Zaproponowano szybką i niezawodną technikę kontrolowania oscylacji kształtu pojedynczej, uwięzionej bańki akustycznej, która opiera się na technice koalescencji między dwoma bąbelkami. Oscylacje kształtu pęcherzyków w stanie ustalonym, kontrolowane symetrią umożliwiają analizę przepływu płynu generowanego w pobliżu granicy faz pęcherzyków.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Indukcja mikrostrumieniowania przez niesferyczne oscylacje pęcherzykowe w systemie lewitacji akustycznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Gdy znajdują się w pobliżu barier biologicznych, oscylujące mikropęcherzyki mogą zwiększyć przepuszczalność błony komórkowej, umożliwiając internalizację leków i genów. Obserwacje eksperymentalne sugerują, że tymczasowa przepuszczalność tych barier może być spowodowana naprężeniami ścinającymi, które są wywierane na tkanki komórkowe przez mikrostrumienie kawitacyjne. Mikrostrumienie kawitacyjne to generowanie przepływów wirowych, które powstają wokół oscylujących mikropęcherzyków ultradźwiękowych. Aby wytworzyć takie przepływy cieczy, oscylacje pęcherzykowe muszą odbiegać od oscylacji czysto sferycznych i zawierać albo niestabilność translacyjną, albo tryby kształtu. Badania eksperymentalne przepływów wywołanych pęcherzykami i naprężeń ścinających na pobliskich powierzchniach są często ograniczone w swoim zakresie ze względu na trudności w uchwyceniu deformacji kształtu mikropęcherzyków w stabilny i kontrolowany sposób. Opisujemy konstrukcję komory lewitacji akustycznej do badania oscylacji niesferycznych sterowanych symetrią. Taka kontrola odbywa się za pomocą techniki koalescencji między dwoma zbliżającymi się pęcherzykami w wystarczająco intensywnym polu ultradźwiękowym. Kontrola oscylacji niesferycznych otwiera drogę do kontrolowanego mikrostrumieniowania kawitacyjnego swobodnej mikropęcherzyki oscylującej powierzchniowo. Kamery o dużej liczbie klatek na sekundę umożliwiają niemal jednoczesne badanie dynamiki pęcherzyków niesferycznych w akustycznej skali czasowej i przepływu cieczy w niższej skali czasowej. Wykazano, że można uzyskać dużą różnorodność wzorców płynów i że są one skorelowane z zawartością modalną granicy faz pęcherzykowych. Pokazujemy, że nawet tryby kształtu wysokiego rzędu mogą tworzyć wzorce płynów na duże odległości, jeśli dynamika interfejsu zawiera kilka modów, podkreślając potencjał oscylacji niesferycznych dla ukierunkowanego i zlokalizowanego dostarczania leków.
Wprowadzenie
W medycynie podany lek musi pokonać wiele barier w żywym organizmie, zanim dotrze do zamierzonych celów. Jednak większość leków jest szybko usuwana z krwiobiegu. Efektywność celowania jest niska, a leki nie mogą łatwo przenikać przez błony komórkowe, co prowadzi do nieskutecznego dostarczania terapeutyków. Obecnie zastosowanie mikropęcherzyków w połączeniu z ultradźwiękami zostało zaproponowane jako innowacyjna metoda nieinwazyjnego, precyzyjnego i ukierunkowanego dostarczania leków oraz genów do tkanek i komórek patologicznych1. W tym podejściu mikropęcherzyki mogą pełnić rolę nośników, w których wolne leki są albo wstrzykiwane wspólnie z zawiesiną pęcherzyków gazowych, albo załadowywane na ich powierzchnię. Mikropęcherzyki mogą również działać jako lokalny wektor do refokusowania energii ultradźwiękowej w celu oddziaływania z komórkami. Pod wpływem ultradźwięków pęcherzyki stabilnie sprężają się i rozszerzają w reżimie zwanym kawitacją stabilną, co generuje przepływy cieczy, a tym samym naprężenia ścinające w obiektach znajdujących się w pobliżu. Mikropęcherzyki mogą również oscylować nieliniowo i rozszerzać się aż do zapadnięcia się, w reżimie kawitacji inercyjnej, wytwarzając fale uderzeniowe rozchodzące się radialnie z miejsca kolapsu2. Wykazano, że kawitacja, zarówno stabilna, jak i inercyjna, zwiększa przepuszczalność błon komórkowych, a tym samym nasila internalizację leków do wnętrza komórki3.
