Artykuł metodologiczny

Monowarstwa nabłonka pochodząca z organoidów: klinicznie istotny model in vitro dla funkcji bariery jelitowej

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62074

⸱

29 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy przygotowanie monowarstw nabłonka jelitowego pochodzących od ludzkich organoidów do badania funkcji bariery jelitowej, przepuszczalności i transportu. Ponieważ organoidy reprezentują pierwotną reakcję tkanki nabłonkowej na bodźce zewnętrzne, modele te łączą zalety rozszerzalności linii komórkowych oraz znaczenie i złożoność tkanki pierwotnej.

Streszczenie

W przeszłości modele nabłonków jelitowych były ograniczone do przekształconych linii komórkowych i tkanek pierwotnych. Te systemy modelowe mają nieodłączne ograniczenia, ponieważ te pierwsze nie reprezentują wiernie oryginalnej fizjologii tkanek, a dostępność tych drugich jest ograniczona. W związku z tym ich stosowanie utrudnia badania podstawowe i badania nad rozwojem leków. Organoidy oparte na dorosłych komórkach macierzystych (zwane dalej organoidami) są miniaturami normalnej lub chorej tkanki nabłonkowej, z której pochodzą. Można je bardzo skutecznie ustalać z różnych regionów przewodu pokarmowego (GI), mają długoterminową zdolność do rozbudowy i symulują specyficzne dla tkanek i pacjentów reakcje na leczenie in vitro. W tym miejscu wykazano tworzenie monowarstw nabłonka pochodzących z organoidów jelitowych wraz z metodami pomiaru integralności bariery nabłonkowej, przepuszczalności i transportu, wydzielania białek przeciwdrobnoustrojowych, a także histologii. Co więcej, monowarstwy pochodzące z organoidów jelitowych mogą być wzbogacone o proliferujące komórki macierzyste i wzmacniające tranzyt, a także o kluczowe zróżnicowane komórki nabłonkowe. W związku z tym stanowią one system modelowy, który można dostosować do badania wpływu związków na komórki docelowe i ich sposób działania. Chociaż hodowle organoidów są technicznie bardziej wymagające niż linie komórkowe, po ustaleniu mogą zmniejszyć liczbę niepowodzeń na późniejszych etapach opracowywania leku, ponieważ naprawdę reprezentują złożoność nabłonka in vivo i niejednorodność między pacjentami.

Wprowadzenie

Nabłonek jelitowy działa jak fizyczna bariera między zawartością światła w jelitach a leżącą pod nim tkanką. Bariera ta składa się z pojedynczej warstwy nabłonkowej składającej się głównie z absorpcyjnych enterocytów, które są połączone ścisłymi połączeniami, które tworzą silne połączenia międzykomórkowe między sąsiednimi komórkami. Komórki te tworzą spolaryzowaną wyściółkę nabłonkową, która oddziela wierzchołkową (światło) i podstawno-boczną stronę jelita, jednocześnie regulując transport parakomórkowy strawionych składników odżywczych i metabolitów. Oprócz enterocytów inne ważne komórki nabłonkowe, takie jak komórki kubkowe, paneth i enteroendokrynne, również przyczyniają się do homeostazy jelit poprzez wytwarzanie odpowiednio śluzu, peptydów przeciwdrobnoustrojowych i hormonów. Nabłonek jelitowy jest stale uzupełniany przez dzielenie bogatych w leucynę, zawierających powtórzenia, zawierających powtórzenia komórek macierzystych 5-dodatnich receptorów (LGR5+) sprzężonych z białkiem G na dnie krypt jelitowych, wytwarzając komórki amplifikujące tranzyt (TA), które migrują w górę i różnicują się w inne typy komórek1. Zaburzenie homeostazy nabłonka jelitowego przez czynniki genetyczne i środowiskowe, takie jak narażenie na alergeny pokarmowe, związki lecznicze i patogeny drobnoustrojowe, prowadzi do zaburzenia funkcji bariery jelitowej. Stany te powodują kilka chorób jelit, w tym nieswoiste zapalenie jelit (IBD), celiakię i toksyczność przewodu pokarmowego wywołaną lekami2.

Badania nad nabłonkiem jelitowym są wykonywane przy użyciu kilku systemów platform in vitro, takich jak wkładki membranowe, systemy narządów na chipie, komory Ussinga i pierścienie jelitowe. Platformy te nadają się do tworzenia spolaryzowanych monowarstw nabłonka z dostępem zarówno do wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej strony błony, wykorzystując jako modele przekształcone linie komórkowe lub tkankę pierwotną. Chociaż przekształcone linie komórkowe, takie jak linie komórkowe raka jelita grubego (adeno)rak Caco-2, T84 i HT-29, są w stanie do pewnego stopnia różnicować się w spolaryzowane enterocyty jelitowe lub komórki wytwarzające śluz, nie są one reprezentatywne dla nabłonka in vivo, ponieważ brakuje kilku typów komórek, a różne receptory i transportery są nieprawidłowo wyrażane3. Ponadto, ponieważ linie komórkowe pochodzą od jednego dawcy, nie reprezentują one heterogeniczności między pacjentami i cierpią z powodu zmniejszonej złożoności i znaczenia fizjologicznego. Chociaż tkanki pierwotne stosowane w komorach Ussinga i jako pierścienie jelitowe są bardziej reprezentatywne dla sytuacji in vivo, ich ograniczona dostępność, krótkoterminowa żywotność i brak możliwości rozszerzania sprawiają, że nie nadają się jako pożywka do badań wysokoprzepustowych (HT).

Organoidy to kultury nabłonkowe in vitro powstałe z różnych organów, takich jak jelita, nerki, wątroba, trzustka i płuca. Udowodniono, że mają długoterminową, stabilną zdolność do rozszerzalności, a także stabilność genetyczną i fenotypową, a zatem są reprezentatywnymi biologicznymi miniaturami nabłonka pierwotnego narządu z wiernymi reakcjami na bodźce zewnętrzne4,5,6,7,8,9. Organoidy są skutecznie tworzone z wyciętej lub biopsji tkanki normalnej, chorej, zapalnej lub nowotworowej, reprezentując heterogeniczne odpowiedzi specyficzne dla pacjenta10,11,12,13,14,15,16. W artykule pokazano, w jaki sposób ustalić monowarstwy nabłonka jelitowego pochodzące z kultur organoidów. Z powodzeniem stworzono monowarstwy z kultur organoidów w jelicie cienkim, okrężnicy i odbycie. Model ten stwarza możliwość badania transportu i przepuszczalności komórek nabłonka do leków, a także ich toksykologicznego wpływu na nabłonek. Co więcej, model umożliwia współhodowlę z komórkami odpornościowymi i bakteriami w celu zbadania ich interakcji z nabłonkiem jelitowym17,18,19. Co więcej, model ten może być wykorzystany do badania odpowiedzi na terapie w sposób specyficzny dla pacjenta i inicjowania badań przesiewowych w celu poszukiwania kolejnej fali terapii skoncentrowanych na barierze nabłonkowej. Takie podejście można rozszerzyć na klinikę i utorować drogę do spersonalizowanych zabiegów.

