Artykuł metodologiczny

Rejestrowanie prądów elektrycznych przez błonę plazmatyczną plemników ssaków

DOI:

10.3791/62049

⸱

14 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Department of Neurobiology, Peking University, 3Institute for Biology II / Chemosensation Lab, RWTH Aachen University, 4Research Training Group 2416 MultiSenses-MultiScales, RWTH Aachen University, 5Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus, 6Department of Physiology, University of California, San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje, jak przeprowadzać rejestracje elektryczne z komórek plemników ssaków w konfiguracji całej komórki, z celem bezpośredniego rejestrowania aktywności kanałów jonowych. Metoda ta odegrała kluczową rolę w opisie elektrofizjologicznych profili kilku kanałów jonowych plemników i pomogła ujawnić ich tożsamość molekularną oraz regulację.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rejestracja aktywności elektrycznej jednej z najmniejszych komórek organizmu ssaka – plemnika – od wielu dekad jest trudnym zadaniem dla elektrofizjologów. Metoda znana jako "patch clamp spermatozoan" została wprowadzona w 2006 roku. Umożliwił bezpośrednie rejestrowanie aktywności kanałów jonowych w konfiguracjach całokomórkowych i połączonych z komórkami oraz odegrał kluczową rolę w opisie fizjologii plemników oraz molekularnej tożsamości różnych kanałów jonowych wapnia, potasu, sodu, chlorków i protonów. Jednak rejestracja pojedynczych plemników wymaga zaawansowanych umiejętności i szkolenia z zakresu elektrofizjologii. Ten szczegółowy protokół podsumowuje krok po kroku procedurę i podkreśla kilka "sztuczek", aby udostępnić go każdemu, kto chce poznać fascynującą fizjologię plemników. Konkretnie, protokół opisuje rejestrację z ludzkich i myszych plemników, ale może być dostosowany praktycznie do każdej komórki plemnika ssaków dowolnego gatunku. Protokół obejmuje ważne szczegóły dotyczące zastosowania tej techniki, takie jak izolacja plemników, wybór odczynników i sprzętu, unieruchomienie wysoce ruchomych komórek, utworzenie szczelnego (Gigaohmowego) uszczelnienia między elektrodą rejestrującą a błoną plazmatyczną plemników, przejście do trybu pełnego plemnika (znanego również jako przebicie) oraz przykładowe zapisy kanału jonowego wapnia plemników, CatSper, pochodzący z sześciu gatunków ssaków. Omawiane są zalety i ograniczenia metody zaciskania plemników oraz najważniejsze kroki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podobnie jak tradycyjny patch clamp wynaleziony przez Erwina Nehera i Berta Sakmanna1, patch clamp plemników umożliwia analizę aktywności poszczególnych kanałów jonowych, a także rejestrowanie aktywności całej populacji kanału jonowego w pojedynczej komórce 2,3. Metoda pozwala na identyfikację konkretnego typu kanału jonowego w stopniach odłączenia od enzymatycznych procesów wewnątrzkomórkowych. Ta metoda jest kluczowa do określenia aktywności kanału jonowego na podstawie jego elektrofizjologicznych i farmakologicznych śladów, a zatem stanowi wiarygodną strategię identyfikacji. Minusem tej metody jest jej niezdolność do wykrywania transporterów nieelektrogennych. Dodatkowo podstawowe szkolenie elektrofizjologiczne pomaga zrozumieć niuanse protokołu. Aby opanować technikę patch clamp i zastosować ją do nasień ssaków, zalecamy zapoznanie się z podstawową literaturą patch clamp 4,5. W tym artykule przedstawiamy szczegółową procedurę krok po kroku i podkreślamy unikalne praktyki, które sprawiają, że technika ta jest łatwa do zrozumienia i dostępna dla każdego, kto chce praktykować elektrofizjologię plemników.

Homeostaza jonowa jest niezbędną funkcją fizjologiczną plemników, która w dużym stopniu polega na kanałach jonowych i transporterach jonów do utrzymania fizjologicznie ważnych gradientów jonów, zmiany wewnątrzkomórkowego wapnia oraz zmiany napięcia transbłonowego. Kanały jonowe i transportery jonów regulują kluczowe funkcje plemników, takie jak ruchliwość, nawigacja w kobiecym traktie rozrodczym, dojrzewanie plemników oraz u organizmów morskich chemotaksja w kierunku komórki jajowej 6,7,8,9,10,11,12 . Ruchliwość plemników to proces stopniowo nabywany. Plemniki są głównie spokojne podczas dojrzewania w jądrze oraz podczas przejścia przez najądrze najądrze. Ich ruchliwość jest ograniczana przez kwaśne środowisko najądrza, które prowadzi do wewnętrznej zakwaszenia plemników. To upośledza funkcjonowanie aksonemu, ponieważ nie jest on w stanie funkcjonować poniżej pH 6,013,14. Jednak po ekspozycji na płyny nasienne lub bardziej zasadowe środowisko stężenia jonów wewnątrzkomórkowych plemników i pH cytoplazmatyczne ulegają znacznym zmianom, przez co plemniki stają się ruchome 15,16,17. Ruch wici plemnika jest napędzany hydrolizą ATP, która umożliwia przesuwanie oksonowych mikrotubul18, a proces ten jest wysoce zależny od pH14. Dodatkowo ruch wiciowych jest również kontrolowany przez podwyższenie wapnia wewnątrzwiczowego i cAMP 13,19,20,21,22,23,24. Te czynniki, takie jak stężenie wapnia wewnątrzkomórkowego plemnika [Ca2+], i, pH, ATP i cAMP, są głównymi mechanizmami regulacyjnymi umożliwiającymi zmiany ruchliwości, a ich stężenia są ściśle regulowane przez kanały jonowe plemników i transportery.

Plemniki są wyjątkowe, ponieważ wyrażają szereg białek, których nie da się znaleźć nigdzie indziej w organizmie. Znaczącymi przykładami są kanały jonowe plemników, takie jak kanał potasowy Slo3 25,26,27,28,29 oraz kanał jonowy Cat Sperm, CatSper 2,30,31,32. Ten ostatni jest głównym kanałem wapniowym plemników ssaków31 i jest regulowany przez alkalizację wewnątrzkomórkową 2,30,31,32,33,34. CatSper jest również regulowany przez specyficzne dla gatunku sygnały 7,35 i jest zorganizowany w czterokątne podłużne nanodomeny wzdłuż wici plemnika 36,37,38. U naczelnych CatSper jest aktywowany przez kombinację zasadowości wici, depolaryzacji błonowej i progesteronu 3,39,40,41, natomiast u myszy aktywacji CatSper progesteron nie jest wymagany 2,39. Kolejną specyficzną cechą tego kanału jest jego organizacja wielojednostkowa: CatSper to kompleks co najmniej 10 różnych podjednostek 31,32,34,37,38,42,43,44,45,46,47. Tak zaawansowana struktura i szczegóły regulacji utrudniały rekombinowaną ekspresję CatSper w każdym znanym heterologicznym systemie ekspresji, dlatego charakterystyka fizjologiczna CatSper została ograniczona do jego rodzimego systemu ekspresji – plemników. Natomiast molekularna charakterystyka białka CatSper została osiągnięta w przełomowym artykule z 2000 roku przez D. Rena i in. al.31, ostateczny dowód, że CatSper jest prawdziwym kanałem jonowym, był możliwy dopiero po wprowadzeniu metody zacisków nasiennych w 2006roku. Od tego czasu technika ta umożliwiła precyzyjną charakterystykę wielu szlaków przewodzących jony w plemnikach 9,28,37,39,40,44,46,48-54.

Klasyczna i najprostsza metoda badania cech kanałów jonowych – technika zacisku patch clamp – uważana była za niestosowalną do plemników ze względu na ich ruchliwość i specyficzną morfologię (Rysunek 1A). Konkretnie, minimalna objętość cytoplazmy plemnika oraz ciasne przyleganie błony plazmatycznej plemnika do sztywnych struktur wewnątrzkomórkowych, takich jak włóknista osłona i jądro plemników, były głównymi wyzwaniami55. Te dwie cechy strukturalne tworzą smukłą, strzałowatą komórkę, zaprojektowaną tak, by przenikać przez silnie lepkie środowiska, takie jak ochronne szaty jaj, bez znaczących deformacji czy uszkodzenia błony plazmatycznej.

Pierwszym krokiem metody zacisku łatkowego jest ustanowienie szczelnego uszczelnienia między pipetą rejestrującą (szklaną mikropipetą) a błoną plazmatyczną komórki. Aby to osiągnąć, należy wciągnąć wystarczającą ilość błony plazmatycznej do pipety rejestrującej, aby między membraną plazmatyczną a szkłem powstała mechanicznie stabilna gigaseal. Błona plazmatyczna musi być elastyczna i nie sztywna (Rysunek 1B). Jak wspomniano powyżej, cała powierzchnia błony plazmatycznej plemnika jest dość mocno przylegająca, z wyjątkiem obszaru znanego jako kropla cytoplazmatyczna (Rysunek 1A i Rysunek 2). Dlatego sztywność błony plazmatycznej plemnika uważano za główną przeszkodę w uzyskaniu szczelnego uszczelnienia lub "gigaseal", nazwanego tak, ponieważ do dobrych nagrań wymagane jest >109 omów. Jednak wprowadzenie techniki zacisku plemnika w 2006 roku 2006usunęło tę barierę i metoda ta mogła być skutecznie zastosowana na plemnikach kilku gatunków ssaków 2,41,51,56. Przełom ten został osiągnięty poprzez skupienie się na kropli cytoplazmatycznej (CD)2,8, maleńkiej strukturze znajdującej się wzdłuż środkowej części plemnika (Rysunek 1A i Rysunek 2), która jest po prostu pozostałością wydłużonego plemnika – prekursora plemników, z którego rozwijają się głowa i ogon. Funkcjonalnie może pomóc komórce przystosować się do zmian w osmolarności zewnątrzkomórkowej podczas ejakulacji. Ważną cechą jest to, że błona plazmatyczna wewnątrz CD jest na tyle elastyczna do pipety, tworząc uszczelnienie gigaomowe. W ten sposób CD plemnika jest najlepszą częścią powierzchni plemnika, przez którą można osiągnąć pomyślne utworzenie gigasealu i przejść do trybu całego komórki, który ostatecznie elektrycznie łączy plemnik z wzmacniaczem patch-clamp 2,8. Warto zauważyć, że wcześniejsze publikacje odnotowały skuteczną formację gigasealu na główce plemnika, co umożliwia rejestrację w konfiguracji przymocowanej do komórki 54,57,58,59. Jednak nagrania w konfiguracji całej komórki zostały jak dotąd odnotowane jedynie poprzez formowanie się gigasealów w regionie CD. Ten tryb całej komórki umożliwia elektryczny dostęp do całej objętości plemników, a tym samym umożliwia wykrywanie aktywności kanału jonowego znajdującego się na wiciach plemnika, a także na główce plemnika. Od czasu opracowania technika zacisku plemnika przyniosła ogromny postęp w zrozumieniu kanałów jonowych plemników i jest jak dotąd jedną z najbardziej zaawansowanych metod bezpośredniego badania funkcjonalności kanałów jonowych plemników 9,28,37,39,40,44,46,48,49,50,51,52,53 (Rysunek 1).

