Artykuł metodologiczny

Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62076

⸱

9 lutego 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Thoraxcenter, Erasmus MC University Medical Center Rotterdam, 2Laboratory of Acoustical Wavefield Imaging, Faculty of Applied Sciences, Delft University of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje trzy metody pozyskiwania i wykorzystywania zarodków kurczaków w wieku od 5 do 8 dni oraz ich błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jako modelu in vivo do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków.

Streszczenie

Zarodek kurczaka i bogata w naczynia krwionośne błona kosmówkowo-omoczna (CAM) to cenny model in vivo do badania procesów biomedycznych, nowych schematów pulsacji ultradźwiękowych lub nowatorskich przetworników do obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków. Powodem takiego stanu rzeczy jest dostępność sieci zarodków i naczyń krwionośnych CAM, a także niskie koszty modelu. Ważnym krokiem do uzyskania dostępu do naczyń zarodka i CAM jest pobranie zawartości jaja ze skorupki jaja. W protokole tym opisano trzy metody pobierania zawartości ze skorupki jaja między 5. a 8. dniem inkubacji, co pozwala zarodkom rozwijać się w skorupce jaja aż do tych dni. Opisane metody wymagają jedynie prostych narzędzi i sprzętu i dają wyższy wskaźnik przeżycia wynoszący 90% dla jaj 5-dniowych, 75% dla 6-dniowych, 50% dla 7-dniowych i 60% dla 8-dniowych jaj inkubowanych w porównaniu z zarodkami hodowanymi ex ovo (~50%). Protokół opisuje również, jak wstrzykiwać jądra kawitacyjne, takie jak mikropęcherzyki, do układu naczyniowego CAM, jak oddzielić błonę zawierającą zarodek i CAM od reszty zawartości jaja w celu przeprowadzenia optycznie przezroczystych badań oraz jak wykorzystać zarodek kurczaka i CAM w różnych krótkoterminowych eksperymentach ultrasonograficznych. Model in vivo zarodka kurczaka i CAM jest niezwykle istotny dla badania nowych protokołów obrazowania, ultrasonograficznych środków kontrastowych i schematów pulsacji ultradźwiękowych do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym, a także do rozwikłania mechanizmów dostarczania leków za pośrednictwem ultradźwięków.

Wprowadzenie

Ex ovo zarodki kurcząt i bogata w naczynia krwionośne błona kosmówkowo-omoczniowa (CAM) okazały się odpowiednim modelem do badania różnych procesów biologicznych i biomedycznych, takich jak embriogeneza, onkologia i dostarczanie leków1,2,3,4. Ultradźwięki zostały wykorzystane do obrazowania rozwoju embrionalnego serca 4,5 oraz do aktywacji jąder kawitacji po wstrzyknięciu, takich jak mikropęcherzyki, do dostarczania leków naczyniowych6,7. Zarodki kurczaków są niedrogie, wymagają mniej infrastruktury i sprzętu oraz mają mniej rygorystyczne przepisy w porównaniu z innymi modelami zwierzęcymi8. Naczynia z zarodkiem kurzym i CAM są łatwo dostępne po otwarciu jaja, podczas gdy w przypadku zarodków i naczyń ssaków okazuje się to znacznie trudniejsze. Poza tym zarodek kurczaka i naczynia CAM zapewniają bicie serca i pulsujący przepływ krwi. CAM wykazuje podobieństwa w anatomii statków ze ssakami i może być używany do badań przesiewowych leków8,9,10. Ze względu na te cechy, naczynia CAM okazały się również odpowiednim modelem do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem (CEUS)11,12,13,14,15,16. Ponadto model może być wykorzystany do optycznego zbadania zachowania ultrasonograficznych środków kontrastowych w polu ultrasonograficznym za pomocą ultraszybkiej kamery oraz wpływu siły promieniowania akustycznego na napęd, wiązanie i wynaczynienie leków7,17,18,19. Chociaż zarodek kurzy i CAM są mniej odpowiednie do długoterminowych eksperymentów, mogą być korzystne dla krótkoterminowych eksperymentów in vivo.

Aby zwiększyć widoczność i kontrolę nad zarodkiem kurczaka i CAM podczas eksperymentów, ważne jest, aby pobrać zawartość jaja zawierającą zarodek i CAM ze skorupki jajka18. W poprzednich badaniach na zarodkach kurcząt z użyciem ultrasonograficznych środków kontrastowych stosowano zarodki w wieku od 5 do 6 dni7,11,12,17,19 i 14 do 18-dniowe zarodki13,14,15,16. Szczegółowo opisano wiele podejść do usuwania zawartości jaj ze skorupy18,20,21. Jednakże, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, poprzednio opublikowane podejścia koncentrują się na wyjęciu zawartości jaja ze skorupki jaja po 3 dniach inkubacji (tj. Hamburger & Hamilton (HH) etap 19-2022) i kontynuowaniu hodowli ex ovo. To podejście do hodowli ex ovo ma wiele wad, w tym zwiększone ryzyko zgonów podczas hodowli (~50%)1,18, stosowanie antybiotyków18,20 oraz zmniejszona całkowita długość naczynia w porównaniu do in ovo growth23. Ponieważ hodowla zarodka w skorupce jaja zapewnia najbardziej naturalne środowisko, najłatwiej jest inkubować zarodek w skorupce jaja do dnia eksperymentu. Z tego powodu podejście, w którym zawartość jaja jest pobierana ze skorupki jaja po 5 do 8 dniach inkubacji, byłoby korzystne zwłaszcza w przypadku eksperymentów na zarodkach w wieku od 5 do 8 dni.

W tym protokole opisujemy trzy metody pobierania zawartości jaja ze skorupki jaja, gdy zarodek jest w 5 do 8 dniu rozwoju (HH 26-3522), pozwalając zarodkowi rozwijać się w skorupce jaja aż do dnia eksperymentu. Rozmiar naczynia CAM waha się od 10-15 μm średnicy, w mniejszych naczyniach włosowatych 8-dniowego zarodka24, do 115-136 μm średnicy w większym naczyniu 6 i 8-dniowych zarodków24,25. Trzy opisane metody wymagają jedynie podstawowych narzędzi laboratoryjnych i zmniejszają ryzyko powikłań przed rozpoczęciem eksperymentu, redukując w ten sposób niepotrzebne koszty i pracę. Szczegółowo opisujemy również metodę oddzielania błony zawierającej zarodek i CAM od worka z żółtkiem, dzięki czemu CAM jest optycznie przezroczysty do badań mikroskopowych. Ponieważ błona zawierająca zarodek i CAM może być przytwierdzona na przykład do uchwytu z membraną akustyczną, konfiguracja może być również akustycznie przezroczysta26, co pozwala na połączenie badań mikroskopowych i ultrasonograficznych, gdy żółtko będzie miało wpływ na ścieżkę światła. Na koniec opisujemy kilka innych konfiguracji ultrasonograficznych, które można wykorzystać do obrazowania ultrasonograficznego lub CEUS.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z niderlandzką ustawą o doświadczeniach na zwierzętach oraz zgodnie z Radą Europejską (2010/63/UE) w sprawie ochrony wykorzystywania zwierząt do celów naukowych.