Chociaż monowarstwy nabłonkowe w tym protokole są przygotowane z normalnych organoidów jelitowych człowieka, protokół może być zastosowany i zoptymalizowany dla innych modeli organoidów. Monowarstwy organoidów nabłonkowych są hodowane w pożywce do ekspandowania organoidów jelitowych zawierającej Wnt w celu wspierania proliferacji komórek macierzystych i reprezentowania składu komórkowego krypty jelitowej. Organoidy jelitowe można wzbogacić, aby miały różne losy nabłonka jelitowego, takie jak enterocyty, Paneth, kielichy i komórki enteroendokrynne, poprzez modulację szlaków Wnt, Notch i naskórkowego czynnika wzrostu (EGF). Tutaj, po ustanowieniu monowarstw w podłożu ekspandacyjnym, są one kierowane w kierunku bardziej zróżnicowanych komórek nabłonka jelitowego, jak opisano wcześniej20,21,22,23,24,25. Do celów przesiewowych, w zależności od sposobu działania związku będącego przedmiotem zainteresowania, jego komórek docelowych i warunków eksperymentalnych, monowarstwy można skierować w kierunku wybranego składu komórkowego, aby zmierzyć wpływ związku z odpowiednimi odczytami funkcjonalnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników do hodowli

UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przestrzegając standardowych wytycznych dotyczących pracy z kulturami komórkowymi. Przed uruchomieniem komory stosuje się naświetlanie promieniami ultrafioletowymi przez 10 min. Przed i po użyciu powierzchnię komory należy oczyścić ręcznikiem papierowym nasączonym 70% etanolem. Aby ułatwić formowanie trójwymiarowych kropel macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), należy przygotować w inkubatorze w temperaturze 37 °C podgrzane wcześniej płytki 96-, 24- i 6-dołkowe.

  1. Przygotowanie pożywki podstawowej
    1. Przygotować pożywkę podstawową (BM) w butelce 500 mL Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium z dodatkiem Ham's Nutrient Mixture F-12 (Ad-DF), dodając 5 mL 200 mM glutaminy, 5 mL 1 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) oraz 5 mL roztworów penicyliny/streptomycyny (pen/strep) (10 000 U/mL lub 10 000 µg/mL). Pożywkę tę można przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 tygodnie.
  2. Źródła Wnt
    1. Przygotować pożywkę warunkowaną Wnt3a (Wnt3aCM) zgodnie z wcześniej opisaną metodą26.
      UWAGA: Opracowano nową generację syntetycznego Wnt (NGS-Wnt), który również wspomaga ekspansję ludzkich organoidów jelitowych27.
  3. Przygotowanie pożywki bazowej do organoidów jelitowych
    UWAGA: Wszystkich czynników wzrostu i odczynników należy używać zgodnie z zaleceniami producenta. Należy stosować małe alikwoty i unikać cykli zamrażania i rozmrażania; funkcjonalne czynniki wzrostu są niezbędne dla pomywnej hodowli organoidów.
    1. Przygotować skoncentrowaną 2x pożywkę bazową do organoidów jelitowych (2x IBM), uzupełniając BM o 1 µM A83-01, 2,5 mM N-acetylocysteinę, suplement B27 2x, 100 ng/mL ludzki czynnik wzrostu naskórka (hEGF), 10 nM gastrynę, 200 ng/mL hNoggin oraz 100 µg/mL preparatu przeciwdrobnoustrojowego dla komórek pierwotnych (patrz Tabela Materiałów).
    2. Rozdzielić 2x IBM na alikwoty i zamrozić w temperaturze -20 °C na maksymalnie 4 miesiące. W razie potrzeby rozmrozić alikwot przez noc w temperaturze 4 °C lub przez kilka godzin w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Aby przygotować pożywkę do ekspansji organoidów jelitowych (IEM), należy uzupełnić 2x IBM o 50% Wnt3aCM lub 50% BM i 0,5 nM NGS-Wnt, 250 ng/mL ludzką Rspondynę-3 (hRspo3), 10 mM nikotynamid oraz 10 µM SB202190.
  4. Przygotowanie pożywki różnicującej organoidy jelitowe
    1. Przygotować pożywkę do różnicowania enterocytów (eDM), uzupełniając 2x IBM o 50% BM, 250 ng/mL hRspo3 oraz 1,5 µM inhibitor szlaku Wnt (IWP-2). Przechowywać eDM w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 10 dni.
    2. Przygotować kombinowaną pożywkę różnicującą (cDM), uzupełniając 2x IBM o 40% BM i 10% Wnt3aCM lub 50% BM i 0,1 nM NGS-Wnt, 250 ng/mL hRspo3, 10 µM DAPT oraz 100 nM PD0325901. Przechowywać cDM w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 10 dni.
  5. Manipulacja macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)
    UWAGA: Macierz zewnątrzkomórkową (ECM) (patrz Tabela Materiałów) należy przygotować zgodnie z zaleceniami producenta.
    1. Rozmrozić ECM przez noc na lodzie; przenieść ECM z butelki do probówki stożkowej 15 mL za pomocą pipety 5 mL, obie schłodzone wcześniej do -20 °C. Alikwoty zamrażać ponownie tylko raz w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu przechowywać ECM w lodówce w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 7 dni. Przed użyciem inkubować przez co najmniej 30 min na lodzie.
      ​UWAGA: Prawidłowo wymieszać ECM i upewnić się, że jest zimna przed osadzaniem krypt lub organoidów.