W zastosowaniach terapeutycznych zrozumienie mechanizmu oddziaływania pęcherzyków z komórkami jest bardzo ważne, jednak istnieje kilka barier, zarówno naukowych, jak i technicznych, które hamują postęp w tej dziedzinie. Po pierwsze, rejestracja dynamiki komórek w odpowiedzi na mechaniczne bodźce indukowane przez pęcherzyki jest bardzo trudna4. W skali czasu akustycznego oscylacje mikropęcherzyków pierwszego rzędu mogą prowadzić do aktywacji kanałów błonowych, ułatwiając transport cząsteczek przez bariery biologiczne. Odbywa się to poprzez bezpośrednie oscylacje błony komórkowej, określane również mianem „masażu komórkowego”5. Aktywację kanałów w wyniku bezpośredniego stresu mechanicznego wykazano przy użyciu technik patch-clamp, które mierzyły właściwości elektrofizjologiczne błon komórkowych w trakcie i po ekspozycji na ultradźwięki6. Pomiar dynamiki komórek indukowanej przez pęcherzyki (rozumianej jako pełne pole deformacji błony komórkowej) w skali czasu akustycznego dostarczyłby również informacji o progu rozszerzenia powierzchni błony ΔA/A wymaganym do powstania porów w błonie komórkowej7. Drugą barierą jest kontrolowanie reżimu zapadania się pęcherzyków, aby uniknąć lizy komórek indukowanej przez mikropęcherzyki. Zapadanie się pęcherzyków oraz indukowane przez nie mikrostrugi zostały zidentyfikowane jako mechanizm, poprzez który dochodzi do perforacji błony8,9. Po permeabilizacji błona komórkowa ulega naprawie poprzez samozamykanie wapniowe dwuwarstw lipidowych oraz fuzję pęcherzyków wewnątrzkomórkowych9. Występowanie zapadania się pęcherzyków może również powodować letalne uszkodzenia komórki i wywoływać niepożądane efekty uboczne w komórkach sąsiednich. W zastosowaniach wrażliwych, takich jak otwieranie bariery krew-mózg za pomocą ultradźwięków, powszechnie przyjmuje się, że należy unikać inercyjnego zapadania się pęcherzyków10.
W związku z tym obecnie ogromne wysiłki poświęca się projektowaniu sekwencji emisji ultradźwięków, połączonych z pasywnym monitorowaniem i kontrolą kawitacji, aby zapewnić stabilne oscylacje mikropęcherzyków11. Sformułowano hipotezę, że w tym stabilnym reżimie stabilnie oscylujące pęcherzyki odgrywają istotną rolę w wywoływaniu permeabilizacji błony, promując ukierunkowane przestrzennie naprężenia ścinające na błonie komórkowej7. Naprężenia ścinające wynikają z przepływów cieczy powstających w sąsiedztwie oscylujących pęcherzyków. Przepływy te nazywa się mikrostrumieniowaniem kawitacyjnym i, jak wspomniano wcześniej, są one jednym z kilku możliwych mechanizmów odpowiedzialnych za zwiększony pobór cząsteczek zewnątrzkomórkowych. W przypadku zawiesin pęcherzyków lub komórek, takich jak w testach transfekcji biologicznych in vitro12, permeabilizacja poprzez mikrostrumieniowanie może być znacznie bardziej wydajna niż permeabilizacja poprzez zapadanie się pęcherzyków. Można to wykazać za pomocą prostych rozważań geometrycznych. W zawiesinach komórkowych sonoporacja będzie wydajna, jeśli większość zawieszonych komórek zostanie poddana wystarczająco silnym oddziaływaniom mechanicznym (prowadzącym do permeabilizacji błony). Znane jest, że zapadanie się pęcherzyków jest ukierunkowane wzdłuż kierunku izotropowego łamania symetrii, np. wzdłuż osi pęcherzyk-ścianka13 lub linii łączącej środki masy pęcherzyka z pęcherzykiem bądź pęcherzyka z komórką14. Powstający mikrojet jest zatem zjawiskiem zlokalizowanym przestrzennie wzdłuż ograniczonej liczby linii łączących centra komórek i pęcherzyków. W zależności od stężenia komórek i pęcherzyków, a także od odległości między pęcherzykiem a komórką, efekt ten może nie być najwydajniejszy w kontekście permeabilizacji wszystkich zawieszonych komórek. Z kolei mikrostrumieniowanie kawitacyjne jest zjawiskiem zachodzącym w wolniejszej skali czasowej, o dużym zasięgu przestrzennym w porównaniu z promieniem pęcherzyka. Ponadto przepływ cieczy jest rozłożony wokół całego pęcherzyka i może zatem oddziaływać na znacznie większą liczbę komórek w bardzo dużym zasięgu. Zrozumienie generowanego mikrostrumieniowania kawitacyjnego wokół oscylującego pęcherzyka jest zatem warunkiem koniecznym do kontrolowania i kwantyfikowania indukowanego przez pęcherzyki naprężenia ścinającego przyłożonego do komórek.
Aby to osiągnąć, krok wstępny polega na kontrolowaniu oscylacji sferycznych i niesferycznych pęcherzyka wzbudzanego ultradźwiękami, ponieważ generowane przepływy cieczy są indukowane przez ruch powierzchni pęcherzyka15,16. W szczególności należy wywołać i utrzymać stabilność oscylacji kształtu mikropęcherzyków. Ponadto należy kontrolować orientację oscylacji kształtu pęcherzyka, aby prawidłowo przeanalizować korelację między dynamiką powierzchni pęcherzyka a indukowanym wzorem mikrostrumieniowania. Analiza istniejącej literatury wykazuje, że szczegółowe wyniki eksperymentalne dotyczące mikrostrumieniowania indukowanego kawitacją są dostępne jedynie dla pęcherzyków przytwierdzonych do powierzchni. Mikropęcherzyki przytwierdzone do ścianki są powszechnie stosowane do dokładnej oceny dynamiki powierzchni i oddziaływań komórkowych w skali mikrometrów przy użyciu ultraszybkiego systemu mikroskopowego. Konfiguracja ta ma znaczenie terapeutyczne w przypadku wibrujących mikropęcherzyków zlokalizowanych na błonie komórkowej17,18,19. Badanie pęcherzyków przytwierdzonych do podłoża może jednak skomplikować analizę dynamiki pęcherzyka, częściowo ze względu na złożony charakter dynamiki linii styku20 oraz wywoływanie asymetrycznych modów kształtu21. W zastosowaniach medycznych i biologicznych pęcherzyki nieprzytwierdzone do ścianki są powszechnie spotykane w zamkniętych geometriach, takich jak małe naczynia. Wpływa to znacząco na dynamikę pęcherzyka i niestabilności kształtu. W szczególności obecność pobliskiej ścianki przesuwa próg ciśnienia dla wyzwalania modów kształtu w stronę niższych wartości ciśnienia, w zależności od numeru modu kształtu i rozmiaru pęcherzyka22. Ścianka wpływa również na indukowane przez pęcherzyk mikrostrumieniowanie, co może skutkować wyższą intensywnością generowanego przepływu23.
