Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62073

⸱

29 grudnia 2021

 ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy inżynierię nowatorskiej polimerazy T7 RNA na uwięzi DNA do regulacji reakcji transkrypcji in vitro. Omawiamy etapy syntezy i charakterystyki białek, walidujemy regulację transkrypcji typu proof-of-concept i omawiamy jej zastosowania w obliczeniach molekularnych, diagnostyce i przetwarzaniu informacji molekularnych.

Streszczenie

Nanotechnologia DNA umożliwia programowalne samoorganizowanie kwasów nukleinowych w określone przez użytkownika kształty i dynamikę dla różnych zastosowań. Prace te pokazują, że koncepcje nanotechnologii DNA można wykorzystać do programowania aktywności enzymatycznej polimerazy T7 RNA (RNAP) pochodzącej z fagów i budowania skalowalnych sieci regulacyjnych genów syntetycznych. Po pierwsze, RNAP T7 na uwięzi oligonukleotydowej jest modyfikowany poprzez ekspresję N-końcowego RNAP znakowanego SNAP, a następnie chemiczne sprzężenie znacznika SNAP z oligonukleotydem modyfikowanym benzylguaniną (BG). Następnie przemieszczenie nici kwasu nukleinowego służy do programowania transkrypcji polimerazy na żądanie. Ponadto pomocnicze zespoły kwasów nukleinowych mogą być wykorzystywane jako "sztuczne czynniki transkrypcyjne" do regulowania interakcji między zaprogramowanym przez DNA T7 RNAP a jego matrycami DNA. Ten mechanizm regulacyjny transkrypcji in vitro może implementować różne zachowania obwodów, takie jak logika cyfrowa, sprzężenie zwrotne, kaskadowanie i multipleksowanie. Komponowalność tej architektury regulacyjnej genów ułatwia abstrakcję projektową, standaryzację i skalowanie. Cechy te umożliwią szybkie prototypowanie urządzeń genetycznych in vitro do zastosowań takich jak biodetekcja, wykrywanie chorób i przechowywanie danych.

Wprowadzenie

Obliczenia oparte na DNA wykorzystują zestaw zaprojektowanych oligonukleotydów jako ośrodek obliczeniowy. Oligonukleotydy te są programowane za pomocą sekwencji umożliwiających ich dynamiczne składanie zgodnie z określoną przez użytkownika logiką oraz reagowanie na specyficzne sygnały wejściowe w postaci kwasów nukleinowych. W badaniach typu proof-of-concept wynik obliczeń zazwyczaj składa się z zestawu znakowanych fluorescencyjnie oligonukleotydów, które można wykryć za pomocą elektroforezy żelowej lub fluorometrycznych czytników płytek. W ciągu ostatnich 30 lat zademonstrowano coraz bardziej złożone obwody obliczeniowe DNA, takie jak różnorodne kaskady logiki cyfrowej, sieci reakcji chemicznych oraz sieci neuronowe1,2,3. Aby wspomóc przygotowanie tych obwodów DNA, wykorzystano modele matematyczne do przewidywania funkcjonalności syntetycznych obwodów genowych4,5, a także opracowano narzędzia obliczeniowe do projektowania ortogonalnych sekwencji DNA6,7,8,9,10. W porównaniu z komputerami krzemowymi, zalety komputerów DNA obejmują ich zdolność do bezpośredniego oddziaływania z biomolekułami, pracę w roztworze bez konieczności zasilania oraz ogólną kompaktowość i stabilność. Wraz z pojawieniem się sekwencjonowania następnej generacji, koszt syntezy komputerów DNA w ciągu ostatnich dwóch dekad spadał w tempie szybszym niż przewiduje prawo Moore'a11. Obecnie zaczynają pojawiać się zastosowania takich komputerów opartych na DNA, na przykład w diagnostyce chorób12,13, w biofizyce molekularnej14, a także jako platformy do przechowywania danych15.

Schemat rekombinacji DNA z drogami crossing-over, przedstawiający wymianę i reorganizację genów.
Rysunek 1: Mechanizm przemieszczania nici DNA zapośredniczonego przez toehold. Toehold, δ, to wolna, niezwiązana sekwencja w częściowym duplexie. Po wprowadzeniu komplementarnej domeny (δ*) na drugiej nici, wolna domena δ służy jako punkt zaczepienia (toehold) do hybrydyzacji, co pozwala pozostałej części nici (ɑ*) powoli wypierać konkurenta poprzez odwracalną reakcję zapinania/rozpinania, znaną jako migracja nici. Wraz ze wzrostem długości δ, ΔG dla reakcji w kierunku prawym maleje, a przemieszczanie zachodzi łatwiej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Do dziś większość komputerów DNA wykorzystuje ugruntowany w dziedzinie dynamicznej nanotechnologii DNA motyw znany jako przemieszczanie nici DNA zapośredniczone przez tzw. toehold (TMDSD, Rysunek 1)16. Motyw ten składa się z częściowo dwuniciowego dupleksu DNA (dsDNA) z krótkimi nawisami typu „toehold” (np. od 7 do 10 nukleotydów (nt)). Nitki „wejściowe” kwasów nukleinowych mogą oddziaływać z częściowymi dupleksami poprzez toehold. Prowadzi to do wyparcia jednej z nici z częściowego dupleksu, a uwolniona w ten sposób nić może następnie służyć jako sygnał wejściowy dla kolejnych częściowych dupleksów. W ten sposób TMDSD umożliwia kaskadowanie sygnałów i przetwarzanie informacji. W teorii ortogonalne motywy TMDSD mogą działać niezależnie w roztworze, co pozwala na równoległe przetwarzanie informacji. Opracowano szereg wariantów reakcji TMDSD, takich jak wymiana nici DNA zapośredniczona przez toehold (TMDSE)17, „szczelne” (leakless) toeholdy z domenami o podwójnej długości18, toeholdy z niedopasowaniami sekwencji19 oraz przemieszczanie nici zapośredniczone przez tzw. „handhold”20. Te innowacyjne zasady projektowania pozwalają na dokładniejsze dostrojenie energetyki i dynamiki TMDSD w celu poprawy wydajności obliczeń DNA.

Syntetyczne obwody genowe, takie jak transkrypcyjne obwody genowe, są również zdolne do przeprowadzania operacji obliczeniowych21,22,23. Obwody te są regulowane przez białkowe czynniki transkrypcyjne, które aktywują lub represują transkrypcję genu poprzez wiązanie się ze specyficznymi regulatorowymi elementami DNA. W porównaniu do obwodów opartych na DNA, obwody transkrypcyjne mają kilka zalet. Po pierwsze, transkrypcja enzymatyczna charakteryzuje się znacznie wyższą liczbą cykli niż istniejące katalityczne obwody DNA, co pozwala na generowanie większej liczby kopii produktu na jedną kopię wejścia i zapewnia bardziej wydajny sposób amplifikacji sygnału. Ponadto obwody transkrypcyjne mogą w ramach wyników obliczeń wytwarzać różne cząsteczki funkcjonalne, takie jak aptamery lub matrycowy RNA (mRNA) kodujący białka terapeutyczne, co można wykorzystać w różnych zastosowaniach. Jednak głównym ograniczeniem obecnych obwodów transkrypcyjnych jest brak ich skalowalności. Wynika to z faktu, że zbiór ortogonalnych białkowych czynników transkrypcyjnych jest bardzo ograniczony, a projektowanie de novo nowych białkowych czynników transkrypcyjnych pozostaje wyzwaniem technicznym i jest czasochłonne.

