Artykuł metodologiczny

Zbieranie i identyfikacja pyłku z kolonii pszczół miodnych

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62064

⸱

19 stycznia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Horticulture, Oregon State University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metody zbierania pyłku sercowego od pszczół miodnych, a także protokoły sortowania kolorów, acetolizy i preparatu mikroskopowego pyłku do identyfikacji taksonomicznej. Ponadto prezentujemy barwę granulek i różnorodność taksonomiczną pyłku guzowatego zebranego z pięciu systemów upraw z wykorzystaniem pułapek pyłkowych.

Streszczenie

Badacze często zbierają i analizują pyłek od pszczół miodnych, aby zidentyfikować źródła roślin, na których zbierają pyłek lub oszacować narażenie pszczół na pestycydy za pomocą pyłku. Opisana w niniejszym dokumencie jest skuteczna metoda zatrzymywania pyłku do zbierania pyłku sercowego od pszczół miodnych powracających do uli. Ta metoda zbierania powoduje uzyskanie dużych ilości pyłku sercowego, który można wykorzystać do celów badawczych. Pszczoły miodne zbierają pyłek z wielu gatunków roślin, ale zazwyczaj odwiedzają jeden gatunek podczas każdej podróży zbiorczej. Dlatego każda granulka pyłku sercowego reprezentuje głównie jeden gatunek rośliny, a każdą pastylkę pyłku można opisać kolorem. Pozwala to na sortowanie próbek pyłku sercowego według koloru w celu segregacji źródeł roślinnych. Naukowcy mogą dalej klasyfikować pyłek korbomienny, analizując morfologię acetolizowanych ziaren pyłku w celu identyfikacji taksonomicznej. Metody te są powszechnie stosowane w badaniach związanych z zapylaczami, takich jak wydajność zapylania, dynamika żerowania zapylaczy, jakość diety i różnorodność. Przedstawiono szczegółowe metodologie zbierania pyłku sercowego za pomocą pułapek pyłkowych, sortowania pyłku według koloru i acetolizowania ziaren pyłku. Zaprezentowano również wyniki dotyczące częstości występowania kolorów granulek i taksonów pyłku guzowatego zbieranego od pszczół miodnych w pięciu różnych systemach upraw.

Wprowadzenie

Zachodnia pszczoła miodna (Apis mellifera L.) jest ważnym zapylaczem wielu upraw rolnych, które zależą od zapylania przez pszczoły1. Przez ponad dekadę odnotowano znaczne straty w koloniach pszczół miodnych2,3,4,5,6,7,8,9. Kilka czynników, w tym pasożyty i choroby, złe odżywianie i pestycydy, jest związanych z tym spadkiem liczby kolonii10. Złe odżywianie można przypisać intensyfikacji rolnictwa i utracie siedlisk żerowania11. Konieczne jest zrozumienie zasobów kwiatowych wykorzystywanych przez pszczoły w różnych krajobrazach w celu poprawy odżywiania pszczół i pomocy w wysiłkach na rzecz ochrony pszczół. Pyłek jest głównym źródłem białka, lipidów, witamin i minerałów dla pszczół i był wykorzystywany w wielu badaniach rolniczych i ekologicznych w celu zrozumienia preferencji pszczół miodnych w zakresie żerowania na poziomie kolonii, oceny wpływu zatrzymywania pyłku na kolonie pszczół miodnych i określenia narażenia pszczół na pestycydy12,13,14.

Pszczoły miodne zbierają pyłek z kwiatów, pakują pyłek w granulki na swoim corbicula - koszyczku pyłkowym piszczelowym na tylnej nodze - i wracają do kolonii w celu przechowywania. Pyłek sercowy można usunąć z zbieraczek, chwytając je przy wejściu do ula lub na kwiatach, krótko schładzając w celu unieruchomienia, a następnie usuwając granulki pyłku z tylnych nóg za pomocą kleszczy. Pracochłonny proces ręcznego zbierania pyłku korboidalnego od indywidualnie schwytanych zbieraczy jest powolny i nieefektywny, jeśli wymaga się znacznej ilości pyłku. Prostszą i bardziej wydajną metodą zbierania dużych ilości pyłku jest zatrzymywanie granulek pyłku z pszczół miodnych przy wejściach do ula. Pułapki pyłkowe są zaprojektowane tak, aby usuwać pyłek z nóg powracających zbieraczy pyłku, gdy wchodzą one do ula15. Zbieracze muszą przeciskać się przez otwory w siatce, które są tak małe, aby umożliwić przejście ciała robotnicy pszczoły miodnej.

Gdy pszczoła miodna przechodzi przez jedną z tych, większe granulki pyłku są zeskrobywane z jej nóg i wpadają do tacki na zbieranie16. Badania wykazały, że zatrzymywanie pyłku stymuluje zbieraczy do zbierania większej ilości pyłku, zwiększając w ten sposób efektywność zapylania okolicznych upraw i roślinności17,18,19,20. Metodologie zbierania pyłku mogą być również wykorzystane do zrozumienia paszy wykorzystywanej przez pszczoły miodne w krajobrazie jako pierwszy krok do określenia ilości, jakości i taksonów gatunków roślin kwitnących. Skuteczne metodologie wychwytywania pyłku ułatwiają zatem zarówno badania nad zapylaniem, jak i żywieniem pszczół miodnych. Porównanie tych metod zbierania pyłku przedstawiono w tabeli 1. Zachowanie związane z żerowaniem pyłku zmieni się w zależności od zapotrzebowania kolonii na przechowywany pyłek w stosunku do poziomu populacji jaj i larw21,22. Ponieważ zmiany te obejmują różną intensywność zbierania, często oczekuje się dużych różnic w ilości pyłku między koloniami w tym samym miejscu i między różnymi lokalizacjami tego samego systemu upraw lub krajobrazu type23,24. Zwiększenie liczby kolonii i miejsc do zatrzymywania pyłku pomoże dostosować się do tej różnorodności.

Pułapki pyłkowe różnią się skutecznością25,26. Wielkość granulek pyłku zbieranych przez pszczoły miodne różni się w zależności od gatunku rośliny i może się zmieniać w zależności od poziomu zapasów pyłku w kolonii27,28. Stwarza to możliwość, że mniejsze granulki pyłku mogą być niedostatecznie reprezentowane, a większe granulki mogą być nadreprezentowane w próbkach pobranych za pomocą pułapek pyłkowych. Dorosłe pszczoły różnią się wielkością ciała, co może również wpływać na reprezentację pyłku zebranego w pułapkach. Istnieją również gatunki roślin, które głównie wytwarzają nektar, który nie zostanie wykryty, jeśli tylko oceni zebrany pyłek w niektórych krajobrazach. Na skuteczność odłowu wpływa również dryf i dezorientacja zbieracza, na którą wpływ ma rodzaj pułapki na pyłki i stan wyposażenia ula. Problem ten można złagodzić, stosując techniki opisane w tym artykule. Badacze mogą rozważyć dodatkowe techniki badawcze, takie jak liczenie wizyt kwiatów przez zbieraczy, w celu uzupełnienia wyników preferencji żywieniowych na poziomie kolonii. Przydatną metodą oceny różnorodności pyłku jest sortowanie pyłku sercowego według koloru. Chociaż pszczoły miodne są ogólnymi zbieraczami, wykazują również wierność kwiatom, gdy zbierają pyłek z tych samych gatunków roślin w tym samym miejscu podczas każdej podróży zbiorczej. Opierając się na tym zachowaniu żerowania, zakłada się, że każda osadka pyłku jądrowego jest głównie reprezentowana przez pojedynczy gatunek rośliny 27,29,30,31. W związku z tym naukowcy mogą opisać różnorodność pyłku, sortując pyłek sercowy według koloru granulek i podając całkowitą liczbę wykrytych kolorów lub proporcję całkowitej liczby reprezentowanej przez każdą grupę kolorów12,32,33,34. Można to osiągnąć, mierząc masę lub liczbę granulek w każdej grupie kolorów. Pomiar liczby osadów w każdej grupie kolorystycznej jest sugerowany, jeśli znane lub podejrzewa się systematyczne różnice w masie granulek pochodzących od różnych taksonów. Różnice systematyczne mogą być spowodowane wielkością granulek lub ilością nektaru, który zbieracze dodają do pyłku podczas formowania osadu.

Sortowanie kolorów jest szybkim i prostym procesem, ale może nie mieć akceptowalnej dokładności dla niektórych badań nad zapylaniem, ponieważ różne taksony roślin mogą mieć podobne kolory granulek pyłku35,36. Dodatkowo istnieje logistyczne ograniczenie liczby różnych grup kolorystycznych, na które można podzielić granulki pyłku. W związku z tym rozdzielenie każdego pojedynczego pyłku taksonu roślin na jego własną, odrębną grupę kolorów granulek może nie zawsze być możliwe w badaniach zapylania. Charakterystyka morfologiczna ziaren pyłku za pomocą mikroskopii świetlnej często uzupełnia separację kolorów granulek poprzez rozróżnienie pyłku dwóch lub więcej taksonów w granulkach o tej samej grupie kolorystycznej. Chociaż często zdarza się, że ziarna pyłku wielu taksonów znajdują się w danej grupie kolorów granulek pyłku, pojedyncze granulki pyłku zebrane przez pszczołę miodną na ogół stanowią jeden dominujący takson, ewentualnie z innymi taksonami w niewielkich ilościach. W związku z tym często zakłada się wierność taksonomiczną w granulkach pyłku sercowego pszczół miodnych. Granulki pyłku innych zapylaczy, które nie wykazują zachowania wierności kwiatom, takich jak trzmiele, często zawierają wiele gatunków roślin i mogą nie posiadać dominującego taksonu. W przypadkach, w których pożądane jest ilościowe oszacowanie proporcji taksonów w wielokwiatowych granulkach pyłku, do prawidłowej analizy wymagane są dodatkowo metody mikroskopowe, które obejmują acetolizę.