Spośród wszystkich możliwych scenariuszy, jakich mogą doświadczyć mikropęcherzyki (wolne lub przytwierdzone, w pobliżu ściany, zapadające się lub stabilnie oscylujące), proponujemy zbadanie dynamiki niesferycznej pojedynczego pęcherzyka oddalonego od jakiejkolwiek granicy. Układ eksperymentalny opiera się na systemie lewitacji akustycznej24, w którym do uwięzienia pęcherzyka wykorzystywana jest stojąca fala ultradźwiękowa. Scenariusz ten jest zgodny z zastosowaniami medycznymi, w których w komorze do sonotransfekcji współistnieje np. zespół zawieszonych pęcherzyków i komórek. Przy założeniu, że pęcherzyki i komórki nie znajdują się zbyt blisko siebie, przyjmuje się, że obecność komórki nie wpływa na dynamikę interfejsu pęcherzyka. Gdy komórki poruszają się po pętlowych trajektoriach mikrostrumieniowania indukowanego kawitacją, cyklicznie zbliżają się i oddalają od położenia pęcherzyka, i możemy założyć, że obecność komórki nie wpływa ani na wzorzec strumieniowania, ani na jego średnią prędkość. Ponadto dynamika niesferyczna i indukowane mikrostrumieniowanie z pojedynczych pęcherzyków oddalonych od granicy są dobrze znane z punktu widzenia teoretycznego. Aby powiązać indukowany przez pęcherzyk przepływ cieczy z dynamiką konturu pęcherzyka, konieczna jest dokładna charakterystyka dynamiki interfejsu pęcherzyka. W tym celu w badaniach eksperymentalnych preferowane jest dostosowanie skali czasoprzestrzennej w stosunku do skali stosowanej w terapii, tak aby możliwe było obrazowanie za pomocą zwykłych kamer wysokiej prędkości (poniżej 1 miliona klatek/sekundę) poprzez zastosowanie dużych pęcherzyków wzbudzanych przy niższych częstotliwościach. W przypadku pęcherzyków niepowlekanych częstotliwość własna ωn danego modu n jest powiązana z rozmiarem pęcherzyka zgodnie z równaniem 
25. Ta zależność między promieniem a częstotliwością własną jest nieco zmodyfikowana w przypadku pęcherzyków powlekanych26, ale rząd wielkości częstotliwości własnej ωn pozostaje taki sam. Zatem badanie pęcherzyków o promieniach równowagi ~50μm w polu ultradźwiękowym 30 kHz jest analogiczne do badania pęcherzyków powlekanych o promieniach ~3μm w polu 1.7 MHz, jak zaproponowano przez Dollet i wsp.27. Oczekuje się zatem podobnych numerów modów kształtu, a tym samym podobnych wzorców mikrostrumieniowania.
Aby wywołać niesferyczne oscylacje powierzchni pęcherzyka, konieczne jest przekroczenie określonego progu ciśnienia, który zależy od promienia, co przedstawiono na Rysunku 1. Istniejące techniki eksperymentalne opierają się na zwiększaniu ciśnienia akustycznego w celu wzbudzenia modów powierzchniowych (zilustrowano to ścieżką (1) na Rysunku 1), albo poprzez stopniowe zwiększanie ciśnienia28, albo poprzez wzbudzenie o modulowanej amplitudzie, odpowiedzialne za okresowe pojawianie się i zanikanie modów powierzchniowych29. Głównymi wadami tych technik są: (i) losowa orientacja osi symetrii oscylacji powierzchniowych, której nie można kontrolować tak, aby znajdowała się w płaszczyźnie obrazowania, (ii) krótki czas życia oscylacji kształtu pęcherzyka, co utrudnia analizę indukowanych przepływów cieczy w większych skalach czasowych, oraz (iii) częste wywoływanie niestabilnych modów kształtu. Proponujemy alternatywną technikę przekraczania progu ciśnienia przy stałym ciśnieniu akustycznym na mapie promień/ciśnienie, co zilustrowano ścieżką (2) na Rysunku 1. Aby to osiągnąć, wymagane jest zwiększenie rozmiaru pęcherzyka w taki sposób, aby znalazł się on w strefie niestabilności. Takie zwiększenie realizowane jest za pomocą techniki koalescencji pęcherzyków. Koalescencję dwóch mikropęcherzyków, początkowo oscylujących sferycznie, wykorzystuje się do stworzenia pojedynczego zdeformowanego pęcherzyka. Jeśli ciśnienie akustyczne i rozmiar pęcherzyka powstałego z koalescencji znajdują się w strefie niestabilności, zostają wzbudzone mody powierzchniowe. Wykazaliśmy również, że technika koalescencji indukuje stabilne oscylacje kształtu w reżimie stanu ustalonego, a także kontrolowaną oś symetrii wyznaczoną przez ruch prostoliniowy dwóch zbliżających się pęcherzyków. Ponieważ zapewnione są stabilne oscylacje kształtu przez wiele minut, analiza przepływu cieczy indukowanego przez pęcherzyk jest możliwa dzięki wprowadzeniu do ośrodka ciekłego fluorescencyjnych mikrocząsteczek, oświetlonych cienką wiązką laserową. Rejestracja ruchu stałych mikrocząsteczek w sąsiedztwie powierzchni pęcherzyka pozwala na zidentyfikowanie wzorca indukowanego przepływu cieczy30. Ogólna zasada wywoływania oscylacji kształtu pęcherzyka, prowadząca do stabilnego w czasie przepływu cieczy, przedstawiona jest na Rysunku 2.