Patch clamp na plemniki różni się w niektórych szczegółach od klasycznej techniki patch clamp, jak opisano poniżej. Po pierwsze, większość błony plazmatycznej plemnika jest ściśle przymocowana do sztywnej struktury wewnątrzkomórkowej, przez co plemniki praktycznie nie mają "zapasowej" błony plazmatycznej, którą można by wciągnąć do pipety. Jedynym elastycznym obszarem jest błona CD, która przypomina błonę plazmatyczną wielu komórek somatycznych, dzięki czemu łatwo ją wciągają do pipety. Aby utworzyć uszczelnienie gigaomowe z CD, ujemne ciśnienie powstaje poprzez lekkie ssanie na górze pipety, aby wciągnąć niewielką część błony plazmatycznej plemnika do końcówki mikropipety (Rysunek 1B). Ta część błony tworzy Ω-kształtne wniknięcie w czubek pipety i zapewnia szczelne uszczelnienie ze swoimi wewnętrznymi ścianami.

Po drugie, kropla cytoplazmatyczna w nasiennikach ludzkich i myszy wynosi od 1 do 2 μm (Rysunek 1 i Rysunek 2). Dlatego zastosowanie techniki patch-clamp do tak małego obiektu wymaga wysokiej rozdzielczości optyki. Większość zestawów patch-clamp z plemnikami wyposażona jest w mikroskop odwrócony z różnicowym kontrastem interferencyjnym (DIC) lub komponenty optyczne Nomarskiego (Rysunek 2 i Rysunek 3). Zaleca się stosowanie mikroskopu wyposażonego w optykę DIC do zaciskania plemników na plemnikach zamiast bardziej konwencjonalnej optyki fazowo-kontrastowej, ponieważ informacje przestrzenne widoczne w DIC pomagają osiągnąć wyższą precyzję przy ustawianiu pipety patch na maleńkim CD. Zalecamy także użycie obiektywu zanurzającego w wodzie 60x lub podobnego, z aperturą numeryczną 1,2. Ten obiektyw ma dużą odległość roboczą (0,28 mm), co pozwala na obserwację swobodnie pływających plemników w roztworze (Rysunek 2). Obiektyw posiada także kołnierz regulacyjny do grubości powłoki pokrywowej (zmiennej od 0,13 do 0,21 mm). Połączenie długiego zasięgu roboczego i kołnierza regulacyjnego umożliwia obserwację przez dwa pokrywy 0,13 mm; Jedna pokrywa służy jako szklane dno komory nagrywającej, a na górze umieszcza się 5 mm pokrywkę z osadzonymi plemnikami. Jak omówiono poniżej, składanie plemników na łatwo wymiennych okrągłych pokrywkach o grubości 5 mm, zamiast bezpośrednio na dnie komory rejestracyjnej, jest wygodnym sposobem na załadowanie świeżych plemników do komory rejestrującej.

Po trzecie, zestaw patch clamp na plemniki musi być wyposażony w wzmacniacz patch-clamp o niskim poziomie szumów oraz cyfrowy mechanizm rejestrujący minimalne prądy elektryczne (w zakresie pikoamperów) oraz minimalne zmiany potencjału błonowego. To urządzenie musi zapewnić najniższy poziom szumu wzmacniacza. Brak drgań jest kluczowym elementem udanego nagrania patch clamp. Zaciskanie plemników wymaga precyzyjnego mikromanipulatora wolnego od dryfu, który można przymocować do mikroskopu odwróconego za pomocą platformy mikromanipulatora, aby zapewnić lepszą stabilność niż niezależny podstawek mikromanipulatora (Rysunek 3A). Aby przetestować ustawienie, nie powinno się widzieć żadnego ruchu końcówki pipety (przy 60-krotnym powiększeniu), nawet gdy ktoś skacze po podłodze w pobliżu stołu izolującego drgania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi badań na zwierzętach i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UC Berkeley (AUP 2015-07-7742), przy wszelkich staraniach mających na celu minimalizację cierpienia zwierząt. Wszystkie opisane metody są zgodne z zaleceniami Panelu ds. Eutanazji Amerykańskiego Stowarzyszenia Medycznych Weterynarii oraz komitetu IACUC. Wszystkie eksperymentalne procedury z wykorzystaniem próbek pochodzenia ludzkiego zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Badań Ludzkich na Uniwersytecie Kalifornijskim w Berkeley, numer protokołu IRB 2013-06-5395.

1. Tworzenie szklanych mikropipet do rejestracji plemników za pomocą patch-clamp w całokomórkowych nasieniach.

UWAGA: Niewielki rozmiar kropli cytoplazmatycznej wymaga szklanych mikropipet z cienkimi końcówkami.

  1. Do produkcji mikropipet zacznij od naczyń włosowatych szkła borokrzemowego o średnicy zewnętrznej 1,5 mm, średnicy wewnętrznej 0,86 mm oraz wewnętrznym włóknie. Pociągnij końcówkę w mikropipecie (rysunek 3B).
  2. Aby kształtować i polerować końcówkę pipety, umieść gorący drut blisko końcówki na chwilę. Wykonaj ten proces polerowania ogniowego przy powiększeniu 100x, używając polerki do pipet (rysunek 3C,D).
  3. Upewnij się, że wewnętrzna średnica końcówki pipety wynosi ~2 μm przed polerowaniem ogniowym i jest zmniejszona do ~0,5 μm po właściwym polerowaniu.
    UWAGA: Zaleca się używanie tylko świeżo wyjętych pipetek wykonanych w dniu nagrania. Zapobiega to gromadzeniu się cząsteczek kurzu na końcówce pipety.

2. Rozstawianie platformy

  1. Montaż komory nagrań
    1. Użyj komory perfuzyjnej o niskiej objętości, diamentowej, o przepływie laminarnym i stosunkowo szybkim przepływie roztworu (Rysunek 4). Podłącz komorę przez kolektor z systemem perfuzyjnym zasilanym grawitacją (Rysunek 5).
    2. Aby perfuzować roztwór przez komorę rejestrującą, złóż prosty, samodzielnie wytwarzany system perfuzji zasilany grawitacją z politetrafluoroetylenowym rozmaitością, który łączy komorę perfuzyjną z ośmioma oddzielnymi liniami perfuzyjnymi.
      UWAGA: Rurka nie powinna wypłukiwać plastyfikatorów do roztworów, ponieważ takie substancje mogą znacząco wpływać na normalne funkcjonowanie plemników60 i zmieniać aktywność kanałów jonowych 61,62. Zaleca się rurkę o małej średnicy z politetrafluoretylenu jako główną rurkę perfuzyjną.
    3. Ponieważ rurki z politetrafluoroetylenu są dość sztywne, należy zamontować elastyczne połączenia z rurką krzemową o wysokiej czystości na rurce poliuretanowej. Dodatkowo używaj strzykawek (np. strzykawek Luer Lock), które nie zawierają smaru, ponieważ oleje mineralne lub inne dodatki smarujące mogą zakłócać rejestrowanie kanałów jonowych (rysunek 5).
  2. Montaż mostu agarowego
    1. Aby uniknąć zmian potencjału złącza cieczy podczas rejestracji, utrzymuj stabilność otoczenia wokół elektrody referencyjnej za pomocą mostka agarowego (rysunek 4).
    2. Aby zrobić most agarowy, zrób szklaną kapilarę w kształcie litery L, wyginając ją pod małym ogniem palnika Bunsena i pozwalając ostygnąć.
    3. Zrób roztwór o stężeniu 1% agarozy w 1 M KCl i podgrzej go w mikrofalówce, aż agaroza się stopi i roztwór stanie się przezroczysty. Ostrożnie napełnij szklaną kapilarę w kształcie litery L powyższym roztworem, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej. Mosty agarowe można przechowywać w 1 M KCl przez ~2 miesiące w temperaturze +4 °C.
    4. Aby użyć mostka agarowego, napełnij elektrodę referencyjną granulatu Ag/AgCl 1 M KCl i ostrożnie włóż mostek agarowy, aby zapobiec wypychaniu zesztywniałej agarozy z kapilary szklanej.
    5. Następnie włóż złoty pin (2 mm) przewodu głowicy wzmacniacza do otworu elektrody referencyjnej o średnicy 2 mm (złoto) i włóż koniec mostka agaru w kształcie litery L do komory perfuzyjnej, jak pokazano na Rysunku 4.
  3. Rozwiązania i przepisy
    UWAGA: Wszystkie odczynniki i chemikalia muszą mieć najwyższą czystość. Wszystkie przygotowane roztwory są filtrowane przez sterylny filtr PES o pojemności 0,22 μm i przechowywane w temperaturze 4 °C przez maksymalnie jeden miesiąc. Należy zauważyć, że dokładna regulacja osmolarności jest warunkiem koniecznym skutecznego patch clampingu.
    1. Przygotuj roztwór ludzkiego płynu rurkowego (HTF) zgodnie z Tabelą 1. Zreguluj pH do 7,4 z NaOH. Osmolariczność powinna wynosić 280 ± 5 mOsm, mierzona za pomocą osmometru ciśnienia pary.
    2. Przygotuj roztwór "kąpielowy" lub "pozakomórkowy" o wysokiej zasolonej zasoleniu (HS), zgodnie z Tabelą 2. Zreguluj pH do 7,4 z NaOH. Osmolaria powinna wynosić 320 ± 5 mOsm.
    3. Przygotuj roztwór "kąpielowy" lub "pozakomórkowy" roztwór metansulfonianu cezu, jak opisano w Tabeli 3. Ustawiam pH do 7,4 z CsOH i osmolariczność do 320 ± 5 mOsm.
    4. Aby przygotować intrakomórkowy roztwór pipety z cezu metanesulfonianu (CsMeSO3), postępuj według Tabeli 4 i dostosuj pH do 7,4 za pomocą CsOH. Osmolariczność powinna być o 10 mOsm wyższa niż w roztworze HS.

3. Izolacja i oczyszczanie plemników ssaków

UWAGA: Uśpienie myszy C57BL/6 w wieku 3-6 miesięcy poprzez wdychanie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Po zwichnięciu szyjki natychmiast wykonaj pobieranie tkanek (cauda lub corpus gididymis) od myszy.

