Artykuł metodologiczny

Barwienie immunofluorescencyjne w całości mount, obrazowanie konfokalne i rekonstrukcja 3D węzła zatokowo-przedsionkowego i przedsionkowo-komorowego u myszy

DOI:

10.3791/62058

⸱

22 grudnia 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udostępniamy krok po kroku protokół barwienia immunofluorescencyjnego całego węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN) i węzła przedsionkowo-komorowego (AVN) u mysich serc.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnał elektryczny fizjologicznie generowany przez komórki rozrusznika serca w węźle zatokowo-przedsionkowym (SAN) jest prowadzony przez system przewodzenia, który obejmuje węzeł przedsionkowo-komorowy (AVN), aby umożliwić pobudzenie i skurcz całego serca. Każda dysfunkcja SAN lub AVN prowadzi do arytmii, co wskazuje na ich fundamentalną rolę w elektrofizjologii i arytmogenezie. Modele mysie są szeroko stosowane w badaniach nad arytmią, ale konkretne badanie SAN i AVN pozostaje wyzwaniem.

SAN znajduje się na styku crista terminalis z żyłą główną górną, a AVN znajduje się na wierzchołku trójkąta Kocha, utworzonego przez otwór zatoki wieńcowej, pierścień trójdzielny i ścięgno Todaro. Jednak ze względu na niewielkie rozmiary, wizualizacja za pomocą konwencjonalnej histologii pozostaje wyzwaniem i nie pozwala na badanie sieci SAN i AVN w ich środowisku 3D.

Tutaj opisujemy podejście immunofluorescencyjne typu full-mount, które pozwala na lokalną wizualizację znakowanych mysich sieci SAN i AVN. Barwienie immunofluorescencyjne metodą całego montażu jest przeznaczone dla mniejszych odcinków tkanek bez potrzeby ręcznego cięcia. W tym celu serce myszy jest preparowane, usuwana jest niechciana tkanka, a następnie utrwalanie, przepuszczalność i blokowanie. Komórki układu przewodzącego w SAN i AVN są następnie barwione przeciwciałem anty-HCN4. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa i przetwarzanie obrazu umożliwiają różnicowanie komórek węzłowych i pracujących kardiomiocytów oraz wyraźną lokalizację SAN i AVN. Co więcej, dodatkowe przeciwciała mogą być łączone w celu znakowania również innych typów komórek, takich jak włókna nerwowe.

W porównaniu z konwencjonalną immunohistologią, barwienie immunofluorescencyjne całej góry zachowuje anatomiczną integralność układu przewodzącego serca, umożliwiając tym samym badanie AVN; szczególnie w ich anatomii i interakcjach z otaczającymi pracującymi komórkami mięśnia sercowego i nie-miocytów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arytmie są powszechnymi chorobami dotykającymi miliony ludzi i są przyczyną znacznej zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Pomimo ogromnych postępów w leczeniu i profilaktyce, takich jak rozwój rozruszników serca, leczenie zaburzeń rytmu serca pozostaje wyzwaniem, przede wszystkim ze względu na bardzo ograniczoną wiedzę na temat mechanizmów leżących u podstaw choroby1,2,3. Lepsze zrozumienie zarówno normalnej elektrofizjologii, jak i patofizjologii arytmii może pomóc w opracowaniu nowych, innowacyjnych i przyczynowych strategii leczenia w przyszłości. Dodatkowo, aby kompleksowo zbadać arytmogenezę, ważne jest zlokalizowanie i wizualizacja specyficznego układu przewodzenia serca w modelach zwierzęcych, takich jak mysz, ponieważ myszy są szeroko stosowane w badaniach elektrofizjologicznych.

Głównymi częściami układu przewodnictwa serca są węzeł zatokowo-przedsionkowy (SAN), gdzie generowany jest impuls elektryczny w wyspecjalizowanych komórkach rozrusznika serca, oraz węzeł przedsionkowo-komorowy (AVN), który jest jedynym połączeniem elektrycznym między przedsionkami a komorami4. Za każdym razem, gdy właściwości elektrofizjologiczne SAN i AVN ulegają zmianie, mogą wystąpić zaburzenia rytmu serca, takie jak zespół chorej zatoki lub blokada przedsionkowo-komorowa, które mogą prowadzić do pogorszenia hemodynamicznego, omdlenia, a nawet śmierci, a tym samym podkreślić istotną rolę zarówno SAN, jak i AVN w elektrofizjologii i arytmogenezie5.