W poniższym protokole przedstawiamy kroki niezbędne do wywołania stabilnych oscylacji kształtu pęcherzyka za pomocą techniki koalescencji oraz opisujemy pomiary przepływu cieczy. Obejmuje to projekt systemu lewitacji akustycznej, kalibrację akustyczną, nukleację pęcherzyków i technikę koalescencji, pomiar dynamiki interfejsu pęcherzyka i przepływu otaczającej cieczy, a także przetwarzanie obrazów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Projekt akustycznej komory lewitacyjnej
- Zaprojektuj optycznie przezroczysty (podobny do PMMA) sześcienny zbiornik (krawędź 8 cm i grubość 2,8 mm na powierzchnię) z modułem geometrii oprogramowania do symulacji multifizycznej (tabela materiałów).
- Włóż cylindryczną powierzchnię (Ø = 35 mm) wyśrodkowaną na dnie zbiornika, aby zamodelować przetwornik ultradźwiękowy.
- Ustaw warunki brzegowe na zerowe ciśnienie na każdej ścianie z normalnym przemieszczeniem amplitudy 1 μm na powierzchni przetwornika.
- Korzystając z modułu dziedziny częstotliwości, zasymuluj funkcję odpowiedzi częstotliwościowej (FRF) zbiornika w zakresie częstotliwości [10 - 40] kHz, w trzech dowolnych lokalizacjach loc1 = (0,01375, 0,01375, 0,04125), loc2 = (0, 0, 0,0088) i loc3 = (0,021725, 0,023375, 0,00935).
- Dostosuj wielkość zbiornika tak, aby jeden z trybów akustycznych wnęki odpowiadał częstotliwości znamionowej przetwornika (tutaj 31,2 kHz). FRF zawiera zatem jeden pik rezonansowy bliski tej częstotliwości, jak pokazano na Rysunek 3.
- Wykreśl pole ciśnienia wewnątrz zbiornika, jak pokazano na rysunku Rysunek 4. Wybrany tryb rezonansu musi zawierać co najmniej jeden antywęzeł ciśnieniowy we wnętrzu pojemnika, na którym zostanie uwięziony pęcherzyk akustyczny.
- Projektując zbiornik, zaprojektuj ruchomą górną powierzchnię z rowkiem prowadzącym na każdej krawędzi, aby szczelnie zamknąć powierzchnie zbiornika. Wywierć mały otwór na górnej powierzchni, aby napełnić zbiornik płynnym medium.
- Umieść zbiornik na wodę na domowej ramie, w której znajduje się przetwornik ultradźwiękowy (typ Langevin, częstotliwość nominalna 31.2 kHz). Użyj żelu echograficznego, aby połączyć przetwornik ze ścianą dna zbiornika.
- Umieść zbiornik i system ramowy na trójkierunkowym stole przemieszczeniowym za pomocą mikrometrycznych.
- Napełnij zbiornik mikrofiltrowaną, zdemineralizowaną i wodą (nie odgazowaną, objętość ~ 500 ml, nasycenie tlenem około 8 mg·L-1).
UWAGA: Użycie wody nieodgazowanej zamiast odgazowanej umożliwia utrzymanie stabilnych pęcherzyków przez cały czas trwania eksperymentów. Użycie odgazowanej wody przyspieszy kurczenie się pęcherzyków w wyniku dyfuzji gazu, nawet jeśli zostanie to nieznacznie zrównoważone przez dyfuzję rektyfikowaną (za pośrednictwem ultradźwięków).
2. Generowanie pęcherzyków i kalibracja akustyczna
- Przygotuj zestaw eksperymentalny używany do indukowanego laserem zarodkowania pęcherzykowego, wzbudzenia akustycznego i szybkiego nagrywania (Rysunek 5a,b,c). Układ eksperymentalny składa się z (A) systemu lewitacji akustycznej, (B) zasilacza laserowego i (C) głowicy laserowej, (D) jednej sferycznej soczewki wklęsłej, (E) jednej soczewki płasko-wklęsłej i jednej soczewki asferycznej, (F) szybkiej kamery, (G) diody elektroluminescencji ciągłej. Później, do pomiarów przepływów cieczy (Rysunek 5d) (H) jedno źródło lasera o ciągłej fali, (I) zostanie dodana cylindryczna soczewka płasko-wklęsła, a następnie cylindryczna soczewka płasko-wklęsła umieszczona za pierwszą soczewką i zorientowana na osi prostopadłej.
- Podłącz przetwornik ultradźwiękowy do generatora funkcyjnego. Ustaw sygnał wzbudzenia jako: przebieg sinusoidalny, fala ciągła, częstotliwość 31,2 kHz. Amplituda jest jedynym parametrem zmiennym.