  1. Izolacja nasienników myszy w najądrzu
    UWAGA: Uśpienie myszy C57BL/6 w wieku 3-6 miesięcy poprzez wdychanie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Po zwichnięciu szyjki natychmiast wykonaj pobieranie tkanek (cauda lub corpus gididymis) od myszy.
    1. Otworzyć dolną część brzucha myszy nożyczkami i usunąć oba najądrza.
    2. Umieść je w misce do hodowli komórek o średnicy 35 mm wypełnionej roztworem HS (roztworem wysokosolnym, patrz Tabela 2). Upewnij się, że aliquot roztworu HS jest wstępnie podgrzany do temperatury pokojowej przed kontaktem z plemnikami.
    3. Przełóż najjedrza do nowej misy hodowli komórkowej zawierającej roztwór HS i dokładnie usuń cały pozostały tłuszcz.
    4. Należy podzielić najądrza na caput, corpus i cauda za pomocą ostrza skalpela #15 (Rysunek 6).
    5. Przenieś ciało (lub ogon, jeśli to konieczne) każdego najądrza do nowej misy hodowli komórkowej zawierającej roztwór HS. Wykonaj wiele nacięć w odizolowanej części najądrza za pomocą ostrza skalpela #11.
    6. Przenieś części najądrza z wieloma nacięciami do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL zawierającej roztwór HS o pojemności 1,5 mL.
    7. Krótko wstrząśnij plemnikami z najądrza do roztworu za pomocą bardzo drobnych kleszczy Dumont typu 5a. Usuń najądrze i pozostawij tubkę w temperaturze pokojowej na 10 minut.
    8. Poczekaj, aż ciało stałe (nieplemniki) osadnie się na dno rurki, a następnie przenieś supernatant do kolejnej mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
    9. Przechowuj mieszankę plemników w temperaturze pokojowej z dostępem do powietrza przez maksymalnie 2 godziny, podczas których można przeprowadzić eksperymenty. Izolowane plemniki tracą swoją wydajność 3 godziny po izolacji.
  2. Pojemność nasienników myszy
    UWAGA: Wszystkie plemniki najądrza nadają się do patch-clamp, ale tylko plemniki z najądrza ogonowego są wystarczająco dojrzałe, by stać się zdolne do zapłodnienia. Ponieważ plemniki ogonowe mogą ulec pojemności, należy prowadzić eksperymenty, zwłaszcza kapacitację plemników, z wykorzystaniem komórek ogonowych plemników.
    1. Wykonaj pobieranie plemników na plemnikach ogonowych lub wytryskowych (patrz kroki 3.1.1-4).
    2. Weźmy caudae isolated opisane w kroku 3.1.4. oraz zastosować wiele nacięć, jak opisano w kroku 3.1.5. Przenieś kaudae do naczynia do hodowli komórek o średnicy 10 mm z 2 mL roztworu pojemnościowego.
    3. Najpierw inkubuj tkankę ogonową w tym roztworze pojemnościowym przez 10 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2, następnie odrzuć tkankę i inkubuj uwolnione plemniki przez kolejne 50-80 minut.
      UWAGA: Pojemność in vitro nasienników ogonowych myszy osiąga się poprzez inkubację 60-90 minut. Komórki plemniki z kapsułką są wizualnie identyfikowane na podstawie nadmiernego asymetrycznego zginania wici, zwanego hiperaktywacją. Ten typ ruchliwości pozwala plemnikom pływać w sposób nieliniowy.
  3. Zbieranie i oczyszczanie ludzkiego plemnika
    UWAGA: W tym przypadku pobrano świeże próbki nasienia od łącznie 21 zdrowych ochotników w wieku 21-38 lat oraz plemników oczyszczonych techniką pływania w temperaturze pokojowej, jak szczegółowo opisano w48,63. Krótko mówiąc, procedura wygląda następująco:
    1. Pozostawić próbki ejakulatu człowieka w temperaturze pokojowej na 60 minut, aby umożliwić upłynnienie przed oczyszczeniem (dłuższe czasy mogą negatywnie wpływać na jakość plemników).
    2. Podgrzej około 7 mL roztworu HTF do 37 °C w rurce wirówki o pojemności 50 mL. Oceń wizualnie objętość ejakulatu – jeśli objętość przekracza 1 mL, przygotuj kilka probówek z roztworem HTF.
    3. Ostrożnie nałóż 1 ml skroplonego ejakulatu na dno każdej rurki, nie unosząc nici nasienia na powierzchnię bufora. Interfejs nasienia do HTF powinien być jak najbardziej wyraźny. Unikaj pęcherzyków powietrza.
    4. Umieść rurki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 1 godzinę w stojące, który utrzymuje je pod kątem 45° dla maksymalnej powierzchni. Jeśli inkubator jest inkubatoremCO2 , należy szczelnie zamknąć pokrywkę, aby zapobiec zakwaszeniu buforu (CO2 nie jest wymagane do tego zabiegu). Podczas inkubacji ruchliwe plemniki stopniowo zbliżają się do powierzchni bufora HTF.
    5. Po 1 godzinie pobierz najwyższą frakcję 1 mL ze wszystkich próbek w probówce wirówki o pojemności 15 mL, łącząc najwyższej jakości, wysoce ruchome plemniki do patch clampingu. Nie próbuj usuwać całego nadnadanka – pozostaw kilka ml HTF nad osiem nasiennym, aby uniknąć skażenia. Oczyszczoną zawiesinę komórkową można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
      UWAGA: Normalny wytrysk powinien zawierać co najmniej 15 x 10 6plemników namL 64, jednak liczba plemników znacznie różni się między próbkami. Przeszkodę w postaci niskiej liczby komórek można pokonać, pozwalając oczyszczonej zawiesinie plemnika stać na 30-60 minut w temperaturze pokojowej przed zaklejeniem patch clamp. W takich warunkach komórki stopniowo gromadzą się na dnie rurki wirówki i tworzą widoczną chmurę komórek, z której można pipetować komórki do komory rejestrującej (patrz niżej).
  4. Pojemność ludzkich plemników
    UWAGA: Pojemność in vitro ludzkich plemników można osiągnąć poprzez 4-godzinną inkubację w roztworze kapacitacyjnym: 20% surowicy płodowej bydła, 25 mM NaHCO3 w buforach HTF lub HS48,51. Komórki plemniki z kapsułką można wizualnie rozpoznać na podstawie ich silnej ruchliwości i nadmiernego asymetrycznego zgięcia wici, co pozwala plemnikom pływać w sposób nieliniowy.
    1. Przygotuj 2x roztwór pojemnościowy i wymieszaj 1:1 z zawiesiną plemników.
    2. Inkubacja należy przeprowadzić w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 4 godziny. Aby zapewnić wysoki odsetek komórek z pojemnością, czas inkubacji nie powinien być krótszy niż 4 godziny.

4. Przygotowanie roztworu powłokowego (potrzebnego tylko do plastycznego zacisku na nasienie u ludzi)

UWAGA: Kluczowym krokiem jest podniesienie przymocowanego plemnika z pokrywy przed wchodzeniem do pracy. Ten krok jest potrzebny tylko dla ludzkich plemników i wymaga pokrycia szkła pokrywowego, aby uzyskać mniej lepką powierzchnię szklaną. Powłoka pokrywkowa zmniejsza prawdopodobieństwo przyklejania się plemników do pokrywy i pozwala na podnoszenie ludzkich plemników z szklanej pokrywy po pomyślnym utworzeniu Gigaseal.

  1. Rozcieńcz 200 μL ejakulatu w 5 mL roztworu HS w rurce wirówki o pojemności 15 mL.
  2. Skręcaj na 300 x g przez 5 minut i usuń supernatant.
  3. Ponownie zawiesić pellet w 1 mL roztworu HS i przenieść go do rurki mikrowirówki.
  4. Sonikować przez 10 minut w temperaturze 25 °C, używając kąpieli sonikacyjnej wypełnionej wodą.
  5. Skręcaj na 10 000 x g przez 5 minut.
  6. Przelej supernatant do nowej rurki mikrowirówki i użyj jej do powlekania (instrukcje poniżej).