Ocena cech morfologicznych acetolizowanych ziaren pyłku jest najczęstszą metodą identyfikacji taksonomicznej16. Procedura acetolizy usuwa protoplazmę ziarna pyłku, aby uwidocznić cechy diagnostyczne, które można zaobserwować pod mikroskopem świetlnym37,38. Korzystając z tej metody, badacze mogą raportować różne taksony, częstotliwość występowania taksonów w określonych systemach upraw oraz dominujące taksony o kolorach granulek33,36. Acetoliza jest najlepszą techniką analityczną pozwalającą na ujawnienie morfologii pyłku28. Jednak niektóre acetolizowane ziarna pyłku, takie jak wiele typów Rosaceae, nie mogą być zidentyfikowane na poziomie rodzaju lub gatunku za pomocą samej acetolizy i mikroskopii świetlnej. Naukowcy rozważają skaningową mikroskopię elektronową lub metabarcoding jako alternatywne metody identyfikacji na poziomie rodzaju lub gatunku. Te alternatywne metody zapewniają jednak jedynie jakościową identyfikację taksonów i nie pozwalają oszacować proporcji różnych taksonów ziaren pyłku w granulkach pyłku wielokwiatowego36,39. Ponadto koszt i niezbędna wiedza specjalistyczna są znacznie wyższe w przypadku tych metod. Porównanie tych metod identyfikacji przedstawiono w tabeli 1.

MetodyGodzinawydatekrezolucjaekspertyza
Kolekcja pyłków
Wychwytywanie pyłkówniskiumiarkowanyzmiennaumiarkowany
Zbieranie pyłkuwysokiumiarkowanywysokiniski
Identyfikacja pyłku
Wizualny (tylko sortowanie kolorów)umiarkowanyniskiniskiniski
Acetolizaumiarkowanyumiarkowanyumiarkowanyumiarkowany
Skaningowa mikroskopia elektronowawysokiwysokiwysokiwysoki
Metabarcoding (metabarcody)zmiennawysokiwysokiwysoki

Tabela 1: Porównanie różnych metod zbierania i identyfikacji pyłku w oparciu o czas, koszty, rozdzielczość i wiedzę. Metody wizualne (tylko sortowanie kolorów) podają całkowitą liczbę wykrytych kolorów lub proporcję sumy reprezentowaną przez każdą grupę kolorów jako metrykę do określania źródeł pyłku, ale nie zapewniają identyfikacji taksonów.

Dostępne informacje na temat wychwytywania i sortowania pyłków oraz acetolizowania ziaren pyłku są zróżnicowane i często rozproszone w wielu źródłach, różne dla badaczy z różnych dziedzin. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat różnych rodzajów pułapek pyłkowych, które mogą być wykorzystywane zarówno przez badaczy, jak i pszczelarzy do skutecznego zbierania dużych ilości pyłku cielesnego. Podano również protokoły przygotowania próbek pyłku - poprzez acetolizę, barwienie i montaż szkiełkowy - w celu identyfikacji taksonów roślin. Przedstawione tu metodologie są wszechstronne i służą jako unikalne źródło informacji na temat dominujących gatunków roślin, na których żerują pszczoły miodne w danym krajobrazie, w szczególności w systemach upraw. Zaprezentowano wyniki oparte na tych metodach z poprzedniego badania, które dokumentują różnorodność kolorów granulek pyłku i taksonów roślin z pyłku sercowego zebranego przez pszczoły miodne w pięciu systemach uprawy14.

Protokół

1. Zbieranie pyłku sercowatego z kolonii pszczół miodnych za pomocą pułapek pyłkowych

  1. Określ, kiedy należy zatrzymać pyłek z żądanej lokalizacji pasieki.
    UWAGA: Idealne warunki klimatyczne obejmują pełne nasłonecznienie, niską prędkość wiatru, niską wilgotność i brak prognozowanych opadów w pożądanym okresie zbierania pyłku.
  2. Wybierz optymalne rodziny pszczół miodnych do zatrzymywania pyłku w obrębie pasieki.
    1. Oceń siłę kolonii, licząc zbieraczki powracające do wejścia do kolonii przez 2 minuty. Wybierz kolonie z największą łączną liczbą powracających zbieraczek.
    2. Wybierz ule z drewnianymi naczyniami, które są w dobrym stanie, najlepiej bez dodatkowych wejść i wypaczonych pokryw. Używaj kolonii z mniejszą liczbą alternatywnych wejść, ponieważ zwiększają one prawdopodobieństwo, że powracający zbieracze zmienią orientację do wejścia do pułapki.
    3. Jeśli to możliwe, wybieraj wejścia do ula od strony południowej. Jeśli ule są paletyzowane, zainstaluj pułapki na pyłki na każdej kolonii skierowanej w tym samym kierunku na danej palecie, aby uniknąć dryfu zbieraczy do sąsiednich wejść do ula.
    4. W razie potrzeby oceń gniazdo lęgowe kolonii, sprawdzając ramki pod kątem obecności larw. Wybierz kolonie ze stosunkowo dużą ilością larw.
  3. Zainstaluj pułapki pyłkowe na wybranych rodzinach pszczół miodnych.
    UWAGA: Instalacja będzie się różnić w zależności od rodzaju łapacza pyłków. Typy obejmują a) montaż z przodu, b) montaż z tyłu, c) montaż z góry lub d) montaż wejściowy z otworem ślimakowym. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji dyskusji.
    1. W przypadku pułapek montowanych z przodu przymocuj pułapkę przed wejściem za pomocą zszywek, i taśmy lub podłącz pułapkę do linek bungee owiniętych wokół ula. W przypadku pułapek montowanych od dołu umieść pułapkę pod najniższą skrzynką ula i zamocuj wejście pułapki w pobliżu oryginalnego wejścia. W przypadku pułapek montowanych na otworze ślimakowym przymocuj pułapkę bezpośrednio przed otworem ślimaka w skrzynce ula za pomocą zszywek, i taśmy. W przypadku pułapek montowanych od góry umieść pułapkę nad najwyższą skrzynką ula i poniżej pokrywy.
  4. Uszczelnij wszystkie inne możliwe wejścia do kolonii za pomocą nieprzylepnego i nadającego się do formowania materiału, takiego jak lateks lub pianka poliuretanowa lub tkanina sprzętowa #8 (otwór 2.7 mm) do otworów świdra. Użyj taśmy klejącej do małych pęknięć.
  5. Jeśli używasz syfonów montowanych z przodu, umieść barierę, taką jak gumowa mata, między koszem zbiorczym a trawą, aby uniknąć uszkodzenia przez wilgoć spowodowaną rosą.
  6. Włączyć mechanizm wychwytywania łapacza pyłku 24 godziny po zainstalowaniu i przed rozpoczęciem dziennego lotu w poszukiwaniu żerowania (późnym wieczorem/wczesnym rankiem).
    UWAGA: Ten krok jest idealny, ale nie jest konieczny. Angażuj pułapki pyłkowe co drugi tydzień, jeśli zatrzymujesz pyłek na tych samych koloniach przez dany okres.
  7. Zbierz pyłek sercowy z tacki zbiorczej, umieść go w plastikowych torebkach lub probówkach wirówkowych i przechowuj w lodówce z lodem.
    1. Aby ocenić różnorodność i liczebność gatunków pyłku, np. badania odżywiania na poziomie krajobrazu, zbierz pyłek w dwóch lub trzech odstępach 72 godzin40.
    2. Do analizy pozostałości pestycydów należy zbierać pyłek w odstępach od 24 do 96 godzin, z minimalną ilością 3 g dla processingu41.
  8. Oczyść pyłek, usuwając części pszczół i inne zanieczyszczenia z ula.
    UWAGA: Podczas pracy z próbkami pyłku należy używać rękawiczek jednorazowych i wymieniać rękawiczki jednorazowe między próbkami. Użyj oddzielnych narzędzi, aby usunąć zanieczyszczenia z pyłku zebranego w każdej pułapce. Spłucz i wysusz przed użyciem narzędzi do kolejnej partii uwięzionego pyłku.
  9. Pyłek należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub niższej, aby zachować jego integralność składową, jeśli pyłek jest przeznaczony do identyfikacji źródła pyłku, oceny ilości lub analizy pozostałości pestycydów41,42.
  10. Po wyjęciu pułapek z uli wysterylizuj cały sprzęt w 5% roztworze wybielacza, spłucz i wysusz sprzęt przed następnym użyciem.

