Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Odpowiedź serca na stymulację β-adrenergiczną określona na podstawie analizy pętli ciśnienie-objętość

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62057

⸱

19 maja 2021

 ,  ,  ,  , 
1Pharmakologisches Institut, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, 2DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), partner site Heidelberg/Mannheim, 3Department of Internal Medicine III, University of Heidelberg, 4Department of Anesthesiology, University Hospital RWTH Aachen

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy analizę pętli ciśnienia i objętości serca pod wpływem rosnących dawek dożylnie podawanego izoproterenolu w celu określenia wewnętrznej funkcji serca i rezerwy β-adrenergicznej u myszy. Do pomiarów pętli ciśnienie-objętość stosujemy zmodyfikowane podejście z otwartą klatką piersiową, w którym uwzględniamy wentylację z dodatnim ciśnieniem końcowo-wydechowym.

Streszczenie

Określenie funkcji serca to solidna analiza punktów końcowych w modelach zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych w celu scharakteryzowania wpływu konkretnych terapii na serce. Ze względu na wykonalność manipulacji genetycznych mysz stała się najpowszechniejszym modelem zwierzęcym ssaków do badania funkcji serca i poszukiwania nowych potencjalnych celów terapeutycznych. W tym miejscu opisano protokół określania czynności serca in vivo za pomocą pomiarów i analizy pętli ciśnieniowo-objętościowej w warunkach podstawowych i podczas stymulacji β-adrenergicznej przez dożylny wlew zwiększających się stężeń izoproterenolu. Zapewniamy dopracowany protokół, w tym wspomaganie wentylacji, biorąc pod uwagę dodatnie ciśnienie końcowo-wydechowe w celu złagodzenia negatywnych skutków podczas pomiarów na otwartej klatce piersiowej oraz silną analgezję (buprenorfina), aby uniknąć niekontrolowanego stresu mięśnia sercowego wywołanego bólem podczas zabiegu. Podsumowując, szczegółowy opis procedury i dyskusja na temat możliwych pułapek umożliwiają wysoce ustandaryzowaną i powtarzalną analizę pętli ciśnieniowo-objętościowej, zmniejszając wykluczenie zwierząt z kohorty eksperymentalnej poprzez zapobieganie ewentualnym błędom metodologicznym.

Wprowadzenie

Choroby sercowo-naczyniowe zazwyczaj wpływają na czynność serca. W tym wydaniu zwrócono uwagę na znaczenie oceny in vivo szczegółowej funkcji serca w modelach chorób zwierzęcych. Eksperymenty na zwierzętach są otoczone ramą trzech zasad przewodnich R (3R) (Reduce/Refine/Replace). W przypadku zrozumienia złożonych patologii obejmujących reakcje ogólnoustrojowe (tj. choroby sercowo-naczyniowe) na obecnym poziomie rozwojowym, główną opcją jest udoskonalenie dostępnych metod. Rafinacja doprowadzi również do zmniejszenia wymaganej liczby zwierząt ze względu na mniejszą zmienność, co zwiększa moc analizy i wniosków. Ponadto połączenie pomiarów kurczliwości serca ze zwierzęcymi modelami chorób serca, w tym tych wywołanych stymulacją neurohumoralną lub przeciążeniem ciśnieniowym, takich jak pasmo aortalne, które naśladuje na przykład zmienione poziomy katecholamin/β-adrenergicznych1,2,3,4, zapewnia potężną metodę badań przedklinicznych. Biorąc pod uwagę, że metoda oparta na cewniku pozostaje najpowszechniej stosowanym podejściem do dogłębnej oceny kurczliwości serca5, naszym celem było przedstawienie tutaj udoskonalonego pomiaru funkcji serca in vivo u myszy za pomocą pomiarów pętli ciśnieniowo-objętościowej (PVL) podczas stymulacji β-adrenergicznej w oparciu o wcześniejsze doświadczenia, w tym ocenę specyficznych parametrów tego podejścia6, 7.

