Artykuł metodologiczny

Ekonomiczny i wszechstronny wysokowydajny system oczyszczania białek za pomocą wielokolumnowego adaptera płytowego

DOI:

10.3791/62075

⸱

21 maja 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Liverpool, 2Health Sciences Center, Texas Tech University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adapter do płytek wielokolumnowych pozwala na połączenie kolumn chromatograficznych z wielodołkowymi płytkami do równoległego powinowactwa lub oczyszczania jonowymiennego, zapewniając ekonomiczną metodę oczyszczania białek o wysokiej przepustowości. Może być stosowany w warunkach grawitacji lub próżni, uzyskując miligramowe ilości białka za pomocą niedrogiego oprzyrządowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie białek jest niezbędne do badania struktury i funkcji białek i jest zwykle stosowane w połączeniu z technikami biofizycznymi. Jest to również kluczowy element w opracowywaniu nowych środków terapeutycznych. Rozwijająca się era proteomiki funkcjonalnej napędza popyt na wysokoprzepustowe oczyszczanie białek i ulepszone techniki ułatwiające to zadanie. Postawiono hipotezę, że adapter płytkowy wielokolumnowy (MCPA) może łączyć wiele kolumn chromatograficznych różnych żywic z płytkami wielodołkowymi w celu równoległego oczyszczania. Metoda ta oferuje ekonomiczną i wszechstronną metodę oczyszczania białek, która może być stosowana pod wpływem grawitacji lub próżni, rywalizując z prędkością zautomatyzowanego systemu. MCPA może być używany do odzyskiwania miligramowych plonów białka za pomocą niedrogiej i efektywnej czasowo metody do późniejszej charakterystyki i analizy. MCPA został wykorzystany do wysokoprzepustowego oczyszczania powinowactwa domen SH3. Zademonstrowano również wymianę jonową za pomocą MCPA w celu oczyszczania białek po chromatografii powinowactwa Ni-NTA, co wskazuje, w jaki sposób system ten można dostosować do innych typów oczyszczania. Ze względu na konfigurację z wieloma kolumnami, indywidualne dostosowanie parametrów może być wykonane w tym samym oczyszczaniu, nieosiągalne przy użyciu obecnych metod opartych na płytach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki oczyszczania białek w celu uzyskania miligramowych ilości oczyszczonych białek są niezbędne do ich charakterystyki i analizy, szczególnie dla metod biofizycznych, takich jak NMR. Oczyszczanie białek ma również kluczowe znaczenie w innych obszarach badań, takich jak procesy odkrywania leków i badania interakcji białko-białko; Jednak osiągnięcie takich ilości czystego białka może stać się wąskim gardłem dla tych technik1,2,3. Główną metodą oczyszczania białek jest chromatografia, która obejmuje różnorodne metody, które opierają się na indywidualnych cechach białek i ich znacznikach. W chromatografii powinowactwa białka mają dodatkowy motyw białka lub peptydu, który działa jako znacznik mający powinowactwo do określonego substratu na żywicy chromatograficznej 4. Najpowszechniejszą metodą powinowactwa jest chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali (IMAC) z wykorzystaniem białek znakowanych Hisem, podczas gdy inną popularną metodą jest chromatografia jonowymienna, która rozdziela białka na podstawie ich ładunku. Aby uzyskać najwyższą czystość, często stosuje się połączenie chromatografii powinowactwa i wymiany jonowej, co zwykle wymaga drogiego sprzętu laboratoryjnego do uzyskania wysokiej przepustowości.

Rozwijająca się era proteomiki funkcjonalnej napędza zapotrzebowanie na wysokoprzepustowe techniki oczyszczania nie pojedynczych białek do konkretnej analizy, ale dużej liczby białek jednocześnie do kompleksowej analizy i badań całego genomu5. Chromatografia powinowactwa do unieruchomionych metali (IMAC) jest jedną z najczęściej stosowanych metod wysokoprzepustowego oczyszczania białek6,7 jednak jej zautomatyzowane systemy są kosztowne i niedostępne dla mniejszych laboratoriów8. Bardziej przystępne cenowo alternatywy oparte na płytkach, które są obecnie dostępne, wykorzystują dostępny sprzęt laboratoryjny, taki jak odkurzacz. Chociaż metody te skutecznie poprawiają szybkość oczyszczania, można osiągnąć oczyszczanie o wysokiej przepustowości tylko na mniejszą skalę, uzyskując tylko białko w zakresie mikrogramów. Ograniczenia te oznaczają, że wstępnie zapakowane 96-dołkowe płytki filtracyjne (np. z GE Healthcare, obecnie należące do Cytiva) nie mogą być używane przed technikami biofizycznymi9. Chromatografia grawitacyjna jest najbardziej opłacalną metodą oczyszczania; Jednak konfigurowanie wielu kolumn jest niewygodne i może być podatne na błędy w przypadku wielu białek.