2. Sortowanie koloru granulek pyłku w celu identyfikacji źródła pyłku i oceny ilości

  1. Upewnij się, że jest co najmniej 20 g próbki pyłku do pracy. Dokładnie wymieszać próbkę pyłku w worku lub innym pojemniku o odpowiedniej wielkości, aby uzyskać jednorodną mieszaninę wszystkich zawartych w niej granulek. Aby uniknąć niezamierzonej stronniczości w następnym kroku, przed usunięciem podpróbki z worka na próbkę należy zasłonić kompozycję kolorystyczną próbki.
  2. Za pomocą szufelki lub dużej łyżki należy pobrać 10 g pyłku jako reprezentatywną podpróbkę całości. Powoli wysypuj pelety ze szufelki na wagę, aż na wyświetlaczu pojawi się 10 g. Jeśli pierwsza miarka nie była wystarczająco duża, pobierz kolejną miarkę z próbki w ten sam sposób.
    UWAGA: Te określone wymagania dotyczące wagi (20 g i 10 g) służą tylko jako examples. Badacze powinni dostosować ilość pyłku używanego na każdym etapie odpowiednio do konkretnych potrzeb.
  3. Usunąć wszystkie części pszczół i inne zanieczyszczenia z podpróbki o masie 10 g. Następnie, jeśli to konieczne, dodać nieco więcej pyłku z oryginalnej próbki, aby uzyskać łączną masę 10 g podpróbki.
  4. Posortuj każdą granulkę pyłku z podpróbki 10 g według grupy kolorów. Użyj zarówno koloru pyłku, jak i tekstury, aby rozróżnić grupy kolorów.
    UWAGA: Spodziewane są pewne różnice w obrębie grupy, ale użycie wzornika kolorów Pantone podczas sortowania może zwiększyć spójność.
  5. Aby zapewnić co najmniej 0,25 g każdej grupy kolorów dla dalszych etapów, umieść wszelkie granulki, które nie są wystarczająco obfite, aby utworzyć grupę kolorów o wadze co najmniej 0,25 g, w różnej grupie. Nazwij każdą pojedynczą grupę kolorów, korzystając z wzornika kolorów Pantone. Oznacz grupę różne różne.
  6. Zważ każdą grupę kolorów na osobnym bibułce wagowej i/lub policz liczbę granulek w każdej grupie kolorów. Zapisz nazwy grup kolorów i wagi lub liczby w arkuszu danych.
    UWAGA: Wybór, czy zważyć, czy policzyć liczbę granulek w każdej grupie kolorów, zależy od metryki zainteresowań badacza i celów projektu.
  7. Utwórz etykietę probówki do mikrowirówki dla każdej grupy kolorów, używając odpornego na rozpuszczalniki pisaka i samoprzylepnych etykiet na probówki papierowe. Na etykiecie należy podać bieżącą datę, identyfikator próbki, datę pobrania próbki i numer grupy kolorów. Nałóż etykiety na czyste, suche probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml.
  8. Odważyć 0,25 g (± 0,05 g) granulek pyłku z każdej grupy kolorów i umieścić tę ilość w odpowiednio oznakowanej probówce do mikrowirówki.
    UWAGA: W przypadku niewielkich różnic w kolorze lub teksturze pyłku danej grupy kolorystycznej, należy upewnić się, że w każdej probówce znajduje się reprezentatywna próbka granulek. Następujące po sobie objętości odczynnika oraz czasy inkubacji i wirowania są odpowiednie dla 0,25 g pyłku. Dlatego należy użyć tej ilości pyłku w probówkach do mikrowirówek, która ma być stosowana w acetolizie. Protokół ten powinien zapewnić obfitość, wybarwionego pyłku do identyfikacji dalszych źródeł roślinnych za pomocą mikroskopii świetlnej. W przypadku stosowania innej ilości pyłku w acetolizie, należy odpowiednio dostosować specyfikę objętości odczynnika i czasu przetwarzania.
  9. Umieść pozostały pyłek z każdej grupy kolorów w osobnych plastikowych torebkach (po jednym woreczku na kolor) oznaczonych nazwą grupy kolorów. Worki te należy przechowywać wraz z innymi częściami odpowiedniej oryginalnej próbki w temperaturze -20 °C.
  10. Dokładnie wymieszaj pyłek w tubie czystą drewnianą wykałaczką przez 10 do 15 s.

3. Przygotowanie do acetolizy

  1. Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek części acetolizy po raz pierwszy należy skontaktować się z działem zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego (EHS) wyznaczonej instytucji w celu uzyskania instrukcji dotyczących postępowania z odczynnikami i odpadami związanymi z acetolizą.
  2. Otrzymać roztwory podstawowe następujących odczynników i umieścić je w dygestoriach zgodnie z wytycznymi EHS dotyczącymi przechowywania chemikaliów: 95% etanol, woda destylowana, lodowaty kwas octowy, bezwodny, stężony kwas siarkowy, gliceryna i bezbarwny lakier do paznokci.
  3. Przygotować roztwory podstawowe następujących odczynników i umieścić je w dygestoriach zgodnie z wytycznymi EHS dotyczącymi przechowywania chemikaliów: nasycony wodorowęglan sodu (8% m/v roztwór w wodzie destylowanej) i safranina O (1% m/v roztwór w 50% etanolu).