Schemat edycji genów z T7 RNAP, SNAP-tagiem, oddziaływaniem DNA i procesem transkrypcji RNA.
Rysunek 2: Abstrakcja i mechanizm kompleksu polimerazy typu „uwięź” (tether) i „klatka” (cage). (A i B) Oligonukleotydowa uwięź zostaje enzymatycznie przyłączona do polimerazy T7 poprzez reakcję SNAP-tag. Klatka składająca się z „pozornego” promotora T7 z nawisową sekwencją komplementarną do uwięzi umożliwia hybrydyzację z uwięzią i blokowanie aktywności transkrypcyjnej. (C) W obecności operatora (a*b*) wiąże się on z punktem dostępu (toehold) na oligonukleotydowej uwięzi (ab) i wypiera region b* klatki, umożliwiając przeprowadzenie transkrypcji. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Chou i Shih27. Skróty: RNAP = polimeraza RNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Niniejsza praca przedstawia nowy moduł dla obliczeń molekularnych, który łączy funkcjonalność obwodów transkrypcyjnych ze skalowalnością obwodów opartych na DNA. Moduł ten stanowi polimerazę T7 RNAP kowalencyjnie połączoną z jednoniciową kotwicą DNA (Ryc. 2A). Aby zsyntetyzować T7 RNAP z kotwicą DNA, polimerazę połączono z N-terminalnym SNAP-tagiem24 i wyeksponowano rekombinacyjnie w Escherichia coli. Następnie SNAP-tag poddano reakcji z oligonukleotydem funkcjonalizowanym substratem BG. Kotwica oligonukleotydowa umożliwia pozycjonowanie gości molekularnych w bliskim sąsiedztwie polimerazy poprzez hybrydyzację DNA. Jednym z takich gości był konkurencyjny bloker transkrypcyjny nazwany „klatką”, która składa się z „pozornego” dupleksu DNA promotora T7 bez genów w regionie downstream (Ryc. 2B). Po związaniu z RNAP za pomocą kotwicy oligonukleotydowej, klatka hamuje aktywność polimerazy, konkurując z innymi matrycami DNA o wiązanie z RNAP, co wprowadza RNAP w stan „OFF” (Ryc. 2C).

Aby aktywować polimerazę do stanu „WŁĄCZENIE” (ON), zaprojektowano matryce DNA T7 z jednoniciowymi domenami „operatorowymi” powyżej promotora T7 genu. Domenę operatorową (tj. domenę a*b* Rysunek 2C) można zaprojektować tak, aby wypierała klatkę z RNAP poprzez TMDSD i pozycjonowała RNAP blisko promotora T7 genu, inicjując tym samym transkrypcję. Alternatywnie zaprojektowano również matryce DNA, w których sekwencja operatorowa była komplementarna do pomocniczych nici kwasów nukleinowych, nazywanych „sztucznymi czynnikami transkrypcyjnymi” (tj. nici TFA i TFB na Rysunku 3A). Po wprowadzeniu obu nici do reakcji, zmontują się one w miejscu operatorowym, tworząc nową domenę pseudociągłą a*b*. Domena ta może następnie wypierać klatkę poprzez TMDSD, aby zainicjować transkrypcję (Rysunek 3B). Nicie te mogą być dostarczone egzogennie lub wytworzone.

Schemat regulacji genów; czynniki transkrypcyjne TF<sub>A</sub>, TF<sub>B</sub>; wiązanie polimerazy RNA.
Rysunek 3: Selektywne programowanie aktywności polimerazy poprzez trójskładnikowy aktywator przełączający. (A) W obecności czynników transkrypcyjnych (TFA i TFB) wiążą się one z domeną operatorową powyżej promotora, tworząc pseudojednoniciową sekwencję (a*b*) zdolną do przemieszczenia klatki poprzez przesunięcie nici DNA zapośredniczone przez toehold. (B) Ta domena a*b* może przemieścić klatkę za pomocą TMDSD, aby zainicjować transkrypcję. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Chou i Shih27. Skróty: TF = czynnik transkrypcyjny; RNAP = polimeraza RNA; TMDSD = przesunięcie nici DNA zapośredniczone przez toehold. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykorzystanie czynników transkrypcyjnych opartych na kwasach nukleinowych do regulacji transkrypcji in vitro umożliwia skalowalną implementację złożonych zachowań obwodów, takich jak logika cyfrowa, sprzężenie zwrotne i kaskadowanie sygnałów. Na przykład można budować kaskady bramek logicznych, projektując sekwencje kwasów nukleinianych w taki sposób, aby transkrypty z genu nadrzędnego aktywowały gen podrzędny. Jednym z zastosowań wykorzystujących kaskadowanie i multipleksowanie możliwe dzięki proponowanej technologii jest opracowanie bardziej zaawansowanych obwodów obliczeń molekularnych dla diagnostyki przenośnej oraz przetwarzania danych molekularnych. Ponadto integracja obliczeń molekularnych z możliwościami syntezy RNA de novo może umożliwić nowe zastosowania. Na przykład można zaprojektować obwód molekularny wykrywający jeden lub kombinację zdefiniowanych przez użytkownika RNA jako wejścia, a w odpowiedzi generujący terapeutyczne RNA lub mRNA kodujące funkcjonalne peptydy lub białka do zastosowań medycznych w punkcie opieki nad pacjentem (point-of-care).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie buforu

UWAGA: Przygotowanie buforu do oczyszczania białek może odbyć się w dowolnym dniu; w tym przypadku wykonano to przed rozpoczęciem eksperymentów.