2. Hodowle organoidów

  1. Zakładanie kultur z zamrożonych organoidów
    UWAGA: Pozostawić BM w temperaturze pokojowej (RT) i przygotować alikwot 12 mL, podgrzany do 37 °C, przed rozpoczęciem procedury rozmrażania jednej kryfiolki zawierającej zamrożone organoidy.
    1. Szybko rozmrozić kryfiolkę z organoidami, wytrząsając ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, aż pozostanie jedynie niewielki odłamek lodu. Bezzwłocznie dodać do kryfiolki kroplami 500 µL ciepłego BM i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby rozcieńczyć medium do zamrażania i starannie wymieszać zawartość.
    2. Za pomocą pipety P1000 przenieść organoidy do probówki stożkowej 15 mL i dodać kroplami kolejny 1 mL ciepłego BM, delikatnie mieszając dno probówki. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby rozcieńczyć medium do zamrażania i starannie wymieszać zawartość.
    3. Dodać kroplami do 12 mL ciepłego BM do probówki stożkowej 15 mL zawierającej organoidy i pipetować w górę i w dół za pomocą sterylnej pipety 10 mL, aby delikatnie resuspendować organoidy.
    4. Wirować zawiesinę z organoidami przez 5 min przy 85 × g i 8 °C. Ostrożnie odlać nadsącz, nie naruszając osadu, a następnie resuspendować organoidy w 30% v/v IEM uzupełnionym o 10 µM Y27632 lub inny inhibitor kinazy serynowo-treoninowej białka ROCK (inhibitor ROCK). Umieścić probówkę na lodzie.
    5. Dodać 70% v/v ECM do probówki stożkowej 15 mL zawierającej organoidy. Wymieszać zawiesinę z organoidami, trzymając probówkę stożkową 15 mL na lodzie, i nanieść 5 µL zawiesiny, aby sprawdzić gęstość (Rysunek 1A). Kontynuować wysiew, jeśli gęstość jest odpowiednia; jeśli gęstość jest zbyt wysoka, dodać więcej roztworu IEM/ECM w tym samym stosunku 30-70% v/v odpowiednio.
    6. W każdym dołku podgrzanej wcześniej płytki 24-dołkowej nanieść 50 µL zawiesiny z organoidami, pipetując 5 oddzielnych kropel po 10 µL (Rysunek 1B). Odwrócić płytkę do góry dnem i pozostawić w komorze z laminarnym przepływem powietrza na 5 min. Przenieść płytkę, wciąż odwróconą do góry dnem, do inkubatora 37 °C i pozostawić na kolejne 30 min.
    7. Dodać 500 µL IEM z 10 µM inhibitorem ROCK do każdego dołka i przenieść płytkę do inkubatora. Regularnie obrazować jedną kroplę, aby monitorować wzrost, i odświeżać IEM co 2-3 dni poprzez odessanie starego medium i dodanie 500 µL świeżego IEM.
    8. Przeprowadzić pasaż organoidów, gdy odpowiednio odzyskają sprawność po rozmrażaniu i osiągną właściwy rozmiar do obróbki (Rysunek 1C), zgodnie z opisem w sekcji 2.2.
  2. Pasaż organoidów jelitowych
    ​UWAGA: Schłodzić ECM na lodzie przez co najmniej 30 min i pozostawić IEM w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 1 h przed użyciem.
    1. Użyć medium z jednego dołka hodowlanego do rozbicia kopułek organoidów za pomocą niskoretencyjnego filtra-tipa 1250 µL, a następnie przenieść zawartość do opisanej probówki stożkowej 15 mL. Przemyć dołek 1 mL BM i przenieść go do tej samej probówki stożkowej 15 mL.
    2. Powtórzyć kroki 2.2.1 i 2.2.2 dla wszystkich pozostałych dołków (do jednej probówki stożkowej 15 mL można przemyć i dodać maksymalnie połowę płytki lub krople ECM o łącznej objętości 600 µL).
    3. Dodać BM, aby wypełnić probówkę do 12 mL, i pipetować w górę i w dół 10 razy za pomocą pipety 10 mL. Wirować przy 85 × g przez 5 min w 8 °C.
    4. Przed usunięciem BM sprawdzić pod mikroskopem, czy wszystkie organoidy osadziły się na dnie probówki stożkowej 15 mL (Rysunek 1D). Jeśli nad osadem organoidów nie ma ECM lub warstwa ECM jest czysta bądź zawiera jedynie zanieczyszczenia, pojedyncze komórki lub bardzo mało organoidów w porównaniu z osadem, odessać nadsącz i bardzo ostrożnie wypipetować ECM nad osadem organoidów za pomocą pipety P200.
      UWAGA: Organoidy mogą zostać uwięzione w ECM i nie osadzać się w postaci zwartego pelletu ze względu na niską siłę wirowania. Jeśli ECM zawiera organoidy, ponownie wirować probówkę przy 450 × g przez 5 min w 8 °C i ostrożnie usunąć nadsącz zgodnie z opisem w punkcie 2.2.4. W przypadku posiadania wielu probówek stożkowych 15 mL, można je połączyć po kroku 2.2.4.
    5. Dodać 1 mL BM do każdego osadu (objętość 50-200 µL, w zależności od kultury i gęstości organoidów) i starannie resuspendować. Pipetować organoidy w górę i w dół co najmniej 5 razy, aby je rozbić, unikając tworzenia piany. Sprawdzić pod mikroskopem, czy organoidy zostały rozbite (Rysunek 2A). Jeśli organoidy są rozbite, przejść do kroku 2.2.7; jeśli nie, pipetować je kolejne 5 razy. Tym razem dotykać końcówką pipety ścianki plastikowej probówki, aby przyłożyć większą siłę mechaniczną do rozbicia organoidów.
      ​UWAGA: Mechaniczne rozbijanie organoidów cystycznych (Rysunek 1C) i pączkujących (Rysunek 1E) jest możliwe przy użyciu plastikowego tipa do pipety 200 µL lub 10 µL założonego na niskoretencyjny filtra-tip 1250 µL (Rysunek 1F), w zależności od objętości wymaganej do rozbicia organoidów. Zaleca się stosowanie zwężonej pipety szklanej (Rysunek 1F), gdy obrabiane jest więcej niż 200 µL ECM zawierającego organoidy (jeden dołek płytki 6-dołkowej lub 4 dołki płytki 24-dołkowej).
    6. Ponownie sprawdzić pod mikroskopem, czy organoidy są rozbite. Jeśli tak, przejść do następnego kroku; jeśli nie, pipetować organoidy do 20 razy, regularnie sprawdzając je pod mikroskopem. Jeśli organoidy nadal nie są rozbite, dodać do zawiesiny 25% v/v odczynnika do dysocjacji komórek 1 (patrz Tabela materiałów), inkubować w kąpieli wodnej w 37 °C przez 2 min i pipetować organoidy do 20 razy, regularnie sprawdzając je pod mikroskopem, aby upewnić się, że nie zostały strawione do pojedynczych komórek.
    7. Dodać do 12 mL BM do probówki stożkowej 15 mL i przemyć osad organoidów, pipetując w górę i w dół. Wirować przy 85 × g przez 5 min w 8 °C. Odlać nadsącz i dostosować końcowe stężenie do 70% v/v ECM poprzez dodanie IEM i ECM do osadu organoidów.
    8. Rozpocząć resuspendowanie osadu organoidów w podwójnej objętości IEM/ECM zebranej do pasażu i nanieść 5 µL zawiesiny, aby sprawdzić gęstość. Kontynuować wysiew, jeśli gęstość jest odpowiednia (Rysunek 2B); dodać więcej roztworu IEM/ECM, jeśli gęstość jest zbyt wysoka. Dodać 200 µL zawiesiny do każdego dołka podgrzanej wcześniej płytki 6-dołkowej, tworząc oddzielne krople o objętości 10 µL.
    9. Odwrócić płytkę do góry dnem i pozostawić w komorze z laminarnym przepływem powietrza na 5 min. Przenieść płytkę, wciąż odwróconą do góry dnem, do inkubatora 37 °C i pozostawić na kolejne 30 min. Dodać 2 mL IEM z 10 µM inhibitorem ROCK do każdego dołka i przenieść płytkę do inkubatora.
    10. Regularnie obrazować jedną kroplę, aby monitorować wzrost, i odświeżać IEM co 2-3 dni poprzez odessanie starego medium i dodanie 2 mL świeżego IEM.
  3. Pasaż organoidów jelitowych do przygotowania nabłonkowej warstwy jednowarstwowej
    1. Przeprowadzić pasaż organoidów 3 dni przed ich zebraniem do przygotowania warstwy jednowarstwowej , stosując ten sam protokół pasażowania opisany w sekcji 2.2 z jednym wyjątkiem. W kroku 2.2.7 resuspendować organoidy w 1-1,5x objętości początkowej IEM/ECM, aby uzyskać wyższą gęstość i potencjał ekspansji podczas ich zbierania do przygotowania warstwy jednowarstwowej (Rysunek 3A).