- Umieść soczewkę (D) w odległości około 6 cm przed głowicą lasera (C).
- Umieść obiektyw (E) w odległości około 12 cm przed obiektywem (D).
- Umieść zbiornik na wodę (A) w taki sposób, aby punkt skupienia lasera znajdował się wewnątrz zbiornika na wodę, co prowadzi do generowania iskry dla każdego impulsu laserowego (5 -10 mJ). Iskra laserowa powinna znajdować się około 3 cm poniżej docelowego antywęzła ciśnieniowego.
UWAGA: Bez ultradźwięków (US) pęcherzyk jądrkowany laserowo uniesie się do górnej powierzchni z powodu wyporu. - Włączyć przetwornik ultradźwiękowy. Zwiększaj przyłożone napięcie, aż pęcherzyk przestanie unosić się pionowo, ale zostanie odchylony w kierunku antywęzła ciśnieniowego i, aby uzyskać wystarczająco wysokie ciśnienie, zostanie uwięziony.
- Ustaw podświetlenie (ciągłą diodę elektroluminescencyjną) i szybką kamerę, aby obserwować uwięzioną bańkę.
UWAGA: Podczas zarodkowania nowej bańki za pomocą iskry laserowej łatwo jest uchwycić trajektorię pęcherzyki zbliżającej się do miejsca pułapki. - Przesuń położenie iskry laserowej w zbiorniku na wodę tak, aby trajektoria pęcherzyka pozostała w płaszczyźnie ogniskowej aparatu.
- Złap jeden bąbelek i uchwyć jego oscylacje radialne z następującymi parametrami: rozmiar klatki 128 x 128 pikseli, szybkość akwizycji 180 kHz. Przykład oscylacji radialnych o dużej amplitudzie w dwóch okresach akustycznych znajduje się na rysunku Rysunek 6. Typowa wielkość pęcherzyków gazu waha się od 30 do 80 μm.
- Rejestruj oscylacje promieniowe pęcherzyków w ciągu 3 do 30 milisekund, aby uchwycić setki do tysięcy oscylacji pęcherzyków. Powtórz ten zapis, aby zwiększyć przyłożone napięcie przetwornika. Typowe stosowane napięcia mieszczą się w zakresie 0 - 8 V.
UWAGA: Podczas modyfikowania przyłożonego napięcia położenie równowagi uwięzionej bańki nieznacznie przesuwa się w pionie. Aby śledzić oscylacje bez przesuwania podświetlanego oświetlenia i kamery, umieść system (przetwornik i zbiornik na wodę) na ruchomym stole w trzech kierunkach z dokładnością mikrometryczną. - Włącz przetwornik ultradźwiękowy i uchwyć jeden obraz tła do analizy końcowej.
- Przetwarzaj serię filmów po wykonaniu tej procedury:
- Uruchom plik wykonywalny VoltagePressure.exe. Interfejs pokazany w Rysunek 7 powinien się otworzyć.
UWAGA: Skrypt jest dostępny jako dokument uzupełniający. - Określ parametry fizyczne i eksperymentalne w lewej kolumnie (Rysunek 7A).
- Określ wartości przyłożonego napięcia dla serii nagrań w tabeli w prawym dolnym rogu tabeli (Rysunek 7B).
- W panelu Analiza promienia bąbelkowego kliknij Parametry obciążenia (Rysunek 7C) i wybierz folder zawierający wszystkie pliki z Twojej serii wideo, a następnie obraz tła (obowiązkowy).
- Dozwolony jest wybór między analizą wszystkich filmów jednocześnie, klikając Auto, lub pojedynczo, klikając Krok po kroku.
- Dla każdego pliku wideo wykreślana jest ewolucja promienia pęcherzyka w ciągu jednego okresu akustycznego, a następnie nakładane jest dopasowanie numeryczne. Czerwona krzywa odpowiada zlinearyzowanemu modelowaniu Rayleigha-Plesseta. Wyświetlany jest promień bąbelka równowagi (Rysunek 7D).
- Zgodnie z dopasowaniem numerycznym, przyłożone ciśnienie dla tego napięcia jest wyświetlane w panelu wykresu ciśnienia (napięcia) (Rysunek 7E). Wartość przyłożonego ciśnienia jest również wyświetlana w tabeli w prawym dolnym rogu (Rysunek 7B). Typowe stosowane ciśnienia odpowiadające dynamice napięcia 0 - 8 V wynoszą 0 - 25 kPa.
- Po przetworzeniu wszystkich filmów kliknij przycisk Regresja liniowa, aby wykonać liniowe dopasowanie krzywej ciśnienia/napięcia. Dane (wartości napięcia i ciśnienia) są zapisywane w pliku .txt znajdującym się w bieżącym katalogu. Zapewnione jest nachylenie pasowania.
- Uruchom plik wykonywalny VoltagePressure.exe. Interfejs pokazany w Rysunek 7 powinien się otworzyć.
3. Technika koalescencyjna
- Włączyć przetwornik ultradźwiękowy. Ustaw przyłożone napięcie na tyle wysoko, aby odpowiednie ciśnienie akustyczne mogło doprowadzić do wyzwolenia niestabilności powierzchni, zgodnie z numerycznym wykresem ciśnienia/promienia stref niestabilności, jak pokazano na Rysunek 8.