Aby określić parametry hemodynamiczne serca, dostępne są podejścia obejmujące obrazowanie lub techniki oparte na cewniku. Obu opcjom towarzyszą zalety i wady, które należy dokładnie rozważyć w odniesieniu do danego pytania naukowego. Metody obrazowania obejmują echokardiografię i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI); Oba zostały z powodzeniem zastosowane u myszy. Pomiary echokardiograficzne wiążą się z wysokimi kosztami początkowymi związanymi z szybką sondą wymaganą do wysokiego tętna myszy; Jest to stosunkowo proste, nieinwazyjne podejście, ale jest zmienne wśród operatorów, którzy powinni mieć doświadczenie w rozpoznawaniu i wizualizacji struktur serca. Ponadto nie można wykonywać pomiarów ciśnienia bezpośrednio, a obliczenia uzyskuje się na podstawie kombinacji wielkości wielkości i pomiarów przepływu. Z drugiej strony ma tę zaletę, że na tym samym zwierzęciu można wykonać kilka pomiarów i monitorować czynność serca, na przykład podczas postępu choroby. Jeśli chodzi o pomiar objętości, MRI jest złotym standardem, ale podobnie jak w przypadku echokardiografii, nie są możliwe bezpośrednie pomiary ciśnienia i można uzyskać tylko parametry zależne od napięcia wstępnego8. Czynnikami ograniczającymi są również dostępność, wysiłek związany z analizą i koszty operacyjne. W tym przypadku dobrą alternatywą są metody pomiaru czynności serca oparte na cewnikach, które dodatkowo pozwalają na bezpośrednie monitorowanie ciśnienia wewnątrzsercowego i określanie parametrów kurczliwości niezależnych od obciążenia, takich jak praca z udarem przy rekrutacji przy obciążeniu wstępnym (PRSW)9. Jednak objętości komór mierzone za pomocą cewnika ciśnieniowo-konduktancyjnego (poprzez określenie przewodności) są mniejsze niż te z MRI, ale różnice między grupami utrzymują się w tym samym zakresie10. W celu określenia wiarygodnych wartości objętości wymagana jest odpowiednia kalibracja, która jest krytycznym krokiem podczas pomiarów PVL. Łączy pomiary ex vivo przewodności krwi w kuwetach skalibrowanych objętościowo (konwersja przewodności na objętość) z analizą in vivo równoległego przewodnictwa mięśnia sercowego podczas wstrzyknięcia bolusa hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej11,12. Poza tym umiejscowienie cewnika wewnątrz komory i prawidłowa orientacja elektrod wzdłuż osi podłużnej komory mają kluczowe znaczenie dla zdolności wykrywania wytwarzanego przez nie otaczającego pola elektrycznego. Mimo to przy zmniejszonym rozmiarze serca myszy możliwe jest uniknięcie artefaktów powstałych w wyniku zmian w orientacji wewnątrzkomorowej cewnika, nawet w rozszerzonych komorach5,10, ale artefakty mogą ewoluować pod wpływem stymulacji β-adrenergicznej6,13. Oprócz metod konduktancji, opracowanie metody opartej na admitancji wydawało się unikać etapów kalibracji, ale tutaj wartości objętości są raczej przeszacowane14,15.

Ponieważ mysz jest jednym z najważniejszych modeli przedklinicznych w badaniach sercowo-naczyniowych, a rezerwa β-adrenergiczna serca jest głównym przedmiotem zainteresowania fizjologii i patologii serca, prezentujemy tutaj wyrafinowany protokół do określania in vivo funkcji serca u myszy za pomocą pomiarów PVL podczas stymulacji β-adrenergicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z przepisami Rady Regionalnej Karlsruhe i Uniwersytetu w Heidelbergu (AZ 35-9185.82/A-2/15, AZ 35-9185.82/A-18/15, AZ 35-9185.81/G131/15, AZ 35-9185.81/G121/17) są zgodne z wytycznymi Dyrektywy Parlamentu Europejskiego 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Dane przedstawione w tym protokole pochodzą od samców myszy C57Bl6/N typu dzikiego (w wieku od 17 ± 1,4 tygodnia). Myszy utrzymywano w określonych warunkach wolnych od patogenów w ośrodku dla zwierząt (IBF) Wydziału Medycznego w Heidelbergu. Myszy trzymano w 12-godzinnym cyklu jasno-ciemnym, z wilgotnością względną między 56-60%, 15-krotną wymianą powietrza na godzinę i temperaturą pokojową 22°C +/- 2°C. Trzymano je w konwencjonalnych klatkach typu II lub typu II, długo wyposażonych w ściółkę dla zwierząt i bibułki jako urozmaicenie. Standardowa żywność w autoklawie i woda w autoklawie były dostępne do spożycia ad libitum.