3. Przygotowanie monowarstwy nabłonkowej

  1. Hodowla monowarstw nabłonkowych na insertach membranowych 24- i 96-dołkowych z zastosowaniem różnych dostępnych typów płytek (Tabela 1). Do obu rozmiarów należy używać insertów membranowych do systemów wysokoprzepustowych (HTS), ponieważ zawierają one zintegrowaną tacę z insertami membranowymi oraz płytkę odbiorczą. W formacie 24-dołkowym możliwe jest również zastosowanie płytek z oddzielnymi, wyjmowanymi insertami membranowymi.
    UWAGA: Dostępne są różne typy membran (politereftalan etylenu (PET) lub poliwęglan) oraz rozmiary porów (0,4-8,0 µm), które można dobrać w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Obrazowanie monowarstw w polu jasnym jest możliwe tylko przy użyciu insertów z membranami PET. Membrany światłoszczelne blokują wyciek światła fluorescencyjnego z komory apikalnej do basolateralnej i mogą być stosowane podczas badania dynamicznego transportu lub przepuszczalności substratów znakowanych fluorescencyjnie. Niniejszy protokół wykorzystuje inserty membranowe 24-dołkowe; adaptacje dla insertów 96-dołkowych opisano w sekcji 5. W zależności od gęstości, morfologii i rozmiaru organoidów (Rysunek 3A), 6 dołków płytki 6-dołkowej (wysianej zgodnie z sekcją 2.3) wystarcza do zasiania pełnej płytki 24-dołkowej z insertami membranowymi.
  2. Powlekanie insertów membranowych ECM
    UWAGA: W przypadku wątpliwości co do liczby dostępnych komórek, należy powlec inserty po przeliczeniu komórek. Ma to na celu zapobieganie niepotrzebnemu powlekaniu i utracie kosztownych insertów membranowych.
    1. Umieścić inserty membranowe w płytce wsporczej w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Rozcieńczyć ECM 40-krotnie w schłodzonym do temperatury lodowej fosforanie DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) z Ca2+ i Mg2+ i pipetować 150 µL rozcieńczonego ECM do komory apikalnej każdego insertu. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 h.
  3. Przygotowanie komórek do siania
    1. Wcześniej ogrzać alikwoty odczynnika 2 do dysocjacji komórek w kąpieli wodnej (37 °C). Przygotować 2 mL odczynnika dla każdego dołka płytki 6-dołkowej.
    2. Przenieść płytkę hodowlaną zawierającą organoidy (przygotowaną w sekcji 2.3) z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza. Przetworzyć organoidy zgodnie z opisem w krokach 2.2.1.-2.2.4. Nie łączyć zawartości wielu probówek w jednej.
    3. Wypełnić probówkę zawierającą organoidy z maksymalnie 3 dołków płytki 6-dołkowej do objętości 12 mL za pomocą DPBS (bez Ca2+ i Mg2+) i pipetować w górę i w dół 10x, używając pipety 10 mL. Wirować przy 85 × g przez 5 min w temperaturze 8 °C, a następnie odessać supernatant, nie naruszając pelletu organoidów.
    4. Dodać 2 mL uprzednio ogrzanego odczynnika 2 do dysocjacji komórek na każdy dołek płytki 6-dołkowej użytej jako materiał wyjściowy i resuspenderować. Inkubować probówki w pozycji skośnej lub poziomej przez 5 min w kąpieli wodnej w 37 °C, aby zapobiec opadaniu organoidów na dno probówki.
    5. Pipetować w górę i w dół 10x za pomocą sterylnej plastikowej pipety 5 mL lub pipety P1000, w zależności od całkowitej objętości odczynnika do dysocjacji komórek. Sprawdzić zawiesinę organoidów pod mikroskopem, aby upewnić się, że powstała mieszanina pojedynczych komórek i niewielkich skupisk komórkowych składających się z 2-4 komórek (Rysunek 3B). W razie potrzeby kontynuować trawienie, powtarzając kroki 3.3.4-3.3.5 (nie zwiększając objętości odczynnika do dysocjacji komórek), aż mieszanina będzie wyglądać podobnie jak na Rysunku 3B.
      ​UWAGA: Unikać całkowitego trawienia organoidów do pojedynczych komórek. Niezbędne jest zachowanie niewielkich grup komórek (tj. grup 2-4 komórek).
    6. Zatrzymać dysocjację komórek, dodając do zawiesiny komórkowej do 12 mL BM zawierającego 10 µM inhibitora ROCK. Wirować przy 450 × g przez 5 min w temperaturze 8 °C i odessać supernatant, nie naruszając pelletu komórkowego. Przy przetwarzaniu tej samej hodowli organoidów w kilku probówkach stożkowych 15 mL, połączyć pellety komórkowe i resuspenderować je w 12 mL BM.
    7. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sito 40 µm uprzednio zwilżone BM i zebrać przesącz do probówki stożkowej 50 mL. Przemyć sito 10 mL BM i zebrać przesącz do tej samej probówki stożkowej 50 mL.
    8. Przenieść przefiltrowaną zawiesinę komórkową do dwóch nowych probówek stożkowych 15 mL. Wirować przy 450 × g przez 5 min w temperaturze 8 °C i odessać supernatant, nie naruszając pelletu komórkowego. Resuspenderować komórki w 4 mL IEM uzupełnionego o 10 µM inhibitora ROCK na każdą pełną płytkę hodowlaną użytą jako materiał wyjściowy.
    9. Zmieszać niewielką ilość zawiesiny komórkowej w stosunku 1:1 z błękitem trypanowym w celu przeliczenia. Przeliczyć żywe komórki, które nie przybarwiły się na niebiesko (Rysunek 3C), i obliczyć całkowitą liczbę żywych komórek. W małych skupiskach przeliczać każdą komórkę z osobna.
    10. Przygotować zawiesinę komórkową zawierającą 3 × 106 żywych komórek na mL IEM uzupełnionego o 10 µM inhibitora ROCK.
  4. Sianie komórek na poliestrowych insertach membranowych
    1. Ostrożnie odessać DPBS z powleczonych ECM insertów (krok 3.2.1), trzymając płytkę poziomo. Pipetować 800 µL IEM uzupełnionego inhibitorem ROCK do każdej komory basolateralnej. Pipetować kroplami 150 µL zawiesiny komórkowej przygotowanej w kroku 3.3.10 na powleczoną ECM membranę w komorze apikalnej. Na każdej płytce należy zapewnić co najmniej jeden dołek „kontrolny” (blank) zawierający tylko BM.
    2. Po opadnięciu komórek na membranę zmierzyć transepitelialną oporność elektryczną (TEER), zgodnie z opisem w sekcji 4.1, i zobrazować inserty membranowe za pomocą mikroskopu. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Mierzyć TEER codziennie i regularnie pobierać obrazy, aby monitorować tworzenie się monowarstwy (Rysunek 4A-D).
  5. Odświeżanie monowarstw
    ​UWAGA: Odświeżać medium co 2-3 dni, przestrzegając następującej kolejności, aby utrzymać dodatnie ciśnienie hydrostatyczne nad komórkami i zapobiec ich odrywaniu od membrany. Podczas odświeżania medium upewnić się, że monowarstwa, widoczna podczas odsysania medium, nie zostanie uszkodzona przez końcówkę pipety.
    1. Usunąć medium z komór basolateralnych płytki z insertami membranowymi. Następnie ostrożnie odessać medium z komór apikalnych insertów membranowych.
    2. Dodawać kroplami 150 µL świeżego IEM do każdej komory apikalnej, a następnie dodać 800 µL świeżego IEM do każdej komory basolateralnej.
  6. Wzbogacanie monowarstwy o pożądane typy komórek nabłonka jelitowego
    1. Pozostawić monowarstwę w IEM do uzyskania konfluencji, co odpowiada wartości TEER wynoszącej około 100 Ω·cm² (obliczonej w kroku 4.1.1.4). Sprawdzić pod mikroskopem, czy monowarstwy całkowicie się uformowały (Rysunek 4D) oraz czy nie występują otwory (jak na Rysunku 4B,C).
    2. Ostrożnie usunąć IEM z komór basolateralnych i apikalnych insertów membranowych i zastąpić go eDM lub cDM przygotowanym zgodnie z sekcją 1.4. Hodować monowarstwę przez kolejne 3-4 dni w specyficznym medium różnicującym, aby uzyskać komórki organoidowe wzbogacone o pożądany, konkretny typ komórek. Odświeżać medium co 2-3 dni, zgodnie z opisem w sekcji 3.4.
    3. Mierzyć TEER codziennie i w razie potrzeby regularnie pobierać obrazy (Rysunek 5A-C).
      UWAGA: Wartość TEER wskazująca na w pełni zorganizowaną, wzbogaconą monowarstwę różni się w zależności od hodowli organoidów; zazwyczaj wartości TEER wzrastają do 600 i mogą osiągnąć do 1000 Ω·cm2 (obliczone w kroku 4.1.1.4) po 3 dniach w mediach różnicujących i pozostają stabilne przez 3-5 dni.