4. Acetoliza

  1. Wykonaj procedurę przed acetolizą płukania lodowatym kwasem octowym. Wykonaj następujące czynności w dygestoriach w fartuchu laboratoryjnym, okularach ochronnych i rękawicach nitrylowych.
    1. Włącz blok grzewczy na 80 °C.
      UWAGA: Upewnij się, że wyciśnięta butelka nasyconego wodorowęglanu sodu jest łatwo dostępna. Można to wykorzystać do neutralizacji rozlanych kwasów w dygestorium, jeśli takie wystąpią.
    2. Oznaczyć jedną szklaną zlewkę na odpady kwasowe, jedną na odpady etanolu i jedną na mieszaninę acetolizy.
    3. Korzystając z wcześniej przygotowanych roztworów podstawowych, utwórz robocze porcje następujących odczynników w oznakowanych, odpowiedniej wielkości szklanych zlewkach: ~23,0 ml lodowatego kwasu octowego; ~33,0 ml wody destylowanej; ~23,0 ml 95% etanolu; ~25,0 ml wodorowęglanu sodu (dla odpadów stałych zanieczyszczonych kwasem).
      UWAGA: Są to objętości wymagane do wykonania następujących procedur acetolizy na łącznie 10 próbkach grup kolorów (10 probówek mikrowirówek).
    4. Powoli dodawać 500 μl lodowatego kwasu octowego do każdej probówki mikrowirówki zawierającej 0,25 g pyłku z grupy kolorów. Podczas oględzin rurki mieszaj pyłek czystą wykałaczką przez 10-15 s i upewnij się, że zawartość probówki jest dokładnie wymieszana. Po użyciu umieść zużytą wykałaczkę w zlewce na odpady wodorowęglanu sodu; Powtórz ten proces dla każdej tuby.
      UWAGA: Użyj czystej, nowej wykałaczki do każdej tubki. Upewnij się, że wieczko każdej probówki jest szczelnie zamknięte.
    5. Odwirować próbki przez 3 minuty przy masie 1 100 × g. Zdekantować sklarowany osad z probówek do zlewki na odpady kwasu. Następnie delikatnie i krótko dotknij otwartego wylotu tubki czystym ręcznikiem papierowym, aby usunąć resztki lodowatego kwasu octowego wokół krawędzi tubki.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie stracić osadu pyłku podczas dekantacji supernatantów.
  2. Wykonaj procedurę acetolizy.
    UWAGA: Wykonaj następujące czynności w dygestoriach w fartuchu laboratoryjnym, okularach ochronnych i rękawicach z butylu winylowego.
    1. Przygotować mieszaninę acetolizy (lodowaty kwas octowy w stosunku 9:1: kwas siarkowy), dodając najpierw 10,8 ml lodowatego kwasu octowego (z podwielokrotności roboczej) do mieszaniny acetolizy znakowanej zlewką. Następnie, używając pipety o pojemności 1000 μl wyposażonej w 1250 μl przefiltrowanych końcówek do pipet, powoli dodać 1200 μl (1,2 ml) stężonego kwasu siarkowego z roztworu podstawowego do zlewki mieszaniny acetolizy zawierającej lodowaty kwas octowy. Wyrzuć zużytą końcówkę pipety do zlewki z wodorowęglanem sodu.
      UWAGA: Zlewka z mieszaniną acetolizy może stać się ciepła w dotyku, a mieszanina może zmienić kolor na żółty. Istnieją dwie możliwości, które powodują, że mieszanina zmienia kolor na ciemny: (a) odczynniki mogą być już po upływie daty ważności lub (b) dodano zbyt dużo kwasu siarkowego. W każdym razie, jeśli mieszanina stanie się ciemna, wyrzuć ją do zlewki na odpady kwasu i przygotuj świeżą mieszaninę acetolizy.
    2. Delikatnie wymieszaj mieszaninę acetolizy szklanym prętem lub drewnianym patyczkiem do mieszania, aby upewnić się, że jest homogenizowana. Umieść zużyty pręt/pałeczkę w zlewce z wodorowęglanem sodu.
    3. Używając pipety o pojemności 1000 μl z przefiltrowanymi końcówkami pipet o pojemności 1250 μl, powoli dodaj 1000 μl mieszaniny acetolizy ze zlewki do każdej probówki. Podczas oględzin probówki mieszaj czystą wykałaczką przez 10-15 s i upewnij się, że zawartość probówki jest dokładnie wymieszana. Po użyciu umieść zużytą wykałaczkę w zlewce na odpady z wodorowęglanu sodu.
      UWAGA: Użyj czystej, nowej wykałaczki do każdej próbki.
    4. Umieścić próbki na podgrzanym (80 °C) bloku grzewczym. Inkubuj probówki przez 5 minut, dokładnie mieszając każdą probówkę czystą wykałaczką w połowie inkubacji. Po użyciu umieść każdą zużytą wykałaczkę w zlewce z wodorowęglanem sodu.
      UWAGA: Nie zostawiaj wykałaczek w próbkach; Kwas je rozpuści.
  3. Wykonać procedurę mycia po acetolizie lodowatym kwasem octowym.
    UWAGA: Wykonaj następujące czynności w dygestoriach w fartuchu laboratoryjnym, ochronie oczu i rękawicach z butylu winylowego.
    1. Powoli dodawać 500 μl lodowatego kwasu octowego do każdej probówki. Podczas oględzin probówki mieszaj czystą wykałaczką przez 10-15 s i upewnij się, że zawartość probówki jest dokładnie wymieszana. Po użyciu umieść zużytą wykałaczkę w zlewce z wodorowęglanem sodu.
      UWAGA: Użyj czystej, nowej wykałaczki do każdej próbki. Upewnij się, że wieczko każdej probówki jest szczelnie zamknięte.
    2. Odwirować próbki przez 3 minuty przy masie 1 100 × g. Zdekantować sklarowany osad z każdej probówki do zlewki na odpady z kwasem. Następnie delikatnie i krótko dotknij otwartego wylotu tubki czystym ręcznikiem papierowym, aby usunąć resztki kwasu wokół krawędzi tubki.
    3. Dokładnie opłucz rękawice butylowo-winylowe pod bieżącą wodą przez co najmniej 30 s, zdejmij je i pozostaw do wyschnięcia.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z wytycznymi producenta dotyczącymi ponownego użycia rękawic z butylu winylowego.
  4. Wykonać trzy płukania wodą dla każdej próbki. Wykonaj następujące czynności w dygestoriach w fartuchu laboratoryjnym, okularach ochronnych i rękawicach nitrylowych.
    1. Do każdej probówki dodać 1000 μl wody destylowanej ze zlewki z wodą destylowaną. Podczas oględzin probówki mieszaj czystą wykałaczką przez 10-15 s i upewnij się, że zawartość probówki jest dokładnie wymieszana. Po użyciu umieść wykałaczkę w zlewce na odpady wodorowęglanu sodu.
      UWAGA: Użyj czystej, nowej wykałaczki do każdej próbki. Upewnij się, że wieczko każdej probówki jest szczelnie zamknięte.
    2. Odwirować próbki przez 3 minuty przy masie 1 100 × g. Zdekantować sklarowany osad z probówek do zlewki z wodorowęglanem sodu. Następnie delikatnie dotknij otwartego wylotu rurki czystym ręcznikiem papierowym, aby usunąć resztki wody wokół krawędzi tuby.
    3. Powtórzyć kroki 4.4.1-4.4.2 jeszcze dwa razy, co daje w sumie trzy płukania wodą.
  5. Przeprowadzić płukanie etanolem dla każdej próbki.
    UWAGA: Wykonaj następujące czynności w dygestoriach w fartuchu laboratoryjnym, okularach ochronnych i rękawicach nitrylowych.
    1. Używając pipety o pojemności 1000 μl z przefiltrowanymi końcówkami pipet o pojemności 1250 μl, dodaj 1000 μl 95% etanolu ze zlewki na etanol do każdej probówki. Wyrzuć końcówkę pipety do odpadów innych niż niebezpieczne. Podczas oględzin probówki mieszaj czystą wykałaczką przez 10-15 s i upewnij się, że zawartość probówki jest dokładnie wymieszana.
      UWAGA: Po użyciu umieść wykałaczkę w zlewce na odpady wodorowęglanu sodu. Użyj czystej, nowej wykałaczki do każdej próbki. Upewnij się, że wieczko każdej probówki jest szczelnie zamknięte.
    2. Odwirować próbki przez 3 minuty przy masie 1 100 × g. Zdekantować supernatant z probówek do zlewki na odpady etanolu i delikatnie dotknąć otwartego otworu probówki czystym ręcznikiem papierowym, aby usunąć resztki etanolu z probówki.
  6. Nosić fartuch laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice nitrylowe do barwienia próbek. Wymieszać roztwór podstawowy barwnika Safranin O, stosując delikatną inwersję.
    1. Za pomocą jednorazowej, plastikowej pipety transferowej dodaj 5-10 kropli barwnika Safranin O do każdej probówki. Podczas oględzin probówki mieszaj czystą wykałaczką przez 10-15 s i upewnij się, że zawartość probówki jest dokładnie wymieszana. Zostaw wykałaczkę w tubce.
    2. Używając pipety o pojemności 1000 μl z przefiltrowanymi końcówkami pipet o pojemności 1250 μl, dodaj 1000 μl 95% etanolu ze zlewki na etanol do każdej probówki. Wyrzuć końcówkę pipety do odpadów innych niż niebezpieczne. Podczas oględzin probówki mieszaj wykałaczką przez 10-15 s i upewnij się, że zawartość probówki jest dokładnie wymieszana. Po użyciu umieść zużytą wykałaczkę w odpadach innych niż niebezpieczne.
    3. Upewnij się, że wieczko każdej probówki jest szczelnie zamknięte. Wirować przez 3 minuty przy 1 100 × g. Zdekantować sklarowany osad do zlewki na odpady etanolu.
      UWAGA: Tym razem nie dotykaj wylotu tubki ręcznikiem papierowym.
    4. Dodaj 10-15 kropli gliceryny do każdej probówki za pomocą plastikowej jednorazowej pipety do przenoszenia. Podczas oględzin probówki mieszaj zawartość probówki czystą wykałaczką przez 10-15 s i upewnij się, że zawartość probówki jest dokładnie wymieszana.
      UWAGA: Po użyciu umieść zużytą wykałaczkę w odpadach innych niż niebezpieczne. Użyj czystej, nowej wykałaczki do każdej próbki. Upewnij się, że wszystkie etykiety tub są czytelne.
  7. Pozostaw otwarte rurki w dygestorium, aby odparowywać etanol przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej. Sprawdź próbki pod kątem zapachu etanolu: jeśli jest on wykrywalny, próbki nie są gotowe i należy je pozostawić do wyschnięcia, aż zapach etanolu zniknie.
  8. Oczyść wszystkie materiały i wyrzuć odpady. Wyłącz zarówno wirówkę, jak i blok grzewczy. Wszystkie odpady stałe i płynne należy utylizować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ochrony środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa wyznaczonej instytucji.
  9. Przygotować preparaty mikroskopowe do identyfikacji pyłków, oznaczyć je czytelnie. Oznacz czysty szklany szkiełko mikroskopu odpowiednio dla każdej grupy kolorów/próbki, która zostanie zamontowana. Podczas oględzin probówki mieszaj próbkę czystą wykałaczką przez 10-15 s i upewnij się, że zawartość probówki jest dokładnie wymieszana.
    UWAGA: Przygotowanie preparatów można wykonać na stole laboratoryjnym. Wyrzuć wykałaczkę do odpadów innych niż niebezpieczne. Użyj czystej, nowej wykałaczki do każdej próbki.
    1. Za pomocą czystej, jednorazowej plastikowej pipety transferowej usuń 1 kroplę pozostałości pyłku z probówki i umieść ją na środku oznakowanego szkiełka mikroskopowego. Pozwól, aby kropla lekko się rozprowadziła. Umieść czyste szkiełko nakrywkowe na kropli na szkiełku.
    2. Po wyschnięciu szkiełka przyklej szkiełko nakrywkowe do szkiełka bezbarwnym lakierem do paznokci. Umieść małą kroplę pasty na każdym rogu szkiełka nakrywkowego i pomaluj obwódkę pasty na obwodzie szkiełka nakrywkowego, w miejscu, w którym styka się ze szkiełkiem. Poczekaj, aż lakier do paznokci całkowicie wyschnie i pomaluj drugą warstwę lakieru na obwodzie szkiełka nakrywkowego.

Wyniki

W poprzednim badaniu przedstawiono ocenę różnorodności pyłku zbieranego przez pszczoły miodne z następujących upraw rolniczych: migdałowca, wiśni, borówki wysokiej, marchwi hybrydowej oraz pianki łąkowej14. Z zastosowaniem opisanych metod zebrano pyłek z koszyczków, posortowano go według koloru, a następnie zidentyfikowano roślinne źródła każdej grupy kolorystycznej granul, aby ocenić różnorodność pyłku. Pułapki pyłkowe montowane od dołu zainstalowano w rodzinach pszczelich w wielu lokalizacjach dla każdej uprawy (Rycina 1A). Ilość pyłku zebranego z każdej lokalizacji była wystarczająca, aby spełnić wymagania dotyczące masy próbek dla metod sortowania kolorystycznego i analizy acetolizy. Każda próbka zebranego pyłku zawierała kilka rozróżnialnych grup kolorystycznych (Rycina 2 oraz Rycina 3). W niektórych próbkach grupy kolorystyczne pyłku zawierały zaledwie 4-5 granul; jednak większość grup posiadała znacznie więcej, przez co stanowiły one osobną, oznakowaną grupę kolorystyczną do acetolizy (Rycina 4 oraz Rycina 5). Po przeprowadzeniu acetolizy (Rycina 6) zastosowano mikroskopię świetlną w polu jasnym, aby skutecznie zidentyfikować każdą grupę kolorystyczną do najniższego możliwego stopnia taksonomicznego, potwierdzając cechy morfologiczne z okazami referencyjnymi zebranymi z obszaru wokół każdego miejsca badania (Rycina 7).