Kompleksowe badania nad SAN lub AVN wymagają precyzyjnej lokalizacji i wizualizacji obu struktur, najlepiej w ich fizjologicznym środowisku. Jednak ze względu na ich niewielkie rozmiary i umiejscowienie w pracującym mięśniu sercowym, bez ustalenia wyraźnej makroskopowo widocznej struktury, badanie anatomii i elektrofizjologii SAN i AVN jest wyzwaniem. Anatomiczne punkty orientacyjne mogą być używane do przybliżonej identyfikacji regionu, który zawiera SAN i AVN6,7,8. Krótko mówiąc, SAN znajduje się w obszarze międzynawczym prawego przedsionka przylegającego do mięśnia zaciskowego (CT), AVN znajduje się w trójkącie Kocha ustanowionym przez zastawkę trójdzielną, ujście zatoki wieńcowej i ścięgno Todaro. Do tej pory te anatomiczne punkty orientacyjne były wykorzystywane głównie do lokalizacji, usuwania, a następnie badania SAN i AVN jako indywidualnych struktur (np. za pomocą konwencjonalnej histologii). Aby jednak lepiej zrozumieć złożoną elektrofizjologię SAN i AVN (np. efekty regulacyjne sąsiednich komórek pracującego mięśnia sercowego), konieczne jest zbadanie układów przewodzenia w fizjologicznym środowisku 3D.

Barwienie immunofluorescencyjne w całości to metoda, która służy do badania struktur anatomicznych in situ, przy jednoczesnym zachowaniu integralności otaczającej tkanki9. Korzystając z mikroskopii konfokalnej i oprogramowania do analizy obrazu, SAN i AVN mogą być wizualizowane za pomocą znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał skierowanych do kanałów jonowych specyficznie eksprymowanych w tych regionach.

Ten poniższy protokół wyjaśnia niezbędne kroki do przeprowadzenia sprawdzonej metody barwienia całego montażu dla lokalizacji i wizualizacji mikroskopów SAN i AVN. W szczególności protokół ten opisuje, w jaki sposób (1) lokalizować SAN i AVN za pomocą anatomicznych punktów orientacyjnych w celu przygotowania tych próbek do barwienia i analizy mikroskopowej, (2) w celu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego w całości markerów referencyjnych HCN4 i Cx43 (3) w celu przygotowania próbek SAN i AVN do mikroskopii konfokalnej (4) w celu wykonania obrazowania konfokalnego SAN i AVN. Opisujemy również, w jaki sposób protokół ten może zostać zmodyfikowany, aby uwzględnić dodatkowe barwienie otaczającego pracującego mięśnia sercowego lub komórek niemiocytowych, takich jak autonomiczne włókna nerwowe, co pozwala na dokładne zbadanie układu przewodzącego serca w sercu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami i wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Monachium, a wszystkie procedury przeprowadzone na myszach zostały zatwierdzone przez Rząd Bawarii, Monachium, Niemcy (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Myszy C57BL6/J zakupiono w Jackson Laboratory.

UWAGA: Rysunek 1 pokazuje instrumenty potrzebne do eksperymentu. Rysunek 2 przedstawia ilustrację ogólnej anatomii serca. Rysunek 3 pokazuje lokalizację sieci SAN i AVN w sercu dorosłej myszy. Rysunek 4 przedstawia przygotowaną próbkę załadowaną do mikroskopii konfokalnej.