1. Przygotowanie narzędzi i roztworów leków

  1. Cewnik do żyły centralnej: Przeciąć mikrorurkę (średnica zewnętrzna 0,6 mm) na rurki cewnika o długości ~20 cm. Użyj kleszczyków, aby przeciągnąć jeden koniec rurki na końcówkę kaniuli o rozmiarze 23. Przetnij drugi koniec rurki po przekątnej, aby utworzyć ostrą końcówkę, która może przebić żyłę udową.
  2. Rurka dotchawicza: W przypadku rurki intubacyjnej wytnij kaniulę do nakłucia żyły o długości 3 cm w rozmiarze 20, aby usunąć nasadkę strzykawki.
    1. Jeśli rurka intubacyjna nie pasuje idealnie do połączenia respiratora, owiń parafilm na końcu rurki, do której podłączone jest urządzenie wentylacyjne. Połączenie musi być stabilne i uszczelnione przez pogrubienie (Rysunek 1A). Skróć metalowy trzpień prowadzący kaniuli do nakłucia żyły w rozmiarze 20 do 2,7 cm i użyj go jako pomocy do intubacji. Wyrafinowane podejścia do intubacji, w tym światłowody ułatwiające wizualizację tchawicy, są również dobrze opisane, na przykład przez Dasa i współpracowników16.
  3. Mieszanina anestezjologiczna stosowana do intubacji: Zmieszać 200 μl heparyny (1000 j.m./ml) z 50 μl 0,9% NaCl i 750 μl 2 mg/ml etomidatu z produktu na bazie emulsji olej w wodzie. Stosować 7 μl/g masy ciała (m.c.) dla każdej myszy (0,1 mg/kg m.c., buprenorfina 10 mg/kg m.c. etomidatu).
  4. Środek zwiotczający mięśnie: Rozpuścić 100 mg bromku pankuronium w 100 ml 0,9% NaCl. Użyj 1,0 μl/g masy ciała (1 mg/kg masy ciała) dla każdej myszy.
  5. Roztwory izoproterenolu: Rozpuścić 100 mg izoproterenolu w 100 ml 0,9% NaCl (1 μg/μl). Przygotować następujące roztwory (Tabela 1) i przenieść każde z nich do strzykawki o pojemności 1 ml.
    1. Aby uzyskać rozcieńczenie 1, rozcieńczyć materiał podstawowy w stosunku 1:1.8. Aby uzyskać rozcieńczenie 2, należy rozcieńczyć materiał podstawowy w stosunku 1:6. Aby uzyskać rozcieńczenie 3, rozcieńczyć rozcieńczenie 1 w stosunku 1:10. Na koniec uzyskać rozcieńczenie 4 przez rozcieńczenie 2 w stosunku 1:10.
  6. 15% Hypertonic NaCl (w/v): Rozpuść 1,5 g 0,9% NaCl w 10 ml podwójnie destylowanegoH2O. Przefiltruj roztwór za pomocą filtra strzykawkowego o porach 0,45 μm.
  7. Przygotowanie 12,5% roztworu albuminy (w/v): Rozpuścić 1,25 g albuminy surowicy bydlęcej w 10 ml 0,9% NaCl. Inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Schłodzić do temperatury pokojowej i przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego o porach 0,45 μm.
  8. Przygotowanie konfiguracji: Najpierw włącz płytę grzewczą i ustaw ją na 39-40 °C. Umieść strzykawkę wypełnioną solą fizjologiczną na poduszce grzewczej i przenieś cewnik pętli ciśnieniowo-objętościowej (PVL) do strzykawki. Przed użyciem należy wstępnie inkubować cewnik przez co najmniej 30 minut w celu stabilizacji. Używana przez nas konfiguracja składa się z cewnika 1,4-F przewodzącego ciśnienie, jednostki sterującej i odpowiedniego oprogramowania, i jest graficznie opisana na stronie Rysunek 1B, a referencje dostawców są wymienione w tabeli materiałów.