5. Rejestracja przewodności jonów z całej błony plazmatycznej plemnika.

  1. Przyczepianie plemników do pokrywki.
    UWAGA: Przed nagraniem patch-clamp plemniki są nakładane na okrągłe pokrywy o grubości 5 mm.
    1. Jeśli pracujesz z ludzkimi komórkami, krótko zanurz pokrywki w przygotowanym roztworze powłokowym za pomocą ostrych kleszczy.
    2. Umieść cztery pokrywy w pojedynczej wgłębieniu płyty czterodołowej i przykryj 300 μL roztworu HS. Zapobiegaj przesuwaniu się pokrywy, przyklejając je do dna płytki z 4 dołkami i popychając plastikową końcówką pipety.
    3. Delikatnie ponownie zawiesić skoncentrowane zawiesiny plemników ludzkich (krok 3.3.5) lub myszy (krok 3.1.9) z rurki magazynowej (20-50 μL skoncentrowanego plemnika) w 300 μL roztworu HS powyżej pokrywy.
    4. Upewnij się, że plemniki gromadzą się na dnie studni, gdzie ich głowy przyczepią się do pokrywy, a ich wicie energicznie uderzają w roztworze tuż nad pokrywą. Ważne jest, aby plemniki osadzały się na pokrywie przez około 10 minut w temperaturze pokojowej przed rejestracją.
      UWAGA: Jeśli ludzkie plemniki słabo się przyczepią, wróć do kroku 5.1.1 i rozcieńcz przygotowany roztwór powłokowy roztworem HS (1:20 do 1:2). Ten krok musi być dostosowany do próbek nasienia od różnych dawców ludzkich, w zależności od zmiennej ruchliwości plemników, która jest powszechna w przygotowaniach nasienia ludzkich.
  2. Zakładanie okładki
    1. Weź jedną pokrywkę z lekko przyklejonymi komórkami z dołka i umieść ją w rombowatej studni komory zapisującej roztwór HS (rysunek 4).
    2. Włącz system perfuzji (Rysunek 5) wypełniony roztworem HS, aby opłukać komorę i usunąć z niej zanieczyszczenia oraz nadmiar odłączonych plemników. Zwiększa to prawdopodobieństwo, że pipeta rejestrująca pozostanie czysta po dotarciu do komórek. Ten krok jest pomocny przy pracy z komórkami nieobjętymi ochroną, które mają tendencję do silniejszego przyklejania się do pokrywy.
      UWAGA: Jeśli nagrywa się z nasienia pojemnościowego, należy unikać włączania perfuzji natychmiast po włożeniu nowej pokrywy do komory. Nasienie z kapsułką mają silną ruchliwość i tylko luźno przyczepiają się do pokrywy. Dlatego, aby zapewnić jak największą liczbę nasień z kapacitą, ważne jest, aby odczekać ~ 10 minut i pozwolić plemnikom przyklejonym do pokrywy przed włączeniem perfuzji. Po wybraniu odpowiedniej komórki kondensencyjnej i utworzeniu gigaseal, perfuzję można ponownie włączyć.
  3. Wybór plemnika do rejestracji za pomocą patch-clamp.
    1. Znajdź odpowiednią komórkę plemnika z kroplą cytoplazmatyczną, używając powiększenia 600x (patrz niżej). Robi się to za pomocą soczewki z zanurzaniem w wodzie 60x, jak opisano w metodach z okularem z powiększeniem 10x. W plemnikach wyizolowanych z ciała najądrza CD zwykle znajduje się blisko środka śródoka. W komórkach ogonowych CD zwykle znajduje się blisko pierścienia (Rysunek 2C). W przypadku ludzkich plemników CD znajduje się w okolicy szyi (Rysunek 2A,B).
      UWAGA: Dodatkowo, wysuwana opcja powiększenia 1,6x mikroskopu może być użyta do dokładnego badania morfologii plemników (powiększenie 960x).
    2. Upewnij się, że kropla cytoplazmatyczna jest owalna i ma lekko wydłużony (rysunek 2G), kształt przypominający wrzeciono. Płyty CD, które wyglądają na bardzo okrągłe i powiększone, są często delikatne i nieodpowiednie do łatania (Rysunek 2D, F).
    3. Wybierz plemnika ruchomego z głową przymocowaną do pokrywy, tak aby plemnik był częściowo unieruchomiony, ale komórka wiczowa i reszta wici nadal poruszały się przy uderzeniach wici. Upewnij się, że główka plemnika jest luźno przymocowana do pokrywy, tak aby się nieco obracała, gdy wici przesuwają się z boku na bok.
      UWAGA: Luźne przyłączenie jest ważne, ponieważ po utworzeniu uszczelki gigaomowej i przed przejściem do trybu całej komórki, plemniki muszą zostać podniesione z pokrywy do roztworu.
  4. Tworzenie gigasealu
    UWAGA: Aby rejestrować monowalentne prądy CatSper w trybie całego ogniwa, pipety są wypełniane roztworem Cs-metanonianu (nazywanym także pipetą lub wewnątrzkomórkową) (Tabela 4) – daje to rezystancję pipety 11-17 MΩ (Rysunek 7A), automatycznie obliczaną przez wzmacniacz po przyłożeniu kroku napięciowego od 0 mV do 10 mV. Pipety można również wypełniać innymi roztworami w zależności od zastosowania. Zaleca się przygotowywanie roztworów z ruchomymi anionami, takimi jak metanoniarkan, Cl- , asparagian lub podobne jony, aby zmniejszyć opór pipet. Osmolariczność roztworu pipety powinna być o 10 mOsm wyższa niż w kąpieli. Nieco wyższa tonistyczność roztworu pipety pomaga utrzymać opór dostępu do plemników jak najniższy podczas nagrywania za pomocą patch-clamp.
    1. Po wizualnym wyborze plemnika o odpowiedniej morfologii (Rysunek 2G), napełnij mikropipetę roztworem pipety (Tabela 4) i zamocuj ją w uchwytie pipety.
    2. Aby utrzymać końcówkę pipety czystą od zanieczyszczeń, należy wywierać dodatnie ciśnienie na pipecie za pomocą zespołu w kształcie rurki U, aby zapewnić, że roztwór pipety wypłynie z końcówki po zanurzeniu w roztworze zewnątrzkomórkowym, określanym poniżej także roztworem "kąpielowym" (patrz Tabela 2).
      UWAGA: Jeśli warunki na to pozwalają, zdecydowanie zaleca się powstawanie uszczelnienia przy stałej perfuzji, ponieważ ten stan zapewnia najczystszą końcówkę pipety.
    3. Opuść pipetę i zanurz jej końcówkę w roztworze kąpielowym (Tabela 2). W tym momencie można zmierzyć rezystancję pipety (rysunek 7A).
    4. Aby wyraźnie zobrazować komórkę, ustaw końcówkę pipety nad płytą CD, a otwór końcówki jest ustawiony po przekątnej (około 45°) w kierunku płyty.
    5. Szybko opuść końcówkę pipety w kierunku płyty CD, aby znalazła się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, w odległości kilku μm od płyty CD.
    6. Gdy tylko końcówka pipety dotknie płyty CD, należy wystosować ujemne ciśnienie na pipetę za pomocą "ustnika", aby przenieść część kropli do końcówki i utworzyć uszczelnienie gigaohma – znane w elektrofizjologii jako "zdarzenie ssania". Zazwyczaj po pierwszym kontakcie z końcówką pipety ujemne ciśnienie w pipetie można utrzymać do minuty, aby stopniowo uzyskać uszczelnienie gigaomowe.
    7. Po pomyślnym utworzeniu uszczelki gigaomowej (> 4-20 GΩ) unieś plemniki z pokrywy (rysunek 7B).
      UWAGA: Ten krok nie jest wymagany dla plemników gryzoni ze względu na ich długość; Jednak częściowe odwarstwienie wici plemnika jest korzystne, aby złagodzić potencjalny dryf pipety. Odłączenie plemników u ludzi jest niezbędnym krokiem, ponieważ CD jest niewielkie (1~3 μm); jeśli komórka pozostaje przymocowana do pokrywki, nawet niewielkie przesunięcie pipety podczas eksperymentu może zakłócić płytę CD. Po uniesieniu plemnika jego wiciec zwykle bije dalej, podczas gdy komórka jest przymocowana tylko do mikropipety.
  5. Włamanie i przejście do trybu pełnej komórki.
    1. Kompensuj przejściowe pojemności za pomocą trybu kompensacyjnego wzmacniacza przed przejściem do trybu całego ogniwa (rysunek 7B). Aby początkowo obserwować przejściowe zjawiska pojemnościowe, utrzymuj potencjał membrany na poziomie 0 mV i stosuje impulsy 10 mV za pomocą narzędzia "Membrane Test" (rysunek 7B).
    2. Wykonaj przejście i przejście do trybu całego ogniwa poprzez zastosowanie krótkich (1 ms) stopniowo rosnących (430-650 mV, ~50 mV) impulsów napięciowych połączonych z bardzo lekkim ssaniem (rysunek 7C).
      UWAGA: Aby zastosować impulsy rozchodzenia , użyj wcześniej zaprogramowanego protokołu wchodzenia w oprogramowaniu patch clamp. Impulsy napięcia wchodzenia są przystosowane do plemnika za pomocą wejścia poleceń wysokiego napięcia (przełącznika tylnego) z tyłu wzmacniacza.
    3. Po zastosowaniu każdego impulsu napięcia przejściowego uruchom narzędzie Membrane Test , aby sprawdzić, czy pojawiają się przejściowe zjawiska o większej pojemności.
      UWAGA: Obecność dużych pojemności przejściowych (rysunek 7C) wskazuje, że doszło do przebicia, a mierzona jest całkowita pojemność komórki (~1 pF dla ludzkich plemników i ~2,5 pF lub więcej dla myszych plemników).
    4. Dopasuj przejściowe o dużej pojemności za pomocą narzędzia Membrane Test Tool, aby określić pojemność całej komórki oraz jej opor dostępu.
      UWAGA: Opór dostępu powinien być jak najmniejszy, aby efektywnie perfuzować wnętrze komórki plemnika roztworem mikropipety, a także zapewnić niezawodne zaciski napięciowe błony plazmatycznej plemnika. Rezystancja dostępu wynosi zwykle 25-30 MΩ oraz 50-70 MΩ dla rozwiązań opartych na Cs+ /K+ i NMDG w celularnych systemach.
    5. Po udanym włamaniu należy przystąpić do planowanych eksperymentów z patch-clampem całej komórki, takich jak stosowanie różnych roztworów kąpielowych (rysunek 8) zawierających różne związki lub pomiar aktywności kanałów za pomocą protokołów krokowych napięciowych (Rysunek 8, Rysunek 9) lub ramp napięciowych. Jeśli włamanie nie zakończyło się sukcesem, wróć do kroku 6.4.1. Wybierając świeżą mikropipetę i wybierając inną odpowiednią komórkę plemnika.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda zacisku plemnika pozwala na bezpośrednie nagrywanie kanału CatSper.
Jak wspomniano powyżej, nagrania CatSper wykonywano poprzez ustanowienie uszczelnienia o wysokiej odporności (gigaohm) między pipetą plastrową a plemnikami ssaków na jej cytoplazmatycznym krople. Po włamaniu i przejściu do trybu całej komórkiuzyskuje się pełny dostęp elektryczny do całego ciała plemnika i jego wnętrza, w tym do głowy plemnika i wici. Ten stan pozwala ostatecznie na rejestrację z dowolnego aktywnego kanału jonowego znajdującego się na błonie plazmatycznej plemnika. Roztwór kąpielowy nominalnie wolny od dwuwalentności (DVF), zawierający główny jon permeowany cezem lub sodem, jest preferowany do rejestrowania monovalentnych prądów CatSper 2,8,39,51. Podczas gdy kanał CatSper przewodzi jony dwuwalentowe, takie jak Ca2+ i Ba2+, poruszają się one przez por CatSper znacznie wolniej, co skutkuje ledwo wykrywalnymi przewodnictwami kilku pikoamperów (~10-20 pA)2,8,39,51. Dlatego pomiar monowalentnych, a więc większych prądów, przez kanał CatSper, jest wygodniejszym sposobem oceny prądu (rysunek 8). Ważne jest, aby zauważyć, że CatSper jest również przepuszczalny dla potasu; dlatego kanał CatSper musi być zablokowany lub należy stosować plemniki niedoborowe CatSper w sytuacjach, gdy chcemy badać tylko kanały potasowe plemników 2,3,8,28,65. Poprzez zmianę składu jonów pipety i roztworu kąpielowego można selektywnie wykluczyć niektóre kanały jonowe, jednocześnie tworząc warunki do selektywnego rejestrowania tylko na podstawie określonych typów kanałów jonowych. Na przykład dodanie Cs+ do roztworu pipety powoduje zablokowanie przepuszczalności jonów przez kanały potasowe plemników.

Kanał CatSper jest regulowany inaczej u gatunków ssaków.
Plemniki różnych gatunków są zróżnicowane pod względem morfologii i wewnętrznych szlaków regulacyjnych66. Nic dziwnego, że ich kanały jonowe są również regulowane w unikalny sposób odzwierciedlający specjalistyczne mikrośrodowiska męskiego i żeńskiego układu rozrodczego. Metoda patch-clamp plemników została z powodzeniem zastosowana u sześciu gatunków ssaków: myszy2, szczura56, człowieka39,51, bydła, dzika i makaków41, jak pokazano na Rysunku 9. Do tych eksperymentów pobrano plemniki dorosłych samców makaków rezus [Macaca mulatta] z Kalifornijskiego Narodowego Centrum Badań nad Naczelnymi zgodnie ze standardami Stowarzyszenia ds. Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC) zgodnie z zatwierdzonymi protokołami dla zwierząt Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis, jak opisano wartykule 41; wszystkie badania prowadzono zgodnie z Przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia USA dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Nasienie byków i dzików zostało pozyskane jako produkty uboczne zwolnione ze specjalnej zgody IACUC z placówek Departamentu Nauk o Zwierzętach UCD, a wszystkie zwierzęta były przechowywane w zakładach zatwierdzonych przez AAALAC. Nasienie byków i dzików można również pozyskać ze źródeł komercyjnych.

