-128, dostarczony przez Marka Q. Benedicta; Aedes aegypti, szczep ROCK, MRA-734, dostarczony przez Davida W. Seversona; Culex quinquefasciatus, szczep JHB, jaja, NR-43025. Autor dziękuje dr Jake'owi Tu, dr Nisha Duggal, dr Jamesowi Wegerowi i Jeffreyowi Marano za dostarczenie jaj komarów Culex quinquefasciatus i Anopheles stephensi (szczep: Liston). Aedes albopictus i Toxorhynchites rutilus septentrionalis pochodzą od komarów polnych zebranych przez autora w rejonie New River Valley (VA, USA). Prace te były wspierane przez Zakład Biochemii i Instytut Nauk Przyrodniczych Fralin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stół powietrzny Clean BenchTMChttps://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriessReduktor szumów
Tablica analogowo-cyfrowaNational InstrumentsBNC-2090A
Benchtop Flowbuddy CompleteGenesee Scientific59-122BCDo znieczulania komarów
Kapilara ze szkła borokrzemianowegoInstrumentSutterB100-78-10Aby dokonać nagrania i odniesień kapilary
ChemikaliaSigma AldrichBenzaldehyd: 418099-100 mL; Kwas masłowy: B103500-100 ml; 1-heksanol: 471402-100 ml; Olej mineralny: M8410-1LChemikalia użyte w prezentowanych tutaj eksperymentach
CO2Airgas lub PraxairN/ADo znieczulania komarów
Źródło zimnego światłaVolpiNCL-150
Strzykawki jednorazoweBD1 ml (309628)  / 3 mL (309657)
elektrodWorld Precision Instruments5371
Żel do elektrod bez soliParkerlabs12-08-Spectra-360
Klatka FaradayaTMChttps://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycagesReduktor hałasu
PrzepływomierzeBel-art65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075)Po jednej z
każdej fiolki i nakrętki GCMSThermo-fisher scientific2-SVWKA8-CPKDo przygotowania rozcieńczeń nawaniaczy
Szklane strzykawki (Fortuna)Sigma AldrichZ314307Do dostarczania zapachów do EAG prep
HumbugQuest Scientifichttp://www.quest-sci.com/Reduktor hałasu
2 mm Uchwyt podnośnika, wąski, 90 stopni, z drutemSystemy AM675748Uchwyt elektrody
Podstawy magnetyczneKanetecMB-FXx 2
MATLAB + Skrzynki narzędzioweMathworkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlDo dostarczania impulsów
Powietrze medyczneAirgas lub PraxairN/ADla głównej linii lotniczej
Mikroskop Mikromanipulatory NikkonSMZ-800N
Trójosiowy mikromanipulator zgrubny/drobnoziarnisty kompaktowyNarishigeMHW-3x 2
Wzmacniacz mikroelektrodowy ze stacją czołowąSystemy AMModel 1800
Materiały do hodowli komarówBioquiphttps://www.bioquip.com/Search/WebCatalog.asp
IgłyBD25G (305127) / 21G (305165)
Pipety PasteuraFisher Scientific13-678-6ADo dostarczania zapachu do EAG prep
PTFE Rurki o różnych średnicachMc Master CarrN/ADo podłączenia zaworu elektromagnetycznego, przepływomierz, linia lotnicza ect.
Zasilacz 30V/5A DC Dr. MeterPS-305DM
R wersja 3.5.1R projekthttps://www.r-project.org/Do analizy danych
Przekaźnik do zaworu elektromagnetycznegoNie dotyczyWykonany
srebrny drut 0,01"AM Systems782500
Zawór elektromagnetyczny (3-drogowy)Firma Lee LHDA0533115H
Oprogramowanie WinEDROprogramowanie do elektrofizjologii StrathclydeWinEDR V3.9.1Do nagrywania EAG
Papier WhatmanCole ParmerUX-06648-03Ładowanie chemikaliów do szklanej strzykawki / pipety Pasteura
na zamówienie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
  2. Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes: a review. International Journal of Tropical Insect Science. 12 (1-2-3), 287-295 (1991).
  3. Zwiebel, L. J., Takken, W. Olfactory regulation of mosquito-host interactions. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 645-652 (2004).
  4. Potter, C. J. Stop the biting: targeting a mosquito's sense of smell. Cell. 156 (5), 878-881 (2014).
  5. Paluch, G., Bartholomay, L., Coats, J. Mosquito repellents: a review of chemical structure diversity and olfaction. Pest Management Science. 66 (9), 925-935 (2010).
  6. Schneider, D. Electrophysiological investigation on the antennal receptors of the silk moth during chemical and mechanical stimulation. Experientia. 13 (2), 89-91 (1957).
  7. Raguso, R. A., Light, D. M., Pickersky, E. Electroantennogram responses of Hyles lineata (Sphingidae: Lepidoptera) to volatile compounds from Clarkia breweri (Onagraceae) and other moth-pollinated flowers. Journal of Chemical Ecology. 22 (10), 1735-1766 (1996).
  8. Schweitzer, E. S., Sanes, J. R., Hildebrand, J. G. Ontogeny of electroantennogram responses in the moth, Manduca sexta. Journal of Insect Physiology. 22 (7), 955-960 (1976).
  9. Martel, V., Anderson, P., Hansson, B. S., Schlyter, F. Peripheral modulation of olfaction by physiological state in the Egyptian leaf worm Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Physiology. 55 (9), 793-797 (2009).