2. Znieczulenie

  1. Buprenorfinę (0,1 mg/kg masy ciała dootrzewnowo) należy wstrzyknąć 30 minut przed intubacją.
  2. Umieść mysz w komorze ze szkła akrylowego wstępnie nasączonej 2,5% izofluranem i wstępnie podgrzanej poduszką grzewczą umieszczoną na podstawie komory.
  3. Gdy tylko mysz zaśnie (brak odruchu), wstrzyknij dootrzewnowo mieszaninę znieczuloną (7 ml/kg m.c.) zawierającą 10 mg/kg etomidatu i heparynę (1,200 j.m./kg m.c.).

3. Wentylacja

  1. Przenieś zwierzę na platformę intubacyjną (Rysunek 1C) 3-4 minuty po wstrzyknięciu środka znieczulającego. Mysz zwisa z zębów z widokiem grzbietowym skierowanym w stronę operatora.
  2. Delikatnie unieś język za pomocą kleszczy. Aby zidentyfikować głośnię, lekko unieś dolną szczękę myszy za pomocą drugich kleszczy.
  3. Ostrożnie włóż rurkę dotchawiczą (Rysunek 1A) do tchawicy i wyjmij pręt prowadzący.
  4. Przenieś zwierzę na płytę grzewczą, połóż je na plecach i podłącz rurkę intubacyjną do respiratora dla małych zwierząt.
  5. Dostosuj częstość oddechów do 53,5 x (masa ciała w gramach)-0,26 [min-1], zgodnie z opisem innych12, a objętości oddechowe do szczytowego ciśnienia wdechowego 11 ± 1 cmH2O. Ustal PEEP na poziomie 2 cmH2O.
  6. Ostrożnie przymocuj kończyny myszy do płyty grzewczej za pomocą pasków samoprzylepnych i nałóż maść do oczu na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
  7. Włożyć sondę temperatury doodbytniczej i utrzymywać temperaturę ciała na poziomie 37 ± 0,2 °C.
  8. Zainstaluj 1-odprowadzeniowe EKG i monitoruj tętno on-line jako wskaźnik głębokości i stabilności znieczulenia.
  9. W przypadku braku odruchów międzypalcowych wstrzyknąć dootrzewnowo 1 mg/kg masy ciała bromku pankuronium zwiotczającego mięśnie. Zapobiega to artefaktom oddechowym podczas pomiarów PVL.

4. Chirurgia

  1. Zalecenia ogólne
    1. Podczas zabiegu wietrzyć ~1,5-2% izofluranu odparowanego zO2. Stężenie izofluranu może również zależeć od zmiennych, takich jak szczep myszy, płeć, wiek i waga zwierząt, ale musi być indywidualnie i doświadczalnie określone, a podane wartości są odniesieniem dla szczepu myszy C57BL6/N. Co ważne, respirator jest podłączony do systemu wyciągowego, aby zapobiec wdychaniu izofluranu przez operatora.
    2. Do zabiegów chirurgicznych należy używać powiększenia 1,5-4x z mikroskopu stereoskopowego.
      UWAGA: Zapoznaj się z instytucjonalnymi/lokalnymi wytycznymi dotyczącymi przygotowania zwierzęcia do operacji, które nie dają szansy na przeżycie.
  2. Kaniulacja kości udowej
    1. Opłucz tylną kończynę 70% etanolem, naciąć lewą okolicę pachwinową i odsłonić lewą żyłę udową.
    2. Przedmuchaj tętnicę i żyłę nadbrzusza za pomocą kauteryzacji.
    3. Podwiązać żyłę udową za pomocą szwu umieszczonego dystalnie do dostępu cewnika.
    4. Przełóż szew pod żyłą udową i przygotuj węzeł czaszkowy w miejscu nakłucia. Nakłuć żyłę udową za pomocą przygotowanej mikrorurki (patrz krok 1.1) podłączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.
    5. Zawiąż węzeł, aby zamocować rurkę wewnątrz naczynia.
    6. Przeciwdziałaj utracie płynów poprzez infuzję 0,9% NaCl uzupełnionego 12,5% albuminą z szybkością infuzji 15 μl/min za pomocą automatycznej pompy strzykawkowej. Dodatkowo utrzymuj odsłoniętą tkankę wilgotną za pomocą wstępnie podgrzanego 0,9% NaCl.
  3. Torakotomia
    1. Przepłucz klatkę piersiową 70% etanolem.
    2. Naciąć skórę tuż pod wyrostkiem ksylifoidalnym i tępo oddzielić mięśnie piersiowe od ściany klatki piersiowej za pomocą kleszczy lub kauteryzacji.
    3. Podnieś wyrostek ksylufowy za pomocą kleszczy, a następnie przetnij ścianę klatki piersiowej, przesuwając się na boki po obu stronach za pomocą kauteryzacji, aż przepona będzie w pełni widoczna od spodu.
    4. Naciąć przeponę od spodu i odsłonić wierzchołek serca. Następnie ostrożnie usuń osierdzie za pomocą kleszczy.
    5. Wykonaj ograniczoną kostotomię po lewej stronie, jak opisano wcześniej6.
    6. Przełóż szew pod dolną żyłą główną, aby przeprowadzić redukcję obciążenia wstępnego w późniejszych etapach.
    7. Delikatnie nakłuj wierzchołek serca kaniulą o rozmiarze 25 (maksymalnie 4 mm). Wyjmij kaniulę i włóż cewnik PV, aż wszystkie elektrody znajdą się w komorze.
    8. Dostosuj położenie cewnika, wykonując delikatne ruchy i obroty, aż uzyskasz pętle w kształcie prostokąta (Rysunek 2A).
    9. Utrzymuj zawsze wszystkie odsłonięte tkanki w wilgotnej wodzie, używając wstępnie podgrzanego 0,9% NaCl.