1 . Protokół przygotowania zarodków

  1. Inkubacja zapłodnionych jaj kurzych
    1. Świeżo zapłodnione jaja kurze należy przechowywać w temperaturze 15 °C przez okres do jednego tygodnia.
    2. Aby wysiadywać zapłodnione jaja, umieść je pionowo spiczastą stroną do dołu w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C. Obracanie jaj podczas inkubacji nie jest konieczne.
      UWAGA: Napisz datę rozpoczęcia inkubacji wierzchołka jaja za pomocą markera permanentnego.
  2. Przygotowanie do 5-dniowego (120 h) wieku zarodka (HH stadium 26-28)22
    1. Przygotowanie obszaru roboczego
      1. Rozgrzej płytę grzewczą do temperatury 37 °C.
      2. Umieść metalowy uchwyt na jajka (Rysunek 1A,B), metalowy uchwyt na łódkę ważącą ( Rysunek 1C,D) i 10 ml Erlenmeyera wypełnionego PBS na płycie grzewczej.
      3. Napełnij łódkę ważącą (85 mm × 85 mm × 25 mm) warstwą żelu ultradźwiękowego o grubości 10 mm i umieść napełnioną łódkę ważącą we wstępnie podgrzanym metalowym uchwycie łodzi wagowej.
        UWAGA: Wypełnienie łodzi wagowej żelem ultradźwiękowym podniesie zarodek i CAM. Może to być korzystne dla wstrzyknięcia lub obrazowania zarodka i CAM, ale nie jest konieczne do wyjęcia zarodka i CAM ze skorupki jaja.
      4. Przygotuj kilka kawałków taśmy (o długości około 3 cm) z częścią jednego końca zagiętą z powrotem na siebie, aby już się nie kleiła.
    2. Wyjmowanie zawartości jaj ze skorupki jajka
      1. Weź 5-dniowe, inkubowane, zapłodnione jajo i przenieś je do podgrzanego metalowego uchwytu na jaja (Rysunek 1A,B). Upewnij się, że jajko jest ułożone w tej samej orientacji (tj. data na górze).
        UWAGA: Ważne jest, aby utrzymać jajo w tej samej orientacji, aby worek powietrzny oraz zarodek i CAM znajdowały się w tej samej pozycji w górnej części jaja.
      2. Użyj spiczastego grzbietu pęsety (lub podobnej; Rysunek 1E) aby zrobić małe wgłębienie na samym czubku jajka (gdzie jest zapisana data) (Rysunek 2A).
      3. Użyj spiczastego grzbietu pęsety, aby zrobić drugie wgłębienie z boku jajka około 2/3 w dół jajka (Rysunek 2B).
        UWAGA: Uważaj, aby wgłębienie nie było zbyt duże i nie utworzyło. Jeśli przypadkowo powstanie, uszczelnij otwór taśmą i nie wykonuj kolejnego wgłębienia.
      4. Za pomocą większej pęsety (Rysunek 1E), wyjmij mały kawałek skorupki jajka z wgłębionego obszaru na wierzchu jajka (z zapisaną datą). Upewnij się, że worek powietrzny w górnej części skorupki jajka styka się z powietrzem na zewnątrz jajka, ale nie wnikaj w skorupę zbyt głęboko.
        UWAGA: Jeśli skorupa zostanie wbita zbyt głęboko podczas wykonywania górnego wcięcia, zarodek i CAM mogą zostać uszkodzone, a zarodek nie przetrwa usunięcia z skorupy. Ważne jest, aby mały otwór na górze tworzył kontakt powietrza między wnętrzem a zewnętrzem jajka. Jeśli nie zostanie to zrobione, w kolejnych krokach procedury zostanie wytworzone podciśnienie, które spowoduje, że duże pęcherzyki powietrza zostaną uwięzione pod CAM, co sprawi, że zarodek i CAM staną się bezużyteczne. Aby sprawdzić położenie worka powietrznego wewnątrz jajka, można użyć źródła światła, ponieważ jego położenie nie zawsze znajduje się dokładnie u góry i może być również bardziej z boku.
      5. Użyj strzykawki o pojemności 5 ml i igły 19 G, aby przebić skorupkę przez drugie wgłębienie z boku 2/3 w dół jajka i pobrać ~ 2 ml białka jaja (Rysunek 2C).
        UWAGA: Upewnij się, że igła jest skierowana w dół w kierunku dolnej części jaja, aby zapobiec ryzyku uszkodzenia zarodka i CAM. Ten krok tworzy większą kieszeń powietrzną w górnej części jaja, potrzebną do usunięcia zawartości jaja. Jeśli przypadkowo zamiast wgłębienia w kroku 1.2.2.3 zostanie przypadkowo utworzona, przekłuj taśmę igłą w celu usunięcia białka jaja. Ponownie uszczelnij nakłucie innym kawałkiem taśmy.
      6. Wyjmij igłę i użyj taśmy, aby uszczelnić szczelinę z boku (Rysunek 2D).
        UWAGA: Aby zapobiec wyciekaniu białka z jajka, górny otwór można zamknąć palcem przed wyjęciem igły. Jeśli białko jaja nadal wycieka, gdy taśma jest już na miejscu, najpierw usuń białko za pomocą kawałka chusteczki, aby upewnić się, że taśma jest prawidłowo przyklejona.
      7. Opróżnij strzykawkę, dodając białko jaja do naczynia do ważenia.
      8. Użyj dużej pęsety (Rysunek 1E), aby powiększyć mały otwór na górze jajka (Rysunek 2E). Zaglądając do wnętrza jaja przez otwór na górze, widoczny jest zarodek i CAM. Kontynuuj lokalizowanie zarodka i CAM, usuwając jak najwięcej skorupki jaja (Rysunek 2F) .
        UWAGA: Kontynuuj przesuwanie jaja, aby zachować maksymalną widoczność pozycji zarodka i CAM wewnątrz skorupki. Upewnij się, że krawędź otworu w obudowie nie schodzi niżej niż CAM. Poza tym nie należy wnikać w membranę wewnętrzną i zapobiegać ostrym krawędziom.
      9. Po utworzeniu otworu obróć jajko o 180° i umieść jajko z powrotem w uchwycie na jajka w taki sposób, aby utworzony otwór w górnej części jajka był teraz skierowany w dół. Zarodek unosi się w górę i staje się niewidoczny od dołu (Rysunek 2G), co zajmuje 1-2 minuty. Upewnij się, że cały zarodek i CAM (w tym wszystkie naczynia) zniknęły i widoczne jest tylko żółtko przed przejściem do następnego kroku (Rysunek 2H).
        UWAGA: Jeśli zarodek jest nadal widoczny od dołu po 2 minutach, obróć jajko zgodnie z ruchem wskazówek zegara na 1-2 minuty. Pomoże to zarodkowi i CAM unosić się w górę.
      10. Usuń taśmę z bocznego otworu. Sprawdź, czy wnętrze jajka wybrzusza się teraz z dolnego otworu. W takim przypadku przejdź do następnego kroku. Jeśli nie, użyj igły na strzykawce, aby ponownie przekłuć otwór z boku, aby uwolnić podciśnienie w jaju. Upewnij się, że igła jest skierowana do góry, aby zapobiec przebiciu worka z żółtkiem. Kontynuuj, aż jajko wybrzuszy się z dolnego otworu.
      11. Trzymając spód jajka blisko łodzi ważącej w metalowym uchwycie łodzi ważącej (Rysunek 1C,D), delikatnie, ale szybko wykonaj poziome rysowanie membrany na całej szerokości otworu za pomocą jednego z ostrych końców małej pęsety (Rysunek 1F) i delikatnie wrzuć zawartość jajka do łodzi ważącej (Rysunek 2I).
        UWAGA: Jeśli zawartość jaja nie wydostanie się na zewnątrz, użyj igły na strzykawce, aby ponownie nakłuć boczny otwór z igłą skierowaną do góry.
      12. Jeśli zarodek znajduje się w łodzi do ważenia bokiem, zwykle sam się podniesie. Jeśli tak się nie stanie, użyj kawałka bibuły, aby zmienić położenie zarodka. Połóż jedną stronę bibułki na zarodku, przeciągnij bibułę na drugi koniec i uwolnij bibułkę z kilkoma kroplami ~30 μL PBS (37 °C) za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
      13. Sprawdź wzrokowo, czy zarodek jest żywy, upewniając się, że bicie serca jest nadal obecne, naczynia CAM są nienaruszone i nie ma krwawienia ani wycieku żółtka. Jeśli jedna z tych rzeczy nie jest prawidłowa, wyrzuć zarodek i CAM, ponieważ nie będą one zdolne do życia.
      14. Upewnij się, że zarodek i CAM są przechowywane w temperaturze 37 °C i nie wysychają, ponieważ spowoduje to pogorszenie naczyń CAM i ostatecznie zarodek umrze. Aby temu zapobiec, regularnie umieszczaj małe krople ~30 μL PBS o temperaturze 37 °C na zarodku i CAM.
  3. Przygotowanie 6 do 7-dniowego (144-168 h) starego zarodka (HH stadium 28-32)22
    1. Przygotowanie obszaru roboczego
      1. Przygotować etap zgodnie z opisem w sekcji 1.2.1.
    2. Wyjmowanie zawartości jaj ze skorupki jajka
      1. Dwie godziny przed eksperymentem weź inkubowane jajo w wieku od 6 do 7 dni i obróć jajo o 180° wewnątrz inkubatora tak, aby górna część jaja była skierowana w dół. Po 1 godzinie obróć jajko z powrotem do pierwotnej pozycji i pozostaw na kolejne 1 godz.
        UWAGA: Obrócenie jajka na 2 godziny przed eksperymentem ułatwi wyjęcie zawartości jajka ze skorupki.
      2. Po obróceniu wyjmij jajo z inkubatora.
      3. Wykonaj krok 1.2.2.2 do kroku 1.2.2.4.
      4. Użyj strzykawki o pojemności 5 ml i igły 19 G, aby przebić skorupkę przez drugie wgłębienie z boku 2/3 w dół jajka i pobrać od 5 do 6 ml białka jaja. Upewnij się, że igła jest skierowana w dół, w kierunku dolnej części jajka.
        UWAGA: Za pomocą użytej przez nas strzykawki o pojemności 5 ml możliwe jest pobranie do 6 ml, więc potrzebna jest tylko jedna penetracja.
      5. Wyjmij igłę i użyj kawałka taśmy, aby uszczelnić szczelinę z boku (Rysunek 2D).
      6. Opróżnij strzykawkę, dodając białko jaja do żelu ultradźwiękowego w łódce do ważenia.
      7. Użyj dużej pęsety (Rysunek 1E), aby powiększyć mały otwór na górze jajka (Rysunek 2E). Postaraj się, aby otwór był jak największy, ale upewnij się, że krawędź otworu w skorupie nie schodzi niżej niż CAM. Poza tym nie należy penetrować wewnętrznej membrany i starać się zapobiegać ostrym krawędziom.
      8. Napełnić strzykawkę ~1 ml objętością PBS o temperaturze 37 °C większą niż pobrana objętość w kroku 1.3.2.4.
      9. Zdejmij taśmę z bocznej szczeliny, przebij szczelinę napełnioną strzykawką i opróżnij ją do skorupy. Upewnij się, że igła jest skierowana w dół, w kierunku dolnej części jajka.
        UWAGA: Ponieważ białko jaja ma wyższą lepkość (~160 cP)27 niż PBS (~1 cP), zastąpienie białka jaja PBS zmniejsza zarówno napięcie, jak i stres na zarodku i CAM podczas wyjmowania zawartości jaja ze skorupki.
      10. Wyjmij igłę i szybko ponownie uszczelnij szczelinę kawałkiem taśmy (Rysunek 2D).
      11. Obróć jajko o 180° i umieść jajko z powrotem w uchwycie na jajka w taki sposób, aby utworzony otwór w górnej części jajka był teraz skierowany w stronę dołu. Obróć jajko zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż cały zarodek i CAM (w tym wszystkie naczynia) znikną i będzie widoczne tylko żółtko.
      12. Wykonuj kroki 1.2.2.10 do kroku 1.2.2.14.
  4. Przygotowanie 8-dniowego (192 h) starego zarodka (stopień HH 32-35)22
    1. Przygotowanie obszaru roboczego
      1. Rozgrzej płytę grzewczą do temperatury 37 °C.
      2. Umieść metalowy uchwyt do ważenia łodzi (Rysunek 1C,D) i 10 ml Erlenmeyera wypełnionego PBS na płycie grzewczej.
      3. Wziąć płytki pojemnik o wymiarach 170 x 110 x 70 mm lub podobny i napełnić go 1 litrem PBS o temperaturze 37 °C.
      4. Umieścić łódkę wagową (85 × 85 × 25 mm) na szalce Petriego o średnicy 90 mm. Umieść szalkę Petriego i łódkę ważącą na dnie pojemnika i upewnij się, że są całkowicie zanurzone.
    2. Wyjmowanie zawartości jaj ze skorupki jajka
      1. Dwie godziny przed eksperymentem weź 8-dniowe jajo z inkubatu i obróć jajo o 180° wewnątrz inkubatora tak, aby górna część jaja była skierowana w dół. Po 1 godzinie obróć jajko z powrotem do pierwotnej pozycji i pozostaw na kolejne 1 godz.
        UWAGA: Obrócenie jajka na 2 godziny przed eksperymentem ułatwi wyjęcie zawartości jajka ze skorupki.
      2. Weź 8-dniowe jajo z inkubatora z inkubatora.
      3. Trzymaj jajko poziomo i użyj spiczastego grzbietu dużej pęsety (Rysunek 1E), aby zrobić małe wgłębienie 1/2 w dół jajka. Kontynuuj robienie małych wgłębień we wzorze pierścienia 360° wokół skorupki jajka. Użyj odstępu ~10 mm między wcięciami.
        UWAGA: Podczas tej procedury między wgłębieniami mogą zacząć tworzyć się małe pęknięcia.
      4. Po utworzeniu małych wgłębień wokół skorupy, zrób jeden większy otwór, rozbijając skorupę między dwoma małymi wgłębieniami za pomocą spiczastego grzbietu dużej pęsety.
      5. Całkowicie zanurz jajko w PBS o temperaturze 37 °C i trzymaj je zanurzone przez 5 minut. Po 5 minutach trzymaj jajko blisko łódki ważącej wewnątrz pojemnika. Włóż górną część obu kciuków do dużego otworu i delikatnie otwórz jajko. Jajko pęknie wzdłuż małych wgłębień.
      6. Kiedy pęknięcie utworzy się na całej długości wokół skorupki jajka, delikatnie spróbuj rozsunąć dwa kawałki skorupki jajka i delikatnie przesuwaj je do przodu iz powrotem, aż zawartość jajka zostanie oddzielona od skorupki. Następnie delikatnie wrzuć zawartość jaj do łódki wagowej.
        UWAGA: Przesuwając dwa kawałki skorupki jajka do przodu iz powrotem, więcej PBS wpłynie do skorupki jajka, co pomoże w oddzieleniu zawartości jajka od skorupki. Czasami odrobina białka jajka przykleja się do wnętrza skorupki jajka. Kiedy tak się stanie, użyj pęsety, aby oddzielić białko jajka od skorupki.
      7. Powoli podnieść szalkę Petriego zawierającą łódkę wagową i zawartość jaj z PBS. Po wyjęciu z PBS lekko przechylić łódkę ważącą, aby usunąć nadmiar PBS.
      8. Umieść łódkę ważącą zawierającą zawartość jaj w metalowym uchwycie łodzi ważącej i przejdź do żądanego zestawu doświadczalnego.