Adapter płytkowy wielokolumnowy (MCPA) został opracowany i sprawdzony, aby skutecznie i wygodnie uruchamiać równoległe kolumny chromatografii powinowactwa jednocześnie w celu oczyszczenia oznaczonych przez Hisa domen SH3 drożdży10. MCPA oferuje ekonomiczną metodę oczyszczania o wysokiej przepustowości, która nie zależy od kosztownego oprzyrządowania. Jego elastyczna konstrukcja może skutecznie oczyszczać miligramy białka za pomocą wielu kolumn chromatograficznych o powinowactwie pod wpływem grawitacji lub kolektora próżniowego. Co więcej, rodzaj, objętość i inne parametry żywicy można dostosować do każdej kolumny z osobna w celu szybszej optymalizacji. Badanie to pokazuje, że chromatografia jonowymienna metodą MCPA może być stosowana w połączeniu z chromatografią powinowactwa MCPA w celu poprawy oczyszczania domeny Abp1 SH3. Dodatkowo, za pomocą tych metod można równolegle rozdzielić do 24 różnych białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Chromatografia Ni-NTA denaturująca

  1. Przygotowanie
    UWAGA: Patrz Tabela 1, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich.
    1. Uzupełnić 500 ml 0,5 M NaOH, upewniając się, że najpierw dodano wodę Milli-Q, a następnie powoli dodając NaOH, podczas gdy zlewka znajduje się na mieszadle. Filtrować za pomocą filtra 0,22 μm.
    2. Przygotować 100 ml 0,1 M siarczanu niklu i przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm.
    3. Przygotować 50 ml 2 M imidazolu i przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm.
    4. Przygotować i przefiltrować 0,22 μm 1,5 l buforu denaturującego o pH 8,0 składającego się z 5,3 mM Tris-HCl, 4,7 mM Tris-Zasada (Tris (hydroksymetylo)metyloamina), 13,7 mM NaH2PO4, 86,3 mM Na2HPO4 i 6 M chlorowodorku guanidyny.
    5. Przygotować i przefiltrować 0,22 μm 500 ml roztworu buforowego do lizy 10 mM imidazolu rozpuszczonego w buforze denaturującym (patrz 1.1.4) przy użyciu 2 M imidazolu podstawowego.
    6. Przygotować i przefiltrować 0,22 μm 500 ml roztworu buforowego 10 mM imidazolu rozpuszczonego w buforze denaturującym (patrz 1.1.4) przy użyciu 2 M imidazolu podstawowego.
    7. Przygotować i 0,22 μm przefiltrować 500 ml 100 mM buforu EDTA, dostosować pH do 8 za pomocą 1 M NaOH.
    8. Przygotować i 0,22 μm przefiltrować 500 ml buforu elucyjnego składającego się z 7 ml 99% lodowatego kwasu octowego do 6 M chlorowodorku guanidyny.
      UWAGA: W przypadku korzystania z natywnych należy dostosować zgodnie z tabelą 1.
  2. Komórki lityczne (metoda denaturacji)
    1. Dodaj 2 ml buforu do lizy na każdy 1 g zebranych granulek komórek E. coli, które zawierają nadmiernie eksprymowane białko znakowane His. Wiruj przez kilka minut, aż komórki zostaną ponownie zawieszone. Pozostawić próbki na bujaku na 30 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Odwirować lizowane granulki o stężeniu 18 000 x g przez 30 minut. Przechowuj 50 μl w zamrażarce w temperaturze -20 °C, aby później przeanalizować żel SDS-PAGE.
    3. Ostrożnie wylać supernatanty, upewniając się, że osad nie jest naruszony. Lizaty powinny mieć klarowny, jasnożółty kolor. Jeśli lizaty są mętne, ponownie odwirować próbkę; Rozważ sonikację, jeśli jest dostępna, w celu degradacji kwasu nukleinowego.
    4. Przefiltrować supernatanty przez pustą kolumnę (bez żywicy, ale z filtrem) i zebrać do otwartej tacki zbiorczej. Następnie przenieś do probówki do użycia w kroku 1.3.
      UWAGA: W przypadku korzystania z natywnych, po kroku 1.2.1 należy potraktować próbki 3 cyklami zamrażania/rozmrażania w temperaturze -80 °C lub poddać je procesowi sonikacji lub prasy francuskiej w celu lizy komórek.
  3. Przygotowanie zestawu do oczyszczania próżniowego i wyrównanie kolumn
    UWAGA: Zobacz Rysunek 1, aby skonfigurować MCPA z 24 kolumnami.