5. Pomiary

  1. Zalecenia ogólne
    1. Podczas pomiarów wietrzyć ~1,5-2% izofluranu odparowanego ze 100%O2.
    2. Wykonać 2 pomiary podstawowe oraz 2 okluzje żyły głównej na każdym etapie protokołu dawka-odpowiedź.
      UWAGA: Ważne jest, aby po pierwszej i drugiej niedrożności żyły głównej zarówno wartości ciśnienia, jak i objętości powróciły do wartości w stanie ustalonym, jak przed pierwszą niedrożnością. Obserwacja ta jest niezbędna do rozpoznania zmiany położenia cewnika spowodowanej seryjnym zmniejszeniem objętości wewnątrzkomorowej. Jeśli dojdzie do zmiany położenia cewnika, zwłaszcza wartości objętości zostaną przesunięte.
  2. Wykonaj analizę parametrów on-line (częstość akcji serca, objętość wyrzutowa, dP/dtmax) i poczekaj na uzyskanie funkcji serca w stanie ustalonym. Aby uzyskać oczekiwany zakres parametrów z tutaj używanym ustawieniem w myszach C57Bl6/N, zapoznaj się z opublikowanymi wynikami6.
  3. Zatrzymaj respirator w pozycji końcowej wydechowej i zapisz parametry podstawowe. Po 3 do 5 sekundach zmniejsz obciążenie wstępne serca, podnosząc szew poniżej żyły dolnej dolnej za pomocą kleszczy w celu uzyskania parametrów niezależnych od obciążenia wstępnego (Rysunek 2B). Włącz wentylator. Odczekaj co najmniej 30 sekund na drugą okluzję, aż parametry hemodynamiczne się ustabilizują.
  4. Po uzyskaniu pomiarów w warunkach podstawowych należy przejść do dawka-odpowiedź izoproterenolu poprzez przejście na przygotowane strzykawki. W tym przypadku szybkość infuzji pozostaje niezmieniona, aby uniknąć modyfikacji obciążenia wstępnego serca. Należy uważać, aby nie wpuścić pęcherzyków powietrza podczas wymiany strzykawki.
    1. Odczekaj co najmniej 2 minuty, aż zostanie uzyskana nowa funkcja serca w stanie ustalonym, a następnie ponownie zatrzymaj respirator w pozycji końcowej wydechowej i zapisz parametry wyjściowe. Po 3 do 5 sekundach należy zmniejszyć obciążenie wstępne serca poprzez uniesienie szwu poniżej żyły głównej dolnej w celu uzyskania parametrów niezależnych od obciążenia wstępnego.
    2. Poczekaj co najmniej 30 sekund na drugą okluzję. Następnie przełączamy się na przygotowaną strzykawkę z kolejnym stężeniem izoproterenolu i powtarzamy zapisy parametrów niezależnych od wartości podstawowej i obciążenia wstępnego.
      UWAGA: Artefakty, takie jak skok ciśnienia skurczowego końca (ESPS, Rysunek 2C) mogą wystąpić podczas zwiększania dawki izoproterenolu, co wynika z uwięzienia cewnika. Artefakty, które pojawiają się przed rozpoczęciem podstawowych parametrów, można łatwo skorygować poprzez zmianę położenia cewnika.