Porównanie konfiguracji uli; schemat systemów wentylacyjnych A, B, C; badanie zachowania kolonii.
Rysunek 1Pułapki pyłkowe zainstalowane w rodzinie pszczelarskiej w celu zbierania pyłku z koszyczków. (APułapki montowane od dołu, umieszczone nad dnem ula i bezpośrednio nad najniższym korpusem ula. Inne rodzaje pułapek na pyłek obejmują (B) montaż przedni i (Cpułapki z wejściem w postaci otworu świdrowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Pszczoły oddziałujące na siatce drucianej w badaniu zachowania pszczół, koncentrującym się na komunikacji i dynamice ula.
Rysunek 2: Mechanizm przechwytujący i taca zbiorcza pułapki pyłkowej. Powracające pszczoły zbieraczki pyłku muszą przecisnąć się przez siatkowy mechanizm przechwytujący, zanim dotrą do swojego ula. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Konfiguracja pułapki na pyłek pszczeli; metoda zbierania z ula; eksperyment pszczelarski; zrównoważone pszczelarstwo.
Rysunek 3: Tacka zbiorcza pułapki na pyłek. Pyłek korbikularny jest zgarniany z nóg powracających pszczół zbieraczek przez pułapkę na pyłek i wpada do tacki zbiorczej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment porównawczy kolorów; wzornik Pantone i nasiona w szalce Petriego, zestaw do precyzyjnych pomiarów.
Rysunek 4: Sortowanie próbki pyłku korbिकुलरnego na grupy kolorystyczne. Pyłek korbिकुलरny można wysuszyć i zważyć po posortowaniu na grupy kolorystyczne, aby określić proporcje zebranych granulek różnych kolorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Eksperyment analizy kolorystycznej z czterema próbkami na paskach Pantone w szalkach Petriego.
Rysunek 5: Cztery grupy peletek pyłku posortowane według koloru przy użyciu przewodnika kolorów Pantone. Grupy kolorystyczne zostały oznaczone jako (A) szary, Pantone 5855C, (B) brązowy, Pantone 7557C, (C) żółty, Pantone 458C oraz (D) jasnobrązowy, Pantone 3547C. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Ustawienie stanowiska laboratoryjnego z pipetami, kolbami i butelkami do eksperymentów i analiz chemicznych.
Rysunek 6: Konfiguracja sprzętu do acetolizy wewnątrz dygestorium. Blok grzejny, odczynniki, pojemniki na odpady rozpuszczalnikowe i kwasowe, opisane zlewki, pipeta, końcówki do pipety, mieszadełka i probówki do mikrocentryfug znajdujące się wewnątrz dygestorium. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Obserwacja krwinek czerwonych, obraz mikroskopowy; biologia komórki, badanie hematologiczne.
Rysunek 7: Mikrografia barwionych, acetolizowanych ziaren pyłku. Wiele ścianek acetolizowanych ziaren pyłku gorczycy (Brassicaceae) przy powiększeniu 40x. Pasek skali = 50,398 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Pyłek zebrany z obszarów upraw migdałowca charakteryzował się stosunkowo niższą różnorodnością niż pyłek z innych upraw, ze średnią wynoszącą 3,0 ± 0,5 kolorów granulek oraz 3,2 ± 1,2 taksonów roślin na stanowisko (Tabela 2)14. Pozostałe cztery systemy upraw wykazywały wyższe poziomy różnorodności pyłku, ze średnią 6,0 ± 2,0 kolorów granulek i 8,0 ± 1,5 taksonów roślin na stanowisko w przypadku wiśni, 8,8 ± 1,4 kolorów granulek i 13,5 ± 2,0 taksonów roślin na stanowisko w przypadku borówki wysokiej, 7,0 ± 1,0 kolorów granulek i 11,0 ± 0,0 taksonów roślin na stanowisko w przypadku marchwi hybrydowej oraz 10,0 ± 0,0 kolorów granulek i 13,0 ± 1,5 taksonów roślin na stanowisko w przypadku pianki łąkowej14.

KadrowanieŚrednia liczba kolorów granulek pyłku na stanowisko (SE)Średnia liczba taksonów roślin na stanowisko (SE)Całkowita liczba zidentyfikowanych taksonów
RodzinaRodzajGatunki
Migdał3.0 (0.5)3.2 (1.2)434
Borówka amerykańska8.8 (1.4)13.5 (2.0)51013
Marchew7.0 (1.0)11.0 (0.0)356
Wiśnia6.0 (2.0)8.0 (1.5)475
limnanorys10.0 (0.0)13.0 (1.5)5414

Tabela 2: Różnorodność pyłku w koszyczkach zebranych od pszczół miodnych w pięciu systemach upraw. Metryki różnorodności obejmują średnią liczbę kolorów grudek pyłku (± SE), średnią liczbę taksonów roślin (± SE) oraz całkowitą liczbę zidentyfikowanych taksonów. Tabela została zmodyfikowana na podstawie źródła14. Skrót: SE = błąd standardowy.

Dyskusja

Różne style pułapek pyłkowych mają swoje zalety i konsekwencje. Poniżej omówiono zalety i ograniczenia czterech powszechnie stosowanych typów pułapek: (1) montowanych z przodu, (2) montowanych na dole, (3) z otworem ślimakowym i (4) z górnymi pułapkami. Pułapki montowane z przodu są najbardziej uniwersalnym stylem (rysunek 1B). Instalacja jest szybka i łatwa; Można to zrobić bez podnoszenia skrzynek ula, a te pułapki mogą pasować do każdego stylu wyposażenia ula Langstroth. Ponieważ taca zbiorcza znajduje się przed kolonią, zbiera minimalną ilość zanieczyszczeń z kolonii. Jednak taca zbiorcza jest również bardziej narażona na działanie czynników zewnętrznych - wilgoci z nawadniania pola, deszczowej lub wilgotnej pogody lub rosy może wejść w kontakt z pyłkiem przez tacę zbiorczą, potencjalnie czyniąc pyłek bezużytecznym, jeśli granulki staną się zbyt nasycone, aby je oddzielić. Ryzyko nasycenia pyłkiem można zmniejszyć, unikając pułapek podczas prognozowanych opadów deszczu lub wysokiej wilgotności. Umieszczenie gumowej maty pod pułapką i dodatkowego materiału pokrywającego (np. papy dachowej) na wierzchu łapacza pyłków może również chronić tacę zbierającą przed warunkami atmosferycznymi.

Do zbierania pyłku użyto pułapek montowanych od dołu dla danych w tym artykule (Rysunek 1A). Nie są tak wygodne w instalacji, ponieważ muszą być umieszczone pod gniazdem lęgowym kolonii. Instalacja jest czasochłonna i powoduje, że do pułapki wpada duża ilość zanieczyszczeń z kolonii, takich jak części pszczół i małe kawałki wosku. Podłoga tacki zbiorczej dla większości produkowanych syfonów montowanych od dołu wykonana jest z drobnej siatki, która umożliwia odpowiednią wentylację w celu ochrony zebranego pyłku przed wilgocią. Pułapki pyłkowe z otworem ślimakowym pomagają zminimalizować dezorientację zbieraczy, jeśli używają one głównie otworów świdrowych jako wejść do ula, a nie wejścia wykonanego przez dolną deskę ula (ryc. 1C). Ponieważ taca zbiorcza do osadników pyłków z otworem ślimakowym jest bardzo mała, należy ją często opróżniać, aby uniknąć przepełnienia tacki zbiorczej. Biorąc pod uwagę jej górne umiejscowienie w ulu, pułapka na pyłek montowana od góry jest najłatwiejszym stylem pułapki do zainstalowania i usunięcia, a zebrana próbka pyłku jest wolna od resztek ula. Jednak ten styl pułapki jest szczególnie wrażliwy na uszkodzony sprzęt ula, ponieważ taca zbiorcza byłaby narażona na wilgoć, gdyby pokrywa, wewnętrzna pokrywa i górna skrzynka ula nie były odpowiednio uszczelnione.

Opisane tu protokoły wymagają selekcji kolonii z dużymi populacjami osobników dorosłych i larw (krok 1.2). Ta metoda selekcji ma na celu wytworzenie bardzo dużych ilości uwięzionego pyłku z tych kolonii. Kolonie ze znacznymi populacjami żerującymi mogą doświadczać dużego zatłoczenia przy wejściu po zainstalowaniu pułapki. Wybór dużego wejścia do ula zmniejszy zatory w tunelu. Duże populacje żerujące mogą również zbierać bardzo duże ilości pyłku, które mogą przekraczać granice tacki zbiorczej. Używaj obszernych tac zbiorczych, jak widać w większości typów pułapek montowanych na dole lub od góry, i często opróżniaj tace, aby pomieścić duże ilości uwięzionych pyłków. Jeśli pożądanym celem badawczym jest ocena ilości pyłku zebranego przez rodziny rodzinne w pasiece, należy wybrać reprezentatywne rodziny, zamiast optymalizować populacje dorosłych i larw pod kątem selekcji. Wszystkie style łapaczy pyłku blokują wejście do ula i tworzą nowe wejście, które różni się przestrzennie od oryginalnego wejścia16. Pułapki pyłkowe często nie zbierają pyłku, gdy zbieracze nie są w stanie przeorientować się na nowe wejście pułapki pyłku po instalacji. Zbieracze ci łatwo dryfują do sąsiednich uli, potencjalnie zanieczyszczając krzyżowo inne próbki zbierające pyłek, jeśli dostaną się do innego ula z pułapką na pyłek. W związku z tym zbieracze powinni mieć co najmniej 24 godziny na zaaklimatyzowanie się do nowego wejścia, utrzymując mechanizm pułapki odłączony po instalacji. Wybór kolonii z niewielką liczbą dodatkowych wejść do ula lub bez nich zmniejsza również zamieszanie podczas orientowania się w kierunku nowego wejścia do pułapki na pyłki.