1. Przygotowania

  1. Przygotować 4% roztwór formaldehydu (4% PFA), rozcieńczając 10 ml 16% roztworu formaldehydu w 30 ml PBS.
  2. Przygotować 15% roztwór sacharozy i 30% roztwór sacharozy, rozpuszczając odpowiednio 15 g i 30 g sacharozy w proszku w 100 ml PBS. Po całkowitym rozpuszczeniu sacharozy w proszku przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotuj żel agarozowy 3%-4%, dodaj 3 g lub 4 g proszku agarozowego i 100 ml 1x TAE (rozcieńczonego z 50x roztworu podstawowego TAE) do zlewki. Umieść zlewkę na mieszadle magnetycznym i gotuj ją, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
  4. Przygotuj naczynie rozekcyjne, delikatnie wlewając 30 ml żelu agarozowego (3%-4%) na szalkę Petriego o średnicy 100 mm. Pozostaw szalkę Petriego na ławce w temperaturze pokojowej, aby ostygła i stwardniała.
  5. Przygotować roztwór blokujący i roztwór do przemywania zgodnie z przepisami podanymi w Tabeli 1. Przygotuj wszystkie roztwory przygotowane w dniu użycia. Nie zaleca się długotrwałego przechowywania.
  6. Przygotować roztwory przeciwciał, rozcieńczając je w zimnym (4 °C) 1x PBS, chronić rozcieńczenie przed światłem (np. owijając folię aluminiową) i utrzymywać rozcieńczenia na lodzie aż do użycia. Rozcieńczyć przeciwciała na krótko przed inkubacją. Unikać pozostawiania rozcieńczonych przeciwciał w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Odpowiednie rozcieńczenie przeciwciał powinno być testowane na porównywalnych próbkach tkanek, wykonując konwencjonalne barwienie immunofluorescencyjne. Tutaj przetestowaliśmy przeciwciała poprzez barwienie zamrożonych skrawków pociętych na grubość 10 μm.

2. Pobieranie narządów i przygotowanie tkanek

  1. Znieczulij mysz, umieszczając ją w komorze inkubacyjnej podłączonej do parownika izofluranowego. Ustaw waporyzator tak, aby dostarczał 4-5% izofluranu (odpowiednio 96-95% tlenu).
    UWAGA: Pełne znieczulenie potwierdza utrata reakcji posturalnej i odruchu prostowania poprzez delikatne przetaczanie komory, aż do momentu ułożenia myszy na jej grzbiecie.
  2. Ułóż mysz w pozycji leżącej na stole operacyjnym. Umieść nos myszy w masce anestezjologicznej podłączonej do zmodyfikowanego obwodu Baina z wewnętrzną rurką podłączoną do parownika izofluranu. Aby utrzymać znieczulenie, należy użyć 1-2% izofluranu w tlenie o natężeniu przepływu 1 l/min. Usuń nadmiar pary znieczulającej z myszy przez zewnętrzną rurkę maski i przeciągnij się przez kanister z węglem aktywnym, który pochłania nadmiar gazu znieczulającego.
  3. Po uzyskaniu pełnego znieczulenia wstrzyknij fentanyl w celu znieczulenia (0,1 μg/25 g masy ciała i.p.).
  4. Gdy odruch szczypania palców u nóg jest niewykrywalny, wykonaj wyraźne cięcie od żuchwy do spojenia za pomocą nożyczek tęczówki, aby usunąć sierść i skórę. Wykonaj kolejne cięcie od lewej do prawej pod żebrami za pomocą nożyczek do tęczówki, aby ostrożnie otworzyć brzuch.
  5. Żyj trochę mieczykowatym za pomocą zakrzywionych kleszczy, aby umożliwić przecięcie przepony od lewej do prawej bez uszkadzania jakichkolwiek narządów. Przetnij klatkę piersiową w przyśrodkowej linii pachowej po obu stronach za pomocą nożyczek do tęczówki, aby obrócić ją czaszkowo i umożliwić dostęp do serca.
  6. Przetnij żyłę główną dolną i aortę piersiową zstępującą na poziomie przepony za pomocą nożyczek do tęczówki. Nakłuć serce igłą 27 G w okolicy wierzchołka, a następnie ostrożnie wepchnąć igłę do lewej komory (LV). Delikatnie wstrzyknij 5-10 ml lodowatego PBS do lewej komory napowietrznej, aby perfować serce.
    UWAGA: Kolor serca powinien zmienić kolor z czerwonego na szary, co wskazuje na udaną perfuzję z PBS.
  7. Ostrożnie podnieś wierzchołek serca za pomocą pęsety, co pozwoli przeciąć duże naczynia i usunąć serce.
  8. Wyciąć serce, przecinając duże tętnice i żyły jak najdalej od serca, aby uniknąć uszkodzenia żyły głównej górnej (SVC). Zachowaj SVC, ponieważ będzie on służył jako ważny punkt orientacyjny podczas późniejszego przetwarzania.
  9. Po usunięciu serca wyłącz waporyzator izofluranu.
  10. Umieść serce w naczyniu separacyjnym wypełnionym lodowatym PBS pod mikroskopem preparacyjnym. Po określeniu lewej/prawej i przedniej/tylnej części serca, obróć serce tak, aby przód serca znajdował się na dnie naczynia (aby odsłonić duże naczynia, które znajdują się z tyłu).
  11. Unieruchomić serce, wkładając małe szpilki przez wierzchołek i uszek lewego przedsionka (LAA) do agarozy na dnie naczynia separacyjnego (Ryc. 2A). Za pomocą cienkiej pęsety i nożyczek ostrożnie usuń tkankę niesercową wokół SVC i żyły głównej dolnej (IVC) (np. płuca, tłuszcz, osierdzie), aby odsłonić obszar międzynawrotny (Rysunek 3A).
  12. Usuń większość komór, wycinając równolegle rowek między komorami a przedsionkami za pomocą mikronożyczek. Zachowaj niewielką część tkanki komorowej do późniejszego obciążenia pierścienia z pleksiglasu.
  13. W celu utrwalenia i odwodnienia umieścić próbkę (zawierającą przedsionki, SVC i IVC) w 4% PFA na noc w temperaturze 4 °C.
  14. Następnego dnia przenieść serce do 15% roztworu sacharozy na 24 godziny w temperaturze 4 °C.
  15. Następnego dnia przenieś serce do 30% roztworu sacharozy na 24 godziny w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W celu utrwalenia i odwodnienia w krokach 2.13, 2.14 i 2.15 próbki pozostawia się w temperaturze 4°C bez dalszego mieszania lub kołysania.