- Zarodkować bąbel, który następnie będzie migrował do miejsca pułapki. Jeśli uwięziony pęcherzyk wykazuje tylko oscylacje sferyczne, przejdź do następnego kroku. Jeśli pojawią się oscylacje niesferyczne:
- Wyłącz moc ultradźwięków, aby pęcherzyk mógł unieść się na górną powierzchnię.
- Zmodyfikuj energię lasera (poprzez precyzyjne dostrojenie o kilka mJ) lub zmniejsz napięcie przetwornika.
- Włącz moc ultradźwięków.
- Zarodkować nową bańkę.
- Powtarzaj tę procedurę, aż rozmiar pęcherzyka doprowadzi do czysto sferycznych oscylacji.
- Gdy uwięziony bąbel wykazuje tylko oscylacje sferyczne, wygeneruj nową iskrę laserową. Gdy nowy pęcherzyk dotrze do miejsca pułapki, następuje koalescencja.
- Jeśli zlana bańka wykazuje tylko oscylacje sferyczne, wygeneruj nową bańkę. Wielokrotne koalescencje mogą być konieczne, aby osiągnąć promień pęcherzyka, przy którym występują deformacje niesferyczne. Przykład koalescencji pęcherzyków prowadzącej do oscylacji niesferycznych jest pokazany na Rysunek 9.
- Gdy zlana bańka wykazuje niesferyczne oscylacje, rejestruj oscylacje pęcherzyka przez czas około 3 do 30 milisekund.
- Zidentyfikuj liczbę drgań kształtu, odwołując się do Rysunek 10.
4. Pomiary przepływu płynów
- W przypadku pomiarów mikrostrumieniowania kawitacyjnego, fluorescencyjne cząstki znacznikowe muszą zostać dodane do wody przed zarodkowaniem pęcherzyków. W tym badaniu wykorzystano cząstki o wielkości 0,71 μm (tabela materiałów). Są one wystarczająco małe, aby były akustycznie przezroczyste (nie miały wpływu na siłę promieniowania akustycznego) i dokładnie podążały za przepływem, a także wystarczająco duże, aby rozpraszać światło laserowe. Użyj trzech kropli na objętość zbiornika na wodę, co odpowiada w przybliżeniu 2,104 cząstki/mm3.
- Przed wykonaniem pomiarów należy ustawić następujące parametry rejestrowania zarówno dynamiki pęcherzyków (szybka skala czasowa), jak i przepływu płynu (niska skala czasowa):
- Utwórz partycjonowanie dysku z nagraniem kamery.
- Alternatywnie można zdefiniować parametry zapisu jako:
- Liczba klatek na sekundę 180 kHz, rozmiar klatki 128 x 128 pikseli i czas naświetlania 1 μs dla jednego nagrania dynamiki interfejsu bąbelkowego
- Liczba klatek na sekundę 600 Hz, rozmiar klatki 1024 x 768 pikseli i czas naświetlania 1 ms dla jednego nagrania ruchu znaczników barwnikowych.
- Użyj lasera ciągłego.
- Utwórz cienki arkusz laserowy, kolejno przepuszczając wiązkę lasera przez cylindryczną soczewkę płasko-wklęsłą i cylindryczną soczewkę płasko-wypukłą zorientowaną na osi prostopadłej. Można uzyskać szerokość wiązki około 160 μm.
- Ustaw arkusz lasera tak, aby odpowiadał płaszczyźnie obrazowania:
- Ustaw laser na ruchomym urządzeniu tak, aby arkusz lasera można było przesuwać równolegle do płaszczyzny obrazowania.
- Dostosuj pozycję tak, aby oświetlone cząstki były widoczne dla kamery.
- Zarodkować i uwięzić bańkę.
- Dostosuj położenie arkusza laserowego dalej, tak aby cień stał się widoczny za bańką. Bąbelek znajduje się teraz wewnątrz arkusza laserowego, jak pokazano na rysunku Rysunek 11.
- Wywołaj koalescencję pęcherzyków, aż pojawi się stabilny tryb oscylacji kształtu.
- Wykonaj kilka nagrań, przełączając się między dynamiką bąbelków a mikrostrumieniowaniem.
UWAGA: Wyłącz laser ciągły, gdy nie jest potrzebny. Ogrzewanie może powodować niepożądane przepływy konwekcyjne. Wyłącz również diodę elektroluminescencyjną podczas wykonywania pomiarów przepływu strumienia.
5. Przetwarzanie obrazu w celu wizualizacji wzorców mikrostrumieniowania kawitacji
- Zainstaluj oprogramowanie do wizualizacji ImageJ do przetwarzania i analizy obrazu w języku Java. Zainstaluj także wtyczkę CINE File Reader, aby otworzyć pliki z kamery o dużej szybkości.
- Kliknij Plik | Import | CineFile i wybierz wideo *.cine zawierające ujęcie ruchu cząstek.
- Wybierz Użyj wirtualnego stosu w nowym oknie, wideo jest teraz załadowane.
- Aby obserwować ruch cząstek bez wyświetlania wzoru strumieniowania, kliknij na Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast | Automatyczny. Ciemne tło jest teraz zastępowane automatycznie optymalizowanym obrazem.
- Aby wyświetlić powstały wzór, kliknij Obraz | Stosy | Z Project (Projekcja maksymalna) i wybierz opcję Max Intensity (Maksymalna intensywność) dla projekcji obrazu. Wyświetlany jest obraz wyjściowy z pikselami zawierającymi maksymalną wartość dla wszystkich obrazów w stosie. W razie potrzeby dostosuj kontrast obrazu zgodnie z opisem w kroku 5.4.