Dodatkowe wejścia do ula (np. i wypaczone pokrywy) powinny być uszczelnione, ale ryzyko dryfowania zbieraczek do sąsiednich uli wzrośnie, gdy wejścia te będą obecne na początku instalacji pułapki. Zbieracze będą również łatwo dryfować do innych wejść do uli, jeśli pułapka na pyłek jest zainstalowana tylko na jednym ulu w skupisku uli na paletach. Zbieracze są mniej skłonni do dryfowania, jeśli wszystkie ule skierowane w tym samym kierunku na palecie mają zainstalowane pułapki. Pułapki pyłkowe montowane od góry mogą stwarzać większe ryzyko dryfowania pszczół ze względu na znaczną odległość między wejściem do pułapki pyłkowej a pierwotnym wejściem do ula. Na potrzeby tego badania pułapki pyłkowe zainstalowano na wielu koloniach pszczół miodnych w każdym miejscu doświadczalnym, aby uwzględnić różnice w ilości pyłku i składzie taksonów między każdą kolonią pszczół miodnych. W związku z tym pułapki pyłkowe powinny być instalowane na wielu koloniach, aby uzyskać solidne zbiory pyłku z krajobrazu, ponieważ zbieranie pyłku może się znacznie różnić między koloniami w zależności od gatunku rośliny i całkowitej zebranej ilości12,13. Każda próbka pyłku miała 7-dniowy okres poboru. W przyszłych badaniach zbieranie pyłku w dwóch lub trzech kolejnych odstępach 72 godzin zwiększy dokładność szacowania paszy pyłkowej40.

Ze względu na wysoki stopień fluktuacji czasowych w zbieraniu pyłku, dokładność szacowania pyłku można zwiększyć, powtarzając proces zbierania pyłku we wczesnych, szczytowych i późnych okresach kwitnienia docelowych systemów uprawy 24,27,39. Pyłek powinien być zbierany z wielu lokalizacji, choć z tego samego systemu uprawy lub typu krajobrazu, ze względu na przewidywane różnice w ilości i typie gatunków roślin między lokalizacjami pasieki 14,27,33,43. Długotrwałe zatrzymywanie pyłku może być szkodliwe dla rodzin pszczelich miodnych. Potencjalne skutki obejmują ograniczenie odchowu czerwiu, skrócenie okresu wzrostu larw oraz kanibalizm jaj i młodych larw w ulach 19,44,45,46. Dłuższe okresy zatrzymywania pyłku, takie jak cały sezon wegetacyjny, mogą pogorszyć szkodliwy wpływ na odchów czerwiu w koloniach. Zatrzymywanie pyłków może również powodować zmniejszenie produkcji miodu i wzrost poziomu wilgotności przechowywanego miodu13. Rotacyjne pułapki pyłkowe między rodzinami w pasiece przy ciągłym monitorowaniu krajobrazu lub systemu upraw mogą złagodzić szkody wyrządzone koloniom wykorzystywanym do zatrzymywania pyłku. Angażowanie pułapek pyłkowych co drugi tydzień zmniejszy szkodliwe skutki, w szczególności straty w produkcji miodu, w przypadku zatrzymywania pyłku na tych samych koloniach przez pewien okres czasu13.

Ponadto pułapki pyłkowe najlepiej umieszczać na silnych koloniach. Czasami pułapki pyłkowe mogą przypadkowo się zatrzasnąć. Można tego uniknąć, blokując mechanizm pułapki pyłku, gdy zbieranie pyłku nie jest pożądane. Pułapki pyłkowe nie usuwają całego pyłku sercowego z zbieraczek pszczół miodnych. Skuteczność odłowu zależy od rodzaju pułapki, wielkości granulek pyłku, wielkości ciała pszczoły, pory dnia i warunków pogodowych. W związku z tym zbieranie pyłku w kształcie guza nie jest spójne w przypadku stosowania pułapek pyłkowych dla różnych gatunków roślin i okresów zbioru25,26. Mniejsze granulki pyłku z roślin takich jak Eucalyptus spp. i Tamarix spp. są mniej podatne na wychwycenie przez pułapki pyłkowe27. Warto zauważyć, że w tym badaniu nie znaleziono pyłku borówki wysokiej (Vaccinium corymbosum L.) z miejsc zbierania borówki wysokiej, co potwierdza wcześniejsze dowody na to, że granulki pyłku borówki wysokiej są zbyt małe do zbierania pułapki na pyłek47. Natomiast pyłek pochodzący z mniszka lekarskiego (Taraxacum officinale F.H. Wigg) znaleziono w każdym systemie upraw w tym badaniu. Granulki pyłku niektórych gatunków roślin mogą być również znacznie większe niż inne, takie jak Taraxacum spp., i mogą być nadreprezentowane w analizie zbiorów pyłku z pułapek pyłkowych27. Chwytanie pojedynczych zbieraczy pyłku i ręczne usuwanie ich pyłku w kształcie nasadki zwiększy dokładność oceny źródła pyłku, ale jest bardzo czasochłonne i zasobochłonne w porównaniu z użyciem pułapek pyłkowych (Tabela 1). Sortowanie granulek pyłku na grupy kolorów jest stosunkowo proste, chociaż jest czasochłonne. O ile nie ma konkretnego celu badawczego, ilość granulek pyłku powinna być ograniczona do 10 g lub mniej (dla danej próbki) w celu sortowania na grupy kolorystyczne. Sortowanie całych próbek, które zawierają większe ilości niż ta ilość, drastycznie wydłuży czas potrzebny do zakończenia analizy. Bardzo ważne jest jednak, aby próbka pyłku była bardzo dobrze wymieszana, zanim zostanie z niej pobrana podpróbka do sortowania kolorów. Niewymieszanie oryginalnej próbki może spowodować, że podpróbka nie będzie reprezentatywna dla całości, czego należy unikać.

Jeżeli oryginalny pojemnik na próbkę nie zawiera wystarczającej ilości wolnego miejsca, aby umożliwić dokładne wymieszanie granulek pyłku, umieszczenie całej próbki w dużej plastikowej torbie lub małej papierowej torbie powinno wystarczyć, nawet w przypadku dużych próbek. Sprawdzą się również twarde plastikowe pojemniki z pokrywką. Mieszanie próbki powinno odbywać się delikatnie, tak aby granulki pyłku nie zostały zgniecione lub w inny sposób zniszczone. Niezamierzona stronniczość może podświadomie przekonać kogoś do zgarnięcia "ładnych fioletowych granulek", na przykład podczas usuwania podpróbki z całości. W związku z tym kompozycja kolorystyczna próbki powinna być zasłonięta podczas pobierania podpróbki. W ten sposób uzyskanie podpróby, która jest naprawdę reprezentatywna dla całości, jest bardziej prawdopodobne. Jednak ta metoda podpróbkowania może nie wyselekcjonować granulek pyłku, które są w niskiej obfitości w próbce. W związku z tym, jeśli identyfikacja każdego pojedynczego taksonu roślin reprezentowanego w próbie jest celem badawczym, zebranie podpróby nie będzie właściwe; Cała próbka musi zostać poddana analizie. Dlatego granulki należy sortować na szklanej szalce Petriego. Po zakończeniu sortowania pod naczyniem można umieścić odpowiednie strony przewodnika kolorów Pantone, aby ułatwić dopasowanie kolorów między przewodnikiem a posortowanym pyłkiem. Przykład tego zilustrowano na rysunku 5.

Podczas zatrzymywania pyłku z kolonii pszczół miodnych umieszczonych w uprawach w celu zapylenia, nie należy stosować łącznie więcej niż dziesięciu grup kolorów: dziewięć pojedynczych kolorów i jedną "różną" grupę kolorów składającą się z kolorów mniejszościowych w próbce. Ustalenie rozsądnego limitu na maksymalną liczbę grup kolorów, na które można podzielić próbkę, zapobiega ugrzęźnięciu badacza w niekończącym się rozdzielaniu granulek na stale rosnącą liczbę niezwykle specyficznych grup, które po zakończeniu sortowania mogą indywidualnie nie zawierać wystarczających ilości do acetolizy. W przypadku odłowu z kolonii, które prawdopodobnie żerują na bardzo zróżnicowanym asortymencie gatunków roślin, może być konieczne zwiększenie liczby grup kolorów, a protokoły powinny być zoptymalizowane, aby odzwierciedlić ten wymóg. Niniejsze badanie koncentrowało się na próbkach pyłku pobranych z kolonii pszczół miodnych zapylających uprawy, a wiele taksonów było powszechnie znajdowanych w grupie kolorów, podobnie jak w poprzednich badaniach 29,30,31.