    1. Określ, ile kolumn jest potrzebnych, a także żądany rodzaj i objętość żywicy. Z reguły na 100 ml kultury autoindukcyjnej (~ 2 g granulki) wyrażającej znakowane przez Hisa domeny SH3 za pomocą plazmidów na bazie T7, należy użyć 0,6 ml żywicy Ni-NTA na kolumnę, aby uzyskać około 3 mg białka z około 6 ml lizatu.
    2. Włóż żądaną liczbę kolumn o pojemności 12 ml (bez żywicy, ale z filtrem) do wstępnie zmontowanego MCPA (długa płyta ociekowa z przebitą matą uszczelniającą). Kolumny powinny ściśle przylegać do otworów maty uszczelniającej, które zostały przebite.
    3. Jeśli używane są mniej niż 24 kolumny, zamknij puste otwory pustą zamkniętą kolumną.
    4. Weź otwartą płytkę zbiorczą i umieść ją w podstawie kolektora próżniowego i zamknij górną częścią kolektora.
    5. Umieść zmontowany MCPA z kolumnami na górze kolektora próżniowego.
    6. Podłącz rurkę z systemu pompy próżniowej do wlotu/dyszy w dolnej części kolektora próżniowego.
    7. Upewnij się, że kulki Ni-NTA znajdują się w 50% roztworze z 20% etanolem. Zanim zrobisz cokolwiek z kulkami, delikatnie potrząśnij/wymieszaj roztwór kulki/etanolu, aby równomiernie zawiesić. Następnie, za pomocą pipety o pojemności 5 ml, odpipetować 1,2 ml 50% roztworu do kolumn. Podczas pipetowania upewnij się, że kulki pozostają całkowicie wymieszane.
    8. Po pipetowaniu do wszystkich 24 kolumn włącz pompę próżniową i przepuść 20% etanol przez kolumnę do znajdującej się poniżej płytki zbiorczej.
    9. Wyłącz pompę, gdy cały 20% etanol przepłynie przez wszystkie kolumny (żywica Ni-NTA toleruje krótkie suszenie, jeśli próżnia jest nadal stosowana po przejściu buforu przez kolumnę). Wyrzuć to, co znajduje się na otwartej płycie zbiorczej, do pojemnika na odpady.
      UWAGA: Wszystkie produkty odpadowe z kulek Ni-NTA są niebezpieczne, podczas obchodzenia się z koralikami lub usuwania odpadów należy nosić rękawice, okulary i inne środki ochrony indywidualnej. Ponadto wszystkie odpady siarczanu niklu należy wyrzucić do osobnego pojemnika do późniejszej indywidualnej utylizacji.
      UWAGA: Jeśli żywica jest nowa lub niedawno zregenerowana, pozostałe kroki można zignorować, przejdź do następnej sekcji.
    10. Dodać 3 objętości żywicy (1,8 ml) 100 mM buforu EDTA za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml lub strzykawki powtarzalnej ze strzykawką o pojemności 50 ml. Następnie włącz pompę próżniową, aby bufor EDTA mógł się przepłukać i wyłącz pompę po przepłukaniu.
      UWAGA: To pranie powinno usunąć niklowo-niebieski kolor, ale jeśli tak nie jest, powtarzaj ten krok, aż wszystkie kolumny stracą swój niebieski kolor. Wyłączyć pompę i wlać zawartość otwartej płytki zbiorczej do pojemnika na odpady.
    11. Dodaj 3 objętości żywicy (1,8 ml) 0,5 M buforu NaOH do każdej kolumny przed włączeniem pompy i przepuszczeniem jej przez każdą kolumnę. Pusta płytka zbiorcza.
    12. Dodać 4 objętości żywicy (2,4 ml) 100 mM siarczanu niklu do każdej kolumny. Włącz pompę próżniową i ponownie przepuść ją przez kolumnę.
    13. Dodaj 10 objętości żywicy (~6000 μL) wody Milli-Q i przepuść ją przez kolumny. Wyłączyć pompę i wylać zawartość płytki zbiorczej do pojemnika na odpady.
    14. Przemyć kolumny dwukrotnie 4 objętościami żywicy (2,4 ml) 10 mM imidazolu w buforze do przemywania (denaturującym lub natywnym) za każdym razem w celu usunięcia nadmiaru niklu i zrównoważenia. Pusta tabliczka odbiorcza.
      UWAGA: Jeśli którakolwiek kolumna działa znacznie wolniej, odłącz kolumnę i sprawdź, czy powietrze można przepchnąć przez MCPA za pomocą dużej strzykawki. Jeśli ta opcja jest odblokowana, użyj innej kolumny z nowym filtrem.
    15. Jeśli wiele różnych próbek/białek ma być oczyszczanych na MCPA, zastąp otwartą płytkę zbiorczą płytką o pojemności 48 x (5 ml / dołek) . Jednak w przypadku przeprowadzania tych samych próbek białka na każdej kolumnie, można kontynuować korzystanie z otwartej płytki zbiorczej.
  4. Ładowanie, mycie i elucja
