Artykuł metodologiczny

Ekonomiczny i wszechstronny wysokowydajny system oczyszczania białek za pomocą wielokolumnowego adaptera płytowego

DOI:

10.3791/62075

⸱

21 maja 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Liverpool, 2Health Sciences Center, Texas Tech University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adapter do płytek wielokolumnowych pozwala na połączenie kolumn chromatograficznych z wielodołkowymi płytkami do równoległego powinowactwa lub oczyszczania jonowymiennego, zapewniając ekonomiczną metodę oczyszczania białek o wysokiej przepustowości. Może być stosowany w warunkach grawitacji lub próżni, uzyskując miligramowe ilości białka za pomocą niedrogiego oprzyrządowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie białek jest niezbędne do badania struktury i funkcji białek i jest zwykle stosowane w połączeniu z technikami biofizycznymi. Jest to również kluczowy element w opracowywaniu nowych środków terapeutycznych. Rozwijająca się era proteomiki funkcjonalnej napędza popyt na wysokoprzepustowe oczyszczanie białek i ulepszone techniki ułatwiające to zadanie. Postawiono hipotezę, że adapter płytkowy wielokolumnowy (MCPA) może łączyć wiele kolumn chromatograficznych różnych żywic z płytkami wielodołkowymi w celu równoległego oczyszczania. Metoda ta oferuje ekonomiczną i wszechstronną metodę oczyszczania białek, która może być stosowana pod wpływem grawitacji lub próżni, rywalizując z prędkością zautomatyzowanego systemu. MCPA może być używany do odzyskiwania miligramowych plonów białka za pomocą niedrogiej i efektywnej czasowo metody do późniejszej charakterystyki i analizy. MCPA został wykorzystany do wysokoprzepustowego oczyszczania powinowactwa domen SH3. Zademonstrowano również wymianę jonową za pomocą MCPA w celu oczyszczania białek po chromatografii powinowactwa Ni-NTA, co wskazuje, w jaki sposób system ten można dostosować do innych typów oczyszczania. Ze względu na konfigurację z wieloma kolumnami, indywidualne dostosowanie parametrów może być wykonane w tym samym oczyszczaniu, nieosiągalne przy użyciu obecnych metod opartych na płytach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki oczyszczania białek w celu uzyskania miligramowych ilości oczyszczonych białek są niezbędne do ich charakterystyki i analizy, szczególnie dla metod biofizycznych, takich jak NMR. Oczyszczanie białek ma również kluczowe znaczenie w innych obszarach badań, takich jak procesy odkrywania leków i badania interakcji białko-białko; Jednak osiągnięcie takich ilości czystego białka może stać się wąskim gardłem dla tych technik1,2,3. Główną metodą oczyszczania białek jest chromatografia, która obejmuje różnorodne metody, które opierają się na indywidualnych cechach białek i ic....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Chromatografia Ni-NTA denaturująca

  1. Przygotowanie
    UWAGA: Patrz Tabela 1, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich.
    1. Uzupełnić 500 ml 0,5 M NaOH, upewniając się, że najpierw dodano wodę Milli-Q, a następnie powoli dodając NaOH, podczas gdy zlewka znajduje się na mieszadle. Filtrować za pomocą filtra 0,22 μm.
    2. Przygotować 100 ml 0,1 M siarczanu niklu i przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm.
    3. Przygotować 50 ml 2 M imidazolu i przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm.
    4. Przygotować i przefiltrować 0,22 μm 1,5 l buforu denaturującego o pH 8,0 składającego się z 5,3 m....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na przykład, MCPA z powodzeniem oczyściło 14 mutantów AbpSH3 w warunkach denaturacji za pomocą Ni-NTA (Rysunek 2A). Widoczne jest niewielkie zanieczyszczenie ~ 25 kDa, jednak białko jest nadal w dużej mierze czyste. Uważa się, że to zanieczyszczenie to YodA, powszechne współoczyszczone białko występujące w E. coli11.Rysunek 2B pokazuje oczyszczanie 11 różnych domen SH3 w warunkach natywnych. Niewielkie zanieczyszczenie widoczne w .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda jest solidna i prosta w użyciu dla stosunkowo niedoświadczonych biochemików białek, jednak należy pamiętać o kilku kwestiach.

Uwaga dotycząca przepełnienia płytek zbiorczych

Sama 48-dołkowa płytka zbiorcza zawiera tylko 5 ml na studzienkę, podczas gdy każda 96-dołkowa tylko 2 ml. Należy o tym pamiętać podczas dodawania buforu i przepuszczania próbki przez kolumnę, ponieważ istnieje ryzyko przepełnienia studzienek. W szczególności należy zacho.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Nagrodę Rozwoju Instytucjonalnego (IDeA) z National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantu numer P20GM103451 oraz wewnętrzny grant badawczy z University of Liverpool.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 ml / płytkę do pobierania studzienekAgilent technologies201240-100
5 ml / płytkę do pobierania studzienekAgilent technologies201238-100
12 ml kolumny chromatograficzneBio-Rad7311550
96 well long drip plateAgilent technologies200919-100Dostarczane są filtry 0,25 um, które należy usunąć.
96-dołkowa uszczelka/mata do płytekAgilent technologies201158-100Powinien być peirceable
His60 Ni Superflow ResinTakara Bio635660
HiTrap Q HP Kolumna anionowymiennaGE Healthcare (Cytiva)17115301
Czytnik płytek LvisBMG LABTECHKompatybilny z FLUOstar Czytnik płytek
Omega Męskie wtyki leurCole-ParmerEW-45503-70
PlatePrep 96-dołkowy kolektor próżniowy Zestaw startowySigma-Aldrich575650-U
Płytka zbiorcza zbiornikaAgilent technologies201244-100
Repeater PlusEppendorf2226020Ze strzykawkami 5 ml i 50 ml
Próżnia VACUSAFEINTEGRA158 320Odkurzacz vacusafe ma zakres podciśnienia od 300 mBar do 600 mBar i butelkę na odpady o pojemności 4 l

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128(2016).
  2. Renaud, J. P., et al.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wydajne oczyszczaniechromatografia powinowactwachromatografia wymiany jonowejoczyszczanie za pomoc niklu NTAoczyszczanie domeny SH3r wnoleg e oczyszczanie bia ekmanifold pr niowyproteomika funkcjonalna

Powiązane artykuły