4. Odczyty testu jednowarstwowej kultury nabłonkowej

  1. Pomiar transepithelialnego oporu elektrycznego (TEER)
    ​UWAGA: Pomiary TEER są powszechnie akceptowaną metodą analizy dynamiki połączeń ścisłych oraz integralności funkcji barierowej w biologicznych modelach barier fizjologicznych, takich jak monowarstwy nabłonkowe28, 29Wzrost wartości TEER po różnicowaniu, wynikający ze zwiększonych oddziaływań komórkowych w obrębie połączeń ścisłych, można zmierzyć przy użyciu ręcznego miernika TEER. lub zautomatyzowany robot do pomiaru TEER.
    1. Pomiar TEER przy użyciu ręcznego miernika TEER
      1. Oczyścić elektrodę 70% etanolem i pozostawić do wyschnięcia wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza. Umieścić elektrodę w probówce zawierającej BM. Podłączyć elektrodę do manualnego miernika TEER. Włączyć Funkcja przełącz na pomiar w Omy (Ω)Obróć Moc włącz.
      2. Umieść krótką elektrodę w przedziale apikalnym wkładu, natomiast długą elektrodę w przedziale basolaterialnym (Rysunek 6A). Należy unikać dotykania monowarstwy.
      3. Zmierz opór w studzience kontrolnej (RProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.), a następnie zmierz pozostałe próbki (Rpróbka) w ten sam sposób. Pomiędzy próbkami o różnych warunkach należy przemyć elektrodę roztworem BM. Elektrodę należy najpierw oczyścić wodą demierejalizowaną, a następnie 70% etanolem i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
      4. Oblicz TEER (Ω·cm2): [Rpróbka (Ω) - RPróbny tekst do tłumaczenia nie został dostarczony. Proszę o wprowadzenie treści źródłowej w języku angielskim, aby możliwe było przygotowanie profesjonalnego tłumaczenia naukowego na język polski zgodnie z wytycznymi. (Ω)] × pole powierzchni membrany (cm²2) (Tabela 1 i Rycina 6B).
    2. Pomiar TEER przy użyciu zautomatyzowanego robota do pomiaru TEER (Tabela materiałów)
      1. Przeprowadź zautomatyzowane pomiary TEER, korzystając z systemów HTS dla płytek HTS z 96 oraz 24 dołkami zawierających wkłady membranowe. Do pomiarów TEER dla obu typów wkładów membranowych (HTS 24- i 96-dołkowych) należy używać różnych elektrod. W celu zmierzenia TEER za pomocą zautomatyzowanego robota do pomiarów TEER postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Pomiar integralności i przepuszczalności bariery nabłonkowej
    UWAGA: Niniejszy protokół wprowadza pomiar przepuszczalności Lucifer Yellow z przedziału apikalnego do basolateralnego jako wskaźnik integralności monowarstwy. Ta sekcja opisuje pomiar fluorescencji w przedziale basolateralnym po 1-godzinnym etapie inkubacji w celu oceny przepuszczalności monowarstwy, a tym samym integralności bariery. Pomiar ten jest testem końcowym i jest szczególnie użyteczny podczas badania wpływu związków na integralność bariery.
    1. Odmrozić Lucifer Yellow na lodzie i pozostawić BM do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej. Dla jednej płytki 24-dołkowej z wkładkami membranowymi przygotować 5 ml roztworu roboczego z 60 µM Lucifer Yellow w medium BM.
      ​UWAGA: Lucifer Yellow jest światłoczuły. Rozcieńczenia należy przygotowywać w ciemnych, sterylnych probówkach o pojemności 1,5 ml, a wszystkie czynności wykonywać przy wyłączonym oświetleniu komory bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Ostrożnie usuń medium z przedziałów bazolateralnego i apikalnego insertów membranowych, zgodnie z opisem w kroku 3.5.1. W razie potrzeby, w celu uzyskania kontroli pozytywnej dla wycieku Lucifer Yellow przez uszkodzoną barierę, wykonaj zarysowanie jednej niepoddanej działaniu czynników monowarstwy za pomocą końcówki pipety.
    3. Dodaj 150 µL z BM za pomocą 60 µM Lucifer Yellow do każdej komory apikalnej, a następnie dodać 800 µL pożywki BM bez Lucifer Yellow do każdego przedziału podstawno-bocznego. Umieść płytkę na wytrząsarce przy 37 °C, 50 obr./min przez 60 min.
    4. W międzyczasie należy przygotować krzywą wzorcową Lucifer Yellow w BM, rozpoczynając od roztworu roboczego przygotowanego w kroku 4.2.1. Próbki należy rozcieńczać w stosunku 1:3 w każdym kolejnym kroku, aż do osiągnięcia stężenia 3 nM. Należy uwzględnić kontrolę negatywną (sam BM).
    5. Transfer 100 µL każdego standardu w trzech powtórzeniach do przezroczystej płytki 96-dołkowej. Po 60 min inkubacji należy usunąć wkłady membranowe i przenieść 100 µL z zawartość każdego dołka podstawno-bocznego (krok 4.2.3) w trzech powtórzeniach do przezroczystej płytki 96-dołkowej. Zmierzyć fluorescencję płytki za pomocą czytnika płytek przy długości fali wzbudzenia 430 nm i długości fali emisji 530 nm.
    6. Po skorygowaniu o wartość kontroli negatywnej (sama membrana BM), należy wykorzystać wartości z krzywej wzorcowej do obliczenia stężenia Lucifer Yellow w przedziale bazolateralnym (ostateczne stężenie w komorze odbiorczej (µM)).