    1. Przy wyłączonym podciśnieniu załaduj lizaty do kolumn (ilość lizatu będzie się różnić, zwykle od 1 do 12 ml lub więcej i może być konieczne załadowanie kilku partii). Użyj cienkiego plastikowego mieszadła, aby delikatnie wymieszać kulki i lizat w kolumnie, aby zmaksymalizować wiązanie.
    2. Po delikatnym mieszaniu każdej kolumny przez kilka minut, włącz pompę próżniową i przepuść lizaty przez kolumny. Jeśli przeprowadza się wiele próbek białka, użyj 48-dołkowej płytki zbiorczej i pamiętaj, aby wymienić płytkę zbiorczą na inną 48-dołkową płytkę po przejściu 4 ml, ponieważ studzienki w tych płytkach mogą pomieścić tylko 4 ml roztworu. Kontynuuj uruchamianie lizatu, aż wszystkie lizaty zostaną przepuszczone przez kolumnę. Zamrozić płytki zbiorcze, które zawierają przepływ.
      UWAGA: Kolumny mogą zostać "zablokowane", co spowoduje, że lizat będzie przepływał przez kolumnę znacznie wolniej niż powinien. Jest to łatwe do zauważenia, ponieważ sąsiednie kolumny będą płynąć z normalną prędkością. W takim przypadku zaleca się przeniesienie mieszaniny lizatu i żywicy do kolumny zawierającej świeży filtr.
    3. Zastąp płytkę zbiorczą pustą, otwartą płytką zbiorczą, a następnie dodaj 9 objętości żywicy (5,4 ml) 10 mM imidazolowego buforu płuczącego do każdej kolumny, włącz odkurzacz i przeprowadź płukanie. Powtórz to 4-5 razy. Aby uniknąć przepełnienia, należy okresowo opróżniać pojemnik na odpady.
      1. Następnie zastąp płytkę zbiorczą czystą odpowiednią płytką (otwarta płytka tylko na jedno białko i 96 dołków, jeśli jest wiele białek, upewniając się, że A1 znajduje się w lewym górnym rogu).
    4. Używając strzykawki powtarzalnej ze strzykawką o pojemności 12,5 ml, odpipetować ~ 1 objętość żywicy (0,75 ml) denaturującego buforu elucyjnego do każdej kolumny.
    5. Aby uniknąć pienienia się białka, włącz pompę próżniową na najniższym ustawieniu. Delikatnie podnieś MCPA, aby sprawdzić, czy nic nie pozostało do kapania do płytki zbiorczej.
      UWAGA: Alternatywą dla elucji za pomocą próżni lub grawitacji jest wciśnięcie tłoka strzykawki o pojemności 10 ml w górną część kolumny, aby delikatnie przepchnąć bufor elucyjny przez kolumnę. Zrób to dla każdej kolumny, zachowując ostrożność podczas wyjmowania tłoka strzykawki, aby nie naruszyć kulek na dole kolumny. Po przepchnięciu buforu elucyjnego delikatnie wyjąć tłok strzykawki z ostatniej kolumny, w której został użyty, i na krótko włączyć pompę próżniową, aby usunąć ostatnie krople z kolumn.
      1. Jeśli użyto 96-dołkowej płytki zbiorczej, należy sprawdzić płytkę zbiorczą, aby upewnić się, że to, co przepływa z każdej kolumny przez długą płytkę ociekową, wpływa tylko do jednej studzienki i nic nie wymywa się do sąsiednich studzienek na płytce zbiorczej.
    6. Do następnej elucji powtórzyć powyższe 2 kroki i zebrać do świeżej płytki wielodołkowej (różne próbki) lub otwartej płytki zbiorczej (te same próbki).
    7. Opcjonalnym krokiem jest pobranie 50 μl podwielokrotności każdej elucji w celu analizy czystości i stężenia.
    8. Dodaj 2 ml 20% etanolu do każdej kolumny i przepuść przez nią za pomocą pompy próżniowej. Następnie dodaj kolejne 2 ml 20% etanolu do kolumn i użyj świeżego cienkiego plastikowego mieszadła, aby wymieszać 20% etanolu i kulki przed przeniesieniem do probówki o pojemności 50 ml w celu przechowywania w temperaturze 4 °C. Wyczyść kolumny i sprawdź, czy woda swobodnie przepływa przez każdą kolumnę, a następnie wyczyść wszystko i odłóż do późniejszego wykorzystania.
      UWAGA: Niektóre kolumny w końcu będą miały zablokowane filtry i będą działać zbyt wolno, te kolumny powinny zostać zastąpione lub filtry wyczyszczone. W związku z tym zaleca się okresowe testowanie filtrów poprzez usunięcie żywicy i napełnienie kolumny wodą, aby sprawdzić, czy szybko przepływa. Filtry można czyścić, pozostawiając zamkniętą kolumnę wypełnioną denaturującym buforem elucyjnym i wstrząsając przez noc.