3. Barwienie immunofluorescencyjne w całości

  1. Umyć serce w 1% Triton X-100 rozcieńczonym w PBS i zablokować i przepuścić w roztworze blokującym (Tabela 1) przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Umieścić serce w probówce o pojemności 1,5 ml i inkubować z króliczymi przeciwciałami anty-mysim Connekina-43 (rozcieńczenie 1:200) i szczurzymi przeciwciałami anty-mysimi HCN4 (rozcieńczenie 1:200) rozcieńczonymi roztworem blokującym przez 7 dni w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Optymalne stężenie przeciwciał pierwszorzędowych należy przetestować przed użyciem arkuszy danych jako orientacji. Inne antygeny będące przedmiotem zainteresowania mogą być również barwione na tym etapie, o ile gatunek gospodarza antygenu pierwotnego różni się od pozostałych. Wyższe stężenie Triton X-100 może pomóc w uzyskaniu bardziej efektywnego barwienia przeciwciał, jak wykazano wcześniej10, ale stężenie może być ustalane indywidualnie.
  3. Po 7 dniach usunąć roztwór zawierający przeciwciała pierwszorzędowe za pomocą pipety i przemyć serce 1%roztworem Triton X-100 3 razy (za każdym razem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej).
  4. Po umyciu inkubować serce = z kozim anty-szczurzym IgG Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:200) i Alexa Fluor 647 kozie anty-królicze IgG (rozcieńczenie 1:200) przez 7 dni w temperaturze 4 °C.
  5. Po 7 dniach usunąć cały roztwór zawierający przeciwciała drugorzędowe za pomocą pipety. Następnie umyć serce roztworem myjącym (Tabela 1) 3 razy (za każdym razem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej).
  6. Aby wybarwić jądra, należy inkubować serce w roztworze DAPI (10 μg/ml) przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Następnego dnia przemyj serce roztworem myjącym 3 razy (za każdym razem przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej).
    UWAGA: W przypadku blokowania, przepuszczalności, inkubacji przeciwciał i barwienia DAPI w krokach 3.1, 3.2, 3.4 i 3.6, należy pozostawić próbki w stanie ustalonym w temperaturze 4 °C, nie jest wymagane mieszanie. Zabarwioną tkankę można było zakonserwować w pełni pokrytą roztworem myjącym w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem przez kilka dni, aż do zobrazowania w mikroskopie konfokalnym.