6. Kalibracja

UWAGA: Procedury kalibracji mogą się różnić w zależności od używanego systemu PVL.

  1. Kalibracja przewodności równoległej
    1. Podłączyć strzykawkę zawierającą 15% roztwór NaCl do kaniuli udowej po ostatnim pomiarze od dawki izoproterenolu do odpowiedzi. Ostrożnie wlej 5 μl roztworu hipertonicznego pozostałego w probówce, aż PVL nieznacznie przesunie się w prawo podczas wizualizacji on-line. Następnie poczekaj, aż pętle powrócą do stanu ustalonego.
    2. Zatrzymaj respirator po wydechu i wstrzyknij jeden bolus 10 μl 15% NaCl w ciągu 2 do 3 sekund. Sprawdź, czy PVL znacznie się poszerzają i są przesunięte w prawo podczas wizualizacji on-line.
  2. Kalibracja przewodności do objętości
    1. Odczekaj 5 minut, nie mniej, aby bolus soli fizjologicznej hipertoniczny został całkowicie rozcieńczony. Następnie wyjmij cewnik i pobierz co najmniej 600 μl krwi z lewej komory bijącego serca za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i kaniuli o rozmiarze 21. W tym momencie zwierzę zostaje poddane eutanazji w głębokim znieczuleniu i analgezji poprzez masywne krwawienie, zatrzymanie wentylacji i usunięcie serca.
    2. Przenieść krew do wstępnie ogrzanej (w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C) kuwety kalibracyjnej z cylindrami o znanej objętości. Umieść cewnik PV centralnie w każdym cylindrze i zapisz przewodność. Obliczając krzywą standardową dla każdego zwierzęcia, jednostki przewodności można przeliczyć na bezwzględne wartości objętości.

7. Analiza

  1. Po udanych pomiarach PVL w warunkach podstawowych i stymulacji izoproterenolem, zwizualizuj, digitalizuj, obliczaj i wyodrębniaj parametry charakteryzujące czynność serca (takie jak m.in. PRSW, dP/dt, ciśnienie i objętość końcoworozkurczowa, ciśnienie i objętość końcowoskurczowa, stała relaksacji Tau) za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy PVL. Dalsza analiza statystyczna i reprezentacje graficzne mogą być wykonywane za pomocą standardowego oprogramowania analitycznego.
  2. Analiza parametrów niezależnych od napięcia wstępnego
    UWAGA: Na tym etapie kluczowe jest ujednolicenie procedury.
    1. Wybierz pierwsze 5-6 PVL pokazujących malejące napięcie wstępne we wszystkich pomiarach do analizy parametrów niezależnych od napięcia wstępnego (Rysunek 2D). Stała liczba PVL wybranych do analizy podczas redukcji napięcia wstępnego zmniejszy zmienność pomiędzy pomiarami uzyskanych parametrów.
    2. Obliczyć średnią wartość z dwóch pomiarów na każdym etapie protokołu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomiar pętli ciśnienia i objętości (PVL) jest potężnym narzędziem do analizy farmakodynamiki leków w obrębie serca oraz badania fenotypu sercowego w genetycznie zmodyfikowanych modelach mysich w warunkach prawidłowych i patologicznych. Protokół ten umożliwia ocenę rezerwy β-adrenergicznej serca w dorosłym modelu mysim. Opisujemy tutaj metodę z otwartą klatką piersiową w znieczuleniu izofluranem w połączeniu z buprenorfiną (analgetykiem) i pankuroniem (lekiem miorelaksacyjnym), która skupia się na odpowiedzi serca na stym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół analizy funkcji serca in vivo u myszy pod wpływem narastającej stymulacji β-adrenergicznej. Procedura może być stosowana zarówno w celu uwzględnienia wyjściowych parametrów czynności serca, jak i rezerwy adrenergicznej (np. inotropii i chronotropii) u myszy zmodyfikowanych genetycznie lub po interwencjach. Najważniejszą zaletą pomiarów pętli ciśnienia i objętości (PVL) w porównaniu z innymi metodami określania czynności serca jest analiza wewnętrznej, niezależnej od obciążenia funkcji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie trzeba zgłaszać konfliktu interesów.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Manueli Ritzal, Hansowi-Peterowi Gensheimerowi, Christinowi Richterowi i zespołowi z Interfakultäre Biomedizinische Forschungseinrichtung (IBF) z Uniwersytetu w Heidelbergu za fachową pomoc techniczną.