    7. Oblicz pozorny współczynnik przepuszczalności (Paplikacja) zgodnie z następującym wzorem (Rycina 6C):
      figure-protocol-1
    8. W przypadku płytki 24-dołkowej z wkładkami membranowymi należy zastosować następujący wzór:
      figure-protocol-2
  3. Utrwalanie monowarstw i przygotowywanie bloków parafinowych do badań histologicznych
    UWAGA: Monowarstwy nabłonkowe mogą być wykorzystywane do barwienia histologicznego w celu oceny ich składu komórkowego, polarności oraz ekspresji różnych interesujących białek, takich jak białka połączeń, markery proliferacji lub różnicowania. W tej sekcji opisano przygotowanie bloków parafinowych do barwienia histologicznego.
    1. Ostrożnie usuń pożywkę z przedziałów podstawno-bocznego i apikalnego wkładek membranowych, zgodnie z opisem w krokach 3.5.1.
    2. Przemyj monowarstwy, dodając 150 µL DPBS (bez Ca)2+ oraz Mg2+) do każdej komory apikalnej i 800 µL do każdego przedziału bazolateralnego. Ponownie ostrożnie odessać DPBS, najpierw z przedziału bazolateralnego, a następnie z przedziału apikalnego.
      ​UWAGA: Od tego kroku przedział bazolateralny pozostanie pusty.
    3. W dygestorium dodać 150 µL do każdego przedziału apikalnego 4% paraformaldehydu i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
      ​UWAGA: Od tego momentu wszystkie czynności w tej sekcji należy wykonywać w dygestorium, ponieważ paraformaldehyd jest toksyczny.
    4. Ostrożnie odessać utrwalacz z przedziałów apikalnych wkładów membranowych i zutylizować go jako ciekłe odpady zawierające halogeny.
      UWAGA: Od tego kroku wszystkie odpady ciekłe należy utylizować jako odpady ciekłe zawierające halogeny.
    5. Przemyj monowarstwy, dodając 200 µL DPBS (bez Ca)2+ oraz Mg2+) do każdego przedziału apikalnego, a następnie ostrożnie ponownie odessać DPBS. Powtórzyć ten krok jeszcze raz.
    6. Dodaj 200 µL dodaj 25% alkoholu etylowego (EtOH) do każdej komory apikalnej i inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT). Po 15 min ostrożnie odessij 25% EtOH z komór apikalnych wkładów membranowych. Powtórz czynność z roztworem 50% EtOH, a następnie z roztworem 70% EtOH.
    7. Dodaj 200 µL 70% EtOH do każdej komory apikalnej i owiń płytkę parafilmem. Przechowywać w 4 °C do czasu dalszego użycia.
    8. Ostrożnie odessać 70% EtOH, a następnie za pomocą skalpela ostrożnie wyciąć membrany z monowarstwą z insertów. Cięcie należy wykonywać od strony bazolateralnej, wzdłuż krawędzi insertu.
    9. Przygotować bloczki parafinowe zgodnie ze standardową procedurą.
      1. Kiedy parafina jest jeszcze ciepła, należy wyjąć z niej monowarstwę za pomocą pęsety i umieścić ją na schłodzonej powierzchni.
      2. Należy uważać, aby nie uszkodzić monowarstwy. Przeciąć monowarstwę na pół, używając ostrza z pojedynczą krawędzią tnącą.
      3. Gdy parafina na dnie kasety zacznie tężeć, należy za pomocą podgrzanych pęset umieścić dwie części monowarstwy w parafinie, obok siebie, stroną prostą skierowaną w dół i w pozycji pionowej, aby zapewnić, że monowarstwa będzie zorientowana pionowo w bloku.
    10. Po przygotowaniu bloków parafnowych, należy wykonać skrawki za pomocą mikrotomu, a następnie przygotować preparaty z 4 µm grube skrawki zgodnie ze standardową procedurą. Należy upewnić się, że monowarstwy znajdują się w przekroju pionowo.
    11. Wykonać barwienia histologiczne zgodnie z wcześniejszym opisem7,9Należy zastosować hematoksylinę i eozynę (H&E), Ki67, mucynę-2 (MUC2) oraz błękit alkianowy w celu wykazania odpowiednio: ogólnej morfologii, komórek proliferujących, produkcji śluzu oraz komórek kubkowych (Rycina 6E).
      UWAGA: Można również zastosować dodatkowe markery różnicowania, takie jak lizozym dla komórek Panetha. Marker ten nie został przedstawiony w Rycina 6E ponieważ komórki Panetha występują w nabłonku jelita cienkiego, a nie w nabłonku jelita grubego.
  4. Pomiar białek wydzielanych w supernatancie pożywki
    1. Pomiar poziomu lizozymu w nadpływie apikalnym monowarstw jelita krętego (patrz Rycina 6D) przy użyciu zestawu wymienionego w Tabela materiałówW razie potrzeby należy zmierzyć poziomy różnych cytokin oraz innych wybranych białek.
  5. Analiza ekspresji genów
    1. Ilościowe określenie wpływu mediów różnicujących na ekspresję genów markerów komórek nabłonkowych z wykorzystaniem ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR).
      1. Zliozy warstwy monowarstw w 350 µL buforu do lizy RNA, a następnie izolacji RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Przeprowadzić syntezę cDNA oraz qPCR zgodnie z wcześniejszym opisem7,9przy użyciu zestawów do syntezy cDNA, mieszanin master mix oraz oligonukleotydów wymienionych w Tabela materiałów.