Naczelne (Rhesus macaque) i ludzkie plemniki wykazywały podobne właściwości i regulacje kanałów CatSper. Co ciekawe, aktywacja progesteronu CatSper wydaje się być unikalna dla plemników naczelnych (Rysunek 9 i 41), ponieważ plemniki dzików, byków i gryzoni nie wykazywały żadnej zmiany prądów CatSper wywołanej progesteronem. U nasienników byków i dzików nawet bazalna aktywność kanałów CatSper była poniżej wykrywalnych granic (rysunek 9), co sugeruje, że u tych gatunków napływ wapnia i wynikająca z tego hiperaktywacja jest napędzana przez inne kanały/transportery lub że do aktywacji kanałów CatSper potrzebny jest inny naturalny stymulator. We wszystkich wymienionych tu gatunkach plemników, w tym plemnikach byków i dzików, uzyskano pełny dostęp elektryczny do wnętrza plemników, a komórki zarejestrowano w trybie całościowym, co widać po pojawieniu się dużych artefaktów pojemności podczas włamania (Rysunek 7). Ten stan umożliwia łatwe rejestrowanie funkcjonalnego kanału CatSper, a jego brak u nasienników dzików i bydła wskazuje, że kanał ten jest albo zablokowany przez jeszcze nieznany endogenny inhibitor obecny w komórkach plemników tych gatunków, albo wymaga aktywacji specjalnego modulatora. Są to jednak wstępne eksperymenty i konieczne będą dodatkowe eksperymenty dotyczące plemników dzików i byków, aby zapewnić funkcjonalne znaczenie kanału CatSper u tych gatunków. To szerokie spektrum różnorodności kanałów jonowych plemników między gatunkami może być powiązane z stosunkiem wielkości plemników do komórek jajowych, relacją między wielkością plemników a ochronnymi szatami jajowymi lub stanowić barierę dla zapłodnienia przez innegatunki 66.

figure-results-1
Rysunek 1: Morfologiczna różnorodność plemników ssaków. (A) Dolny panel: schematyczne przedstawienie plemnika; Przedziały komórkowe są oznaczone. Górne panele: Obrazy DIC plemników różnych gatunków zgodnie z ruchem wskazówek zegara: szczur (Rn; Rattus norvegicus); mysz (Mm; Mus musculus); byk (Bt; Bos taurus); Dzik (Sd; sus scrofa domesticus); człowiek (Hs; Homo sapiens), oraz makaka rezusa (Mmu; Macaca mulatta). Pasek skali dotyczy wszystkich obrazów DIC. Wkładki wskazują na krople cytoplazmatyczne. (B) Łatanie plemników ssaków. Aby zapewnić skuteczne uszczelnie między końcówką pipety a błoną plazmatyczną, część błony plazmatycznej jest delikatnie zasysana do końcówki pipety. Przeniesienie do trybu całej komórki odbywa się poprzez przerwanie błony plazmatycznej między czubkiem a komórką (ten wykres został odtworzony z8). Prawy panel: ludzkie plemniki przymocowane do mikropipety rejestrującej. (C) Schematyczne przedstawienie ludzkich plemników i niektórych kanałów jonowych wiciowych badanych w ludzkich komórkach plemników metodą patch clamp, a także jonów, które przewodzą. CatSper – kanał jonowy wapnia39,51; Hv1 – kanał protonów51, 56, 67; Slo3/Slo1 – kanałypotasowe 50,53,65,68; TRPV4 – przejściowy kanał kationowy potencjału receptora wanilloid typ 448. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Wielkość plemników i zmienna morfologia kropelek cytoplazmatycznych. Zdjęcia DIC nienaruszonych żywych plemników. (A) Porównanie rozmiaru ludzkiej komórki plemnika (na dole) i dwóch komórek CHO (górnej). (B) Nienaruszone plemniki ludzkie (Homo sapiens) (na dole) oraz bezgłowa plemnik (wici, górna). Krople cytoplazmatyczne są oznaczone żółtymi grotami strzał; ta figura została odtworzona od8. (C) Nienaruszone nasienie mysie (Mus musculus) z normalnie ukształtowanymi kroplami cytoplazmatycznymi (CD) oznaczonymi żółtą strzałką. (D-G) Plemniki myszy w najądrzu mają cytoplazmatyczne krople o różnych rozmiarach i kształtach; tylko (C) i (G) nadają się do patch-clampu. (D) CD jest mikroskopijna i jednostronna; (E) CD zaginęło; (F) CD zawiera cząstki wewnątrz, które mogą zatkać pipetę rejestrującą; (G) CD jest gładka, jednolita i nie jest spuchnięta. Utworzenie gigaseal z tego typu płyty CD prawdopodobnie zakończy się udanym nagraniem. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Elementy zestawu zacisków plemników. (A) Typowy zestaw elektrofizjologii plemników z kluczowymi elementami: (1) odwrócony mikroskop; (2) cyfrowy system o niskim poziomie szumów; (3) wzmacniacz; (4) mikromanipulator o niskim dryfie, sprzężony z mikroskopem odwróconym z platformą mikromanipulatora; (5) komputer PC; (6) stół powietrza tłumiący drgania; (7) Klatka Faradaya, aby osłonić układ przed zakłóceniami elektrycznymi w otoczeniu. Niezbędne jest, aby wszystkie elektryczne elementy zestawu, w tym klawiatura komputerowa i mysz, generowały niski lub żaden dźwięk elektryczny (50Hz lub 60Hz) oraz aby wszystkie elementy były prawidłowo uziemione. (B) Mikropipeta wyciągająca używana do rejestrowania produkcji pipet. (C) (1) mikrokuźnia używana do polerowania pipet ogniem; (2) Naczynia włosowate szkła borokrzemowego o średnicy zewnętrznej 1,5 mm, średnicy wewnętrznej 0,86 mm i wewnętrznym włóknie; (3) pudełko na zbieranie pipet. (D) Etapy udanego polerowania pipety ogniowo: (a) Niepolerowana pipeta o średnicy wewnętrznej 2 mm; (b) pipeta polerowana ogniem o średnicy wewnętrznej 0,5 mm; (c) Zbyt polerowana uszczelniona pipeta nieodpowiednia do nagrywania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Elementy systemu komory nagrywającej i jego montaż. (A) Podstawowe elementy systemu komory rejestracyjnej: (1) adapter do mikroskopu do platform serii 20 z (2) dwoma zaciskami do trzymania stopnia; (3-4) Magnetyczna platforma podgrzewana serii PM z (3) magnetycznymi zaciskami do przechowywania komory perfuzyjnej; (5) komora perfuzyjne; (6) most agar; (7) zacisk magnetyczny, elektroda odniesienia z gniazdem 2 mm do pelletu Ag/AgCl; (8) magnetyczny uchwyt (MAG-1) dla przewodu ssącego; (9) rurka ssąca; (10) O-uchwyt rurki ssącej. (B) Złożony system komory nagrywającej z podłączonymi elementami z (A). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-5
Rysunek 5: Elementy systemu perfuzyjnego. (A) Złożony linie perfuzyjne oraz (B) jej niezbędne komponenty: (1) strzykawki o pojemności 20 mL i 3 mL; (2) zaworek z połączeniami Luer; 4-kierunkowy; zamek męski; (3) żeński adapter do węża luer, 1/16"; (4) rurka perfuzyjna z politetrafluoroetylenu (PTFE) (rurka mikrobore PTFE, średnica 0,022" × 0,042" średnica); (5) Politetrafluoroetylenu o 8-pozycyjnej perfuzji rozmaitości; (6) rurki złączowe silikonowe (rury silikonowe utwardzone platyną, średnica 1/32" × średnica 3/32"); (7) Rurka złącza kolektora (rurka PTFE, średnica 1/32" × średnica 1/16"). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-6
Rysunek 6: Sekcja myszy samca. (A) Męskie narządy rozrodcze myszy; Pokazane są zarówno jądra, jak i najeądrza. (B) Najądrza są przenoszone do 35 mm naczynia do hodowli komórek zawierającej roztwór HS, a pozostałości tłuszczu i nasiewodowodow są usuwane. (C) Każde najądrze dzieli się następnie na caput, corpus i cauda za pomocą ostrza skalpela #15. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-7
Rysunek 7: Powstawanie gigaseal i przełamanie się do mysiej plemnik. Interfejs narzędzia "Membrane Test" komercyjnego oprogramowania patch clamp. Trzy etapy zaciskania plemników: (A) zarejestrowana pipeta jest zanurzona w roztworze HS w kąpieli, co daje rezystancję pipety 14,8 MΩ; (B) powstaje gigaseal (rezystancja wynosi 4,7 GΩ), przejściowe zjawiska pojemności są kompensowane, a plemnik jest usuwany z pokrywy; (C) Przejście w tryb całkowitej komórki. Przejście do trybu całego ogniwa i przejście do trybu całego ogniwa odbywa się poprzez zastosowanie krótkich (1 ms) stopniowo rosnących (430-650 mV, ~50 mV) impulsów napięciowych połączonych z lekkim ssaniem, jak pokazano po lewej. Przebicie nastąpiło po widoczności dużych pojemności przejściowych, które odzwierciedlają całą pojemność komórki (~2,93 pF dla tej plemniku). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-8
Rysunek 8: Zapis CatSper u myszy z dzikiego typu (WT) cauda cauda w najądrzu najądrza, nasienie z wyłączeniem i knockout CatSper. Aby rejestrować monowalentną aktywność CatSper, co 5 s stosuje się protokół ramp oraz prądy CatSper generowane przez rampy napięciowe z potencjału utrzymania 0 mV39,51. Rampy napięciowe (-80 mV do 80 mV; 850 ms) są stosowane w HS i nominalnie bezwartościowym roztworze (DVF). Dane były próbkowane z częstotliwością 2-5 kHz i filtrowane przy 1 kHz. Prądy bazowe są rejestrowane w roztworze HS, który nie generuje prądu CatSper z powodu hamowania przez wysoki poziom magnezu zewnątrzkomórkowego39,51. Prądy bazowe są przydatne do oszacowania przewodności nieszczelności (szlaków kanału niejonowego). Reprezentatywne, pełnokomórkowe gęstości prądu CatSper (pA/pF; niebieski) zarejestrowane w ogonowych myszych plemnikach WT (niezdolnych; lewych i zdolnych; środkowych) oraz niedoborowych CatSper w tkankach myszy (po prawej). Prądy były generowane przez rampy napięciowe z potencjału utrzymania 0 mV, a rampy od -80 mV do 80 mV w HS i nominalnie bezwartościowym rozwiązaniu. Prądy bazowe (czarne) rejestrowane w roztworze HS. Aby uzyskać gęstości prądu, amplitudy prądu CatSper zostały znormalizowane do pojemności komórki (pA/pF). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-9
Rysunek 9: Regulacja progesteronu CatSper u różnych gatunków ssaków. (A) Reprezentatywny prąd CatSper wywołany z plemników różnych gatunków poprzez protokół napięciowy ramp, zgodnie z wskazaniami. Gatunek: człowiek (Hs; H. sapiens); Makak rezus (Mmu; M. mulatta), mysz (Mm; M. musculus), byka (Bt; B. taurus); szczur (Rn; R. norvegicus); Dzik (Sd; S. scrofa domesticus). Zarejestrowano prądy CatSper w przypadku braku (niebieskiego) i obecności (czerwony) 1 mM progesteronu, a także prądy bazalne w roztworze HS (). (B) amplitudy prądu CatSper (ICatSper, pA) oraz (C) Średnie gęstości prądu (pA/pF) zapisy komórek plemników różnych gatunków, jak wskazano; n oznacza liczbę użytych pojedynczych plemników. Dane są Mean +/- S.E.M. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej liczby.

figure-results-10
Rysunek 10: Różnica w ruchliwości wici. Dwa reprezentatywne przykłady kropli cytoplazmatycznych i ruchliwości wici. Nakładające się obrazy tych samych plemników szczura (Rn) i człowieka (Hs) zostały wykonane w dwóch różnych momentach, gdy wykazują najbardziej odległe odchylenie wici. Przerywane prostokąty wskazują obszar z cytoplazmatycznymi kroplami oraz odpowiadającą im ruchomością przestrzenną. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-11
Rysunek 11: Zespół rurki U i jej podstawowe elementy. (A) Elementy rurki U: (1) 10 mL pipeta serologiczna; (2) rurki silikonowe; (3) rurki złączowe silikonowe; (4) 1 ml strzykawki; (5) Adapter do żłobka luer; (6) męski adapter zamka Luer 1/8"; (7) zaworek z połączeniami Luer; 4-kierunkowy; zamek męski; (8) męski adapter do kolców serii Luer, 1/16". (B) W pełni zmontowaną rurkę U-tubę oraz (C) U-rurkę przymocowaną do klatki Faradaya. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-12
Rysunek 12: Schematyczne przedstawienie zespołu rurki U. Lewy panel: Dodatnie ciśnienie powietrza dostarczane jest przez usta, co powoduje różnicę w poziomie cieczy w rurce U. Poziom cieczy w prawym rogu wzrasta o 2 cm. Po uzyskaniu tej różnicy poziomów zaworek jest obracany, aby połączyć rurkę U z przewodem prowadzącym do pipety zapisującej. Prawy panel: wyższy poziom cieczy w prawym rogu tworzy dodatnie ciśnienie, które nieustannie wypycha roztwór pipety z końcówki i utrzymuje końcówkę czystą od zanieczyszczeń. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