UWAGA: Uzyskuje się wzorzec przesyłania strumieniowego, taki jak te pokazane na Rysunek 12b i Rysunek 12d.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Kompletna sekwencja koalescencji pęcherzyków prowadząca do stabilnych w czasie, kontrolowanych symetrią oscylacji niesferycznych została przedstawiona na Rysunku 9. Faza zbliżania się dwóch oscylujących sferycznie pęcherzyków kończy się w momencie przerwania cienkiej warstwy cieczy między nimi. Warto zauważyć, że w ostatnim stadium przed koalescencją powierzchnie pęcherzyków odbiegają od kształtu sferycznego. Oba pęcherzyki wydłużają się, przyjmując kształt e...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona procedura polega na wykorzystaniu koalescencji pęcherzyków w celu wywołania stacjonarnych, kontrolowanych symetrią oscylacji kształtu pęcherzyka, co umożliwia badanie długotrwałego przepływu płynu indukowanego przez te oscylacje. Głównym wyzwaniem w tej technice jest kontrola oscylacji niesferycznych dla pęcherzyka uwięzionego z dala od jakichkolwiek granic.
Większość istniejących technik proponowanych w literaturze koncentruje się na pęcherzykach przytwierdzonych do podłoża
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez LabEx CeLyA Uniwersytetu w Lyonie (ANR-10-LABX-0060 / ANR-11-IDEX-0007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Soczewka asferyczna | Thorlabs | AL4050 | Soczewka ostrości 40 mm |
| Źródło lasera o fali ciągłej | CNI | MLL6FN | Laser DPSS o długości fali 532nm, energia 400 mW |
| Cylindryczna soczewka płasko-wklęsła | Thorlabs | LJ1277L1-A | soczewka o ogniskowej -25×4mm |
| Cylindryczna soczewka płasko-wklęsła | Thorlabs | LK1900L1 | soczewka ostrości 250 mm |
| Cząstki fluorescencyjne | Duke Scientific | R700 | Czerwone polimerowe mikrosfery fluorescencyjne |
| Generator funkcyjny | Agilent | HP33120 | Generator funkcji zasilającej przetwornik ultradźwiękowy |
| Szybka kamera | Vision Research | Phantom v12.0 | Szybki zapis do 1 Mfps |
| Płynne medium | Carlo Erba | Woda do analizy | Woda demineralizowana, nieodgazowana |
| Oprogramowanie Multiphysics | Comsol | None | Softwate do symulacji pola akustycznego komory lewitacyjnej |
| Laser impulsowy Nd:Yag | New Wave Research | Solo III-15 | Czas trwania impulsu 5 ns, λ=532 nm, średnica wiązki 3,5 mm, do 50 mJ |
| Soczewka płasko-wklęsła | Thorlabs | N-BK7 | o ogniskowej 125 mm |
| Sferyczna soczewka wklęsła | Thorlabs | N-SF11 | Dwuwklęsła soczewka ostrości -25mm |
| Przetwornik ultradźwiękowy | SinapTec | Wykonany na zamówienie | Częstotliwość nominalna 31kHz, obszar aktywny o średnicy 35mm |
| Oprogramowanie do wizualizacji | NIH | ImageJ | Oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazu w Java |
| XY Stolik liniowy | Newport | M-406 | Stopień przemieszczenia ze śrubą mikrometryczną |
| Stolik liniowy osi Z | Edmund Optics | 62-299 | Stopień przemieszczenia pionowego ze śrubą mikrometryczną |
Bibliografia
- Roovers, S., et al. The role of ultrasound-driven microbubble dynamics in drug delivery: from microbubble fundamentals to clinical translation. Langmuir. 35 (31), 10173-10191 (2019).
- Liu, H. L., Fan, C. H., Ting, C. Y., Yeh, C. K. Combining microbubbles and ultrasound for drug delivery to brain tumors: current progress and overview. Theranostics. 4 (4), 432-444 (2014).
- Lammertink, B. H. A., et al. Sonochemotherapy: from bench to bedside. Frontiers in Pharmacology. 6, 138(2015).
- Lajoinie, G., et al. In vitro methods to study bubble-cell interactions: fundamentals and therapeutic applications. Biomicrofluidics. 10, 011501(2016).
- Van Wamel, A., Bouakaz, A., Versluis, M., de Jong, N. Micromanipulation of endothelial cells: ultrasound-microbubble-cell interaction. Ultrasound in Medicine and Biology. 30, 1255-1258 (2004).
- Tran, T. A., Roger, S., Le Guennec, J. Y., Tranquart, F., Bouakaz, A. Effect of ultrasound-activated microbubbles on the cell electrophysiological properties. Ultrasound in Medicine and Biology. 33, 158-163 (2007).
- Marmottant, P., Hilgenfeldt, S. Controlled vesicle deformation and lysis by single oscillating bubbles. Nature. 423 (6936), 153-156 (2003).
- Prentice, P. A., Cuschieri, K., Dholakia, K., Prausnitz, M., Campbell, P. Membrane disruption by optically controlled microbubble cavitation. Nature Physics. 1, 107-110 (2005).
- Kudo, N., Okada, K., Yamamoto, K. Sonoporation by single-shot pulsed ultrasound with microbubbles adjacent to cells. Biophysical Journal. 96, 4866-4876 (2009).