4. Mikroskopia konfokalna

  1. Przygotuj pierścienie z pleksiglasu i wypełnij plasteliną (Rysunek 1). W środku plasteliny w środku tworzy się mały rowek do ładowania serca. Wykonaj płytki rowek, ponieważ łatwiej będzie uzyskać płaską płaszczyznę obrazowania oraz dostosować przestrzeń i uniknąć pęcherzyków powietrza między próbką a szkiełkami nakrywkowymi w kroku 4.4.
  2. Użyj tej samej próbki serca do sekwencyjnego obrazowania zarówno SAN, jak i AVN. W przypadku obrazowania SAN należy bezpośrednio obciążyć serce, natomiast w przypadku obrazowania AVN należy wcześniej wykonać mikrodyfrakcję.
    1. Obrazowanie sieci SAN
      1. Zidentyfikuj SAN za pomocą anatomicznych punktów orientacyjnych: znajduje się po grzbietowej stronie serca w obszarze międzykawałkowym (obszar między żyłą główną górną i dolną). Crista terminalis (CT) to pasmo mięśniowe między SAN a RAA.
      2. Umieść serce w rowku z plasteliny tyłem serca skierowanym do góry. Dodaj PBS do serca, aby wyprzeć całe powietrze w jamie, aż serce zostanie całkowicie pokryte PBS (zwykle wystarczy kilka kropli PBS).
      3. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie wciśnij RAA, LAA i pozostałe części lewej komory do plasteliny, aby zamocować serce. Upewnij się, że cały obszar międzywałowy i crista terminalis są wyraźnie widoczne (nie są pokryte plasteliną). Obszar, który zostanie zobrazowany, jest pokazany w Rysunek 3A.
    2. Obrazowanie AVN
      1. Po zakończeniu obrazowania SAN należy pobrać tę samą próbkę, a następnie użyć jej do obrazowania AVN. W przypadku mikrodysekcji AVN umieść serce = na naczyniu separacyjnym pod mikroskopem preparacyjnym
        2. .
      2. Ustaw serce prawą stroną skierowaną do góry (w tym pozostałe części prawej komory). Przełóż szpilki przez pozostałą część wolnej ściany LV (która znajduje się teraz na dole), aby unieruchomić tkankę (Rysunek 2B).
      3. Przetnij pozostałą wolną ścianę RV w górę przez zastawkę trójdzielną i żyłę główną górną. Następnie odwróć RV i RA, aby odsłonić przegrodę międzykomorową i międzyprzedsionkową. (Rysunek 3B)
        UWAGA: Zwróć uwagę, aby nie uszkodzić zatoki wieńcowej (CS), ponieważ jest to ważny anatomiczny punkt orientacyjny, aby znaleźć trójkąt Kocha, który następnie pozwala zlokalizować AVN. CS biegnie poprzecznie w lewym rowku przedsionkowo-komorowym po tylnej stronie serca, a otwór otworu CS znajduje się między IVC a zastawką trójdzielną w dolnej części przegrody międzyprzedsionkowej (Ryc. 3A i B).
      4. Zidentyfikuj trójkąt Kocha, który znajduje się na powierzchni wsierdzia prawego przedsionka, otoczony z przodu linią zawiasów płatka przegrody zastawki trójdzielnej (TV), a z tyłu ścięgnem Todaro. Podstawę tworzy otwór zatoki wieńcowej (Ryc. 3B). Ponieważ jest to obszar docelowy dla obrazowania AVN, musi być wyraźnie widoczny.
      5. Przenieś serce do rowka z plasteliny w pierścieniu z pleksiglasu, tak aby trójkąt Kocha był wyraźnie odsłonięty (tj. nie był pokryty plasteliną). Delikatnie wciśnij tkankę wokół trójkąta Kocha w plastelinę, aby utrwalić próbkę. Dodaj PBS do serca, aby wyprzeć całe powietrze w jamie, aż serce zostanie całkowicie pokryte PBS (zwykle wystarczy kilka kropli PBS).