ChemikaliaWaga trzonowca (g/mol)mMg jak 1L
NaCl58.4497.85,72 g
KCl74.5550,373 g
KH2PO4136.090.3750,4 mg
MgSO4 x 7.H2O246.480.249,3 mg
CaCl2 x 2.H2O147.0220,294 g
HEPES238.3204,766 g
Glukoza180.230,540 g
Mleczan sodu (60% w/w)112.06203 ml
Pirorotroczan sodu1100.444 mg

Tabela 1: Roztwór ludzkiego płynu rurkowego (HTF)

ChemikaliaWaga trzonowca (g/mol)mMg jak 1L
NaCl58.441357,889 g
KCl74.5550,373 g
CaCl2 x 2. H2O147.0220,294 g
MgSO4 x 7. H2O246.4810,247 g
HEPES238.3204,766 g
Glukoza180.250,901 g
Mleczan sodu (60% w/w)112.06101,5 ml
Pirorotroczan sodu11010,110 g

Tabela 2: Roztwór wysokosoli fizjologicznej (HS)

ChemikaliaWaga trzonowca (g/mol)mMg (dla 500 ml)
CsMeSO3228.014015,960 g
HEPES238.3404,766 g
EDTA292.2410,146 g

Tabela 3: Roztwór CsMeSOw 3 kąpielach (dwuwartościowy roztwór wolnowartościowy: DVF)

ChemikaliaWaga trzonowca (g/mol)mMmg (dla 25 ml)
CsMeSO3228.0130741 mg
HEPES238.370417 mg
EDTA292.24214,6 mg
EGTA380.35328,5 mg
CSCLRozwiązanie 1 M125 μl

Tabela 4: Roztwór pipety CsMeSO3

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy szczegółowy protokół przeprowadzania rejestracji elektrofizjologicznych z komórek plemników różnych gatunków. Biorąc pod uwagę fizjologiczne znaczenie kanałów jonowych i elektrogennych transporterów dla plemników, technika ta jest potężnym narzędziem do badania fizjologii plemników oraz wad prowadzących do męskiej niepłodności. Eksperymentator może początkowo uznać wykonanie tej techniki za trudne, ale wraz z wytrwałością i wytrwałością przychodzi sukces.

Nasienie ssaków są długie (zwykle >50 μm), wąskie i bardzo ruchome. Podstawowa częstotliwość bicia (BF) plemników ssaków znacznie się różni, ze średnimi wartościami od 4 Hz (mysz 69), 7-15 Hz (dzik 70,71), 11 Hz (szczur 72), 11-20 Hz (byk 18), 24 Hz (makak rezus 23) oraz do 25 Hz (człowiek 3). Kropla cytoplazmatyczna (CD) jest wejściem do rejestracji z plemników. U plemników gryzoni płyta CD często znajduje się dystalnie, ale porusza się wzdłuż wicia (Rysunek 10), co stanowi dodatkową przeszkodę w nagrywaniu. Jednak w ludzkich komórkach plemników CD częściej znajduje się w pobliżu główki. Kluczowymi elementami skutecznego patch-clampu na plemniki są zatem doskonałe optyki umożliwiające wyraźny, ostry widok na CD oraz bardzo precyzyjny system mikromanipulacji bez dryfu czy drgań. Początkowo przewiduje się wysoki wskaźnik niepowodzenia, który jest normalny w ciągu pierwszych kilku dni od założenia plemnika. Zalecamy rutynowe ćwiczenia obejmujące wiele prób tygodniowo. Wykonywanie kilku nagrań dziennie w tygodniu ustanowi rutynę i poprawi umiejętności motoryczne.

Do niedawna identyfikacja i farmakologiczna charakterystyka kanałów jonowych plemników była utrudniona przez brak możliwości ich bezpośredniego badania. Dziedzina ta w dużej mierze opierała się na badaniach immunocytochemii, które często cierpią na niespecyficzność przeciwciał i/lub brak odpowiadających im modeli genetycznych. Do badania kanałów wapniowych szeroko stosowano klasyczną metodę obrazowania wapnia, która ma swoje zalety i ograniczenia 73,74,75,76,77. Chociaż obrazowanie wapnia jest stosunkowo prostą metodą, stosowalną w badaniach średnio- i wysokoprzepustowych 78,79,80,81 i jest mniej inwazyjna, wymaga stosunkowo nienaruszonych komórek, co stanowi przeszkodę w rozłożeniu funkcji kanałów jonowych oddzielonych od kaskad sygnalizacji wewnątrzkomórkowej lub w odróżnieniu ich od wymienników jonów wapnia. Dodatkowo trudno jest kontrolować potencjał błonowy, a tym samym trudniej jest wykluczyć wkład kanałów wapniowych zależnych od napięcia. Jedną z wielu zalet fluorometrii wapnia jest zastosowanie barwników proporcjonalnych wapnia, które pozwalają precyzyjnie mierzyć zmiany stężenia jonów wapnia. Jednocześnie należy pamiętać, że wrażliwość tych barwników może się różnić w zależności od zmian pH wewnątrzkomórkowego.

Poniżej opisujemy kluczowe kroki w protokole, w tym kroki rozwiązywania problemów metody. Niezbędne jest stosowanie wyłącznie czystych odczynników do przygotowania roztworów eksperymentalnych, ponieważ nawet niewielkie zanieczyszczenia niepożądanymi jonami (takimi jak magnez czy metale ciężkie) mogą utrudniać wykrywanie prądów jednowartościowych. Biorąc pod uwagę niewielki rozmiar plemników, można się spodziewać stosunkowo niewielkiej liczby kanałów jonowych na komórkę. W związku z tym prąd netto waha się od kilku pA do kilkuset pA. Dlatego wewnętrzny hałas elektryczny platformy musi być minimalny, aby wykryć niewielkie prądy, dlatego zaleca się stosowanie urządzeń wolnych od dryfu. Aby odróżnić konkretną przewodność od szumu elektrycznego i tła, aparat nagrywający i system uziemiający muszą być maksymalnie wykorzystane. Osiąga się to poprzez prawidłowe uziemienie urządzenia, aby uniknąć zakłóceń elektrycznych82. Zaleca się stosowanie klatki Faradaya, aby chronić przed zakłóceniami elektrycznymi wywołanymi przez różne urządzenia elektryczne, takie jak oświetlenie budynków czy instalacje elektryczne w ścianie. Niezbędne jest, aby wszystkie elektryczne elementy zestawu, w tym klawiatura komputerowa i myszka, emitowały niewiele lub wcale szumów elektrycznych (50 Hz lub 60 Hz) oraz aby wszystkie elementy były prawidłowo uziemione. Szum elektryczny w konfiguracji całej komórki, gdy wszystkie kanały jonowe są zamknięte, powinien wynosić < 0,5-1 pA.

Kolejnym ważnym punktem jest monitorowanie prawidłowej osmolarności roztworów roboczych. Skład roztworów wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych musi być precyzyjnie określony, a ich osmolaria prawidłowo zmierzona. Roztwór zewnątrzkomórkowy musi być nieco hipotoniczny w porównaniu do roztworu pipety, ponieważ prowadzi do minimalnego obrzęku komórek i zapobiega zatkaniu pipety przez błonę plemnikową. Uwaga: jeśli roztwór pipety jest zbyt hipertoniczny i różni się od roztworu kąpielowego o więcej niż 10 mOsm, dochodzi do nadmiernego obrzęku komórek i pęknięcia uszczelnienia. W rezultacie komórka będzie krucha, a gigaseal zniknie w ciągu kilku sekund po włamaniu. Z naszego doświadczenia wynika, że niedokładne przygotowanie roztworu jest jednym z najczęstszych błędów, które uniemożliwiają skuteczne patch-clampowanie.

Kolejną potencjalną przeszkodą, której należy uniknąć, są plastiki zawierające plastyczne środki/ftalan, a także strzykawki smarowane olejem mineralnym. Rurki, strzykawki i cały plastikowy sprzęt, który trafia na roztwory, a więc plemniki, nie powinny wypłukiwać plastyfikatorów ani innych toksyn środowiskowych czy olejów, ponieważ takie substancje mogą znacząco zmieniać aktywność kanałów jonowych. Stosujemy rurki teflonowe o małej średnicy jako główną linię perfuzyjną. Teflon (PTFE) ma niewiele związków wymywania się i jest dość sztywny. Elastyczne połączenia wykonane są z rur krzemowych o wysokiej czystości, które pasują na teflonowe rurki. Wszystkie strzykawki używane w systemie perfuzji nie mają żadnego smaru, ponieważ olej mineralny lub inne dodatki smarujące mogą zakłócać rejestrację kanału jonowego.

Nie można przecenić znaczenia używania odpowiedniego szkła i dobrania odpowiedniego kształtu mikropipety. Dlatego optymalna produkcja szklanych mikropipet jest warunkiem koniecznym skutecznego łatania. Używamy szklanych mikropipet wykonanych wyłącznie ze szkła borokrzemowego zawierającego włókno, co zapewnia lepsze wypełnienie roztworu. Końcówka pipetek musi być polerowana ogniowo, aby zapewnić idealne szczelne uszczelnienie. Końcówki pipety o średnicy przekraczającej 2 μm (a tym samym o oporze 10 MΩ lub mniej) zazwyczaj nie nadają się do stosowania patch-clamp plemników.

Kolejnym ważnym krokiem jest upewnienie się, że końcówka mikropipety jest czysta z wszelkich zanieczyszczeń lub pęcherzyków powietrza przed utworzeniem uszczelnienia. Jest to trudne zadanie, ponieważ mikropipeta jest załadowana do roztworu pełnego komórek ruchomych. Jednym z czynników, które pomagają uniknąć przypadkowego "zderzenia" pipety z wolno pływającymi plemnikami, jest ciągłe perfuzje do usuwania wszystkich nienaturalnych komórek. Innym narzędziem jest domowej roboty "U-tube", która pozwala przełączać się między trybem dodatnim a ujemnym ciśnieniowym, aby utrzymać czubek w czystości (Rysunek 11 i Rysunek 12).

Ponieważ plemniki znacznie różnią się kształtem i wielkością kropelek cytoplazmatycznych (CD), ważne jest, aby wybrać kroplę o odpowiedniej morfologii. Jak pokazano na rysunku 2, do patch-clampu nadają się tylko płytki (1-3 μm), gładkie, jednolite i niezbyt spuchnięte. Maleńki, jednostronny; "Spuchnięte", w pełni przezroczyste płyty CD mają słabe lub żadne uszczelnienia. Płyty CD zawierające duże cząstki rozpuszczalne mogą zatkać pipetę rejestrującą. Gdy nasienniki myszy w jądrach wchodzą do najądrza, ich krążki znajdują się w okolicy szyi, blisko głowy. Podczas przemieszczania się przez najądrze ich płyty CD przesuwają się wzdłuż środkowego elementu i ostatecznie dochodzą do połączenia między środkowym a głównym elementem (pierścieńkiem), gdy plemniki docierają do najądrza ogonia. Dlatego, jak wspomniano wyżej w plemnikach wyizolowanych z korpusu najądrza, CD zwykle znajduje się blisko środka śródka. W komórkach ogonowych CD zwykle znajduje się blisko pierścienia (Rysunek 2C). W przypadku ludzkich plemników CD znajduje się w okolicy szyi (Rysunek 2A,B).