- Novell, A., et al. A new safety index based on intrapulse monitoring of ultra-harmonic cavitation during ultrasound-induced blood-brain barrier opening procedures. Scientific Reports. 10, 10088(2020).
- Cornu, C., et al. Ultrafast monitoring and control of subharmonic emissions of an unseeded bubble cloud during pulsed sonication. Ultrasonics Sonochemistry. 42, 697-703 (2018).
- Reslan, L., Mestas, J. L., Herveau, S., Béra, J. C., Dumontet, C. Transfection of cells in suspension by ultrasound cavitation. Journal of Controlled Release. 142 (2), 251-258 (2010).
- Reuter, F., Gonzalez-Avila, S. R., Mettin, R., Ohl, C. D. Flow fields and vortex dynamics of bubbles collapsing near a solid boundary. Physical Review Fluids. 2, 064202(2017).
- Chew, L. W., Klaseboer, E., Ohl, S. W., Khoo, B. C. Interaction of two differently sized oscillating bubbles in a free field. Physical Review E. 84, 066307(2011).
- Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Acoustic microstreaming around a gas bubble. The Journal of the Acoustical Society of America. 127 (2), 703-709 (2010).
- Tho, P., Manasseh, R., Ooi, A. Cavitation microstreaming patterns in single and multiple bubble systems. Journal of Fluid Mechanics. 576, 191-233 (2007).
- Van Wamel, A., et al. Vibrating microbubbles poking individual cells: Drug transfer into cells via sonoporation. Journal of Controlled Release. 112, 149-155 (2006).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. PNAS. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Pereno, V., et al. Layered acoustofluidic resonators for the simultaneous optical and acoustic characterization of cavitation dynamics, microstreaming, and biological effects. Biomicrofluidics. 12, 034109(2018).
- Shklyaev, S., Straube, A. V. Linear oscillations of a compressible hemispherical bubble on a solid substrate. Physics of Fluids. 20, 052102(2008).
- Fauconnier, M., Bera, J. C., Inserra, C. Nonspherical modes non-degeneracy of a tethered bubble. Physical Review E. 102, 033108(2020).
- Xi, X., Cegla, F., Mettin, R., Holsteyns, F., Lippert, A. Study of non-spherical bubble oscillations near a surface in a weak acoustic standing wave field. The Journal of the Acoustical Society of America. 135, 1731(2014).
- Doinikov, A. A., Bouakaz, A. Effect of a distant rigid wall on microstreaming generated by an acoustically driven gas bubble. Journal of Fluid Mechanics. 742, 425-445 (2014).
- Cleve, S., Guédra, M., Inserra, C., Mauger, C., Blanc-Benon, P. Surface modes with controlled axisymmetry triggered by bubble coalescence in a high-amplitude acoustic field. Physical Review E. 98, 033115(2018).
- Lamb, H. Hydrodynamics. 6th ed. , University Press. Cambridge. (1932).
- Liu, Y., Wang, Q. Stability and natural frequency of nonspherical mode of an encapsulated microbubble in a viscous liquid. Physics of Fluids. 28, 062102(2016).
- Dollet, B., et al. Nonspherical oscillations of ultrasound contrast agent microbubbles. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (9), 1465-1473 (2008).
- Versluis, M., et al. Microbubble shape oscillations excited through ultrasonic parametric driving. Physical Review E. 82, 026321(2010).
- Guédra, M., Cleve, S., Mauger, C., Blanc-Benon, P., Inserra, C. Dynamics of nonspherical microbubble oscillations above instability threshold. Physical Review E. 96, 063104(2017).
- Cleve, S., Guédra, M., Mauger, C., Inserra, C., Blanc-Benon, P. Microstreaming induced by acoustically trapped, non-spherically oscillating microbubbles. Journal of Fluid Mechanics. 875, 597-621 (2019).
- Doinikov, A. A., Cleve, S., Regnault, G., Mauger, C., Inserra, C. Acoustic microstreaming produced by nonspherical oscillations of a gas bubble. I. Case of modes 0 and m. Physical Review E. 100, 033104(2019).
- Inserra, C., Regnault, G., Cleve, S., Mauger, C., Doinikov, A. A. Acoustic microstreaming produced by nonspherical oscillations of a gas bubble. III. Case of self-interacting modes n-n. Physical Review E. 101, 013111(2020).
- Prabowo, F., Ohl, C. D. Surface oscillations and jetting from surface attached acoustic driven bubbles. Ultrasonics Sonochemistry. 18 (1), 431-435 (2011).
- Garbin, V., et al. Changes in microbubble dynamics near a boundary revealed by combined; optical micromanipulation and high-speed imaging. Applied Physics Letters. 90, 114103(2007).
- Collis, J., et al. Cavitation microstreaming and stress fields created by microbubbles. Ultrasonics. 50, 273-279 (2010).
- Loughran, J., Eckersley, R. J., Tang, M. X. Modeling non-spherical oscillations and stability of acoustically driven shelled microbubbles. The Journal of the Acoustical Society of America. 131 (6), 4349-4357 (2012).
- Vos, H. J., Dollet, B., Bosch, J. G., Versluis, M., de Jong, N. Nonspherical vibrations of microbubbles in contact with a wall - a pilot study at low mechanical index. Ultrasound in Medicine and Biology. 34 (4), 685-688 (2008).
- Regnault, G., Mauger, C., Blanc-Benon, P., Inserra, C. Secondary radiation force between two closely spaced acoustic bubbles. Physical Review E. 102, 031101(2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