Ta praca była wspierana przez DZHK (Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych), BMBF (Niemieckie Ministerstwo Edukacji i Badań), Badenia-Wirtembergia Kraj Związkowy Innowacje oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) Project-ID 239283807 - TRR 152, FOR 2289 oraz Collaborative Research Center (SFB) 1118.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cewnik 1.4F SPR-839Millar Instruments, USA840-8111
Strzykawki 1 mlBeckton Dickinson, USAREF303172
Wzmacniacz biologicznyADInstruments, USAFE231
Wzmacniacz mostkowyADInstruments, USAFE221
Albumina surowicy bydlęcejRoth, Niemcy8076.2
Chlorowodorek buprenorfinyBayer, Niemcy4007221026402
Kuweta kalibracyjnaMillar, USA910-1049
Przetwornik różnicy ciśnień MPXHugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, NiemcyTyp 39912
Kleszcze Dumonta # 5/45Fine Science Tools Inc.11251-35
Kleszcze Dumont #7BFine Science Tools Inc.11270-20
Graefe KleszczeNarzędzia do nauki o naukach Inc.11051-10
GraphPad PrismOprogramowanie GraphPadVer. 8.3.0
EcoLab-PE-MicotubeSmiths, USA004/310/168-1
Etomidate LipuroBraun, Niemcy2064006
ExcelMicrosoft
HeparinRatiopharm, NiemcyR26881
Płyta grzejna i jednostka sterującaLabotec, NiemcyPłyta grzejna 062
IsofluranBaxter, NiemcyHDG9623
Waporyzator IsofluranAbbotVapor 19.3
Chlorowodorek izoprenalinySigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneI5627
Rurka polietylenowa drobnootworowa 0,61 mm OD, 0,28 mm IDSmiths Medical International Ltd, Wielka BrytaniaRef. 800/100/100
MiniVent respirator dla myszyHugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, NiemcyTyp 845
MPVS Ultra PVL SystemMillar Instruments, USA
NaClAppliChem, NiemcyA3597
NaCl 0,9% izotonikBraun, Niemcy2350748
Pankuronium-bromekSigma-Aldrich, Stany ZjednoczoneBCBQ8230V
Perfusor 11 PlusHarvard ApparatusNr. 70-2209
Powerlab 4/35 jednostka sterującaADInstruments, USAPL3504
Akumulatorowy zestaw do kauteryzacjiFaromed, Niemcy09-605
NożyczkiFine Science tools Inc.140094-11
Oprogramowanie LabChart 7 ProADInstruments, USALabChart 7.3 Pro
Standardowe jedzenie dla myszyLASvendi GmbH, NiemcyRod18
Mikroskop stereoskopowyZeiss, NiemcyStemi 508
Szew chirurgiczny 8/0Suprama, NiemcyCh.B.03120X
Kaniula do nakłucia żyły Venflon Pro Safty 20-gaugeBeckton Dickinson, Stany Zjednoczone393224
Kleszcze do kaniulacji naczyńFine Science Tools Inc.00574-11
Łaźnia wodnaThermo Fisher Scientific, USA
Filtr strzykawkowy (Filtropur S 0.45)Sarstedt, NiemcyRef. 83.1826