Chociaż nie stanowi to problemu dla plemników izolowanych od zwierząt laboratoryjnych, istnieje znaczna zmienność między ludzkimi dawcami. Różnice jakości plemników u tego samego dawcy głównie wpływają na jakość błony plazmatycznej plemnika i czasami utrudniają tworzenie plomb. Zachowanie i farmakologia kanałów jonowych są mniejsze, co prawdopodobnie koreluje z indywidualną genetyką lub fizjologią. Trzeba być wytrwałym i oceniać próbki z różnych dawstw przez kilka dni, a także polegać na wielu ludzkich dawcach. Praca z materiałem ludzkim wymaga dodatkowej cierpliwości, ponieważ jakość nasienia oddanych u tego samego dawcy znacznie różni się w zależności od różnych czynników środowiskowych. Zalecamy ocenę próbek z różnych dni darowizny, aby podjąć ostateczną decyzję o statusie dawcy. Podczas gdy oczyszczone plemniki z wytryskiem są zazwyczaj odpowiednie do elektrofizjologii w ciągu kilku godzin (do 12 godzin po izolacji dla plemników ludzkich), nasienniki mysich w najądrzu są nadawane do łatania tylko w ciągu 2 godzin po izolacji.

I wreszcie, ale nie mniej ważne, formowanie się gigasealów różni się między komórkami plemnikowymi. W przypadku myszy/gryzoni plemników formowanie gigaseal następuje niemal natychmiast, podczas gdy do utworzenia gigaseal z ludzkiego plemnika potrzeba kilku sekund (a czasem nawet minuty). Często początkowe ssanie powoduje opór wejściowy w zakresie od 200 MΩ do 800 MΩ. Przełączanie potencjału utrzymującego napięcie do -60 mV oraz dostarczanie krótkich impulsów "Membrane Test" do 10 mV często pomaga ratować powstawanie megasealu (poprzez ruch membrany w pipecie wywołany polem napięciowym).