5. Skalowanie do płytek 96-dołkowych z wkładkami membranowymi

UWAGA: W celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków lub testów w wielu różnych warunkach hodowlanych należy przygotować monowarstwy nabłonkowe, wykorzystując do tego 96-dołkowe płytki HTS z wkładkami membranowymi.

  1. Adaptacje przy przygotowywaniu monowarstw w formacie 96-dołkowym
    1. Należy postępować zgodnie ze wszystkimi etapami opisanymi w niniejszym protokole dla płytek 24-dołkowych z wkładkami membranowymi, zmieniając objętości i liczbę komórek na wartości opisane w Tabeli 1. W celu przygotowania monowarstw na płytkach 96-dołkowych z wkładkami membranowymi należy postępować zgodnie z opisem w sekcji 3, z następującymi różnicami.
      1. Do zasiaienia całej płytki 96-dołkowej z wkładkami membranowymi potrzeba około 9 dołków płytki hodowlanej 6-dołkowej o gęstości organoidów przedstawionej na Rysunku 3A. W kroku 3.2.1 membrany należy pokryć 67 µL macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) rozcieńczonej 40x w DPBS (z Ca2+ i Mg2+).
      2. W sekcji 3.5 należy najpierw przenieść zintegrowaną płytkę z wkładkami membranowymi do drugiej płytki 96-dołkowej, aby umożliwić odświeżenie medium w przedziale apikalnym i bazolateralnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1A przedstawia reprezentatywny obraz w polu jasnym organoidów jelitowych po rozmrożeniu z krioprobówki. Ważne jest, aby rozmrażać organoidy przy wysokiej gęstości w celu zapewnienia optymalnego odzysku. Organoidy wysiewa się na płytki 24- lub 6-dołkowe w kopułkach ECM o objętości około 10 µL (Rysunek 1B). Większość prawidłowych organoidów jelitowych ma morfologię torbielowatą. Po regeneracji z procesu rozmrażania organoidy zwiększają swoją wielkość i są ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje ogólną manipulację i konserwację organoidów jelitowych, a także przygotowanie i możliwe zastosowania monowarstw nabłonka pochodzących z tych organoidów. Do tej pory z powodzeniem przygotowano monowarstwy z dwunastnicy, jelita krętego i różnych regionów organoidów okrężnicy pochodzących z normalnej, a także wcześniej i aktywnie zapalnej tkanki jelitowej (dane niepublikowane). Zastosowanie monowarstw organoidowych pochodzących od pacjenta ułatwia badanie funkcji bariery w sposób specyficzny dla choroby...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) dodatek partnerstwa publiczno-prywatnego (PPP) holenderskiego sektora LSH z numerem projektu LSHM16021 Organoidy jako nowatorskie narzędzie do modelowania toksykologicznego dla Hubrecht Organoid Technology (HUB) oraz wewnętrzne finansowanie HUB dla działu Modelowania Chorób i Toksykologii. Dziękujemy laboratoriom Sabine Middendorp (Oddział Gastroenterologii Dziecięcej, Szpital Dziecięcy Wilhelmina, UMC, Utrecht) oraz Hugo R. de Jonge i Marcelowi J.C. Bijveldsowi (Oddział Gastroenterologii i Hepatologii, Erasmus MC, Rotterdam) za zapewnienie wstępnego wsparcia technicznego w zakresie zakładania monowarstw na wkładkach membranowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100% etanolFisher Emergo10644795
1250, 300 i 20 &mikro; Końcówki filtrujące L o niskiej retencjiGreiner bio-one732-1432 / 732-1434 / 732-2383
Probówki stożkowe 15 mlGreiner bio-one188271
24-dołkowe płytki do hodowli komórkowychGreiner bio-one662160
24-dołkowa płytka HTS Fluoroblok Transwell (światłoszczelna)Corning351156
24-dołkowe płytki HTS Transwell (Tabela 1)Corning3378
Płytka 24-dołkowa z wkładkami TranswellCorning3470
40 µ m Sitko do komórekPluriSelect43-50040-01
Probówki stożkowe 50 mlGreiner bio-one227261
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowychGreiner bio-one657160
96-dołkowa płytka przezroczyste dnoGreiner bio-one655090
96-dołkowe szybkie termiczne płytki cykliczneLife Technologies Europe BV4346907
96-dołkowa płytka HTS Fluoroblok TranswellCorning351162
96-dołkowa płytka HTS Transwell (Tabela 1)Corning7369
96-dołkowa przezroczysta płytka hodowlanaGreiner bio-one655180
A83-01Bio-Techne Ltd2939
Odczynnik do dysocjacji komórek AccutaseLife Technologies Europe BVA11105-01Komórka odczynnik dysocjacyjny 2
Zaawansowany DMEM/F-12Life Technologies Europe BV 12634028
B27 suplementLife Technologies Europe BV17504001
Mikroskop do hodowli komórkowych (mikroskop świetlny / optyczny)Wirówka Leica
CellTiter-GloPromegaG9683
Eppendorf
Inkubator CO2PHCBI
DAPTSigma-AldrichD5942
DEPC z powłoką H2OLife Technologies Europe BV 750024
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco z Ca2+ i Mg2+Life Technologies Europe BV14040091
DPBS, proszek, bez wapnia, bez magnezuLife Technologies Europe BV 21600069
Zestaw do oznaczania lizozymu EnzChek LifeTechnologies Europe BVE22013
Miernik EVOM2 z elektrodą STXWTI
GastrinBio-Techne Ltd3006
Pipety szklaneVolac
GlutaMAXLife Technologies Europe BV35050038
hEGFPeprotechAF-100-15
HEPESLife Technologies Europe BV15630056
Human NogginPeprotech120-10C
Human Rspo3Bio-Techne Ltd3500-RS/CF
IWP-2Miltenyi Biotec130-105-335
Przeciwciało pierwotne Ki67SanbioBSH-7302-100
Ki67 przeciwciało wtórneAgilentK400111-2
Kova International Szkiełko szklane z kratkami zliczającymiFisher Emergo10298483
Okap z przepływem laminarnymThermo scientific