  1. Przygotować bufor do lizy/równoważenia zawierający 50 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris), 300 mM chlorku sodu (NaCl), 5% glicerolu i 5 mM β-merkaptoetanolu (BME), pH 8. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL dodać 1,5 mL 1M Tris, 1,8 mL 5M NaCl, 1,5 mL glicerolu oraz 25,2 mL wody dejonizowanej (ddH2O), a tuż przed użyciem dodać 10,5 µL 14,2 M BME.
    UWAGA: Tris może wywołać ostrą toksyczność; należy zatem unikać wdychania jego pyłu oraz kontaktu ze skórą i oczami. BME jest toksyczne i powinno być używane wyłącznie w dygestorium. BME należy dodać na samym końcu, tuż przed resuspensją i lizą komórek. Skład buforu do lizy przedstawiono w Tabeli 1.
  2. Przygotować bufor do płukania (pH 8) zawierający 50 mM Tris, 800 mM NaCl, 5% glicerolu, 5 mM BME i 20 mM imidazolu. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL dodać 1,5 mL 1 M Tris, 4,8 mL 5 M NaCl, 1,5 mL glicerolu oraz 22,2 mL ddH2O. Tuż przed użyciem, do 20 mL powyższego roztworu dodać 7 µL 14,2 M BME oraz 200 µL 2 M imidazolu.
    UWAGA: Aby zapobiec ostrej toksyczności spowodowanej przez imidazol, należy stosować środki ochrony osobistej. BME i imidazol należy dodać na samym końcu, tuż przed wypłukaniem białka z kolumny. Skład buforu do płukania przedstawiono w Tabeli 2.
  3. Przygotować bufor do elucji (pH 8) zawierający 50 mM Tris, 800 mM NaCl, 5% glicerolu, 5 mM BME i 200 mM imidazolu. Do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL dodać 0,5 mL 1 M Tris, 1,6 mL 5 M NaCl, 0,5 mL glicerolu oraz 6,4 mL ddH2O. Tuż przed użyciem, do 10 mL powyższego roztworu dodać 3,5 µL 14,2 M BME oraz 1 mL 2 M imidazolu.
    UWAGA: BME i imidazol należy dodać na samym końcu, tuż przed elucją białka z kolumny. Skład buforu do elucji przedstawiono w Tabeli 3.
  4. Przygotować 2x bufor do przechowywania (do zmieszania w stosunku 1:1 z glicerolem) zawierający 100 mM Tris, 200 mM NaCl, 40 mM BME i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) oraz 0,2% niejonowego surfaktanta (patrz Tabela Materiałów). Aby przygotować 50 mL buforu do przechowywania, do probówki wirówkowej o pojemności 50 mL dodać 5 mL 1 M Tris, 2 mL 5 M NaCl, 42,56 mL ddH2O, 200 µL 0,5 M EDTA oraz 100 µL niejonowego surfaktanta. Mieszać do uzyskania jednorodnego roztworu, przefiltrować bufor przez filtr strzykawkowy 0,2 µm i przed użyciem dodać 140,8 µL BME do powyższego roztworu.
    UWAGA: Aby uniknąć ostrej toksyczności spowodowanej przez EDTA, należy unikać wdychania jego pyłu oraz kontaktu ze skórą i oczami. BME należy dodać na samym końcu, a następnie zmieszać cały bufor do przechowywania w stosunku 1:1 z glicerolem, tuż przed przechowywaniem oczyszczonego białka. Skład buforu do przechowywania przedstawiono w Tabeli 4.

2. Inkubacja kultury przez noc: Dzień 1

  1. Przygotuj 1,000x roztwór zapasu kanamycyny, rozpuszczając 500 mg kanamycyny w 10 mL ddH2O.
    UWAGA: Należy stosować środki ochrony osobistej, aby zapobiec ostrej toksyczności spowodowanej przez kanamycynę.
  2. Dodaj 20 µL 1,000x roztworu zapasu kanamycyny do 20 mL pożywki LB (lysogeny broth). Za pomocą sterylnego końcówki pipety pobierz próbkę z mrożonego w glicerolu banku transformowanych szczepów E. coli BL21, a następnie zaszczep kulturę, wprowadzając końcówkę do pożywki hodowlanej.

Schemat plazmidu pQE 80L Kan SNAP T7 RNAP; elementy genowe, promotory, miejscetly początek replikacji.
Rysunek 4: Mapa plazmidu dla SNAP T7 RNAP. Plazmid koduje T7 RNAP zawierającą N-końcowy znacznik histydynowy (6x His) i domenę SNAP-tag (SNAP T7 RNAP) pod kontrolą represora lac (lacI) na szkielecie pQE-80L. Inne cechy obejmują geny oporności na kanamycynę (KanR) i chloramfenikol (CmR). Skrót: RNAP = polimeraza RNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

UWAGA: Plazmid koduje T7 RNAP zawierającą N-końcowy znacznik histydynowy i domenę SNAP-tag (SNAP T7 RNAP), a także gen oporności na kanamycynę w obrębie szkieletu pQE-80L (Rysunek 4)25.

  1. Ponownie dodaj 20 µL roztwoku kanamycyny o stężeniu 1 000x do oddzielnej kolby z 20 mL pożywki LB (lysogeny broth) i inkubuj jako kontrolę.
  2. Inkubuj obie próbki (z kroków 2.2 i 2.3) przez noc, od 12-18 h w temperaturze 37 °C, przy rotacji z prędkością 10 × g.

3. Wzrost komórek i indukcja: Dzień 2

  1. Zaszczep 400 mL bulionu lizogennego zawierającego 400 µL roztwoku kanamycyny za pomocą 4 mL kultury z nocnej inkubacji z kroku 2.4. Inkubuj kolby z kulturą w temperaturze 37 °C, rotując z prędkością 10 × g.
  2. Gdy kultura osiągnie gęstość optyczną (OD) przy 600 nm wynoszącą ~0,5, pobierz z kolby z hodowlą 1 mL próbki jako kontrolę. Próbkę kontrolną przechowuj w temperaturze 4 °C.
  3. Indukuj komórki za pomocą izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG), dodając 40 µL 1M IPTG na każde 100 mL kultury, aby uzyskać końcowe stężenie 0,4 mM IPTG. Inkubuj próbkę przez 3 h w temperaturze 37 °C, rotując z prędkością 10 × g, a następnie odwiruj indukowaną kulturę przy 8 000 × g przez 10 min, aby uzyskać pellet komórek. Usuń nadsącz i przechowuj pellet w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
    ​UWAGA: Aby uniknąć ostrej toksyczności związanej z IPTG, należy unikać wdychania jego pyłu oraz kontaktu ze skórą i oczami. W razie potrzeby można w tym miejscu przerwać eksperyment i kontynuować go następnego dnia.