2. Wymiana jonowa - Oczyszczanie pojedynczego białka

  1. Przygotowanie
    UWAGA: Patrz Tabela 1, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich
    1. Przygotuj 2 l buforu o niskiej zawartości soli: 10 mM Tris pH 8,1 (5 mM Tris Acid, 5 mM Tris Zasada). Roztwór filtrujący za pomocą filtra 0,22 μm.
    2. Przygotować 0,5 l buforu o wysokiej zawartości soli: 10 mM Tris pH 8,1, 4 M NaCl. Odmierz 116,9 g NaCl i uzupełnij do 0,5 l 10 mM Tris pH 8,1 od góry. Roztwór filtrujący za pomocą filtra 0,22 μm.
  2. Wytwarzanie serii stężeń soli: 0-1 M NaCl.
    UWAGA: Zakres stężeń soli można dostosować do każdego białka.
    1. Ustaw 24 x 50 ml oznakowanych probówek wirówkowych w stojaku
    2. Korzystając z powyższych, przygotuj 24 x 14 ml Rozcieńczenia NaCl w zakresie 0-1000 μM. Zacznij od dodania wymaganych objętości 4 M NaCl 10 mM Tris. Można to zrobić w krokach co 25 mM lub 50 mM w zależności od białka.
    3. Następnie dodaj wymagane objętości 10 mM Tris do każdej probówki. Odwróć każdą rurkę kilka razy, aby wymieszać.
  3. Przygotowanie próbek
    1. Otrzymać próbki do oczyszczenia w drodze wymiany jonowej. Opcjonalnie należy pobrać podwielokrotność 50 μl do późniejszej analizy.
      UWAGA: Próbki powinny być zawsze przechowywane w niskiej temperaturze; mogą to być lizaty, a może po Ni-NTA. Próbki z Ni-NTA w denaturujących wymagają dializacji lub wymiany buforu w buforze Tris 10 mM. Próbki z Ni-NTA w natywnych można rozcieńczyć 10 mM buforem Tris w celu zmniejszenia stężenia soli, tak aby białko mogło wiązać się z żywicą IEX.
    2. Wirować próbki w temperaturze 18 000 x g przez 10 minut.
    3. Ostrożnie przelać supernatant do łódki wagowej. Unikaj naruszania pelletu.
    4. Ostrożnie pobrać supernatant do strzykawki o pojemności 20 ml i założyć filtr 0,22 μm.
    5. Powoli wysunąć supernatant przez filtr do świeżej probówki o pojemności 50 ml.
    6. Jeśli wymagane jest rozcieńczenie, rozcieńczyć supernatant 10 mM buforem Tris wykonanym powyżej (w tym doświadczeniu supernatant rozcieńczono 1:2). W międzyczasie przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotowanie zestawu do oczyszczania próżniowego i ustawienia równoważenia
    UWAGA: W tym protokole tylko jedna kolumna jest używana do oczyszczania IEX jednej próbki. Aby uzyskać informacje na temat wielokrotnych oczyszczań, zobacz następną sekcję.
    1. Określ żądany rodzaj i objętość żywicy. Z reguły dla maksymalnie 20 mg częściowo czystych domen SH3 znakowanych His, należy użyć 0,4 ml żywicy szybkiego przepływu Q-sepharozy na kolumnę (patrz krok 2.4.8).
    2. Włóż 24 otwarte puste kolumny (puste bez filtra na dole) do wstępnie zmontowanego MCPA. Kolumny powinny ściśle przylegać do otworów maty uszczelniającej, które zostały przebite.
    3. Umieścić tłok strzykawki o pojemności 10 ml w każdej pustej kolumnie z wyjątkiem pierwszej pozycji, w której rozpocznie się oczyszczanie.