2. Wybrane aplikacje

  1. Wstrzykiwanie mikropęcherzyków i/lub innych roztworów do naczyń CAM
    1. Przygotowanie konfiguracji iniekcji
      1. Wyciągnij szklane igły ze szklanych kapilar za pomocą mikrokuźni (Rysunek 3A) lub kup ciągnięte szklane igły kapilarne.
      2. W przypadku, gdy końcówka szklanej igły kapilarnej nie jest ścięta, odłamać niewielką część końcówki igły. Napełnij szklaną igłę olejem mineralnym i umieść ją w systemie mikroiniekcji. Upewnij się, że w oleju mineralnym w szklanej igle nie ma pęcherzyków powietrza.
        UWAGA: Olej mineralny jest dodawany zgodnie z instrukcją producenta zastosowanego przez nas układu wtryskowego.
      3. Opróżnij igłę kapilarną z wyciąganego szkła do oporu w systemie mikroiniekcji i częściowo napełnij szklaną igłę powietrzem.
        UWAGA: Niewielka ilość powietrza zapobiegnie mieszaniu się oleju mineralnego i roztworu, który ma być wstrzyknięty.
      4. Umieść 10 μl pożądanego roztworu, w tym protokole mikropęcherzyków, na kawałku woskowej folii (Rysunek 3B). Jeśli potrzeba więcej niż jednego roztworu, roztwory można wymieszać przed pipetowaniem7.
        UWAGA: Przed napełnieniem igły mikropęcherzykami pozostaw kroplę mikropęcherzyków na woskowym filmie na ~1 min, aby mikropęcherzyki uniosły się na wierzch kropli i uległy skoncentrowaniu. W przypadku ultrasonograficznego środka kontrastowego typu F wykonanego na zamówienie28, ten etap koncentracji zwiększy stężenie mikropęcherzyków do wstrzyknięcia o ~30%. Stężenie po wstrzyknięciu we krwi zarodka kurcząt będzie wynosić od 32 x 103 mikropęcherzyki/μl dla zarodków 5-dniowych i 19 x 103 mikropęcherzyki/μl dla zarodków 6-dniowych.
      5. Napełnij szklaną igłę mikropęcherzykiem i/lub innym roztworem, umieszczając szklaną końcówkę igły w kropli na woskowym filmie. Podczas zasysania mikropęcherzyków upewnij się, że końcówka igły znajduje się w górnej części kropli cieczy, aby zassać roztwór wzbogacony w mikropęcherzyki.
        UWAGA: Przed wstrzyknięciem mikropęcherzyków należy podnieść końcówkę szklanej igły do najwyższego punktu i odczekać ~2 min. Zapewni to, że mikropęcherzyki skoncentrują się na końcówce szklanej igły.
  2. Wstrzykiwanie do naczyń CAM
    1. Przed wstrzyknięciem należy przyjrzeć się CAM pod mikroskopem stereoskopowym i wybrać najlepsze naczynie do wstrzyknięcia. Zawsze wstrzykiwać do jednej z żył zarodka. Są to naczynia, w których przepływ krwi przemieszcza się w kierunku zarodka. Żyły mają jaśniejszy kolor niż tętnice ze względu na natlenioną krew29. Ponadto żyły zawsze znajdują się na szczycie tętnicy, z dwoma wyjątkami, a mianowicie żyłami przednimi i tylnymi witelinowymi (tj. mniej rozgałęzionymi żyłami, oznaczonymi gwiazdkami w Rysunek 6A,B), które nie mają tętnicy w swoim otoczeniu.
      UWAGA: Wstrzyknięcie do jednej z gałęzi ograniczy utrudnienie przepływu krwi podczas wstrzyknięcia. Dobre miejsca wstrzyknięć zostały oznaczone grotami strzałek w Rysunek 6A,B. Bardzo ważne jest, aby wstrzyknąć do żyły, ponieważ zmusi to wstrzykniętą substancję do przepływu w kierunku zarodka. Poza tym wstrzyknięcie do tętnicy spowoduje masywne krwawienie po usunięciu szklanej igły, co zabije zarodek.
    2. Umieścić szklaną igłę i zarodek w taki sposób, aby szklana końcówka igły i wybrana żyła znajdowały się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej i w tej samej linii kierunkowej. Spróbuj ustawić igłę jak najbardziej poziomo, równolegle do wybranej żyły. Końcówka igły powinna dotykać ścianki naczynia.
      UWAGA: Ustawiając szklaną igłę tak poziomo, jak to możliwe, szansa na przebicie całego naczynia jest mniejsza.
    3. Po ustawieniu powoli przesuwaj się i penetruj ścianę naczynia szklaną igłą. Podczas penetracji CAM zostanie najpierw odepchnięty przez ruch szklanej igły. Przesuwaj szklaną igłę, aż ściana naczynia zostanie przebita.
      UWAGA: Jeśli przez przypadek naczynie zostanie przebite na wylot, powoli cofnij igłę, aby wrócić do światła. Po powrocie do światła lekko unieś igłę do góry i przesuń do przodu wzdłuż naczynia, aby zmienić położenie igły.
    4. Po penetracji lekko cofnij szklaną igłę, aby lepiej ustawić końcówkę w świetle naczynia i przesuń szklaną igłę na boki, aby sprawdzić, czy nie jest przymocowana do ścianki naczynia. Powoli wstrzyknąć niewielką ilość roztworu, aby upewnić się, że końcówka znajduje się wewnątrz światła naczynia (Rysunek 3C).
    5. Upewnij się, że wstrzyknięty roztwór podąża za przepływem krwi. Jeśli tak się nie stanie, lekko przesuń szklaną igłę i kontynuuj wstrzykiwanie małych ilości, aż szklana igła zostanie prawidłowo umieszczona17.
    6. Po wstrzyknięciu żądanej ilości pozostaw szklaną igłę w naczyniu na ~15 sekund, aby zapobiec masywnemu krwawieniu. Następnie przesuń szklaną igłę nieco na boki, w górę i w dół oraz kilka razy w przód iw tył, aby umożliwić delikatne cofnięcie szklanej igły.
      UWAGA: Niektóre krwawienia są normalne. Do każdego wstrzyknięcia należy użyć nowej szklanej igły, ponieważ szklana igła łatwo zapycha się i od białka jaja.
  3. Obrazowanie mikroskopowe zarodka i/lub naczyń CAM
    1. Przygotowanie uchwytu z membraną akustyczną
      1. Weźmy komorę do hodowli komórkowej składającą się z kwadratowego plastikowego uchwytu z dwiema równoległymi, akustycznie przezroczystymi membranami poliwęglanowymi o grubości 50 μm26, zwaną dalej pojemnikiem z membraną akustyczną. Zamknij oba porty pokrywą.
      2. Za pomocą skalpela usuń jedną z dwóch membran z uchwytu z membraną akustyczną.
        UWAGA: Aby usunąć membranę, przetnij membranę tuż obok linii kleju na plastiku. Uważaj, aby nie zsunąć się z krawędzi, aby zapobiec uszkodzeniu drugiej membrany.
      3. Przygotuj ~15 ml 2% agarozy w roztworze demi wody, podgrzewając do temperatury 80-95 °C w małej szklanej zlewce. Schłodzić szklaną zlewkę rozpuszczonym roztworem agarozy pod bieżącą wodą z zimną wodą.
        UWAGA: Jeśli agaroza jest zbyt gorąca, stopi membranę akustyczną, co stworzy nierówną powierzchnię.
      4. Gdy roztwór sschłodzi się do około 37 °C, powoli wlewaj roztwór do uchwytu z membraną akustyczną, aż wypełni cały uchwyt. Lekko przechyl uchwyt z membraną akustyczną, aby warstwa agarozy równomiernie rozprowadziła się wewnątrz plastikowej ramy (Rysunek 4A). Upewnij się, że warstwa agarozy jest płaska i pozwól agarozie zastygnąć w temperaturze pokojowej.
    2. Usunięcie zarodka i CAM z worka żółtkowego i umieszczenie na uchwycie z membraną akustyczną
      1. Wyjąć zawartość jaja z jaja zgodnie z opisem w sekcji 1.2, 1.3 lub 1.4.
      2. W razie potrzeby wstrzyknąć do CAM mikropęcherzyki i/lub inny roztwór(-y) zgodnie z opisem w sekcji 2.1.2.
      3. Napełnij szalkę Petriego o pojemności 1 l ~500 ml PBS o temperaturze 37 °C i umieść uchwyt z membraną akustyczną z agarozą na dnie naczynia. Upewnij się, że warstwa agarozy jest skierowana do góry.