4. Lizaż komórek, oczyszczanie białek: Dzień 3

  1. Resuspendować przechowywany osad komórkowy w 10 ml buforu lizującego w temperaturze 0°C, delikatnie obracając naczynie, aby upewnić się, że cały osad został resuspendowany. Następnie pipetować po 1 ml próbki do dziesięciu probówek o pojemności 1,5 ml przechowywanych w lodzie.
  2. Poddaj każdą próbkę sonikacji przy ustawieniu amplitudy „1”, stosując impulsy o czasie trwania 2 s i cyklu pracy 50% przez okres 30 s. Przed i po każdej próbce oczyść końcówkę sonikatora 70% etanolem oraz wodą ddH.2O. Wszystkie próbki należy przechowywać w lodzie podczas i po sonikacji.
    UWAGA: Należy przechowywać 70% etanol z dala od źródeł ciepła i otwartego ognia.
  3. Równoważyć kolumnę wirówkową do oczyszczania z kwasem nitrylotrioctowym naładowanym niklem (Ni-NTA) do temperatury roboczej wynoszącej 4 °CUmieścić/przechowywać kolumnę w temperaturze 4 °Ci przechowywać w lodzie podczas użytkowania.
  4. Wiruj dziesięć próbek o objętości 1 ml przy 15 000 × g przez 20 min w temperaturze 4 °COstrożnie odpipetuj supernatant zawierający rekombinowaną RNAP, nie naruszając osadu. W razie potrzeby użyj dodatkowego buforu równoważącego, aby dostosować objętość całkowitą do ≥ 6 ml.
  5. Ostrożnie usuń dolną zapinkę z kolumny wirówkowej Ni-NTA, aby umożliwić przepływ przez kolumnę. Umieść kolumnę w probówce do wirowania i przechowuj ją w lodzie.
    UWAGA: Do kolumn wirówkowych Ni-NTA o pojemności 3 ml należy używać probówek do wirowania o pojemności 50 ml.
  6. Wirować kolumnę przy 700 × g i 4 °C przez 2 min, aby usunąć bufor do przechowywania. Równoważ kolumnę, dodając do niej 6 ml buforu równoważącego. Odczekaj, aż bufor całkowicie przeniknie przez złoże żywicy.
  7. Usuń bufor równoważący z kolumny poprzez wirowanie przy 700 × g i 4 °C przez 2 min. Przed nałożeniem przygotowanego ekstraktu komórkowego na kolumnę, należy umieścić w niej korek dolny, aby zapobiec utracie produktu. Następnie należy nanieść ekstrakt komórkowy na kolumnę i mieszać na wytrząsarce orbitalnej przez 30 min w 4 °C.
  8. Wyjąć dolną zatyczkę z kolumny, a następnie umieścić kolumnę w probówce do wirowania o pojemności 50 ml z odpowiednią etykietą przepływ przez kolumnęWiruj kolumnę z prędkością 700 × g przez 2 min, aby zebrać frakcję przepływową.
  9. Dodaj 6 ml buforu piorącego do kolumny, aby wypłukać żywicę. Odwiruj kolumnę przy 700 × g przez 2 min, aby zebrać frakcję do nowej, opisanej probówki do wirowania płukanie 1Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aby uzyskać łącznie 3 oddzielne frakcje, i zbieraj frakcje do osobnych probówek do wirowania (płukanie 2 i płukanie 3).
  10. Dodaj 3 ml buforu elucyjnego, aby wyeluować białka z tagiem His z żywicy. Odwiruj kolumnę z prędkością 700 × g przez 2 min, aby zebrać frakcję do nowej, opisanej probówki do wirowania eluat 1Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, aby uzyskać łącznie 3 oddzielne frakcje, i zbierz frakcje do osobnych probówek wirówkowych (eluat 2 i eluat 3).
  11. Połączyć eluaty i przeprowadzić odsalanie, aby usunąć sole z roztworu białka.
    1. Napiętkuj 15 ml 0,05% (m/v) polisorbatu 20 do wirówkowej jednostki filtrującej o odcięciu 100 kDa. Wiruj przy 4000 × g przez 40 min, a następnie odrzucić frakcję przepływową.
    2. Użyj powlekanego filtra do zagęszczenia eluatów 1, 2 i 3 (łącznie 9 ml eluatu białkowego + 6 ml buforu do przechowywania) do poziomu ~1,500 µLOdwiruj filtr przy 3 220 × g przez 20 min, delikatnie przemywając membranę za pomocą pipety, aby zapobiec wytrącaniu osadu.
    3. Rozcieńczyć próbkę do objętości 15 ml za pomocą buforu do przechowywania. Przeprowadzić wymianę buforu na bufor do przechowywania w stosunku 1:1000, powtarzając krok 4.11.2 jeszcze dwukrotnie.
  12. Ilościowo określ zawartość oczyszczonego białka, mierząc absorbancję frakcji przy 280 nm. Wyzeruj spektrofotometr, używając buforu do przechowywania (2-krotny bufor do przechowywania przy 4 °C). Delikatnie wymieszać próbkę połączonych eluatów i zmierzyć jej absorbancję.
    UWAGA: Należy przeprowadzić trzy oddzielne pomiary przy rozcieńczeniach 1x, 10x i 50x próbki białka w celu uśrednienia i ilościowego oznaczenia białka. Próbki należy rozcieńczać w buforze do przechowywania.
  13. Dostosuj stężenie próbek białkowych do 100 µM przy użyciu 2x buforu do przechowywania. Rozcieńczyć skorygowaną próbkę w stosunku 1:1 objętościowo z 100% glicerolem. Przechowywać otrzymany roztwór białka w temperaturze -80 °C.

5. Elektroforeza żelowa białek w obecności dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) produktu białkowego: Dzień 3

  1. Przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE w celu analizy białek. Wymieszaj 9 µL próbki z 3 µL 4x barwnika do nakładania białek z dodecylosiarczanem litu (LDS). Inkubuj próbki w temperaturze 95 °C przez 10 min.
  2. Naładuj próbki na żel 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE. W pierwszej studzience nanieś marker mas białek, a następnie kolejne próbki (od lewej do prawej): flow-through, przemywanie 1, przemywanie 2, przemywanie 3, elucja 1, elucja 2, elucja 3 oraz całkowitą elucję odsoloną.
    UWAGA: Tabela 5 zawiera schemat nakładania próbek na żel SDS-PAGE.
  3. Elektroforezę próbek na żelu przeprowadź w buforze kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) przez 35 min przy napięciu 200 V. Przepłucz żel w czystej kuwecie trzy razy po 10 min, używając za każdym razem 200 mL ddH2O, przy delikatnym mieszaniu w celu usunięcia SDS z matrycy żelu.
    UWAGA: Należy stosować środki ochrony osobistej, aby uniknąć ostrej toksyczności związanej z MES.
  4. Zafarbuj żel 20 mL Coomassie blue i inkubuj go przez noc w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Odbarwiaj żel dwukrotnie po 1 h każdy, używając 200 mL ddH2O, przy delikatnym mieszaniu na wstrząsarze orbitalnym.
    UWAGA: Dłuższe przemywanie żelu lub częsta wymiana wody zwiększy czułość. Ponadto umieszczenie w pojemniku złożonej chusteczki do zadań precyzyjnych w celu absorpcji nadmiaru barwnika przyspieszy proces odbarwiania.

6. Weryfikacja funkcjonalna SNAP T7 RNAP poprzez transkrypcję in vitro

UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano matrycę DNA, która koduje fluorescencyjny aptamer RNA Broccoli, co umożliwia wykorzystanie fluorescencji do monitorowania kinetyki transkrypcji za pomocą płytkowego czytnika fluorescencyjnego.