  3. Nałóż silikon na krawędzie pierścieni z pleksiglasu, aby umożliwić pokrycie serc załadowanych w pierścienie z pleksiglasu wypełnionych plasteliną szkiełkami nakrywkowymi.
  4. Delikatnie dociśnij tylną stronę plasteliny, aby wycisnąć części PBS i przymocować serce do szkiełka nakrywkowego, unikając pęcherzyków powietrza w obszarze obrazowania.
    UWAGA: Upewnij się, że obszary zainteresowania nie są zagięte i zakryte podczas naciskania tylnej strony plasteliny. Płaska płaszczyzna obrazowania bez nadmiernej kompresji próbki jest niezbędna do zachowania anatomii i prawidłowego obrazowania konfokalnego próbek. W przypadku SAN ważne jest, aby upewnić się, że obszar międzykasztowy jest wyraźnie odsłonięty. W przypadku AVN trójkąt Kocha powinien być w pełni odsłonięty.
  5. Połóż próbki barwiące z całą mocą do góry nogami na platformie mikroskopu konfokalnego. Odsłonięty SAN/AVN przymocowany do szkiełka nakrywkowego znajduje się teraz na spodzie platformy mikroskopu (Rysunek 4).
    UWAGA: Do robienia zdjęć używamy Carl Zeiss LSM800 z modułem Airyscan i oprogramowaniem ZEN 2.3 SP1 black.
  6. Wybierz płytkę "BP420-480 + LP605" do wzbudzenia sprzężonego anty-HCN4 Alexa Fluor 647. Zmień wzmocnienie główne w zakresie 650-750.
  7. Wykonaj obraz poglądowy całego regionu SAN i AVN za pomocą funkcji Tile Scan. Następnie wybierz region HCN4-dodatni, klikając i dodając kwadrat na obrazie przeglądowym wokół obszaru zainteresowania, który zostanie zeskanowany.
  8. Sprawdź parametry, w tym płytki i wzmocnienie główne dla pozostałych kanałów (Alexa, Fluor 488 i DAPI) mikroskopu konfokalnego i ustaw zgodnie z opisem w kroku 4.6.
  9. Powoli dostosuj ostrość od góry do dołu próbki, aby wyświetlić podgląd całej próbki i ustawić Pierwszy i Ostatni dla zakresu Z-stack. Ustaw optymalny interwał dla stosu Z w oparciu o grubość próbki optycznej. Używamy obiektywu 20x i 0,8-1 μm jako interwału dla stosu Z.
  10. Po prawidłowym ustawieniu wszystkich parametrów przeskanuj cały obszar sieci SAN i AVN.
  11. Wykonaj rekonstrukcję 3D obrazów za pomocą oprogramowania (np. Imaris w wersji 8.4.2).
    1. Wybierz opcję Przetwarzanie obrazów | Odejmowanie linii bazowej w celu usunięcia przebarwień tła.
    2. Wybierz tworzenie powierzchni do ustawienia dla wybranego kanału i obszaru zainteresowania do przetwarzania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego powyżej protokołu, obrazowanie mikroskopowe zarówno sieci SAN, jak i AVN może być niezawodnie wykonane. Specyficzne barwienie układu przewodzącego za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych skierowanych przeciwko HCN4 i barwienie pracującego mięśnia sercowego za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych skierowanych przeciwko Cx43 pozwala na wyraźną identyfikację SAN (Rysunek 5, Wideo 1) i AVN (Figura 6, Wide...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anatomia serca jest tradycyjnie badana przy użyciu cienkich skrawków histologicznych11. Metody te nie zachowują jednak trójwymiarowej struktury układu przewodzącego, a zatem dostarczają jedynie informacji 2D. Opisany tutaj protokół barwienia immunofluorescencyjnego pozwala przezwyciężyć te ograniczenia i może być rutynowo stosowany do obrazowania SAN i AVN.

