Udostępniamy krok po kroku protokół barwienia immunofluorescencyjnego całego węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN) i węzła przedsionkowo-komorowego (AVN) u mysich serc.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Barwienie immunofluorescencyjne w całości mount, obrazowanie konfokalne i rekonstrukcja 3D węzła zatokowo-przedsionkowego i przedsionkowo-komorowego u myszy
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Sygnał elektryczny fizjologicznie generowany przez komórki rozrusznika serca w węźle zatokowo-przedsionkowym (SAN) jest prowadzony przez system przewodzenia, który obejmuje węzeł przedsionkowo-komorowy (AVN), aby umożliwić pobudzenie i skurcz całego serca. Każda dysfunkcja SAN lub AVN prowadzi do arytmii, co wskazuje na ich fundamentalną rolę w elektrofizjologii i arytmogenezie. Modele mysie są szeroko stosowane w badaniach nad arytmią, ale konkretne badanie SAN i AVN pozostaje wyzwaniem.
SAN znajduje się na styku crista terminalis z żyłą główną górną, a AVN znajduje się na wierzchołku trójkąta Kocha, utworzonego przez otwór zatoki wieńcowej, pierścień trójdzielny i ścięgno Todaro. Jednak ze względu na niewielkie rozmiary, wizualizacja za pomocą konwencjonalnej histologii pozostaje wyzwaniem i nie pozwala na badanie sieci SAN i AVN w ich środowisku 3D.
Tutaj opisujemy podejście immunofluorescencyjne typu full-mount, które pozwala na lokalną wizualizację znakowanych mysich sieci SAN i AVN. Barwienie immunofluorescencyjne metodą całego montażu jest przeznaczone dla mniejszych odcinków tkanek bez potrzeby ręcznego cięcia. W tym celu serce myszy jest preparowane, usuwana jest niechciana tkanka, a następnie utrwalanie, przepuszczalność i blokowanie. Komórki układu przewodzącego w SAN i AVN są następnie barwione przeciwciałem anty-HCN4. Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa i przetwarzanie obrazu umożliwiają różnicowanie komórek węzłowych i pracujących kardiomiocytów oraz wyraźną lokalizację SAN i AVN. Co więcej, dodatkowe przeciwciała mogą być łączone w celu znakowania również innych typów komórek, takich jak włókna nerwowe.
W porównaniu z konwencjonalną immunohistologią, barwienie immunofluorescencyjne całej góry zachowuje anatomiczną integralność układu przewodzącego serca, umożliwiając tym samym badanie AVN; szczególnie w ich anatomii i interakcjach z otaczającymi pracującymi komórkami mięśnia sercowego i nie-miocytów.
Wprowadzenie
Arytmie są powszechnymi chorobami dotykającymi miliony ludzi i są przyczyną znacznej zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Pomimo ogromnych postępów w leczeniu i profilaktyce, takich jak rozwój rozruszników serca, leczenie zaburzeń rytmu serca pozostaje wyzwaniem, przede wszystkim ze względu na bardzo ograniczoną wiedzę na temat mechanizmów leżących u podstaw choroby1,2,3. Lepsze zrozumienie zarówno normalnej elektrofizjologii, jak i patofizjologii arytmii może pomóc w opracowaniu nowych, innowacyjnych i przyczynowych strategii leczenia w przyszłości. Dodatkowo, a....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opieka nad zwierzętami i wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komisji ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Monachium, a wszystkie procedury przeprowadzone na myszach zostały zatwierdzone przez Rząd Bawarii, Monachium, Niemcy (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Myszy C57BL6/J zakupiono w Jackson Laboratory.