  1. Przygotuj trzy reakcje transkrypcji in vitro (IVT), aby porównać aktywność SNAP T7 RNAP z polimerazą T7 typu dzikiego (WT) z komercyjnego źródła oraz z kontrolą zawierającą wyłącznie bufor. Dostosuj objętość każdej reakcji do 20 µL.
    1. Przygotuj reakcję IVT z SNAP T7 RNAP, mieszając 2 µL 10x buforu do transkrypcji, 0,4 µL mieszaniny 25 mM rybonukleozydowych trifosforanów (rNTP), 5 µL 500 nM matrycy DNA, 2 µL 500 nM SNAP T7 RNAP oraz 10,6 µL ddH2O.
    2. Przygotuj reakcję IVT z WT RNAP, mieszając 2 µL 10x buforu do transkrypcji, 0,4 µL mieszaniny 25 mM rNTP, 5 µL 500 nM matrycy DNA, 2 µL WT T7 RNAP oraz 10,6 µL ddH2O.
    3. Przygotuj reakcję IVT z samym buforem, mieszając 2 µL 10x buforu do transkrypcji, 0,4 µL mieszaniny 25 mM rNTP, 5 µL 500 nM matrycy DNA oraz 12,6 µL ddH2O.
      UWAGA: RNAP dodaj na samym końcu, utrzymując próbki w lodzie aż do momentu jej wprowadzenia. Tabela 6, Tabela 7 i Tabela 8 zawierają skład reakcji IVT.
  2. Monitoruj kinetykę transkrypcji za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek przez 2 h w odstępach 2 min w temperaturze 37 °C, stosując długość fali wzbudzenia 470 nm i długość fali emisji 512 nm.

7. Przygotowanie oligonukleotydów modyfikowanych BG: Dzień 1

  1. Rozpuścić oligonukleotyd z modyfikacją aminową na końcu 3' w wodzie ddH2do stężenia końcowego 1 mM. Oznakuj to S1.
    1. Wymieszać 25 µL 1 M wodorowęglanu sodu (NaHCO3), 284 µL 100% dimetylosulfotlenku (DMSO), 125 µL S1 (stoku oligonukleotydów) oraz 66 µL 50 mM BG-Nester N-hydroksysukcynimidu (NHS) (BG-GLA-NHS) rozcieńczony DMSO, dostosować objętość do 500 µLi inkubować przez noc w temperaturze pokojowej przy 100 × g.
      UWAGA: Należy przechowywać DMSO z dala od źródeł ciepła i otwartego ognia, ponieważ jest to ciecz łatwopalna. Tabela 9 zawiera wzór reakcji koniugacji BG z oligonukleotydem.

8. Wytrącanie koniugatu BG-oligonukleotydu w etanolu/acetonie: Dzień 2

  1. Odwiruj produkt z etapu 7.1.1 przy 13 000 × g przez 5 min. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki, a wytrącone BG odrzucić. Podzielić odczynnik na dwie równe 250 µL alikwoty, aby zapobiec przepełnieniu, a następnie wykonać poniższe kroki na obu alikwotach.
  2. Dodać 1/10th objętości 3 M octanu sodu (25 µL), a następnie 2,5-krotności objętości w 100% etanolu (625 µL). Inkubować w temperaturze -80 °C przez 1 h.
    UWAGA: Podczas pracy z octanem sodu (może powodować podrażnienie oczu, skóry, przewodu pokarmowego i dróg oddechowych) oraz etanolem (skrajnie łatwopalny, powoduje podrażnienia w kontakcie ze skórą) należy stosować środki ochrony osobistej. W razie potrzeby można przerwać eksperyment w tym miejscu i kontynuować go następnego dnia.
  3. Umieść probówki w wirówce i zaznacz ich zewnętrzną krawędź. Wirować probówki z prędkością 17 000 × g przez 30 min w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Osad oligonukleotydów pojawi się na zaznaczonym brzegu probówki.
  4. Bez naruszania osadu usunąć nadsącz. Dopełnić do objętości 750 µL schłodzonego 70% etanolu, a następnie wirować przy 17 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  5. Bez naruszania osadu usunąć nadsącz. Dopełnić do objętości 750 µL z 100% acetonu, a następnie wirować przy 17 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Podczas pracy z acetonem należy stosować środki ochrony osobistej, ponieważ jest on skrajnie łatwopalny i powoduje podrażnienia w przypadku kontaktu.
  6. Przy otwartej pokrywce probówki suszyć na powietrzu przez 5 min, aby usunąć nadmiar acetonu poprzez odparowanie. Ponownie rozpuścić oligonukleotyd w 250 µL buforu Tris-EDTA (TE) 1x w celu uzyskania ~850 µM roztwór oligonukleotydów BG.
  7. Powtórzyć kroki od 8.2 do 8.6 i ponownie rozpuścić w 70 µL buforu TE 1x. Oznakuj tę S2.

9. Oczyszczanie oligonukleotydów BG za pomocą chromatografii żelowej

  1. Resuspend matrycę, energicznie odwracając kolumny kilka razy; zdejmij górną zatyczkę i odłam dolną końcówkę kolumny. Umieść kolumnę w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 mL i wiruj probówkę przy 1,000 × g przez 1 min w temperaturze pokojowej. Usuń eluat i probówkę zbieralną.
    UWAGA: Ważne jest zapobieganie powstawaniu próżni. Użyj przygotowanych kolumn natychmiast.
  2. Umieść upakowane kolumny w czystych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 mL. Dodaj 300 µL buforu 1x TE na środek złoża kolumny i wiruj przy 1,000 × g przez 2 min w celu wymiany roztworu buforu. Ponownie usuń eluat i probówkę zbieralną.
  3. Umieść kolumny po wymianie buforu w czystych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 mL. Nanieś do 75 µL próbki na środek złoża. Wiruj przy 1,000 × g przez 4 min.
    UWAGA: Nie zakłócaj złoża i nie dotykaj ścianek kolumny; najwyższy punkt medium żelowego powinien być skierowany w stronę zewnętrznej części rotora.
  4. Zbierz eluat z probówki zbieralnej, ponieważ zawiera on oczyszczone kwasy nukleinowe. Aby określić ilość próbki, zmierz jej absorbancję przy 260 nm; oznacz tę wartość jako S3.
    ​UWAGA: Zwróć uwagę na długość drogi optycznej zastosowaną w pomiarze i oblicz stężenie, korzystając z prawa Beer-Lamberta.