W porównaniu ze standardowymi metodami, takimi jak konwencjonalna immunohistochemia, które wymagają zatapiania w p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Chińską Radę Stypendialną (CSC, do R. Xia), Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (DZHK; 81X2600255 do S. Clauss, 81Z0600206 do S. Kääb), Fundację Corona (S199/10079/2019 do S. Clauss), SFB 914 (projekt Z01 dla H. Ishikawa-Ankerhold i S. Massberg oraz projekt A10 dla C. Schulza), ERA-NET ds. Chorób Sercowo-Naczyniowych (ERA-CVD; 01KL1910 do S. Claussa) oraz Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (do S. Claussa). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System parownika Anesthesia
Isoflurane Hugo Sachs Elektronik34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910Zawiera komorę indukcyjną, jednostkę odprowadzającą gaz i filtry węglowe
Zmodyfikowany obwód BainaHugo Sachs Elektronik73-4860Zawiera maskę anestezjologiczną dla myszy
Platforma chirurgicznaKent ScientificSURGI-M
In vivo oprzyrządowanie
Szczypce do drobnych tkaninFine Science Tools11295-51
Nożyczki do tęczówkiFine Science Tools14084-08
Nożyczki sprężynoweFine Science Tools91500-09
Kleszczyki do tkanekFine Science Tools11051-10
Szpilki do tkanekFine Science Tools26007-01Można użyć igieł 27G jako substytutu
General lab instruments
Wytrząsarka orbitalnaSunlabD-8040
Mieszadło magnetyczneIKA Pipeta podstawowa
, pojemność 10 i mikro; L, 100 i mikro; L, 1000 i mikro; LMikroskopy EppendorfZ683884-1EA
Mikroskop
stereoskopowy stereoskopowy z zoomem VWR10836-004
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyZeissLSM 800
Software
Imaris 8.4.2Instrumenty
ZEN 2.3 SP1Zeiss
General Lab Materiał
0,2 &mikro; m filtr strzykawkowySartorius17597
100 mm szalka PetriegoFalcon351029
27G igłaBD Microlance 3300635
50 ml Polipropylenowa stożkowa rurkaFalcon352070
5ml StrzykawkaBraun4606108V
Szkiełka nakrywkoweThermo Scientific7632160
Eppendorf RurkiEppendorf30121872
Chemicals
0,5 M EDTASigma20-158Składniki TEA
16% roztwór formaldehyduThermo Scientific 28908Stosować jako 4% roztwór 
Kwas octowyMerck100063Składniki herbaty
AgarozaBiozym850070
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA2153-100G
DPBS (1X) Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoGibco14190-094
Normalna surowica koziaSigmaNS02L
SacharozaSigmaS1888-1kg
Tris-baseRocheTRIS-ROSkładniki TEA
Triton X-100SigmaT8787-250mlRozcieńczony do 1% w PBS
Tween 20SigmaP2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0,5  mg/10  mLBraun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mLCp-pharma31303
Tlen 5 LLinde2020175Zawiera regulator ciśnienia
Przeciwciała
Goat anty-Rabbit IgG Alexa Fluor  488 Technologia sygnalizacji komórkowej#4412rozcieńczony do 1:200
Kozia anty-szczurza IgG Alexa Fluor 647Invitrogen#A-21247rozcieńczony do 1:200
Hoechst 33342, Trichlorowodorek, Trójwodzian (DAPI)InvitrogenH3570rozcieńczony do 1:1000
Królik Anti-Connexin-43SigmaC6219rozcieńczony do 1:200
Szczurzy anty-HCN4 (SHG 1E5)InvitrogenMA3-903rozcieńczony do 1:200
Inne
pleksiSamodzielnie zaprojektowana i wydrukowana w 3D
plastelinaCernit49655005
Silikonpasten, BaysiloneVWR291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6Laboratorium
po prawej stronieOxfordPierścień z Jacksona

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  2. Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374(2020).
  3. Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  4. van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
  5. Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
  6. Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
  7. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
  8. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
  9. Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
  10. Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  11. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
  12. Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
  13. Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
  14. Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
  15. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
  16. Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
  17. Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
  18. Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
  19. Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664(2014).
  20. Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
  21. Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81(2013).
  22. van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 2/21/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

to:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

Tagi

Rekonstrukcja 3Dw ze zatokowo przedsionkowyserce myszyuk ad przewodz cy sercaprzeciwcia o HCN4koneksyna 43przeciwcia a fluorescencyjne

Powiązane artykuły