Technika patch clamp z plemnikami umożliwia szczegółowe badanie specyficznych kanałów jonowych w ich naturalnym systemie ekspresji. Sukces tej techniki zależy od odpowiedniego sprzętu, wysokiej jakości żywotnych plemników, czystych odczynników, podstawowych umiejętności elektrofizjologicznych, cierpliwości i wytrwałości. Metoda otwiera nowe granice fizjologii plemników, badając ewolucyjną różnorodność kanałów jonowych, mechanizmy ich regulacji oraz zmiany w ich funkcjonowaniu podczas przemieszczania się z męskiego do żeńskiego traktu rozrodczego i zmienianych przez warunki egzogenne, takie jak pH i ligandy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te zostały wsparte przez grant NIH R01GM111802, Pew Biomedical Scholars Award 00028642, Alfred P. Sloan Award FR-2015-65398 oraz Packer Wentz Endowment Will (dla P.V.L.). Prace te były również wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (Niemiecką Fundację Badawczą) 368482240/GRK2416 (dla Nowego Meksyka) oraz przez China Scholarship Council Fellowship dla B.L. Dziękujemy dr Danowi Feldmanowi za udostępnienie tkanek szczura, Katie Klooster i Stuartowi Meyersowi z UC Davis za pomoc w pozyskiwaniu plemników naczelnych oraz Stevenowi Mansellowi za pomoc w analizie danych z plemników dzików i byków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IX71 z optyczną DICOlympus IncIX71Nikon TiU mikroskop również może być użyty
UplanSApo 60xOlympus Inccel immersji w wodzie
Stół powietrza tłumiący drganiaNewport IncTMC airtables lub podobne tabele mogą być użyte
Axopatch™ Wzmacniacz 200BAxon™   /Urządzenia molekularneSutter IPA®/Double IPA® Zintegrowany system patch clamp to również doskonały wzmacniacz
Konwerter analogowo-cyfrowy Axon DigidataAxon™   /Urządzenia molekularne1440 lub 1550 można też używać
Osmometr paryWescorModel 5600
Mikromanipulator MPC 385Sutter Instruments, Novato CAMPC 385 Seria mikromanipulatorów Eppendorf TransferMan może być również używana
Mikropipeta wyciągaczSutter Instruments, Novato CAP1000P97 można użyć
MicroForgeNarishigeMF-830 powinien być wyposażony w obiektyw Nikon MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 obiektyw
Klatka FaradayaDomoweaby osłonić setup przed zakłóceniami elektrycznymi
  Szkło 5 mm Cover SlipsWPI #502040
Komora perfuzyjneWarner Instruments, Inc  RC-24E
Kapilarnia ze szkła borosilikatowegoSutter Instruments, Novato CABF 150-85-7.5średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 0,86 mm oraz wewnętrzny filament
Rozmaitość teflonowa MP-8Warner Instruments, Inc64-0211Teflonowy 8-pozycyjny rozmaitość perfuzyjna
Płytka Nunc 4-wellNunc#179820
1 X bufor HTFEmbryoMaxMR-070-Drozwiązanie pojemnościowe
Adapter SA-Oly/2 stopniWarner Instruments, IncDla peronów serii 20tylko do mikroskopu Olympus
Magnetyczna platforma podgrzewanaWarner Instruments, IncPM-1 lub podobna seria do przechowywania komory RC-24E
Magnetyczna zacisk MAG-1Warner Instruments, Inc#64-0358
Uchwyt mikroelektrody z pelletem 2mm Ag/AgClWPIMEH3F4515
Zaworek z połączeniami Luera; 4-kierunkowy; Zamek męskiCole-Parmer, IncEW-30600– 09
Adapter do żołdów żołdowych samicy, 1/16"Cole-Parmer, IncEW-45508 00
Rurka perfuzyjna z politetrafluoroetylenu (PTFE)Cole-Parmer, IncEW-06417 – 21 (Rurka PTFE mikrocylindrowa, 0,022" ID i czasy; 0,042" OD)
Rurka silikonowa (silikonowa rurka utwardzona platyną, 1/32" ID i czasy; 3/32" OD)Cole-Parmer, IncEW-95802 i dodatek; 01
Rurka złącza kolektora (rurka PTFE, 1/32" ID i czasy; 1/16" OD)Cole-Parmer, IncEW-06407 i dash; 41
Męski adapter do kolczyków serii Luer, 1/16"Cole-Parmer, Inc45518 – 00
Męski adapter zamka Luer 1/8"Cole-Parmer, Inc45-503-04
Rurka złączowa silikonowaDow Silicone Corporation;   MI#508-008
StrzykawkiFisher Scientific lub VWRAir-Tite, Norm-Ject Luer1 mL, 3 mL i 20 mL< em>
NaClSigma-AldrichS7653
KH2PO4Sigma-Aldrich60216
MgSO4 x 7.H2OSigma-Aldrich63140
CaCl2 x 2.H2OSigma-Aldrich21097
HEPESSigma-AldrichH7523-250G
GlukozaSigma-AldrichG8270
Mleczan sodu (60% w/w)Sigma-AldrichL7900
Pirorotroczan soduSigma-AldrichP2256
EDTASigma-AldrichBCBG2421V
CsMeSO3Sigma-AldrichC1426Cezowy metanonisulfonat
KClFisher ScientificP217
EGTASigma-AldrichBCBF5871V
Tris-HClJakość biologiczna315-006-7211 M rozwiązanie podobnego
NaOHSigma-Aldrich221465
CsOHSigma-Aldrich232041
Embryomax Human Tubal Fluid Medium:MilliporeMR-070-Dośrodek kapacitacyjny dla myszich plemników
(Embryomax-HTF)
Zwierzęta
Samce szczurów WistarWistarHarlan Laboratories (Livermore, CA)dorosłych szczurów
Męskie myszy C57BL/6Myszy C57BL/6Harlan Laboratories (Livermore, CA)< > 3-6 miesięcy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
  2. Kirichok, Y., Navarro, B., Clapham, D. E. Whole-cell patch-clamp measurements of spermatozoa reveal an alkaline-activated Ca2+ channel. Nature. 439, 737-740 (2006).
  3. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 110, 6823-6828 (2013).
  4. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes 3rd Edition. , Sinauer Associates - an imprint of Oxford University Press. (2001).
  5. Molleman, A. An Introductory Guide to Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons Ltd. (2003).
  6. Darszon, A., et al. Measuring ion fluxes in sperm. Methods Cell Biology. 74, 545-576 (2004).
  7. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Physiology. 74, 453-475 (2012).
  8. Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. Sperm patch-clamp. Methods in Enzymology. 525, 59-83 (2013).
  9. Ren, D., Xia, J. Calcium signaling through CatSper channels in mammalian fertilization. Physiology (Bethesda). 25, 165-175 (2010).
  10. Darszon, A., Labarca, P., Nishigaki, T., Espinosa, F. Ion channels in sperm physiology. Physiological Reviews. 79, 481-510 (1999).
  11. Cook, S. P., Brokaw, C. J., Muller, C. H., Babcock, D. F. Sperm chemotaxis: egg peptides control cytosolic calcium to regulate flagellar responses. Developmental Biology. 165, 10-19 (1994).
  12. Miller, R. L. Chemotaxis of the spermatozoa of Ciona intestinalis. Nature. 254, 244-245 (1975).
  13. Goltz, J. S., Gardner, T. K., Kanous, K. S., Lindemann, C. B. The interaction of pH and cyclic adenosine 3',5'-monophosphate on activation of motility in Triton X-100 extracted bull sperm. Biology of Reproduction. 39, 1129-1136 (1988).
  14. Gibbons, B. H., Gibbons, I. R. Flagellar movement and adenosine triphosphatase activity in sea urchin sperm extracted with triton X-100. Journal of Cell Biology. 54, 75-97 (1972).
  15. Carr, D. W., Acott, T. S. Intracellular pH regulates bovine sperm motility and protein phosphorylation. Biology of Reproduction. 41, 907-920 (1989).
  16. Babcock, D. F., Rufo, G. A., Lardy, H. A. Potassium-dependent increases in cytosolic pH stimulate metabolism and motility of mammalian sperm. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 80, 1327-1331 (1983).
  17. Zeng, Y., Oberdorf, J. A., Florman, H. M. pH regulation in mouse sperm: identification of Na(+)-, Cl(-)-, and HCO3(-)-dependent and arylaminobenzoate-dependent regulatory mechanisms and characterization of their roles in sperm capacitation. Developmental Biolgy. 173, 510-520 (1996).
  18. Lindemann, C. B., Gibbons, I. R. Adenosine triphosphate-induced motility and sliding of filaments in mammalian sperm extracted with Triton X-100. Journal of Cell Biology. 65, 147-162 (1975).
  19. Lindemann, C. B., Goltz, J. S., Kanous, K. S. Regulation of activation state and flagellar wave form in epididymal rat sperm: evidence for the involvement of both Ca2+ and cAMP. Cell Motility and Cytoskeleton. 8, 324-332 (1987).
  20. Brokaw, C. J. Calcium-induced asymmetrical beating of triton-demembranated sea urchin sperm flagella. Journal of Cell Biology. 82, 401-411 (1979).
  21. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14, 647-657 (2008).
  22. Suarez, S. S., Varosi, S. M., Dai, X. Intracellular calcium increases with hyperactivation in intact, moving hamster sperm and oscillates with the flagellar beat cycle. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 90, 4660-4664 (1993).
  23. Ishijima, S., Mohri, H., Overstreet, J. W., Yudin, A. I. Hyperactivation of monkey spermatozoa is triggered by Ca2+ and completed by cAMP. Molecular Reproduction and Development. 73, 1129-1139 (2006).
  24. Ho, H. C., Granish, K. A., Suarez, S. S. Hyperactivated motility of bull sperm is triggered at the axoneme by Ca2+ and not cAMP. Developmental Biology. 250, 208-217 (2002).
  25. Schreiber, M., et al. Slo3, a novel pH-sensitive K+ channel from mammalian spermatocytes. Journal of Biological Chemisty. 273, 3509-3516 (1998).
  26. Santi, C. M., et al. The SLO3 sperm-specific potassium channel plays a vital role in male fertility. FEBS Letters. 584, 1041-1046 (2010).
  27. Zeng, X. H., Yang, C., Kim, S. T., Lingle, C. J., Xia, X. M. Deletion of the Slo3 gene abolishes alkalization-activated K+ current in mouse spermatozoa. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, 5879-5884 (2011).
  28. Navarro, B., Kirichok, Y., Clapham, D. E. KSper, a pH-sensitive K+ current that controls sperm membrane potential. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104, 7688-7692 (2007).
  29. Navarro, B., Kirichok, Y., Chung, J. J., Clapham, D. E. Ion channels that control fertility in mammalian spermatozoa. International Journal of Developmental Biology. 52, 607-613 (2008).
  30. Quill, T. A., Ren, D., Clapham, D. E., Garbers, D. L. A voltage-gated ion channel expressed specifically in spermatozoa. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 12527-12531 (2001).
  31. Ren, D., et al. A sperm ion channel required for sperm motility and male fertility. Nature. 413, 603-609 (2001).
  32. Carlson, A. E., et al. Identical phenotypes of CatSper1 and CatSper2 null sperm. Journal of Biological Chemistry. 280, 32238-32244 (2005).
  33. Carlson, A. E., et al. CatSper1 required for evoked Ca2+ entry and control of flagellar function in sperm. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 100, 14864-14868 (2003).
  34. Quill, T. A., et al. Hyperactivated sperm motility driven by CatSper2 is required for fertilization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 100, 14869-14874 (2003).
  35. Xia, J., Reigada, D., Mitchell, C. H., Ren, D. CATSPER channel-mediated Ca2+ entry into mouse sperm triggers a tail-to-head propagation. Biology of Reproduction. 77, 551-559 (2007).
  36. Chung, J. J., et al. Structurally distinct Ca(2+) signaling domains of sperm flagella orchestrate tyrosine phosphorylation and motility. Cell. 157, 808-822 (2014).
  37. Chung, J. J., et al. CatSperzeta regulates the structural continuity of sperm Ca2+ signaling domains and is required for normal fertility. eLife. 6, 23082(2017).
  38. Hwang, J. Y., et al. Dual Sensing of Physiologic pH and Calcium by EFCAB9 Regulates Sperm Motility. Cell. 177, 1480-1494 (2019).
  39. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, 387-391 (2011).
  40. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, 382-386 (2011).
  41. Sumigama, S., et al. Progesterone accelerates the completion of sperm capacitation and activates CatSper channel in spermatozoa from the rhesus macaque. Biology of Reproduction. 93, 130(2015).
  42. Chung, J. J., Navarro, B., Krapivinsky, G., Krapivinsky, L., Clapham, D. E. A novel gene required for male fertility and functional CATSPER channel formation in spermatozoa. Nature Communication. 2, 153(2011).
  43. Wang, H., Liu, J., Cho, K. H., Ren, D. A novel, single, transmembrane protein CATSPERG is associated with CATSPER1 channel protein. Biology of Reproduction. 81, 539-544 (2009).
  44. Qi, H., et al. All four CatSper ion channel proteins are required for male fertility and sperm cell hyperactivated motility. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104, 1219-1223 (2007).
  45. Liu, J., Xia, J., Cho, K. H., Clapham, D. E., Ren, D. CatSperbeta, a novel transmembrane protein in the CatSper channel complex. Journal of Biological Chemistry. 282, 18945-18952 (2007).
  46. Jin, J., et al. Catsper3 and Catsper4 are essential for sperm hyperactivated motility and male fertility in the mouse. Biology of Reproduction. 77, 37-44 (2007).
  47. Lobley, A., Pierron, V., Reynolds, L., Allen, L., Michalovich, D. Identification of human and mouse CatSper3 and CatSper4 genes: characterisation of a common interaction domain and evidence for expression in testis. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 53(2003).
  48. Mundt, N., Spehr, M., Lishko, P. V. TRPV4 is the temperature-sensitive ion channel of human sperm. eLife. 7, 35853(2018).
  49. Zeng, X. H., Yang, C., Xia, X. M., Liu, M., Lingle, C. J. SLO3 auxiliary subunit LRRC52 controls gating of sperm KSPER currents and is critical for normal fertility. Proceedings of the National Academy Science U. S. A. 112, 2599-2604 (2015).
  50. Mansell, S. A., Publicover, S. J., Barratt, C. L., Wilson, S. M. Patch clamp studies of human sperm under physiological ionic conditions reveal three functionally and pharmacologically distinct cation channels. Molecular Human Reprodroduction. 20, 392-408 (2014).
  51. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Fedorenko, A., Kirichok, Y. Acid extrusion from human spermatozoa is mediated by flagellar voltage-gated proton channel. Cell. 140, 327-337 (2010).
  52. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science. 352, 555-559 (2016).
  53. Brenker, C., et al. The Ca2+-activated K+ current of human sperm is mediated by Slo3. eLife. 3, 01438(2014).
  54. Orta, G., et al. Human spermatozoa possess a calcium-dependent chloride channel that may participate in the acrosomal reaction. Journal of Physiology. 590, 2659-2675 (2012).
  55. Kirichok, Y., Lishko, P. V. Rediscovering sperm ion channels with the patch-clamp technique. Molecular Human Reproduction. 17, 478-499 (2011).
  56. Miller, M. R., et al. Asymmetrically positioned flagellar control units regulate human sperm rotation. Cell Reports. 24, 2606-2613 (2018).
  57. Espinosa, F., et al. Mouse sperm patch-clamp recordings reveal single Cl- channels sensitive to niflumic acid, a blocker of the sperm acrosome reaction. FEBS Letters. 426, 47-51 (1998).
  58. Gu, Y., Kirkman-Brown, J. C., Korchev, Y., Barratt, C. L., Publicover, S. J. Multi-state, 4-aminopyridine-sensitive ion channels in human spermatozoa. Developmental Biology. 274, 308-317 (2004).
  59. Jimenez-Gonzalez, M. C., Gu, Y., Kirkman-Brown, J., Barratt, C. L., Publicover, S. Patch-clamp 'mapping' of ion channel activity in human sperm reveals regionalisation and co-localisation into mixed clusters. Journal of Cell Physiology. 213, 801-808 (2007).
  60. Khasin, L. G., et al. The impact of di-2-ethylhexyl phthalate on sperm fertility. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 426(2020).
  61. Tavares, R. S., et al. p,p'-DDE activates CatSper and compromises human sperm function at environmentally relevant concentrations. Human Reproduction. 28, 3167-3177 (2013).
  62. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO Reports. 15, 758-765 (2014).
  63. Skinner, W. M., Mannowetz, N., Lishko, P. V., Roan, N. R. Single-cell motility analysis of tethered human spermatozoa. Bio-Protocols. 9, 5(2019).
  64. World Health Organization. World Health Organization Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. , (2010).
  65. Mannowetz, N., Naidoo, N. M., Choo, S. A., Smith, J. F., Lishko, P. V. Slo1 is the principal potassium channel of human spermatozoa. eLife. 2, 01009(2013).
  66. Miller, M. R., Mansell, S. A., Meyers, S. A., Lishko, P. V. Flagellar ion channels of sperm: similarities and differences between species. Cell Calcium. 58, 105-113 (2015).
  67. Berger, T. K., et al. Post-translational cleavage of Hv1 in human sperm tunes pH- and voltage-dependent gating. Journal Physiology. 595, 1533-1546 (2017).
  68. Chavez, J. C., et al. SLO3 K+ channels control calcium entry through CATSPER channels insperm. Journal Biological Chemistry. 289 (46), 32266-32275 (2014).
  69. Wennemuth, G., Babcock, D. F., Hille, B. Calcium clearance mechanisms of mouse sperm. The Journal of General Physiology. 122, 115-128 (2003).
  70. de Wagenaar, B., et al. Spermometer: electrical characterization of single boar sperm motility. Fertility and Sterility. , (2016).
  71. Satake, N., Elliott, R. M., Watson, P. F., Holt, W. V. Sperm selection and competition in pigs may be mediated by the differential motility activation and suppression of sperm subpopulations within the oviduct. The Journal of Experimental Biology. 209, 1560-1572 (2006).
  72. Dostal, L. A., Faber, C. K., Zandee, J. Sperm motion parameters in vas deferens and cauda epididymal rat sperm. Reproductive Toxicology. 10, 231-235 (1996).
  73. Umehara, T., et al. The acceleration of reproductive aging in Nrg1(flox/flox); Cyp19-Cre female mice. Aging Cell. 16, 1288-1299 (2017).
  74. Florman, H. M., Tombes, R. M., First, N. L., Babcock, D. F. An adhesion-associated agonist from the zona pellucida activates G protein-promoted elevations of internal Ca2+ and pH that mediate mammalian sperm acrosomal exocytosis. Developmental Biology. 135, 133-146 (1989).
  75. Carlson, A. E., Hille, B., Babcock, D. F. External Ca2+ acts upstream of adenylyl cyclase SACY in the bicarbonate signaled activation of sperm motility. Developmental Biology. 312, 183-192 (2007).
  76. Cook, S. P., Babcock, D. F. Activation of Ca2+ permeability by cAMP is coordinated through the pHi increase induced by speract. Journal of Biological Chemistry. 268, 22408-22413 (1993).
  77. Babcock, D. F., Pfeiffer, D. R. Independent elevation of cytosolic [Ca2+] and pH of mammalian sperm by voltage-dependent and pH-sensitive mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 262, 15041-15047 (1987).
  78. Rehfeld, A., et al. Medium-throughput screening assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (145), e59212(2019).
  79. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. 7 (1), 16-25 (2017).
  80. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. 32, 974-984 (2017).
  81. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28, 866-876 (2013).
  82. Jim Rae, R. L. Optimizing your Axopatch 200B setup for low-noise recording. Axobits. 38, (2003).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Patch clamp plemnik wpr dy b ony plazmatycznejkana y jonowe plemnik wrejestracja z ca ej kom rkikana CatSpertechnika elektrofizjologicznaizolacja kom rek plemnik wuszczelnienie gigaohmowerejestracja kana w wapniowych

Powiązane artykuły