10. Analiza koniugatu BG-oligonukleotydu za pomocą denaturującego PAGE

  1. Odlej żel PAGE 18% Tris-boran-EDTA (TBE)-mocznik. Rozpuść 4,8 g mocznika (UREA), 4,5 mL 40% akryloamidu (19:1) oraz 1 mL 10x TBE w 2,8 mL ddH2O; dodaj 5 µL tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i wymieszaj dokładnie. Powtórz czynność, dodając 100 µL 10% persiarczanu amonu (APS). Wlej roztwór do pustej kasety żelowej i pozostaw do polimeryzacji na 40 min.
    UWAGA: Podczas pracy z mocznikiem (powoduje podrażnienia oczu i skóry), akryloamidem (toksyczny i rakotwórczy) oraz TEMED (toksyczny, łatwopalny, żrący) należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. Tabela 10 zawiera formułę reakcji dla 18% żelu poliakrylamidowego TBE-UREA.
  2. Podgrzej w kuchence mikrofalowej 500 mL buforu TBE (0,5x) przez 2 min i 30 s lub do osiągnięcia temperatury ~70 °C i wlej do aparatury do elektroforezy. Przygotuj denaturujący barwnik do nakładania próbek zawierający 95% formamidu + 1 mM EDTA oraz błękit bromofenolowy. Wymieszaj barwnik z każdą próbką, a następnie nanieś mieszaninę na żel poliakrylamidowy.
    UWAGA: Podczas pracy z formamidem należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, ponieważ jest on rakotwórczy. Tabela 11 zawiera przykładową tabelę nakładania próbek na żel.
  3. Prowadź elektroforezę przy napięciu 270 V przez 35 min lub do momentu, gdy czoło barwnika dotrze do końca żelu. Umieść żel w kuwecie i barw barwnikiem cyjaninowym do kwasów nukleinowych przez 15 min w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem.
    UWAGA: Podczas pracy z barwnikiem cyjaninowym należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, ponieważ jest on łatwopalny.

11. Koniugacja oligonukleotydu z SNAP T7 RNAP i analiza metodą PAGE

  1. Przygotować odczynniki do sprzęgania BG-oligonukleotydu z SNAP T7 RNAP w skali analitycznej: przygotować 9 rozcieńczeń jednoniciowego DNA (ssDNA) oligo w ddH2O, aby uzyskać stosunki oligo:RNAP w zakresie od 5:1 do 1:5. Rozcieńczyć roztwór białka do stężenia 50 µM.
    UWAGA: Przykładowe stosunki znajdują się w Tabeli 12; stosunki te obliczono przy założeniu stężenia RNAP wynoszącego 50 µM.
  2. Dla każdego rozcieńczenia ssDNA oligo przygotować 10 µL mieszaniny reakcyjnej zawierającej 2 µL buforu SNAP, 4 µL BG-oligonukleotydu oraz 4 µL SNAP T7 RNAP.
    UWAGA: Tabela 13 zawiera schematy reakcji dla procesu znakowania SNAP-tagiem.
    1. Przygotować dwie dodatkowe próbki kontrolne: 1) kontrolę RNAP, zastępując BG-oligonukleotyd ddH2O; 2) kontrolę DNA, zastępując SNAP T7 RNAP ddH2O (dla najniższego stężenia oligonukleotydu względem SNAP T7 RNAP). Inkubować wszystkie próbki w temperaturze pokojowej przez 1 h, a następnie przechowywać na lodzie do czasu użycia.
  3. Przygotować jedenaście reakcji o objętości 10 µL, dodając 2 µL każdej próbki do 4 µL buforu SNAP oraz 2 µL barwnika do ładowania białek, a następnie ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 10 min. Nałożyć 2 µL każdej próbki na żel białkowy Bis-Tris 4-12% i przeprowadzić elektroforezę w żelu na lodzie przy napięciu 200 V przez 35 min.
    UWAGA: Tabela 14 zawiera schematy reakcji dla próbek nakładanych na żel.
    1. Wypłukać SDS poprzez trzykrotną wymianę wody na wytrząsarce, gdzie każde płukanie trwa 10 min. Przed obrazowaniem barwić barwnikiem cyjaninowym do kwasów nukleinowych przez 15 min. Ponownie zbarwić żel, używając 20 mL barwnika Coomassie blue przez 1 h. Odbarwić w ddH2O przez 1 h (lub przez noc) przed obrazowaniem.
      UWAGA: W żelu jedna z reakcji wykaże największą ilość sprzężonej polimerazy przy najmniejszej ilości nadmiarowego wolnego BG-oligonukleotydu; jest to stosunek optymalny.
  4. Przygotować odczynniki do sprzęgania BG-oligonukleotydu z SNAP T7 RNAP w skali preparatywnej. Przeprowadzić reakcję sprzęgania z zastosowaniem optymalnego stosunku wyznaczonego w skali analitycznej.
    ​UWAGA: Zminimalizować ekspozycję białka na temperaturę pokojową, trzymając je na lodzie, gdy nie jest używane.

12. Oczyszczanie SNAP-T7 z przyłączonymi oligonukleotydami przy użyciu kolumn do wymiany jonowej

  1. Jeśli instrukcje producenta dotyczące przygotowania probówek różnią się od poniższych, należy postępować zgodnie z wytycznymi producenta. Przygotować bufor do oczyszczania o pH wyższym niż punkt izoelektryczny białka.
    UWAGA: W przypadku białka użytego jako przykład w tym protokole, zastosowano bufor do oczyszczania w postaci 10 mM buforu fosforanowego sodu (pH 7).
    1. Przygotować 1 000 µL buforu elucyjnego o końcowych stężeniach 50 mM Tris i 0,5 M NaCl. Wymieszać 50 µL 1 M Tris, 100 µL 5 M NaCl oraz 850 µL ddH2O.
      UWAGA: Tabela 15 zawiera formułę reakcji dla buforu elucyjnego.
  2. Umieścić kolumnę w probówce wirówkowej o pojemności 2 mL i przemyć buforem do oczyszczania, wirując przy 2 000 × g przez 15 min lub do momentu całkowitego przepływu buforu. Odrzucić przemywany bufor.
  3. Rozcieńczyć każdą próbkę buforem do oczyszczania w stosunku bufor do próbki 3:1, a następnie nanosić próbkę na kolumnę w ilościach po 400 µL. Wirować przy 2 000 × g przez 10 min lub do momentu całkowitego przepływu buforu. Zebrać frakcję przepływową i oznaczyć ją jako flow-through.
  4. Dodać 400 µL buforu do oczyszczania do centrum kolumny. Wirować przy 2 000 × g przez 15 min lub do momentu całkowitego przepływu buforu. Zebrać frakcję przepływową i oznaczyć ją jako wash 1. Powtórzyć czynność dwukrotnie dla frakcji wash 2 i wash 3.
  5. Dodać 50 µL buforu elucyjnego do centrum kolumny. Wirować przy 2 000 × g przez 5 min lub do momentu całkowitego przepływu buforu. Zebrać frakcję przepływową i oznaczyć ją jako eluate 1. Powtórzyć czynność dwukrotnie dla frakcji eluate 2 i eluate 3.
  6. Połączyć eluaty 1, 2 i 3 (oznaczyć jako total eluate), pozostawiając niewielką ilość każdego eluatu do analizy w żelu, a następnie zmierzyć absorbancję przy 260 nm (A260) i 280 nm (A280). Po pomiarze dodać glicerol w stosunku 1:1 i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego użycia.
  7. Użyć jednostki filtra odśrodkowego (0,5 mL; 30 kDa), aby wymienić bufor w frakcji total eluate na 2x bufor do przechowywania (~1:100) (oznaczyć jako product). Ponownie zmierzyć A260/280. Dodać glicerol w stosunku 1:1 i przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego użycia.
  8. Nanieść każdą frakcję: flow-through, wash 1-3, total eluate oraz product na żel 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE, wraz z markerem mas białkowych. Prowadzić elektroforezę przy napięciu 200 V przez 35 min lub do momentu dotarcia frontu barwnika do końca żelu.