Acetoliza rozpuszcza lipidy, białka i zanieczyszczenia organiczne z powierzchni ziaren pyłku, ujawniając charakterystyczne cechy egzyny, dzięki czemu ziarna można łatwiej zabarwić i zidentyfikować. Jest to stara i powszechna metodologia stosowana w wielu rodzajach badań pyłku37. Ogólne kroki są ustandaryzowane; Różnią się one niewiele w zależności od protokołu. Jednak specyfika szybkości i czasu wirowania, temperatury i czasu trwania inkubacji, objętości odczynników zależnych od ilości pyłku, a nawet metody usuwania supernatantu (dekantacja vs pipetowanie) może wymagać eksperymentalnej optymalizacji zgodnie z celami badawczymi i, do pewnego stopnia, rodzajami pyłku, który można napotkać48. Rzeczywiście, acetoliza może usunąć ważne cechy diagnostyczne pyłku z niektórych taksonów, takich jak Malvaceae i Orchidaceae38. Dlatego nie wszystkie pyłki poddają się standardowym metodom acetolizy. Jak wspomniano powyżej, metody te zostały zoptymalizowane w tym badaniu w celu identyfikacji dominujących źródeł taksonu roślin w pyłku zbieranym przez pszczoły miodne zapylające rośliny. Szczegóły, które należy wziąć pod uwagę, jeśli dokładna kwantyfikacja ziaren pyłku jest częścią badania, nie zostały omówione w tym artykule.

Stosowanie rozpuszczalników i kwasów wymaga starannego planowania, odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) i odpowiedzialnej utylizacji odpadów (rysunek 6). Bardzo ważne jest, aby naukowcy określili prawidłowy sposób przechowywania odczynników i utylizacji odpadów przed rozpoczęciem jakiejkolwiek części acetolizy. W tym laboratorium rękawice butylowe są używane podczas każdej części procesu, w którym występuje kwas siarkowy, a nawet lodowaty kwas octowy, ponieważ mają znacznie lepsze wskaźniki degradacji i przenikania dla obu kwasów niż rękawice nitrylowe, a jednocześnie nie wpływają negatywnie na zręczność49. Rozsądne byłoby zapoznanie się z wytycznymi bezpieczeństwa danej instytucji w celu uzyskania zaleceń dotyczących odpowiednich rękawic i innych środków ochrony indywidualnej49. Dodanie lodowatego kwasu octowego przed etapem acetolizy pomaga usunąć resztki wilgoci z próbki i przygotowuje ją do ważnej reakcji acetolizy. Lodowata mieszanina kwasu octowego i kwasu siarkowego na etapie acetolizy może gwałtownie reagować z wodą, dlatego ważne jest, aby wszystkie naczynia szklane i materiały eksploatacyjne były całkowicie suche, a cała wilgoć została usunięta z próbki przed acetolizą. Dodatek po acetolizie lodowatego kwasu octowego rozcieńcza i neutralizuje mieszaninę acetolizy.

W szczególności etanol i lodowaty kwas octowy mogą rozpuszczać tusz na etykietach probówek do mikrowirówek, jeśli odczynniki te kapią na zewnątrz probówki, nawet w przypadku pisaków odpornych na rozpuszczalniki. Często sprawdzaj etykiety tubek podczas całego procesu, aby upewnić się, że są nadal czytelne. Jeśli jest to logistycznie wykonalne, rozważ użycie etykiet drukowanych przez LaserJet jako zabezpieczenie przed taką możliwością. Sposób, w jaki supernatanty są dekantowane, będzie miał wpływ na to, czy odczynniki będą spływać po zewnętrznej stronie probówek do mikrowirówek. Ważne jest, aby dekantować supernatant pewną siebie, płynną ręką, co przychodzi z praktyką. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć utraty próbek pyłku z probówki wirówkowej podczas dekantacji. Zbyt szybka dekantacja grozi utratą części lub całości pozostałości pyłku; Zbyt wolna dekantacja może spowodować, że supernatant spłynie w dół probówki. Chociaż powszechnie zalecana jest temperatura inkubacji wynosząca 100 °C, pyłek może łatwo ulec "rozgotowaniu" w tej temperaturze w ilościach użytych w tym badaniu (0,25 g), zwłaszcza jeśli jest inkubowany przez nieco dłuższy czas29. W rzeczywistości nawet w temperaturze 80 °C ziarna pyłku mogą pękać lub w inny sposób ulec uszkodzeniu, jeśli pozostaną zbyt długo w mieszaninie acetolizy. Temperatura i czas trwania inkubacji muszą być dokładnie określone, aby uniknąć zniszczenia ziaren pyłku w próbce.

Barwienie pyłku zwiększa definicję i kontrast cech egzyny, ułatwiając fotografowanie i identyfikację (ryc. 7). Pięć kropli (z plastikowej pipety transferowej) 1% Safraniny O skutecznie zabarwiło 0,25 g pyłku. Jednak różne pyłki barwią się w różny sposób. Jeśli ziarna pyłku są zabarwione zbyt lekko lub zbyt mocno, identyfikacja może być trudna. Tam, gdzie jest to możliwe, objętość roztworu barwienia potrzebna do odpowiedniego zabarwienia gatunków pyłku, które mają zostać znalezione w badaniu, powinna zostać zatwierdzona przed rozpoczęciem przetwarzania próbek doświadczalnych. Niemniej jednak, jeśli jedna z próbek eksperymentalnych nie jest odpowiednio zabarwiona, można ją skorygować. Aby rozjaśnić próbkę pyłku, która jest zbyt mocno zabarwiona, należy spłukać próbkę wodą, a następnie etanolem. Jeśli pyłek nie jest wystarczająco dobrze wybarwiony, aby zobaczyć cechy wyróżniające, można dodać kilka dodatkowych kropel plamy. Plamę tych próbek należy sprawdzić przed dodaniem gliceryny. Podobnie, może być konieczne wykonanie kilku prób i błędów, aby określić idealną objętość gliceryny dla pozostałości pyłku. Piętnaście kropli gliceryny odpowiednio chroniło próbki w tym badaniu przed wysuszeniem, jednocześnie rozcieńczając pozostałości pyłku do stężenia idealnego do dalszej identyfikacji za pomocą mikroskopii świetlnej. Inne ilości pozostałości pyłku mogą wymagać większej lub mniejszej ilości gliceryny, aby zapobiec wysuszeniu i ułatwić montaż.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Gretchen Jones (USDA-ARS, APMRU, College Station, TX) za pomoc w sortowaniu kolorów i analizie acetolizy. Badania te były wspierane przez fundusze badawcze przekazane R.R.S. przez Stowarzyszenie Pszczelarzy Stanu Oregon.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#8 ściereczkaapertura 2,7
mm cylinder
1000 ml końcówki
1000 ml końcówki
szkiełkaGrubość: 0,93 mm - 1,05 mm
Probówki
Zlewki ze szkła borokrzemianowego z podziałką 250 ml (x3)VWR10754-952
Zlewki ze szkła borokrzemianowego z podziałką 50 ml (x6)VWR10754-946
95% EtOH PharmcoAAPER111000200DM55ACS/USP/koszerne
rękawice
WirówkaMaksymalna prędkość 1060 x g; preferowany obrót poziomy
Okulary
Przewodnik po kolorachPantoneSKU: GP1601A
Szkiełko nakrywkowe z solidną powłoką 1 lub 1,5Grubość: 0,13 mm - 0,19 mm
Woda destylowana
Kleszcze
Wyciąg
Lodowcowy kwas octowyBDH ChemikaliaBDH3092Klasa ACS
Lejek
GlicerynaHumco103196001_1Klasa USP, 99,5%, bezwodna
Pojemniki na odpady niebezpieczne Narzędzie
ula
Gorący blokMusi osiągnąć 80 stopni C
Fartuch laboratoryjny z długimi rękawami
Lateks lub pianka
Mikroskop
Lakier do paznokci, przezroczysty
Rękawice
Pipeta P1000VWR
szalka
Łyżka
SafraninWard's Science470302-322Wędzarnia
Do instalacji pułapki na pyłki
Wodorowęglan soduEMD MilliporeSX0320Klasa ACS,
proszek Butelki do spryskiwania (x2)
Kwas siarkowyEMD MilliporeSX1244Klasa ACS
Sundance Pułapka na pyłki do montażu na doleBetterbee Pszczelarstwo ZaopatrzenieTaśma
Drewniane patyczki
Drewniane wykałaczki
sprzętowa z podziałkądo mikropipetdo mikropipet z filtrem 1250 ml podstawowe 15 x 75 mm do mikrowirówek 2 mlbutylowo-winyloweochronneszklanypoliuretanowanitrylowePetriegoplastikowa klasy laboratoryjnej PTRAPB do mieszania