      4. Użyj małych nożyczek, aby szybko przeciąć błonę worka z żółtkiem, zwaną również błoną Vitellusa, wokół całego CAM, podczas gdy zawartość jaja znajduje się w łodzi ważącej (Rysunek 4B). Utrzymuj nożyczki w tej samej pozycji i obracaj łódkę ważącą podczas cięcia, aby uzyskać lepszą precyzję i większą prędkość.
        UWAGA: Od momentu wykonania pierwszego cięcia żółtko zacznie przeciekać. Zmniejsza to widoczność zarodka i CAM. Spróbuj przeciąć całą długość wokół CAM w ciągu 6-7 cięć. Nie powinno to zająć dużo więcej niż 20 sekund. Mała pęseta (Rysunek 1F) może być używana do przytrzymywania krawędzi membrany witelinowej i zapobiegania wcięciu się w CAM.
      5. Użyj łyżki stołowej, aby zgarnąć wyciętą błonę zawierającą zarodek i CAM z łodzi wagowej. Powoli podnieść łyżkę z łódki do ważenia i sprawdzić wzrokowo, czy wycięta błona zawierająca zarodek i CAM jest nadal przymocowana do pozostałej błony worka żółtkowego. W takim przypadku użyj nożyczek, aby wykonać dodatkowe cięcie. Podczas nabierania lekko przechyl łyżkę, aby pozbyć się jak największej ilości żółtka, ale nie pozwól mu wyschnąć. Przenieść wyciętą błonę zawierającą zarodek i CAM na płytkę Petriego o pojemności 1 l, zanurzyć w PBS o temperaturze 37 °C i wyjąć łyżkę.
      6. Gdy błona zawierająca zarodek i CAM zostanie zanurzona w PBS o temperaturze 37 °C, użyj małej pęsety (Rysunek 1F), aby chwycić jedną krawędź błony i delikatnie zawirować wokół błony, aby pozbyć się żółtka, które jest nadal przyczepione.
      7. Po usunięciu całego żółtka użyj małej pęsety, aby przesunąć błonę zawierającą zarodek i CAM i umieść ją nad uchwytem z membraną akustyczną.
      8. Użyj jednej szpilki do próbki owadów, aby przypiąć błonę zawierającą zarodek i CAM w jednym rogu. Unikaj przebijania naczyń w CAM i tylko przypinaj membranę.
      9. Użyj drugiej szpilki do próbki owadów, aby przypiąć błonę zawierającą zarodek i CAM w przeciwległym rogu po przekątnej.
      10. Powoli podnieść uchwyt z membraną akustyczną zawierającą zarodek i CAM z PBS o temperaturze 37 °C. Lekko przechyl uchwyt, aby pozbyć się większości PBS.
      11. Użyj małej pęsety (Rysunek 1F), aby rozciągnąć i równomiernie rozprowadzić błonę zawierającą zarodek i CAM nad uchwytem z membraną akustyczną i przypiąć resztę błony. Upewnij się, że błona zawierająca zarodek i CAM jest lekko rozciągnięta, aby upewnić się, że jest płaska (Rysunek 4C).
      12. Umieścić uchwyt z membraną akustyczną z przypiętą błoną zawierającą zarodek i CAM w urządzeniu do mikroskopii utrzymywanym w temperaturze 37 °C.
      13. Umieść szkiełko nakrywkowe lub akustycznie i optycznie przezroczystą membranę (w zależności od pożądanego celu i użycia ultradźwięków lub nie) na obszarze zainteresowania na zarodku lub CAM (Rysunek 4D), aby umożliwić wizualizację optyczną.
  4. Obrazowanie ultrasonograficzne zarodków kurzych i/lub naczyń CAM
    1. Obrazowanie ultrasonograficzne od strony zarodka kurzego i naczyń CAM
      1. Zawartość jaj należy pobrać zgodnie z opisem w sekcji 1.2, 1.3 lub 1.4. Nie należy jednak używać standardowej łodzi do ważenia. Zamiast tego użyj specjalnie wykonanej łodzi wagowej z jedną akustycznie przezroczystą ścianą.
        UWAGA: Standardowa łódź wagowa została dostosowana poprzez odcięcie jednej strony łodzi ważącej i zastąpienie jej okienkiem z folii poliestrowej, która została sklejona za pomocą kleju epoksydowego.
      2. Zanurz preferowany przetwornik ultradźwiękowy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i ustaw w żądanym miejscu z wymaganą odległością odstępu.
      3. Umieścić łódkę wagową w łaźni wodnej w taki sposób, aby przezroczysta ścianka była skierowana w stronę przetwornika. Upewnij się, że łódka ważąca jest wystarczająco głęboka, aby znajdowała się na poziomie przetwornika, ale nie pozwól, aby woda dostała się do łodzi ważącej (Rysunek 5A).
      4. W razie potrzeby dodaj inną konfigurację w górnej części zarodka lub naczyń CAM, taką jak mikroskop lub laser (Rysunek 5A).
    2. Obrazowanie ultrasonograficzne z górnej części naczyń zarodkowych i CAM bez zakłóceń akustycznych
      1. Napełnić szklankę zlewki o pojemności 2 l PBS o temperaturze 37 °C. Umieść szklankę ze zlewką o pojemności 500 ml do góry dnem na dnie szklanki z zlewką o pojemności 2 litrów. Unikaj powietrza wewnątrz szklanej zlewki o pojemności 500 ml.
        UWAGA: Szklana zlewka o pojemności 500 ml ma na celu podniesienie łodzi ważącej zawierającej zawartość jaj bliżej powierzchni PBS. Zastępując zlewkę przedmiotami o innych rozmiarach, można zmieniać odległość między przetwornikiem a zawartością jaja.
      2. Umieścić napełnioną zlewkę o pojemności 2 l wraz ze szklanką o pojemności 500 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      3. Zawartość jaj należy pobrać zgodnie z opisem w sekcji 1.2, 1.3 lub 1.4.
      4. Zwilżyć zawartość jaja PBS o temperaturze 37 °C i przykryć zarodek przezroczystą folią spożywczą. Można to zrobić, aby utrzymać zarodek w tej samej pozycji i zapobiec jego obracaniu się lub odpływaniu.
        UWAGA: Zwilżając zawartość jaj PBS, staną się one mniej lepkie, co ułatwi pokrycie zawartości jaj przezroczystą folią spożywczą.
      5. Umieść łódkę ważącą z zawartością jaj na szalce Petriego o średnicy 90 mm i powoli zanurz szalkę Petriego w PBS (Rysunek 5B).
        UWAGA: Użycie dwóch zacisków po bokach szalki Petriego naprzeciwko siebie ułatwia zanurzenie szalki Petriego.
      6. Ustaw przetwornik ultradźwiękowy w żądanej odległości odstępu.
    3. Obrazowanie ultrasonograficzne zarodków kurzych i naczyń CAM z ruchomym przetwornikiem
      1. Zawartość jaj należy pobrać zgodnie z opisem w sekcji 1.2, 1.3 lub 1.4.
      2. Przygotować 2% roztwór agarozy w wodzie demi, podgrzewając roztwór do temperatury 80-95 °C w małej szklanej zlewce. Schłodzić szklaną zlewkę rozpuszczonym roztworem agarozy pod bieżącą zimną wodą.
      3. Wlej roztwór agarozy do płaskiego pojemnika, aby utworzyć podkładkę agarozową o grubości około 1 mm. Po całkowitym wystygnięciu i stężeniu pokrój wacik agarozowy do żądanego rozmiaru za pomocą skalpela.
        UWAGA: Grubość podkładki agarozowej można zmieniać, aby uzyskać pożądaną odległość ogniskową niezbędną do prawidłowego działania przetwornika ultradźwiękowego.
      4. Umieść podkładkę agarozową na wierzchu zarodka i CAM (Rysunek 5C). Dodaj kilka kropli ~30 μL PBS o temperaturze 37 °C na wierzch podkładki agarozowej, aby utworzyć cienką warstwę PBS między podkładką agarozową a przetwornikiem.
        UWAGA: Korzystanie z PBS zapobiegnie przywieraniu przetwornika do podkładki agarozowej. Jest to korzystne, gdy na przykład używasz silnika do mechanicznego przesuwania dwuwymiarowego przetwornika w celu wykonania trójwymiarowego skanowania (Rysunek 9B)11. Gdy przetwornik nie musi być przenoszony, PBS można również zastąpić żelem ultradźwiękowym.
      5. Ustaw żądany przetwornik ultradźwiękowy.