UWAGA: Rysunek 1 pokazuje instrumenty potrzebne do eksperymentu. Rysunek 2 przedstawia ilustrację ogólnej anatomii serca.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Stosując opisany powyżej protokół, można niezawodnie przeprowadzić obrazowanie konfokalne zarówno węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN), jak i węzła przedsionkowo-komorowego (AVN). Specyficzne barwienie układu przewodzącego z użyciem przeciwciał fluorescencyjnych skierowanych przeciwko HCN4 oraz barwienie pracującego mięśnia sercowego z użyciem przeciwciał fluorescencyjnych skierowanych przeciwko Cx43 umożliwia jednoznaczną identyfikację SAN (Rycina 5,.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Anatomia serca jest tradycyjnie badana przy użyciu cienkich skrawków histologicznych11. Metody te nie zachowują jednak trójwymiarowej struktury układu przewodzącego, a zatem dostarczają jedynie informacji 2D. Opisany tutaj protokół barwienia immunofluorescencyjnego pozwala przezwyciężyć te ograniczenia i może być rutynowo stosowany do obrazowania SAN i AVN.
W porównaniu ze standardowymi metodami, takimi jak konwencjonalna immunohistochemia, które wymagają zatapiania w p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Chińską Radę Stypendialną (CSC, do R. Xia), Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (DZHK; 81X2600255 do S. Clauss, 81Z0600206 do S. Kääb), Fundację Corona (S199/10079/2019 do S. Clauss), SFB 914 (projekt Z01 dla H. Ishikawa-Ankerhold i S. Massberg oraz projekt A10 dla C. Schulza), ERA-NET ds. Chorób Sercowo-Naczyniowych (ERA-CVD; 01KL1910 do S. Claussa) oraz Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (do S. Claussa). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w przygotowaniu manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System parownika Anesthesia | |||
| Isoflurane | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Zawiera komorę indukcyjną, jednostkę odprowadzającą gaz i filtry węglowe |
| Zmodyfikowany obwód Baina | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Zawiera maskę anestezjologiczną dla myszy |
| Platforma chirurgiczna | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo oprzyrządowanie | |||
| Szczypce do drobnych tkanin | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Nożyczki do tęczówki | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Kleszczyki do tkanek | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Szpilki do tkanek | Fine Science Tools | 26007-01 | Można użyć igieł 27G jako substytutu |
| General lab instruments | |||
| Wytrząsarka orbitalna | Sunlab | D-8040 | |
| Mieszadło magnetyczne | IKA | Pipeta podstawowa | |
| , pojemność 10 i mikro; L, 100 i mikro; L, 1000 i mikro; L | Mikroskopy Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Mikroskop | |||
| stereoskopowy stereoskopowy z zoomem | VWR | 10836-004 | |
| Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Instrumenty | ||
| ZEN 2.3 SP1 | Zeiss | ||
| General Lab Materiał | |||
| 0,2 &mikro; m filtr strzykawkowy | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm szalka Petriego | Falcon | 351029 | |
| 27G igła | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polipropylenowa stożkowa rurka | Falcon | 352070 | |
| 5ml Strzykawka | Braun | 4606108V | |
| Szkiełka nakrywkowe | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Rurki | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0,5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Składniki TEA |
| 16% roztwór formaldehydu | Thermo Scientific | 28908 | Stosować jako 4% roztwór |
| Kwas octowy | Merck | 100063 | Składniki herbaty |
| Agaroza | Biozym | 850070 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco | Gibco | 14190-094 | |
| Normalna surowica kozia | Sigma | NS02L | |
| Sacharoza | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Składniki TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Rozcieńczony do 1% w PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0,5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Tlen 5 L | Linde | 2020175 | Zawiera regulator ciśnienia |
| Przeciwciała | |||
| Goat anty-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Technologia sygnalizacji komórkowej | #4412 | rozcieńczony do 1:200 |
| Kozia anty-szczurza IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | rozcieńczony do 1:200 |
| Hoechst 33342, Trichlorowodorek, Trójwodzian (DAPI) | Invitrogen | H3570 | rozcieńczony do 1:1000 |
| Królik Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | rozcieńczony do 1:200 |
| Szczurzy anty-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | rozcieńczony do 1:200 |
| Inne | |||
| pleksi | Samodzielnie zaprojektowana i wydrukowana w 3D | ||
| plastelina | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Laboratorium |
Bibliografia
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characte....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 2/21/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