Lucifer Yellow CH sól dilithiumSigma-AldrichL0259
Matrigel, Zredukowany czynnik wzrostu ( GFR)Corning356231macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)
MicroAmp Fast 8-rurkowy pasek, 0,1 mlLife Technologies Europe BV4358293
MicroAmp Optyczne paski z 8 nasadkamiLife Technologies Europe BV4323032
Probówki do mikrowirówekEppendorf0030 120 086
Mikropipety (1000, 200 i 20 &mikro; L)Gilson
MicrotomeLeica
MUC2 przeciwciało pierwszorzędoweSanta Cruz Biotechnologysc-15334
Przeciwciało drugorzędowe MUC2VWRVWRKS/DPVR-HRP
Pipeta wielokanałowa (200 &mikro; L)Gilson
N-acetylocysteinaSigma-AldrichA9165
NGS WntU-Protein ExpressN001-0,5 mg
NikotynamidSigma-AldrichN0636
Oligonukleotyd ALPI1 / NaprzódWykonany na zamówienieGGAGTTATCCTGCTCCCCAC
Oligonukleotyd ALPI1 / ReverseCustom-madeCTAGGAGGTGAAGGTCCAACG
Oligonukleotyd LGR5 / NaprzódWykonany na zamówienieACACGTCACAGAAGCTC
LGR5 / OdwrotnyWykonany na zamówienieGGAATGCAGGCCACTGAAAC
Oligonukleotyd MUC2 / NaprzódWykonany na zamówienieAGGATCTGAAGAAGTGTCACTG
MUC2 / OdwrotnyWykonany na zamówienieTAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT
Oligonukleotyd TBP/NaprzódWykonany na zamówienieACGCCGAATATAATCCCAAGCG
Oligonukleotyd TBP/OdwrotnyWykonany na zamówienieAAATCAGTGCCGTGGGGTTCGTG
Optyczne powłoki samoprzylepne LifeTechnologies Europe BV4311971
PD0325901Stemcell Technologies72184
Penicylina/streptomycynaTechnologie życia Europe BV 15140122
Wytrząsarka płytkowaPanasonic
PowerUp SYBR Green Master MixFisher EmergoA25776
PrimocinInvivoGenANT-PM-2preparat przeciwdrobnoustrojowy do komórek pierwotnych
Zestaw testowy Qubit RNA HS LifeTechnologies Europe BVQ32852
Zbiornik na odczynnik do pipety wielokanałowejCLS4870Sigma-Aldrich
z 24-sondową lub sondą 96CWTI
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Specjalny zestaw do barwieniaThermo scientific87023
Zestaw DNaz bez RNazQiagen79254
RNeasy Mini KitQiagen74106
SB202190Sigma-AldrichS7076
Pipety serologiczneGreiner bio-one606180 / 607180 / 760180
Pipetor serologiczny (Pipet-Aid)Drummond
Żyletka jednoostrzowaGEM Scientific
Indeks górny 1. nitka system do RT-PCRLife Technologies Europe BV 11904018
Tecan Czytnik płytek Spark 10MTecan
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Life Technologies Europe BV15250-061
Enzym ekspresowy TrypLE (1x)Life Technologies Europe BV12605-010Odczynnik do dysocjacji komórek 1
Kąpiel wodnaGrant
Y27632 (inhibitor ROCK)AbMoleM1817
Oligonukleotyd Oligonukleotyd Automatyczny podajnik próbek

Bibliografia

  1. Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
  2. Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  3. Martínez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., et al. HT29 Cell Line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 113-124 (2015).
  4. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  5. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  6. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 11 (2), 179-194 (2013).
  7. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).
  8. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  9. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  10. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  11. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  12. Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  13. Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).
  14. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  15. d'Aldebert, E., et al. Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363(2020).
  16. Dotti, I., et al. Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis. Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).
  17. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  18. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270(2017).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. van Es, J. H., et al. Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts. Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).
  21. van Es, J. H., et al. Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  22. de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C. The R-spondin protein family. Genome Biology. 13 (3), 1-10 (2012).
  23. Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
  24. Beumer, J., et al. Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient. Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).
  25. Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  26. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
  27. Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
  28. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  29. Blume, L. -F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).
  30. Lea, T. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 103-111 (2015).
  31. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  32. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

monowarstwa pochodna z organoid wintegralno bariery nab onkowejtransepitelialna oporno elektrycznahodowla organoid wprzepuszczalno nab onkaorganoidy z kom rek macierzystychsekrecja bia ek przeciwdrobnoustrojowychmarkery r nicowania kom rkowegomembrana Transwell

Powiązane artykuły