Wyniki

W niniejszym protokole opisujemy trzy metody wyjmowania zawartości jaja ze skorupki w 5.–8. dniu inkubacji (HH 26-35)22). Rycina 6 przedstawia zawartość jaja w łódkach wagowych po usunięciu go ze skorupki. 5-dniowy embrion oraz CAM (Rycina 6A) wyjęto metodą opisaną w sekcji 1.2. Zarodki w wieku 6 i 7 dni oraz błonę Callerunga (CAM) (Rycina 6B,C) wyjęto metodą opisaną w sekcji 1.3. 8-dniowy embrion oraz błona pozarhodowa (CAM (Rysunek 6D) został wyjęty metodą opisaną w sekcji 1.4. Nie zaobserwowano krwawienia ani uszkodzeń zarodka lub błony pozarodkowej (CAM), co wskazuje, że metody te można stosować do bezpiecznego usuwania zawartości jaja ze skorupki bez uszkadzania zarodka lub naczyń CAM. Przy prawidłowym wykonaniu metoda dla zarodków 5-dniowych zapewni żywotny zarodek i nienaruszoną błonę CAM w 90% wszystkich procedur. Wskaźnik żywotności opiera się na całkowitej liczbie zapłodnionych jaj pomyślnie wyjętych ze skorupki. W przypadku drugiej metody, stosowanej dla jaj inkubowanych przez 6 i 7 dni, prawdopodobieństwo uzyskania żywotnego zarodka i nienaruszonej błony CAM wynosi około 75% dla zarodków 6-dniowych i około 50% dla zarodków 7-dniowych. W trzeciej metodzie opisanej dla zarodków 8-dniowych prawdopodobieństwo uzyskania żywotnego zarodka i nienaruszonej błony CAM wynosi około 60%. Można zaobserwować różnice w stadiach rozwojowych między zarodkami 5- a 8-dniowymi, co jest zgodne z klasyfikacją Hamburgera i Hamiltona22Zarówno wielkość zarodka, jak i złożoność naczyń błony pozarodkowej (CAM) zwiększają się w trakcie rozwoju (Rysunek 6A-D). Rycina 6C przedstawia cienką warstwę agarozy na powierzchni zawartości jaja, która umożliwia obrazowanie zarodka i błony CAM przy użyciu układu ultradźwiękowego pokazanego w Rysunek 5CPo wyjęciu zawartości jaja ze skorupki bicie serca zarodka jest widoczne gołym okiem. Częstość akcji serca tych ex ovo zarodki są podobne do in ovo zarodki z tętnem wynoszącym 183 uderzenia na minutę (bpm) w 5. dniu do ok. 208 bpm w 8. dniu30Przy zachowaniu odpowiedniej wilgotności i w temperaturze 37 °Czarodek będzie utrzymywać taką częstotliwość akcji serca przez około 5 h w eksperymentalnych układach ultradźwiękowych.

Podczas trzech wcześniej opisanych metod może wystąpić wiele powikłań. Rysunek 7A przedstawia pęcherzyki powietrza uwięzione pod błoną chorioallantoiczną (CAM), co sprawia, że embrion nie nadaje się do obrazowania ultradźwiękowego; ponadto nacisk pęcherzyka(ów) powietrza może uszkodzić embrion i/lub CAM. Problem ten pojawia się, gdy worek powietrzny wewnątrz skorupki nie nawiąże kontaktu z powietrzem na zewnątrz podczas usuwania zawartości jaja ze skorupki. Rysunek 7B pokazuje niewielki wyciek żółtka z pęcherzyka żółtkowego w prawym górnym rogu obrazu. Może to nastąpić podczas usuwania zawartości jaja ze skorupki, gdy pęcherzyk żółtkowy zostanie uszkodzony przez ostre krawędzie skorupki lub przebity pęsetą. Wyciek żółtka może pogorszyć widoczność embrionu oraz naczyń CAM. Rysunek 7C przedstawia embrion, w którym pod CAM uwięziony jest pęcherzyk powietrza. Zdarza się to niekiedy w trakcie rozwoju embrionalnego. Innym możliwym powikłaniem jest uszkodzenie naczyń. Uszkodzenia te mogą powstać podczas usuwania zawartości jaja ze skorupki lub podczas wykonywania iniekcji (Rysunek 7D). Ponadto embrion i naczynia mogą z czasem wyschnąć (Rysunek 7E). Dzieje się tak, gdy zawartość jaja nie jest zraszana PBS. Wyschnięcie embrionu może prowadzić do masywnych zatorów kapilarnych (Rysunek 7F), co wpływa na żywotność embrionu. Masywne zatory kapilarne mogą wystąpić również w trakcie rozwoju lub gdy czynność serca embrionu jest niestabilna.

Po bezproblemowym usunięciu zawartości jaja ze skorupki, do embrionu można wprowadzić, na przykład, środki kontrastowe do USG, takie jak mikropęcherzyki (Rycina 3C). Rycina 8 przedstawia krążące mikropęcherzyki w świetle naczynia krwionośnego po wstrzyknięciu. Mikropęcherzyki te są transportowane wraz z przepływem krwi i pozostają w krwiobiegu przez kilka godzin (Wideo uzupełniające 1). Obecność tych mikropęcherzyków w krążeniu umożliwia przeprowadzenie różnych rodzajów badań CEUS oraz eksperymentów z dostarczaniem leków7,11,12. Błona CAM jest idealna do badania nowych metod detekcji kontrastu ultradźwiękowego, dla których przedstawiamy trzy przykłady. Rycina 9A przedstawia wysokoczęstotliwościowe obrazowanie subharmoniczne ultradźwiękowe 6-dniowego embrionu kurczaka w trybie B oraz w CEUS przed i po wstrzyknięciu mikropęcherzyków. W tym przypadku do naczyń CAM wstrzyknięto 5 µL środka kontrastowego do USG, a obrazowanie wykonano za pomocą przedklinicznego aparatu USG dla zwierząt z głowicą MS250 (częstotliwość nadawania 30 MHz i odbioru 15 MHz, moc 10%). Przed wstrzyknięciem mikropęcherzyków kontrast jest już widoczny wewnątrz embrionalnego serca na obrazach w trybie B (Rycina 9A-I). Zjawisko to wynika z obecności jądra w erytrocytach ptaków, co zwiększa kontrast krwi w obrazowaniu ultradźwiękowym5,31. Dodanie mikropęcherzyków zwiększyło kontrast i widoczność embrionu zarówno w obrazowaniu w trybie B, jak i w CEUS. Rycina 9B przedstawia obraz optyczny oraz wysokoczęstotliwościowy obraz subharmoniczny 3D 6-dniowego embrionu i otaczających go naczyń. Do CAM wstrzyknięto 5 µL środka kontrastowego do USG, a obrazowanie wykonano przedklinicznym aparatem USG dla zwierząt z głowicą MS550s (częstotliwość nadawania 40 MHz, szczytowe ciśnienie ujemne ~300 kPa). Wyniki te pokazują, że obrazowanie CEUS w połączeniu ze środkiem kontrastowym może być również wykorzystywane do tworzenia wysokoczęstotliwościowych obrazów subharmonicznych 3D oraz do obrazowania naczyń krwionośnych poza embrionem. Rycina 9C przedstawia obraz optyczny oraz ultraharmoniczny obraz wewnątrznaczyniowego USG (IVUS) mikronaczyń CAM 6-dniowego embrionu, wykonany za pomocą specjalistycznej głowicy (częstotliwość nadawania 26 MHz oraz odbioru 39 i 65 MHz). Do naczyń CAM wstrzyknięto 4 ± 1 µL środka kontrastowego do USG. Obraz optyczny i obraz IVUS pochodzą z tego samego embrionu i tego samego obszaru zainteresowania, przedstawiając odpowiadające sobie sieci naczyniowe.