Bibliografia

  1. Bacmeister, L., et al. Inflammation and fibrosis in murine models of heart failure. Basic Research in Cardiology. 114 (3), 19(2019).
  2. Hartupee, J., Mann, D. L. Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection fraction. Nature Reviews Cardiology. 14 (1), 30-38 (2017).
  3. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovascular Research. 39 (1), 60-76 (1998).
  4. Lefkowitz, R. J., Rockman, H. A., Koch, W. J. Catecholamines, cardiac beta-adrenergic receptors, and heart failure. Circulation. 101 (14), 1634-1637 (2000).
  5. Cingolani, O. H. K. Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301, 2198-2206 (2011).
  6. Bacmeister, L., et al. Assessment of PEEP-Ventilation and the Time Point of Parallel-Conductance Determination for Pressure-Volume Analysis Under beta-Adrenergic Stimulation in Mice. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 36(2019).
  7. Segin, S., et al. Cardiomyocyte-Specific Deletion of Orai1 Reveals Its Protective Role in Angiotensin-II-Induced Pathological Cardiac Remodeling. Cells. 9 (5), (2020).
  8. Clark, J. E., Marber, M. S. Advancements in pressure-volume catheter technology - stress remodelling after infarction. Experimental Physiology. 98 (3), 614-621 (2013).
  9. Glower, D. D., et al. Linearity of the Frank-Starling relationship in the intact heart: the concept of preload recruitable stroke work. Circulation. 71 (5), 994-1009 (1985).
  10. Winter, E. M., et al. Left ventricular function in the post-infarct failing mouse heart by magnetic resonance imaging and conductance catheter: a comparative analysis. Acta Physiologica. 194 (2), 111-122 (2008).
  11. Krenz, M. Conductance, admittance, and hypertonic saline: should we take ventricular volume measurements with a grain of salt. Journal of Applied Physiology. 107 (6), 1683-1684 (2009).
  12. Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nature Protocols. 3 (9), 1422-1434 (2008).
  13. Wei, A. E., Maslov, M. Y., Pezone, M. J., Edelman, E. R., Lovich, M. A. Use of pressure-volume conductance catheters in real-time cardiovascular experimentation. Heart, Lung and Circulation. 23 (11), 1059-1069 (2014).
  14. van Hout, G. P., et al. Admittance-based Pressure-Volume Loops versus gold standard cardiac magnetic resonance imaging in a porcine model of myocardial infarction. Physiological Reports. 2 (4), 00287(2014).
  15. Wei, C. L., Shih, M. H. Calibration Capacity of the Conductance-to-Volume Conversion Equations for the Mouse Conductance Catheter Measurement System. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 56 (6), 1627-1634 (2009).
  16. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  17. Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
  18. Weiss, J. L., Frederiksen, J. W., Weisfeldt, M. L. Hemodynamic determinants of the time-course of fall in canine left ventricular pressure. Journal of Clinical Investigation. 58 (3), 751-760 (1976).
  19. Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavioral Research Methods. 39 (2), 175-191 (2007).
  20. Jacoby, C., et al. Direct comparison of magnetic resonance imaging and conductance microcatheter in the evaluation of left ventricular function in mice. Basic Research in Cardiology. 101 (1), 87-95 (2006).
  21. Georgakopoulos, D., Kass, D. A. Estimation of parallel conductance by dual-frequency conductance catheter in mice. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 279 (1), 443-450 (2000).
  22. Calligaris, S. D., Ricca, M., Conget, P. Cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50050(2013).
  23. Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e52942(2015).
  24. Pearce, J. A., Porterfield, J. E., Larson, E. R., Valvano, J. W., Feldman, M. D. Accuracy considerations in catheter based estimation of left ventricular volume. Conference proceedings - IEEE engineering in medicine and biology society. 2010, 3556-3558 (2010).
  25. Nielsen, J. M., et al. Left ventricular volume measurement in mice by conductance catheter: evaluation and optimization of calibration. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (1), 534-540 (2007).
  26. Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810(2016).
  27. Barnabei, M. S., Palpant, N. J., Metzger, J. M. Influence of genetic background on ex vivo and in vivo cardiac function in several commonly used inbred mouse strains. Physiological Genomics. 42 (2), 103-113 (2010).
  28. Oosterlinck, W., Vanderper, A., Flameng, W., Herijgers, P. Glucose tolerance and left ventricular pressure-volume relationships in frequently used mouse strains. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 281312(2011).
  29. Guo, X., Kono, Y., Mattrey, R., Kassab, G. S. Morphometry and strain distribution of the C57BL/6 mouse aorta. The American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (5), 1829-1837 (2002).
  30. Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Funkcja sercastymulacja beta adrenergicznainfuzja izoproterenolumysi model sercapodej cie z otwart klatk piersiowwsparcie wentylacyjneredukcja obci enia wst pnegokurczliwo sercaparametry hemodynamiczne
Odpowiedź serca na stymulację β-adrenergiczną określona na podstawie analizy pętli ciśnienie-objętość
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.