    4. Przepchnij spód otwartej kolumny (z filtrem) przez gumową uszczelkę tłoka strzykawki o pojemności 5 ml (która została przebita), aby utworzyć gumowy pierścień na końcu kolumny. Ten gumowy pierścień zapewni dobre uszczelnienie, gdy ta kolumna zostanie włożona do każdej pustej kolumny powyżej. Na razie wstaw tę kolumnę do pierwszej pustej kolumny w MCPA.
    5. Weź otwartą płytkę zbiorczą i umieść ją w podstawie kolektora próżniowego i zamknij górną częścią kolektora.
    6. Umieść zmontowany MCPA (z kolumnami) na górze kolektora próżniowego.
    7. Podłącz rurkę z systemu pompy próżniowej do wlotu/dyszy na dole próżni.
    8. Wytnij niebieską końcówkę pipety ~ 2 cm od dna i użyj do pobrania 800 μl kulek Q-sepharozy (lub innej żywicy jonowymiennej), upewniając się, że roztwór etanolu w kulkach 50/50 jest zmieszany, aby uniknąć warstw. Pipetować 800 μl do jednej otwartej kolumny (z filtrem) w pierwszej pozycji, a gdy kulki osiądą na dnie kolumn, włącz próżnię na tyle, aby przepuścić 20% etanol.
    9. Przemyć kolumnę zawierającą kulki sefarozy 2 x 2 ml 10 mM Tris. Wyłącz próżnię tuż przed przejściem bufora Tris, aby zapobiec wysychaniu żywicy. Spływ można wyrzucić.
      UWAGA: Jeśli żywica była używana wcześniej, zregeneruj ją, przemywając 5 objętości żywicy po 4 M NaCl, a następnie 5 objętości żywicy po 10 mM Tris przed krokiem 2.4.9.
  5. Ładowanie, mycie i elucja
    1. Przenieść całą próbkę do oczyszczenia (patrz sekcja 3) do kolumny sefarozy Q w pierwszej pozycji, użyć małej plastikowej pętli do mieszania próbki i kulek przez około ~2 minuty przed włączeniem pompy próżniowej.
      UWAGA: W przypadku nadmiaru supernatantu (>12 ml) należy uważać na przepełnienie kolumny. Pozwól próbce przepłynąć, a następnie dodaj więcej, mieszając przed ponownym przepuszczeniem.
    2. Zapisz/zamroź przepływ do późniejszej analizy.
    3. Umieścić kolejną otwartą płytkę zbiorczą w kolektorze próżniowym, a następnie umyć każdą kolumnę sefarozy 2 x 2 ml 10 mM Tris i przechowywać.
    4. Włóż 96-dołkową płytkę zbiorczą, upewniając się, że A1 znajduje się w lewym górnym rogu.
    5. Aby zebrać pierwszą frakcję elucyjną, należy wyjąć tłok strzykawki z następnej kolumny, przesunąć kolumnę sefarozy Q do tej pozycji i umieścić tłok strzykawki w poprzedniej pozycji. Następnie odpipetować 1 ml pierwszego stężenia soli do kolumny sefarozy Q. Włącz pompę i zbierz elucję. Wyłącz pompę w momencie, gdy ciecz przewodzi się w pobliżu kulek, aby uniknąć wysuszenia kulek.
    6. Aby zebrać następną frakcję elucyjną, wyjąć tłok strzykawki z następnej kolumny wzdłuż, przesunąć kolumnę sefarozy Q do tej pozycji i umieścić tłok strzykawki w poprzedniej pozycji.
    7. Dodać 1 ml następnego stężenia soli do kolumny i powtarzać proces, aż wszystkie stężenia zostaną wykorzystane i 24 elucjacje zostaną zebrane w 24 oddzielnych studzienkach. Sprawdź, czy żadna ciecz nie dostała się do sąsiednich studni.
    8. Przemyć kolumnę 2 ml 4 M NaCl 10 mM Tris. Niech to przejdzie.
    9. Umyć 2 ml 20% etanolu. Pozwól etanolowi płynąć, aż znajdzie się tuż nad koralikami i kolumną uszczelniającą do przechowywania.
    10. Przechowywać 96-dołkową płytkę zbiorczą i analizować za pomocą spektroskopii UV i SDS PAGE.