Zarodek kurczaka oraz naczynia CAM mogą być również wykorzystywane do badania dostarczania leków wspomaganego ultradźwiękami, dla czego przedstawiamy jeden przykład. Ponieważ żółtko blokuje drogę światła podczas obrazowania, w celu optycznego zbadania dostarczania leków do zarodka i naczyń CAM konieczne jest usunięcie worka żółtkowego. W niniejszym badaniu zarodek i CAM przygotowano do obrazowania mikroskopowego zgodnie z opisem w sekcji 2.2 poprzez oddzielenie błony zawierającej zarodek i CAM od worka żółtkowego (Rycina 4C). W przypadku tych zarodków częstotliwość akcji serca jest stabilna i wynosi około 80 bpm, a zarodki pozostają żywe do 2 h w temperaturze 37 °C7. Rycina 10 przedstawia badanie dostarczania leków wspomaganego ultradźwiękami i mikropęcherzykami do komórek śródbłonka naczyń CAM. Mikropęcherzyki pokryte lipidami, ukierunkowane na ścianę naczynia za pomocą przeciwciał αvβ3 i znakowane barwnikiem fluorescencyjnym DiI7, zostały wstrzyknięte do naczyń CAM (Rycina 10A,C). Jądra komórek śródbłonka naczyń CAM zabarwiono Hoechst 33342 (Rycina 10B), a jako modelowy lek do wizualizacji sonoporacji wykorzystano jodek propidyny (PI)7. Oba te barwniki wstrzyknięto jednocześnie z mikropęcherzykami. Po zastosowaniu ultradźwięków (1 MHz, szczytowe ciśnienie ujemne 200 kPa, pojedynczy impuls 1000 cykli) zaobserwowano pobieranie PI przez jądra znajdujące się najbliżej ukierunkowanych mikropęcherzyków (Rycina 10D). Wykazuje to, że oscylacje ukierunkowanych mikropęcherzyków indukowane ultradźwiękami były w stanie wytworzyć por w błonie komórki śródbłonka.

Metalowe formy i narzędzia do odlewania z linijką jako punktem odniesienia dla rozmiaru; oznaczenia A-F zestawu eksperymentalnego.
Rycina 1. Sprzęt do przygotowania embrionów. (A-B) widok z góry i z boku metalowego uchwytu na jaja oraz (C-D) widok z góry i z boku metalowego uchwytu na łóreczkę wagową. (E-F) pincety niezbędne do wydobycia zawartości jaja ze skorupki. Skala w cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces wstrzykiwania do jaja, wstrzykiwanie strzykawką, penetracja skorupki jaja, eksperyment z biologii rozwoju.
Rysunek 2. Procedura usuwania zarodka. (A) Małe wgłębienie na górze jaja, zaznaczone czarnym okręgiem. (B) Małe wgłębienie w 2/3 wysokości jaja, zaznaczone czarnym okręgiem. (C) Odessanie ~2 mL białka jaja. (D) Szczelina z boku uszczelniona taśmą. (E) Powiększanie małego otworu na górze jaja. (F) Zarodek staje się widoczny po usunięciu części skorupki. (G-H) Po obróceniu jaja o 180°, zarodek wypływa do góry i staje się niewidoczny (strzałki wskazują kierunek przemieszczania się zarodka). Po 1-2 min zarodek jest niewidoczny od dołu. (I) Po nacięciu błony zawartość jaja wypływa do łódki wagowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ do mikroiniekcji; porównanie rozmiarów pipet, precyzyjne manipulowanie, miejsce iniekcji pod mikroskopem.
Rycina 3. Iniekcja mikropęcherzyków do naczyń CAM. (A) Szklana igła kapilarna. Skala w cm. (B) Roztwór jodku propidyny (PI) (kropla po lewej) oraz mikropęcherzyki (kropla po prawej) przed aspiracją przed iniekcją. Igła (obrysowana na czarno) widoczna jest w prawym górnym rogu (C) Iniekcja mikropęcherzyków. Końcówka igły kapilarnej jest umieszczona w świetle jednej z żył (lewo). Mikropęcherzyki, biała chmura wskazana strzałką, są wstrzykiwane i rozprzestrzeniają się zgodnie z kierunkiem przepływu krwi (prawo). Pasek skali reprezentuje 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ doświadczalny angiogenezy in vitro: test błony jajowej embrionalnej w 4 etapach, schemat badawczy.
Rysunek 4. Usuwanie zarodka i CAM z worka żółtkowego i umieszczanie ich na uchwycie z membraną akustyczną. (A) Uchwyt z membraną akustyczną wypełniony warstwą agarozy. (B) Zarodek kurzęcy i naczynia CAM w łódce wagowej przed wycięciem. Linia przerywana wskazuje linię cięcia wokół CAM. (C) Zarodek kurzęcy i CAM oddzielone od żółtka i przymocowane szpilkami do membrany akustycznej. (D) Przymocowany szpilkami zarodek kurzęcy z akustycznie i optycznie przezroczystą membraną w uchwycie (niebieski) umieszczonym na górze CAM. Uchwyt można wypełnić wodą demineralizowaną, aby umożliwić zastosowanie obiektywu immersyjnego. Wszystkie paski skali reprezentują 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

System akwakultury: analiza danych, wylęgarnia, obserwacja embrionów; konfiguracja obejmuje zbiorniki, mikroskop, kamerę.
Rysunek 5. Różne konfiguracje do obrazowania ultradźwiękowego embrionu kurczaka i CAM. (A) Konfiguracja do obrazowania ultradźwiękowego z boku. Embrion kurczaka umieszczono w specjalnie dostosowanej łódce wagowej z jedną ścianką akustycznie przezroczystą, a następnie w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Przetwornik ultradźwiękowy ustawiono po lewej stronie (a) obok ścianki akustycznie przezroczystej, a laser (b) do obrazowania fotoakustycznego na górze. (B) Konfiguracja do obrazowania ultradźwiękowego z góry. Embrion i CAM zanurzono w zlewce z PBS, która została umieszczona w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Przerywana linia pokazuje szklaną zlewkę o pojemności 2 L (a) z szklaną zlewką o pojemności 500 mL (b) wewnątrz. (C) Konfiguracja do obrazowania ultradźwiękowego z góry z ruchomym przetwornikiem. Cienka podkładka z agarozy (linia kropkowana) została umieszczona na embrionie, z cienką warstwą PBS jako medium sprzęgającym między przetwornikiem a powierzchnią agarozy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Test angiogenezy w zarodku kurczaka wykazujący wzrost naczyń CAM, schemat, konfiguracja analizy naczyń krwionośnych.
Rysunek 6. Zawartość jaja poza skorupą. (A) Zawartość jaja wyjęta ze skorupy po 5 dniach inkubacji. Wskazano błonę chorioallantoiczną (CAM), ciało zarodka (EB), przednią i tylną żyłę witelinową (*) oraz odpowiednie miejsca do iniekcji (groty strzałek). (B) Zawartość jaja wyjęta ze skorupy po 6 dniach inkubacji. Wskazano przednią i tylną żyłę witelinową (*) oraz odpowiednie miejsca do iniekcji (groty strzałek). (C) Zawartość jaja wyjęta ze skorupy po 7 dniach inkubacji. Na wierzchu umieszczono fragment agarozy, aby umożliwić obrazowanie ultradźwiękowe. Narożniki fragmentu agarozy zaznaczono czarnymi kółkami. (D) Zawartość jaja wyjęta ze skorupy po 8 dniach inkubacji. Wszystkie paski skali reprezentują 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Etapy rozwoju zarodka kury, układ naczyniowy, schemat eksperymentalny, badanie embriologiczne.
Rycina 7. Powikłania, które mogą wystąpić podczas procedur z zarodkiem kury i modelem CAM. (A) Pęcherzyki powietrza uwięzione pod CAM podczas usuwania zawartości jaja ze skorupki metodą 1.2 (zarodek 5-dniowy) lub 1.3 (zarodek 6 do 7-dniowy). (B) Niewielki wyciek żółtka zaznaczony strzałką w prawym górnym rogu (zarodek 6-dniowy). (C) Powietrze uwięzione pod CAM, zaznaczone czarnym przerywanym okręgiem (zarodek 7-dniowy). (D) Krwawienie, zaznaczone czarnymi strzałkami (zarodek 5-dniowy). (E) Wyschnięty zarodek i CAM (zarodek 5-dniowy). (F) Masowe zatory w naczyniach włosowatych (zarodek 5-dniowy). Wszystkie paski skali reprezentują 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy, światło naczynia, identyfikacja ściany; analiza histologiczna, badanie struktury tkanki.
Rysunek 8. Mikropęcherzyki w naczyniu krwionośnym CAM. Ścianę naczynia zaznaczono linią przerywaną, a pojedyncze mikropęcherzyki wskazano strzałkami. Pasek skali reprezentuje 20 µm. Odpowiadające temu nagranie mikroskopowe znajduje się w Supplemental Video 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazowanie embrionów, mikroskopia fluorescencyjna, rozwój płodowy, struktury anatomiczne, analiza optyczna.
Rysunek 9. Obrazowanie ultrasonograficzne z użyciem kontrastu u embrionów kurczaka i w naczyniach błony żółtkowej (CAM). (A) Projekcja maksymalnej intensywności obrazów w trybie B (I, III) oraz obrazów subharmonicznych w czasie rzeczywistym (II, IV) (prekliniczny aparat USG dla zwierząt z głowicą MS250, częstotliwość nadawcza 30 MHz i odbiorcza 15 MHz, moc 10%) 6-dniowego embrionu z nałożoną warstwą agarozy. Górne obrazy (I, II) przedstawiają wyniki przed, a dolne (III, IV) po wstrzyknięciu 5 µL środka kontrastowego do USG. Pasek skali reprezentuje 1 mm. Obraz został zmodyfikowany za zgodą Daeichin et al. 201511 (B) Obrazowanie optyczne (lewo) i subharmoniczne 3D (prawo) 6-dniowego embrionu kurczaka z nałożoną warstwą agarozy. Do naczyń CAM wstrzyknięto 5 µL środka kontrastowego do USG, a obrazowanie wykonano za pomocą głowicy wysokoczęstotliwościowej (prekliniczny aparat USG dla zwierząt z głowicą MS550s, częstotliwość nadawania 40 MHz, szczytowe ujemne ciśnienie ~300 kPa, renderowane w trybie 3-D preklinicznego aparatu USG dla zwierząt). Pasek skali reprezentuje 5 mm. Obraz został zmodyfikowany za zgodą Daeichin et al. 201511. (C) Obraz optyczny (lewo) oraz projekcja średniej intensywności ultraharmonicznego wewnątrznaczyniowego USG (IVUS) (prawo) mikrokrążenia CAM 6-dniowego embrionu. Do naczyń CAM wstrzyknięto 4 ± 1 µL środka kontrastowego. Obrazowanie ultraharmoniczne IVUS wykonano za pomocą niestandardowej głowicy IVUS (częstotliwość nadawania 35 MHz, szczytowe ujemne ciśnienie 600 kPa). Oba obrazy pochodzą z tego samego embrionu i tego samego obszaru zainteresowania. Strzałki wskazują odpowiadające sobie naczynia na obu obrazach. Pasek skali reprezentuje 1 mm. Obraz został zmodyfikowany za zgodą Maresca et al. 201412. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia struktur komórkowych; obrazy fluorescencyjne A-D; panel pokazujący lokalizację białek.
Rycina 10. Dostarczanie leku do komórek śródbłonka naczyń CAM w embrionie w 6-tym dniu rozwoju. (A) Obraz w świetle przechodzącym przedstawiający sześć mikropęcherzyków ukierunkowanych na αvβ3, zaznaczonych białymi strzałkami, przylegających do ściany naczynia przed zabiegiem ultradźwiękowym. (B) Jądra komórek śródbłonka barwione fluorescencyjnie przed zabiegiem ultradźwiękowym. (C) Obraz fluorescencyjny zabarwionych mikropęcherzyków ukierunkowanych, zaznaczonych białymi strzałkami, przed zabiegiem ultradźwiękowym. (D) Wchłanianie modelowego leku, jodku propidyny (PI), do jąder komórkowych znajdujących się pod ukierunkowanymi mikropęcherzykami po zabiegu ultradźwiękowym (1 MHz, szczytowe ciśnienie ujemne 200 kPa, pojedynczy impuls 1000 cykli). Pasek skali odpowiada 10 µm i odnosi się do wszystkich obrazów. Obraz został zmodyfikowany za zgodą Skachkov et al. 20147. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