13. Demonstracja kontroli aktywności przywiązanej polimerazy RNA na żądanie

  1. Przygotować 5x bufor do wyżarzania zawierający 25 mM Tris, 5 mM EDTA i 25 mM chlorku magnezu (MgCl2). Wymieszać 2,4 µL każdej matrycy (1 µM) z 5 µL buforu do wyżarzania i 14,2 µL ddH2O, aby otrzymać 25 µL dsDNA cage o stężeniu 1 µM. Inkubować ten roztwór w temperaturze 75 °C przez 2 min. W ten sam sposób wyżarzyć nici sens i antisense matrycy DNA promotora oraz aptameru zieleni malachitowej. Przygotować roztwór szczawianu zieleni malachitowej o stężeniu 1 mM.
    UWAGA: Tabela 16 zawiera skład 5x buforu do wyżarzania, Tabela 17 zawiera skład reakcji wyżarzania dwóch matryc ssDNA.
  2. Inkubować przywiązaną polimerazę SNAP T7 RNAP z dsDNA cage w stosunku molowym 1:5 w temperaturze pokojowej przez 15 min do końcowego stężenia 500 nM RNAP. Przechowywać na lodzie do momentu użycia.
  3. Rozgrzać czytnik płytek do 37 °C. Przygotować na lodzie trzy reakcje IVT o objętości 25 µL każda
    1. Przygotować reakcję zawierającą SNAP T7RNAP w klatce z czynnikami transkrypcyjnymi kwasów nukleinowych. Wymieszać 2,5 µL 10x buforu IVT, 1 µL mieszaniny rNTP 25 mM, 1 µL zieleni malachitowej 1 mM, 2,5 µL mieszaniny RNAP-cage, po 2,5 µL oligonukleotydów czynnika transkrypcyjnego A i B o stężeniu 1 µM oraz 3 µL matrycy aptameru zieleni malachitowej 1 mM w 10 µL ddH2O.
    2. Przygotować reakcję zawierającą SNAP T7RNAP w klatce bez czynników transkrypcyjnych kwasów nukleinowych. Wymieszać 2,5 µL 10x buforu IVT, 1 µL mieszaniny rNTP 25 mM, 1 µL zieleni malachitowej 1 mM, 2,5 µL mieszaniny RNAP-cage oraz 3 µL matrycy aptameru zieleni malachitowej 1 mM w 15 µL ddH2O.
    3. Przygotować reakcję zawierającą tylko bufor. Wymieszać 2,5 µL 10x buforu IVT, 1 µL mieszaniny rNTP 25 mM, 1 µL zieleni malachitowej 1 mM oraz 3 µL matrycy aptameru zieleni malachitowej 1 mM w 17,5 µL ddH2O.
      UWAGA: Tabela 18 zawiera ogólne zestawienie reakcji transkrypcji in vitro.
  4. Przenieść każdą reakcję na płytkę 384-dołkową. Monitorować transkrypcję aptameru zieleni malachitowej na fluorescencyjnym czytniku płytek przez 2 h w temperaturze 37 °C, przy wzbudzeniu 610 nm i emisji 655 nm. Po zakończeniu przechowywać płytkę na lodzie do momentu użycia.
  5. Podgrzać w mikrofalówce bufor 0,5x TBE przez 2 min 30 s lub do osiągnięcia temperatury ok. 70 °C. Produkty RNA z każdego dołka rozdzielić w denaturującym żelu poliakrylamidowym 12% TBE-Urea w podgrzanym buforze 0,5x TBE przy 280 V przez 20 min lub do momentu dotarcia frontu barwnika do końca żelu. Barwić żel barwnikiem kwasów nukleinowych z cyjaniną przez 10 min na wstrząsarze orbitalnym przed obrazowaniem.
    UWAGA: Tabela 19 zawiera skład denaturującego żelu PAGE 12% TBE-Urea.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza białek na żelu elektroforetycznym i wykres badania fluorescencyjnego przedstawiający wynik ekspresji SNAP T7 RNAP.
Rysunek 5: Analiza SDS-PAGE ekspresji SNAP T7 RNAP i badanie transkrypcji in vitro. (A) Analiza oczyszczania białka SNAP T7 RNAP, masa cząsteczkowa SNAP T7 RNAP: 119,4 kDa. F...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to demonstruje inspirowane nanotechnologią DNA podejście do kontrolowania aktywności polimerazy RNA T7 poprzez kowalencyjne sprzężenie N-końcowego rekombinowanego RNAP T7 znakowanego SNAP z oligonukleotydem funkcjonalizowanym BG, który następnie wykorzystano do programowania reakcji TMDSD. Zgodnie z projektem, znacznik SNAP został umieszczony na N-końcu polimerazy, ponieważ C-koniec dzikiego T7 RNAP jest zakopany w rdzeniu struktury białkowej i nawiązuje ważne kontakty z matrycą DNA28. Wcz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów finansowych, które mógłby zadeklarować.