3. Wymiana jonowa - Jednoczesne oczyszczanie 24 różnych białek

UWAGA: Zobacz kroki 2.1-2.3, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tworzenia, serii stężeń soli i przygotowywania próbek.

  1. Przygotowanie zestawu do oczyszczania
    UWAGA: Sposób, w jaki skonfigurowany jest system oczyszczania, zależy w dużej mierze od tego, ile białek jest oczyszczanych i ile warunków soli zostanie użytych. Aby oczyścić 12 próbek do maksymalnej liczby 24 próbek jednocześnie, wymagana jest płytka zbiorcza dla każdego stężenia soli użytej do elucji. W przypadku mniej niż 12 próbek możliwe jest przesunięcie kolumn chromatograficznych o kilka pozycji w obrębie tego samego MCPA przed zmianą płytek zbiorczych. W takim przypadku nie ma potrzeby umieszczania kolumn w pustych kolumnach i można je bezpośrednio przymocować do maty uszczelniającej MCPA. Poniższy protokół dotyczy 24 jednoczesnych oczyszczań jonowymiennych.
    1. Umieść zmontowany MCPA bezpośrednio przymocowany do 24 pustych kolumn z filtrami na górze kolektora próżniowego, który zawiera otwartą płytkę zbiorczą, a następnie przygotuj i umyj 24 kolumny jonowymienne, jak w powyższej metodzie pojedynczego oczyszczania. Do tego oczyszczania wygodnie jest użyć wzmacniacza Eppendorf lub strzykawki do szybkiego pipetowania do kolumn.
  2. Ładowanie, mycie i elucja
    1. Umieść 48-dołkową płytkę zbiorczą w podstawie kolektora próżniowego przed zamontowaniem MCPA (z dołączonymi umytymi kolumnami oczyszczającymi). Upewnij się, że A1 znajduje się w lewym górnym rogu.
    2. Odpipetować każdą próbkę białka (jednorazowo do 5 ml) do odpowiedniej kolumny. Mieszaj każdą kolumnę za pomocą cienkiej plastikowej pętli (jedna pętla na każdą kolumnę, aby uniknąć zanieczyszczenia) przez około 2 minuty. Następnie włącz pompę próżniową i pozwól supernatantowi przepłynąć.
      UWAGA: W przypadku nadmiaru supernatantu należy uważać na przepełnienie kolumn. Pozwól próbce przepłynąć przez kolumnę, a następnie dodaj więcej, mieszając przed ponownym przepuszczeniem.
    3. Przechowywać/zamrażać 48-dołkową płytkę zbiorczą do późniejszej analizy, ponieważ zawiera ona przepływ dla każdego białka.
    4. Umieść kolejną 48-dołkową płytkę zbiorczą w kolektorze próżniowym, a następnie umyj każdą kolumnę sefarozy 2 x 2 ml 10 mM Tris.
    5. Włóż pierwszą 96-dołkową płytkę zbiorczą do kolektora, upewniając się, że A1 znajduje się w lewym górnym rogu, a następnie odpipetuj 1 ml pierwszego stężenia soli do każdej kolumny, a następnie włącz pompę próżniową, aby przepuścić ją przez kolumny. Wyjąć płytkę zbiorczą, przykryć parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C do analizy.
    6. Powtórz krok dla każdego kolejnego stężenia soli użytego do elucji. Upewnij się, że do każdej elucji używana jest nowa płytka zbiorcza oraz że każda płytka zbiorcza jest oznakowana i przechowywana.
    7. Przemyć każdą kolumnę 2 ml 10 mM Tris, 4 M NaCl.
    8. Umyj każdą kolumnę 2 ml 20% etanolu. Pozwól etanolowi płynąć, aż znajdzie się tuż nad koralikami i kolumnami uszczelniającymi do przechowywania.
    9. Przechowuj 96-dołkowe płytki zbiorcze i analizuj je za pomocą spektroskopii UV i SDS-PAGE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na przykład, MCPA z powodzeniem oczyściło 14 mutantów AbpSH3 w warunkach denaturacji za pomocą Ni-NTA (Rysunek 2A). Widoczne jest niewielkie zanieczyszczenie ~ 25 kDa, jednak białko jest nadal w dużej mierze czyste. Uważa się, że to zanieczyszczenie to YodA, powszechne współoczyszczone białko występujące w E. coli11.Rysunek 2B pokazuje oczyszczanie 11 różnych domen SH3 w warunkach natywnych. Niewielkie zanieczyszczenie widoczne w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda jest solidna i prosta w użyciu dla stosunkowo niedoświadczonych biochemików białek, jednak należy pamiętać o kilku kwestiach.