PLIKI UZUPEŁNIAJĄCE

Wideo uzupełniające 1. Mikropęcherzyki w naczyniach krwionośnych błony CAM. Pasek skali reprezentuje 20 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Dyskusja

Protokół ten opisuje trzy metody pozyskiwania i wykorzystywania zarodków kurcząt w wieku od 5 do 8 dni i ich CAM jako modelu in vivo do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków. Najbardziej krytyczne kroki przy wyjmowaniu zarodków 5-dniowych (sekcja 1.2) i 6 do 7-dniowych (sekcja 1.3) ze skorupy to: 1) wykonanie małego otworu w górnej części jaja, aby przejść przez całą skorupkę jaja do worka powietrznego przed wyjęciem białka jaja; 2) Utwórz gładkie krawędzie dla dużego otworu w powłoce. W przypadku metody wyjmowania 8-dniowych zarodków ze skorupy (sekcja 1.4) najbardziej krytycznymi krokami są: 1) Wykonaj wystarczającą liczbę wgłębień, aby utworzyć ładne pęknięcie wzdłuż jaja; 2) Trzymaj jajko zanurzone w PBS. Aby zapewnić żywotność zarodka we wszystkich metodach, ważne jest, aby przechowywać komórkę jajową i jej zawartość w temperaturze 37 °C. Ponadto należy unikać wstrzykiwania do tętnicy CAM. Zaleca się wizualne monitorowanie częstości akcji serca zarodka podczas badań w celu zapewnienia żywotności zarodka. Aby potwierdzić dokładny etap rozwoju zarodka, można posłużyć się wskazaniem Hamburger & Hamilton22.

Ważne jest, aby zapobiec uszkodzeniu zarodka, CAM i worka żółtkowego. To uszkodzenie może wpływać na żywotność, przepływ krwi i widoczność zarodka i CAM. Ponadto uszkodzenie worka żółtkowego, a co za tym idzie niska sztywność membrany, uniemożliwia wstrzyknięcie do naczyń CAM. 5-dniowy zarodek ma stosunkowo mały worek powietrzny, więc aby móc zrobić wystarczająco duży otwór w skorupce, przez który można usunąć zawartość jaja, należy pobrać 2 ml białka jaja. W rezultacie powstaje większa przestrzeń między skorupką jaja a zarodkiem. Po wyjęciu białka jaja kawałek taśmy musi zamknąć otwór, w który weszła igła. Jeśli białko jaja nadal wycieka, nałóż kolejny kawałek taśmy. Poza tym nałożenie taśmy na otwór z boku wytwarza podciśnienie wewnątrz jajka, które zapobiega wypadaniu zawartości jajka pod własnym ciężarem, gdy duży otwór zostanie utworzony w kroku 1.2.2.8. Do uszkodzenia zarodka lub CAM może dojść również wtedy, gdy krawędź skorupki jaja była zbyt ostra lub gdy zawartość jaja jest wrzucana do łodzi wagowej zbyt rygorystycznie, dlatego skorupka jaja powinna być trzymana bardzo blisko łodzi do ważenia. Między 5 a 6 dniem rozwoju CAM zaczyna przyczepiać się do membrany powłoki32. To przywiązanie zwiększa ryzyko uszkodzenia zarodka i CAM podczas wyjmowania zawartości jaja ze skorupki jaja. Otwierając jajo po wstrzyknięciu do niego PBS w przypadku jaja inkubowanego przez 6 do 7 dni lub w pojemniku wypełnionym PBS, jak opisano dla jaja inkubowanego przez 8 dni, zmniejsza się ryzyko uszkodzenia. Jeśli chodzi o wstrzyknięcie do żyły CAM: jeśli pierwsze wstrzyknięcie nie powiedzie się, drugie wstrzyknięcie można wykonać dalej w górę tej samej żyły, jeśli uszkodzenie było niewielkie lub w innej żyle CAM. Oddzielenie zarodka i CAM od żółtka sprawia, że naczynia zarodkowe i CAM są optycznie przezroczyste. W konsekwencji zarodek traci swoje główne źródło składników odżywczych33. Ta utrata składników odżywczych może być wyjaśnieniem obserwowanego niższego częstości akcji serca wynoszącego 80 uderzeń na minutę w porównaniu do ~190 dla 6-dniowego zarodka, który nadal ma kontakt z żółtkiem30 i skróconego czasu przeżycia do 2 godzin po tej procedurze separacji. Innym czynnikiem, który może odgrywać rolę w obniżeniu częstości akcji serca i skrócenia czasu przeżycia, jest wyzwanie polegające na utrzymaniu oddzielonego żółtkiem zarodka i naczyń CAM w temperaturze 37 °C. Pomocne może być inkubator ze stopniem mikroskopowym. Oprócz tego oderwanie się CAM od żółtka prawdopodobnie prowadzi do zmian mechanicznych w tkance, ponieważ napięcie błony staje się mniejsze. Niższe napięcie błony może powodować zwiększone tempo ścinania naczyń wewnętrznych, co prowadzi do niższego tętna.