Podziękowania

L.Y.T.C dziękuje za hojne wsparcie od New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant oraz University of Toronto's Medicine by Design Initiative, która otrzymuje fundusze z Canada First Research Excellence Fund (CFREF).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5% polisorbat 20 (TWEEN 20)BioShopTWN510.5
0,5 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Bio BasicSD8135
10 mM bufor fosforanowo-sodowy (pH 7)Bio BasicPD0435Tabletki używane do produkcji 10 mM buforu
10% nadsiarczanu amonu (APS)Sigma AldrichA3678-100G
100 kDa Amicon Ultra-15 Odśrodkowy Jednostka filtrującaFisher ScientificUFC910008
100% acetonFisher ChemicalA18P4
100% etanol (EtOH)Marka własna39752-P016-EAAN
10x bufor do transkrypcji in vitro (IVT) NewEngland BiolabsB9012
10x Bufor Tris-Boran-EDTA (TBE)Bio BasicA0026
1M Izopropyl β- d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Sigma AldrichI5502-1G
1M bufor wodorowęglanu soduSigma AldrichS6014-500G
1M Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)Sigma Aldrich648311-1KG
1X Bufor Tris-EDTA (TE)ThermoFisher12090015
2M imidazolSigma Aldrich56750-100G
2-merkaptoetanol (BME)Sigma AldrichM3148
3M octan soduBio BasicSRB1611
40% akryloamid (19:1)Bio BasicA00062
4x LDS bufor do ładowania próbki białkaFisher ScientificNP0007
5M chlorek sodu (NaCl)Bio BasicDB0483
5mM ditiotreitol (DTT)Sigma Aldrich43815-1G
6x barwnik ładujący żelNew England BiolabsB7024S
agaroza B w proszkuBio BasicAB0014
BG-GLA-NHSNew England BiolabsS9151S
BL21 kompetentny E. coliAddgeneC2530H
BLUeye wstępnie barwiona drabinka białkowaFroggaBioPM007-0500
błękit bromofenolowyBio BasicBDB0001
coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)ThermoFisherLC6060
barwnik cyjaninowy (barwnik żelowy kwasu nukleinowego SYBR Gold)FisherScientific S11494
(SYBR Safe Barwnik żelowy kwasu nukleinowego)Fisher ScientificS33102
suchy dimetylosulfotlenek (DMSO)Fisher ScientificD12345
formamidSigma AldrichF9037-100ML
glicerolBio BasicGB0232
siarczan kanamycynyBioShopKAN201.5
bulion lizogenicznySigma AldrichL2542-500ML
zielony szczawian malachituSigma Aldrich2437-29-8
N,N,N'N'-Tetrametyloetano-1,2-diamina (TEMED)Sigma AldrichT9281-25ML
NuPAGE MES SDS bufor do biegania (20x)Fisher ScientificLSNP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1,0 mm 12-dołkowyNP0322BOX
(antysens klatkowy)IDTN/ATATAGTGAGTCGTATTAATTTG
oligonukleotyd ( sens klatki)IDTN/ATCAGTCACCTATCTGTTTCAAA
TTAATACGACTCACTATA
oligonukleotyd (malachitowo-zielony antysens aptamerowy)IDTN/AGGATCCATTCGTTACCTGGCT
CTCGCCAGTCGGGATCCTATA
GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT
TATCGCCGTAGTTGGTGTACT
oligonukleotyd (malachit green aptamer sense)IDTN/ATAATACGACTCACTATAGGATC
CCGACTGGCGAGAGCCAGGT
Oligonukleotyd AACGAATGGATCC
(czynnik transkrypcyjny A)IDTN/AAGTACACCAACTACGAGTGAG
oligonukleotyd (czynnik transkrypcyjny B)IDTN/ATCAGTCACCTATCTGGCGATAA
Oligonukleotyd TGGAACTG z 3' Modyfikacja amin (tether)IDTN/AGCTACTCACTCAGATAGGTGAC
TGA/3AmMO/
Pierce silne kolumny spinowe wymiany jonowejFisher Scientific90008
kodowanie plazmidu SNAP T7 Geny oporności na RNAP i kanamycynęGenscriptN/Aniestandardowa kolumna oczyszczająca białko z wkładką genową
(kolumna spinowa HisPur Ni-NTA)Fisher Scientific88226
Mieszanka rNTPNew England BiolabsN0466S
Roche mini szybka kolumna wirująca DNASigma Aldrich11814419001
Triton X-100Sigma AldrichT8787-100ML
Drabinka DNA Ultra Low RangeFisher Scientific10597012
mocznikBioShopURE001.1
Barwnik cyjaninowy oligonukleotyd Life Technologies

Bibliografia

  1. Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
  2. Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 475 (7356), 368-372 (2011).
  3. Chen, Y. -J., et al. Programmable chemical controllers made from DNA. Nature Nanotechnology. 8 (10), 755-762 (2013).
  4. di Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. Predicting synthetic gene networks. Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).
  5. Xiang, Y., Dalchau, N., Wang, B. Scaling up genetic circuit design for cellular computing: advances and prospects. Natural Computing. 17 (4), 833-853 (2018).
  6. Gould, N., Hendy, O., Papamichail, D. Computational tools and algorithms for designing customized synthetic genes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2, (2014).
  7. MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational sequence design with R2oDNA Designer. Mammalian Synthetic Promoters. 1651, 249-262 (2017).
  8. Cervantes-Salido, V. M., Jaime, O., Brizuela, C. A., Martínez-Pérez, I. M. Improving the design of sequences for DNA computing: A multiobjective evolutionary approach. Applied Soft Computing. 13 (12), 4594-4607 (2013).
  9. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. Journal of Computational Chemistry. 32 (1), 170-173 (2011).
  10. Fornace, M. E., Porubsky, N. J., Pierce, N. A. A unified dynamic programming framework for the analysis of interacting nucleic acid strands: enhanced models, scalability, and speed. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2665-2678 (2020).
  11. Wetterstrand, K. DNA sequencing costs: Data. Genome.gov. , (2020).
  12. Lopez, R., Wang, R., Seelig, G. A molecular multi-gene classifier for disease diagnostics. Nature Chemistry. 10 (7), 746-754 (2018).
  13. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  14. Yurke, B., Turberfield, A. J., Mills, A. P., Simmel, F. C., Neumann, J. L. A DNA-fuelled molecular machine made of DNA. Nature. 406 (6796), 605-608 (2000).
  15. Lin, K. N., Volkel, K., Tuck, J. M., Keung, A. J. Dynamic and scalable DNA-based information storage. Nature Communications. 11 (1), 2981(2020).
  16. Yurke, B., Mills, A. P. Using DNA to power nanostructures. Genetic Programming and Evolvable Machines. 4 (2), 111-122 (2003).
  17. Zhang, D. Y., Turberfield, A. J., Yurke, B., Winfree, E. Engineering entropy-driven reactions and networks catalyzed by DNA. Science. 318 (5853), 1121-1125 (2007).
  18. Wang, B., Thachuk, C., Ellington, A. D., Winfree, E., Soloveichik, D. Effective design principles for leakless strand displacement systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (52), 12182-12191 (2018).
  19. Machinek, R. R. F., Ouldridge, T. E., Haley, N. E. C., Bath, J., Turberfield, A. J. Programmable energy landscapes for kinetic control of DNA strand displacement. Nature Communications. 5 (1), 5324(2014).
  20. Cabello-Garcia, J., Bae, W., Stan, G. -B. V., Ouldridge, T. E. Handhold-mediated strand displacement: a nucleic acid-based mechanism for generating far-from-equilibrium assemblies through templated reactions. bioRxiv. , (2020).
  21. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  22. Khalil, A. S., et al. A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions. Cell. 150 (3), 647-658 (2012).
  23. Swank, Z., Laohakunakorn, N., Maerkl, S. J. Cell-free gene-regulatory network engineering with synthetic transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (13), 5892-5901 (2019).
  24. Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles. Journal of immunotherapy. 31 (7), 607(2008).
  25. Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits. Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).
  26. Baugh, C., Grate, D., Wilson, C. 2.8 Å crystal structure of the malachite green aptamer11. Journal of Molecular Biology. Doudna, J. A. 301 (1), 117-128 (2000).
  27. Chou, L. Y. T., Shih, W. M. In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors. ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).
  28. Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis. Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).
  29. Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors. Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).
  30. Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase. Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).
  31. Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase. Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).
  32. Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step. Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).
  33. Zhang, W. -B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

nanotechnologia DNApolimeraza RNA T7przywi zanie DNAsieci regulacji gen wwypieranie nicisztuczne czynniki transkrypcyjneSDS PAGEfluorescencyjny czytnik p ytek
Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.