Uwaga dotycząca przepełnienia płytek zbiorczych

Sama 48-dołkowa płytka zbiorcza zawiera tylko 5 ml na studzienkę, podczas gdy każda 96-dołkowa tylko 2 ml. Należy o tym pamiętać podczas dodawania buforu i przepuszczania próbki przez kolumnę, ponieważ istnieje ryzyko przepełnienia studzienek. W szczególności należy zacho...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Nagrodę Rozwoju Instytucjonalnego (IDeA) z National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantu numer P20GM103451 oraz wewnętrzny grant badawczy z University of Liverpool.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 ml / płytkę do pobierania studzienekAgilent technologies201240-100
5 ml / płytkę do pobierania studzienekAgilent technologies201238-100
12 ml kolumny chromatograficzneBio-Rad7311550
96 well long drip plateAgilent technologies200919-100Dostarczane są filtry 0,25 um, które należy usunąć.
96-dołkowa uszczelka/mata do płytekAgilent technologies201158-100Powinien być peirceable
His60 Ni Superflow ResinTakara Bio635660
HiTrap Q HP Kolumna anionowymiennaGE Healthcare (Cytiva)17115301
Czytnik płytek LvisBMG LABTECHKompatybilny z FLUOstar Czytnik płytek
Omega Męskie wtyki leurCole-ParmerEW-45503-70
PlatePrep 96-dołkowy kolektor próżniowy Zestaw startowySigma-Aldrich575650-U
Płytka zbiorcza zbiornikaAgilent technologies201244-100
Repeater PlusEppendorf2226020Ze strzykawkami 5 ml i 50 ml
Próżnia VACUSAFEINTEGRA158 320Odkurzacz vacusafe ma zakres podciśnienia od 300 mBar do 600 mBar i butelkę na odpady o pojemności 4 l

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128(2016).
  2. Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
  3. Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
  4. Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164(2019).
  5. Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
  6. Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
  7. Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
  8. Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
  9. Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
  10. Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152(2018).
  11. Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
  12. Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O'Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
  13. Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
  14. Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wydajne oczyszczaniechromatografia powinowactwachromatografia wymiany jonowejoczyszczanie za pomoc niklu NTAoczyszczanie domeny SH3r wnoleg e oczyszczanie bia ekmanifold pr niowyproteomika funkcjonalna

Powiązane artykuły