  10. Spaethe, J., Brockmann, A., Halbig, C., Tautz, J. Size determines antennal sensitivity and behavioral threshold to odors in bumblebee workers. Naturwissenschaften. 94 (9), 733-739 (2007).
  11. Suchet, C., et al. Floral scent variation in two Antirrhinum majus subspecies influences the choice of naïve bumblebees. Behavioral Ecology and Sociobiology. 65 (5), 1015-1027 (2011).
  12. De Jong, R., Pham-Delègue, M. H. Electroantennogram responses related to olfactory conditioning in the honeybee (Apis mellifera ligustica). Journal of Insect Physiology. 37 (4), 319-324 (1991).
  13. Patte, F., Etcheto, M., Marfaing, P., Laffort, P. Electroantennogram stimulus-response curves for 59 odourants in the honeybee, Apis mellifica. Journal of Insect Physiology. 35 (9), 667-675 (1989).
  14. Alcorta, E. Characterization of the electroantennogram in Drosophila melanogaster and its use for identifying olfactory capture and transduction mutants. Journal of Neurophysiology. 65 (3), 702-714 (1991).
  15. Park, K. C., Ochieng, S. A., Zhu, J., Baker, T. C. Odor discrimination using insect electroantennogram responses from an insect antennal array. Chemical Senses. 27 (4), 343-352 (2002).
  16. Du, Y. J., Millar, J. G. Electroantennogram and oviposition bioassay responses of Culex quinquefasciatus and Culex tarsalis (Diptera: Culicidae) to chemicals in odors from Bermuda grass infusions. Journal of Medical Entomology. 36 (2), 158-166 (1999).
  17. Costantini, C., et al. Electroantennogram and behavioural responses of the malaria vector Anopheles gambiae to human-specific sweat components. Medical and Veterinary Entomology. 15 (3), 259-266 (2001).
  18. Collins, L. E., Blackwell, A. Electroantennogram studies of potential oviposition attractants for Toxorhynchites moctezuma and T. amboinensis mosquitoes. Physiological Entomology. 23 (3), 214-219 (1998).
  19. Seenivasagan, T., Sharma, K. R., Sekhar, K., Ganesan, K., Prakash, S., Vijayaraghavan, R. Electroantennogram, flight orientation, and oviposition responses of Aedes aegypti to the oviposition pheromone n-heneicosane. Parasitology Research. 104 (4), 827-833 (2009).
  20. Puri, S. N., Mendki, M. J., Sukumaran, D., Ganesan, K., Prakash, S., Sekhar, K. Electroantennogram and behavioral responses of Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) females to chemicals found in human skin emanations. Journal of Medical Entomology. 43 (2), 207-213 (2014).
  21. Cooperband, M. F., McElfresh, J. S., Millar, J. G., Carde, R. T. Attraction of female Culex quinquefasciatus Say (Diptera: Culicidae) to odors from chicken feces. Journal of Insect Physiology. 54 (7), 1184-1192 (2008).
  22. Dekker, T., Ignell, R., Ghebru, M., Glinwood, R., Hopkins, R. Identification of mosquito repellent odours from Ocimum forskolei. Parasites & Vectors. 4 (1), 183(2011).
  23. Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
  24. Wolff, G. H., Lahondère, C., Vinauger, C., Riffell, J. A. Neuromodulation and differential learning across mosquito species. bioRxiv. , 755017(2019).
  25. Lahondère, C., et al. The olfactory basis of orchid pollination by mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (1), 708-716 (2020).
  26. Beyenbach, K., Masia, R. Membrane conductances of principal cells in Malpighian tubules of Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 48, 375-386 (2002).
  27. Oesterle, A. The Pipette Cookbook. , (2018).
  28. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2018).
  29. Afify, A., Betz, J. F., Riabinina, O., Lahondère, C., Potter, C. J. Commonly used insect repellents hide human odors from Anopheles mosquitoes. Current Biology. 29 (21), 3669-3680 (2019).
  30. Martin, F., Riveron, J., Alcorta, E. Environmental temperature modulates olfactory reception in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 57 (12), 1631-1642 (2011).
  31. Qiu, Y. T., Gort, G., Torricelli, R., Takken, W., van Loon, J. J. Effects of blood-feeding on olfactory sensitivity of the malaria mosquito Anopheles gambiae: application of mixed linear models to account for repeated measurements. Journal of Insect Physiology. 59 (11), 1111-1118 (2013).
  32. Taylor, B., Jones, M. D. R. The circadian rhythm of flight activity in the mosquito Aedes aegypti (L.): the phase-setting effects of light-on and light off. Journal of Experimental Biology. 51 (1), 59-70 (1969).
  33. Eilerts, D. F., VanderGiessen, M., Bose, E. A., Broxton, K., Vinauger, C. Odor-specific daily rhythms in the olfactory sensitivity and behavior of Aedes aegypti mosquitoes. Insects. 9 (4), 147(2018).
  34. Krishnan, B., Dryer, S. E., Hardin, P. E. Circadian rhythms in olfactory responses of Drosophila melanogaster. Nature. 400 (6742), 375-378 (1999).
  35. Pelletier, J., Guidolin, A., Syed, Z., Cornel, A. J., Leal, W. S. Knockdown of a mosquito odorant-binding protein involved in the sensitive detection of oviposition attractants. Journal of Chemical Ecology. 36 (3), 245-248 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja elektroantenograficznapowonanie komar wdetekcja substancji zapachowychsprz enie chromatografii gazowej z EAGodpowied antenalnabod ce sensoryczne komar wkontrola wektor w chor btesty behawioralneklatka Faradaya

Powiązane artykuły