Bibliografia

  1. Klein, A. M., Vaissière, B. E., Cane, J. H., Steffan-Dewenter, I., Cunningham, S. A., Kremen, C., Tscharntke, T. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 274 (1608), 303-313 (2007).
  2. vanEngelsdorp, D., Hayes, J., Underwood, R. M., Pettis, J. S. A survey of honey bee colony losses in the United States, fall 2008 to spring 2009. Journal of Apicultural Research. 49 (1), 7-14 (2010).
  3. vanEngelsdorp, D., Hayes, J., Underwood, R. M., Caron, D., Pettis, J. S. A survey of managed honey bee colony losses in the USA, fall 2009 to winter 2010. Journal of Apicultural Research. 50 (1), 1-10 (2011).
  4. vanEngelsdorp, D., et al. A national survey of managed honey bee 2010-11 winter colony losses in the USA: results from the Bee Informed Partnership. Journal of Apicultural Research. 51 (1), 115-124 (2012).
  5. Spleen, A. M., et al. A national survey of managed honey bee 2011-12 winter colony losses in the United States: results from the Bee Informed Partnership. Journal of Apicultural Research. 52 (2), 44-53 (2013).
  6. Steinhauer, N. A., et al. A national survey of managed honey bees 2012-2013 annual colony losses in the USA: results from the Bee Informed Partnership. Journal of Apicultural Research. 53 (1), 1-18 (2014).
  7. Lee, K. V., et al. A national survey of managed honey bee 2013-2014 annual colony losses in the USA. Apidologie. 46 (3), 292-305 (2015).
  8. Seitz, N., et al. A national survey of managed honey bee 2014-2015 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 54 (4), 1-12 (2016).
  9. Kulhanek, K., et al. A national survey of managed honey bee 2015-2016 annual colony losses in the USA. Journal of Apicultural Research. 56 (4), 328-340 (2017).
  10. Steinhauer, N., et al. Drivers of colony losses. Current Opinion in Insect Science. 26, 142-148 (2018).
  11. Smart, M. D., Pettis, J. S., Euliss, N., Spivak, M. S. Land use in the Northern Great Plains region of the U.S. influences the survival and productivity of honey bee colonies. Agriculture, Ecosystems & Environment. 230, 139-149 (2016).
  12. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PloS One. 8 (7), 70182(2013).
  13. Hoover, S. E., Ovinge, L. P. Pollen collection, honey production, and pollination services: managing honey bees in an agricultural setting. Journal of Economic Entomology. 111 (4), 1509-1516 (2018).
  14. Topitzhofer, E., Lucas, H., Chakrabarti, P., Breece, C., Bryant, V., Sagili, R. R. Assessment of pollen diversity available to honey bees (Hymenoptera: Apidae) in major cropping systems during pollination in the western United States. Journal of Economic Entomology. 112 (5), 2040-2048 (2019).
  15. Judd, H. J., Huntzinger, C., Ramirez, R., Strange, J. P. A 3D printed pollen trap for bumble bee (Bombus) hive entrances. Journal of Visualized Experiments. (161), e61500(2020).
  16. Delaplane, K. S., Dag, A., Danka, R. G., Freitas, B. M., Garibaldi, L. A., Goodwin, R. M., Hormaza, J. I. Standard methods for pollination research with Apis mellifera. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-28 (2013).
  17. Barker, R. J. The influence of food inside the hive on pollen collection by a honeybee colony. Journal of Apicultural Research. 10 (1), 23-26 (1971).
  18. Levin, M. D., Loper, G. M. Factors affecting pollen trap efficiency. American Bee Journal. 124 (10), 721-723 (1984).
  19. Webster, T. C., Thorp, R. W., Briggs, D., Skinner, J., Parisian, T. Effects of pollen traps on honey bee (Hymenoptera: Apidae) foraging and brood rearing during almond and prune pollination. Environmental Entomology. 14 (6), 683-686 (1985).
  20. Gemeda, T. K., Li, J., Luo, S., Yang, H., Jin, T., Huang, J., Wu, J., Nascimento, F. S. Pollen trapping and sugar syrup feeding of honey bee (Hymenoptera: Apidae) enhance pollen collection of less preferred flowers. PLoS One. 13 (9), 0203648(2018).
  21. Hellmich, R. L., Rothenbuhler, W. C. Relationship between different amounts of brood and the collection and use of pollen by the honey bee (Apis mellifera). Apidologie. 17 (1), 13-20 (1986).
  22. Weidenmüller, A., Tautz, J. In-hive behavior of pollen foragers (Apis mellifera) in honey bee colonies under conditions of high and low pollen need. Ethology. 108 (3), 205-221 (2002).
  23. Pernal, S. F., Currie, R. W. The influence of pollen quality on foraging behavior in honeybees (Apis mellifera L.). Behavioral Ecology and Sociobiology. 51 (1), 53-68 (2001).
  24. Couvillon, M. J., et al. Honey bee foraging distance depends on month and forage type. Apidologie. 46, 61-70 (2015).
  25. Percival, M. Pollen collection by Apis mellifera. New Phytologist. 46, 142-165 (1947).
  26. Synge, A. D. Pollen collection by honey bees (Apis mellifera). Journal of Animal Ecology. 16, 122-138 (1947).
  27. O'Neal, R. J., Waller, G. D. On the pollen harvest by the honey bee (Apis mellifera L.) near Tucson, Arizona (1976-1981). Desert Plants. 6, 81-109 (1984).
  28. Eckert, C. D., Winston, M. L., Ydenberg, R. C. The relationship between population size, amount of brood, and individual foraging behaviour in the honey bee, Apis mellifera. Oecologia. 97 (2), 248-255 (1994).
  29. Free, J. B. The flower constancy of honey bees. Journal of Animal Ecology. 32 (1), 119-132 (1963).
  30. van der Moezel, P. G., Delfs, J. C., Pate, J. S., Loneragan, W. A., Bell, D. T. Pollen selection by honeybees in shrublands of the Northern Sandplains of Western Australia. Journal of Apicultural Research. 26 (4), 224-232 (1987).
  31. Hill, P. S., Wells, P. H., Wells, H. Spontaneous flower constancy and learning in honey bees as a function of color. Animal Behaviour. 54 (3), 615-627 (1997).
  32. Barth, O., Munhoz, M., Luz, C. Botanical origin of Apis pollen loads using colour, weight and pollen morphology data. Acta Alimentaria. 38, 133-139 (2009).
  33. Colwell, M. J., Williams, G. R., Evans, R. C., Shutler, D. Honey bee-collected pollen in agro-ecosystems reveals diet diversity, diet quality, and pesticide exposure. Ecology and Evolution. 7 (18), 7243-7253 (2017).
  34. Stoner, K. A., Cowles, R. S., Nurse, A., Eitzer, B. D. Tracking pesticide residues to a plant genus using palynology in pollen trapped from honey bees (Hymenoptera: Apidae) at ornamental plant nurseries. Environmental Entomology. 48 (2), 351-362 (2019).
  35. Almeida-Muradian, L., Pamplona, L. C., Coimbra, S. I., Barth, O. M. Chemical composition and botanical evaluation of dried bee pollen pellets. Journal of Food Composition and Analysis. 18 (1), 105-111 (2005).
  36. Lau, P., Bryant, V., Rangel, J. Determining the minimum number of pollen grains needed for accurate honey bee (Apis mellifera) colony pollen pellet analysis. Palynology. 42 (1), 36-42 (2018).
  37. Erdtman, G. Handbook of palynology: morphology, taxonomy, ecology: an introduction to the study of pollen grains and spores. , Munksgaard, Copenhagen, DK. (1969).
  38. Jones, G. D. Pollen analyses for pollination research, acetolysis. Journal of Pollination Ecology. 13 (21), 203-217 (2014).
  39. Richardson, R. T., Lin, C. H., Sponsler, D. B., Quijia, J. O., Goodell, K., Johnson, R. M. Application of ITS2 metabarcoding to determine the provenance of pollen collected by honey bees in an agroecosystem. Applied Plant Science. 3 (1), 1-6 (2015).
  40. Dimou, M., Thrasyvoulou, A., Tsirakoglou, V. Efficient use of pollen traps to determine the pollen flora used by honey bees. Journal of Apicultural Research. 45 (1), 42-46 (2005).
  41. Szczesna, T., Rybak-Chmielewska, H., Chmielewski, W. Effect of infestation of pollen loads with acarid mites on amino acid content and organoleptic characteristics of the product. Pszczelnicze Zeszyty Naukowe. 43 (1), 235-245 (1999).
  42. Stoner, K. A., Eitzer, B. D. Using a hazard quotient to evaluate pesticide residues detected in pollen trapped from honey bees (Apis mellifera) in Connecticut. PLoS One. 8 (10), 77550(2013).
  43. Garbuzov, M., Couvillon, M. J., Schürch, R., Ratnieks, F. L. Honey bee dance decoding and pollen-load analysis show limited foraging on spring-flowering oilseed rape, a potential source of neonicotinoid contamination. Agriculture, Ecosystems & Environment. 203, 62-68 (2015).
  44. Moeller, F. E. Managing colonies for pollen production. Proceedings of 26th International Agricultural Congress. , Adelaide, SA. 232-239 (1977).
  45. Dustmann, J. H., Ohe, W. V. D. Einfluss von Kälteeinbrüchen auf die Frühjahresentwicklung von Bienenvölkern (Apis mellifera L). Apidologie. 19 (3), 245-254 (1988).
  46. Schmickl, T., Crailsheim, K. J. Cannibalism and early capping: strategy of honeybee colonies in times of experimental pollen shortages. Journal of Comparative Physiology A. 187 (7), 541-547 (2001).
  47. Hodges, D. The pollen loads of the honeybee: a guide to their identification by colour and form. , London Hill House. Chalfont St Peter, UK. (1974).
  48. Jones, G. D. Pollen extraction from insects. Palynology. 36 (1), 86-109 (2012).
  49. Ansell, Chemical resistance guide. Permeation and degradation data. 8th Ed. , Available from: https://ehs.unc.edu/files/2015/09/Ansell_8thEditionChemicalResistanceGuide.pdf (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

pyłek z koszyczkówpułapkowanie pyłkuidentyfikacja pyłkusortowanie pyłkumetoda acetolizyróżnorodność pyłkużerowanie zapylaczymorfologia pyłkuekspozycja na pestycydy
Zbieranie i identyfikacja pyłku z kolonii pszczół miodnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.