Naczynia ex ovo chicken embryo i CAM mają pewne ograniczenia, podobnie jak model in vivo, w tym tylko krótkie obserwacje czasowe, do obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków. Ze względu na małą objętość krwi wynoszącą 100±23 μl w 5. dniu i 171±23 μl w 6.34. dniu, można wstrzyknąć maksymalną objętość ~5 μl. W późniejszych stadiach rozwoju (7 dzień i starsze) sztywność naczyń wzrasta, a elastyczność żółtka maleje. Może to skomplikować udane wstrzyknięcie w starszych zarodkach. Po wstrzyknięciu mikropęcherzyki krążą przez wiele godzin, ponieważ zarodek kurczaka nie ma na tym etapie w pełni rozwiniętego układu odpornościowego35. W związku z tym mikropęcherzyki nie są usuwane w ciągu ~6 minut, jak u ludzi36,37, co sprawia, że typowe badania ultrasonograficzne obrazowania molekularnego z 5-10-minutowym okresem oczekiwania na usunięcie niezwiązanych docelowych mikropęcherzyków38 są niewykonalne. W celu celowania w mikropęcherzyki należy użyć odpowiednich ligandów zdolnych do wiązania się z komórkami śródbłonka ptaków, takich jak opisane wcześniej dla markera angiogenezy αvβ37. Inne aspekty, które należy wziąć pod uwagę w tym modelu, to zwiększona trudność oddzielenia naczyń zarodkowych i CAM od żółtka u starszych zarodków (> 8 dni) oraz niższy hematokryt o ~20%39 w porównaniu z ludźmi. To ostatnie może wpływać na oscylacje mikropęcherzyków, ponieważ wiadomo, że oscylacje mikropęcherzyków są tłumione w bardziej lepkim środowisku40. Tętnice CAM są mniej natlenione niż żyły CAM41,42. Różnica ta powinna być brana pod uwagę np. przy badaniu fotoakustycznego obrazowania natlenienia krwi.

Opisane tutaj metody pozwalają na pobranie zawartości jaja ze skorupki jaja w dniu obrazowania ultrasonograficznego lub badania dostarczania leku, zwykle w 5 do 8 dniu inkubacji. Różni się to od istniejących metod, w których zawartość jaj jest wyjmowana ze skorupki po 3-dniowej inkubacji i dalej rozwijana jako hodowla ex ovo 18,20,21. Zaletami są wyższy wskaźnik przeżywalności wynoszący 90% dla jaj 5-dniowych, 75% dla 6-dniowych, 50% dla 7-dniowych i 60% dla 8-dniowych jaj inkubowanych w porównaniu do ~50% dla 3-dniowych zarodków wyjętych ze skorupki jaja i dalej inkubowanych ex ovo 1,18, unikanie antybiotyków podczas hodowli18, 20 i duży sterylny inkubator do hodowli Ex ovo. Przeżywalność zarodków w wieku od 6 do 8 dni jest niższa, ponieważ CAM zaczyna przyczepiać się do otoczki21, co sprawia, że błona CAM jest bardziej podatna na pękanie po ekstrakcji. Opisano również oddzielenie zarodka od CAM od żółtka, dzięki czemu zarodek i CAM są optycznie przezroczyste.

Umieszczając zawartość jaj w różnych konfiguracjach, zarodek kurzy i CAM mogą być wykorzystywane do wielu badań obrazowania ultrasonograficznego, takich jak IVUS, fotoakustycznie, bez lub z ultradźwiękowymi środkami kontrastowymi w 2D i 3D. Można skupić się na opracowywaniu nowych schematów pulsacji ultradźwiękowych lub testowaniu nowatorskich przetworników. Poza tym model może być również wykorzystany do badania nowych ultrasonograficznych środków kontrastowych i ich zachowania w naczyniach krwionośnych pod przepływem. Ponieważ mechanizm dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków jest nadal nieznany43, zastosowanie modelu CAM in vivo może pomóc w wyjaśnieniu tego mechanizmu poprzez badanie zachowania mikropęcherzyków w odniesieniu do odpowiedzi komórkowej. Wreszcie, naczynia CAM okazały się odpowiednim systemem do badania przeszczepu guza ksenoprzeszczepu44. Stwarza to możliwość wykorzystania naczynia CAM jako modelu do badania obrazowania guza za pomocą ultradźwięków oraz do badania przepływu krwi wewnątrz guza za pomocą CEUS. Guzy są zwykle przeszczepiane na naczyniach CAM 8 lub 9-dniowych zarodków 1,14,45, w przypadku których zarodek jest wyjmowany ze skorupki jaja w 3 dniu inkubacji i dalej rozwijany ex ovo. Metody opisane w tym protokole mogą być stosowane do hodowli zarodków in ovo do dnia przeszczepu guza.

Autorzy mają nadzieję, że praca ta będzie pomocna dla badaczy, którzy chcą wykorzystać zarodki kurczaka i ich błonę kosmówkowo-omoczniową (CAM) jako model in vivo do zastosowań środków kontrastowych i badań przepływu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Nauki Stosowane i Inżynieryjne (TTW) (Vidi-project 17543), część NWO. Autorzy pragną podziękować Robertowi Beurskensowi, Luxi Wei i Rezie Pakdamanowi Zangabadowi z Wydziału Inżynierii Biomedycznej oraz Michielowi Mantenowi i Geertowi Springelingowi z Wydziału Eksperymentalnego Oprzyrządowania Medycznego za pomoc techniczną, wszyscy z Erasmus MC University Medical Center Rotterdam w Holandii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zacisk AgaroseSigma-AldrichA9539
(zacisk Kocher)
na folię
z membraną akustyczną (CLINIcell 25 cm2)MABIO, Tourcoing, FrancjaCLINIcell25-50-T FER 00106
Demi water
Jednorazowe plastikowe pipety PasteuraVWR612-1747
JajaDrost Pluimveebedrijf Loenen BV, HolandiaŚwieżo zapłodniona
lodówka 15 ° C
Igły kapilarne szklaneDrummond1-000-1000Średnica wewnętrzna: 0,0413 cala
Płyta grzewcza 37 & deg; C
Inkubator nawilżany 37 ° C
Szpilki
Metalowy uchwytWykonany na zamówienie przez Eksperymentalne Oprzyrządowanie Medyczne w Erasmus MC. Patrz rysunek 1 A,B
Metalowy uchwytłodzi wykonany na zamówienie przez Eksperymentalne Oprzyrządowanie Medyczne w Erasmus MC. Zobacz rysunek 1 C,D
System mikroiniekcjiFUJIFILM VisualSonics
Olej mineralnySigma-AldrichM8410-100ML
Igła, 19 GVWR (TERUMO)613-5392
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS), 1xThermoFisher10010023
szalka Petriego, 1 LSzklana
szalka Petriego, średnica 90 mmVWR391-0559
Przedkliniczny aparat ultrasonograficzny dla zwierząt (Vevo 2100)Sonda FUJIFILM VisualSonics
(MS250)Sonda FUJIFILM VisualSonics30 MHz nadawania i odbioru 15 MHz
(MS550s)FUJIFILM VisualSonicsczęstotliwość transmisji 40 MHz
SkalpelVWR (SWANN-MORTON)233-5363
Nożyczki, małeFine Science Tools (FST)14558-09
Strzykawka, 5 mLVWR (TERUMO)613-0973
Taśma na łyżkę
(Scotch Magic tape)Taśma klejąca
Bibułkaklejąca
duża Akcje VWR (USBECK Laborgerä te)232-0107Zobacz rysunek 1E
Pęseta małaDUMONT Medical, Szwajcaria0103-5/45Zobacz rysunek 1F
Ultradźwiękowy środek kontrastowy (custum wykonany typu F)Wyprodukowany zgodnie z opisem przez: Daeichin, V. i wsp. Skład mikropęcherzyków i przygotowanie do obrazowania: ocena in vitro i in vivo. TRANSAKCJE IEEE NA ULTRASONICS. art. 64 ust. 3, art. 555– 567 (2017).
Ultradźwiękowy środek kontrastowy (MicroMarker)FUJIFILM VisualSonics, Inc.
Ultradźwiękowy środek kontrastowy (Definity)Obrazowanie medyczne Lantheus, Stany Zjednoczone
Żel do ultradźwiękówAquasonic
Waxi film (Parafilm)Parafilm
Łodzie do ważenia (85 &x; 85&24 mm)VWR611-0094
Uchwyt spożywcządo próbek owadów na jajka do ważenia stołową Pęseta Tork

Bibliografia

  1. Martowicz, A., Kern, J., Gunsilius, E., Untergasser, G. Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (99), e1(2015).
  2. Schmitz, M., Nelemans, B. K. A., Smit, T. H. A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos. Journal of Visualized Experiments. (118), e1(2016).
  3. Brauer, R., Chen, P. Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e1(2015).
  4. Oosterbaan, A. M., Ursem, N. T. C., Struijk, P. C., Bosch, J. G., van der Steen, A. F. W., Steegers, E. A. P. Doppler flow velocity waveforms in the embryonic chicken heart at developmental stages corresponding to 5-8 weeks of human gestation. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology. 33 (6), 638-644 (2009).
  5. McQuinn, T. C., Bratoeva, M., DeAlmeida, A., Remond, M., Thompson, R. P., Sedmera, D. High-Frequency Ultrasonographic Imaging of Avian Cardiovascular Development. Developmental Dynamics. 236 (12), 3503-3513 (2007).
  6. Stieger, S. M., Caskey, C. F., Adamson, R. H., Curry, F. E., Wisner, E. R., Ferrara, K. W. Enhancement of Vascular Permeability with Low-Frequency Contrast-enhanced Ultrasound in the Chorioallantoic Membrane Model. Radiology. 243 (1), 112-121 (2007).
  7. Skachkov, I., Luan, Y., van der Steen, A. F. W., De Jong, N., Kooiman, K. Targeted microbubble mediated sonoporation of endothelial cells in vivo. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 61 (10), 1661-1667 (2014).
  8. Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (11), 1162-1176 (2007).
  9. Rytelewski, M., Buensuceso, A., Leong, H. S., Deroo, B. J., Chambers, A. F., Koropatnick, J. Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In vivo. Journal of Visualized Experiments. (96), e1(2015).
  10. Schmitd, L. B., Liu, M., Scanlon, C. S., Banerjee, R., Silva, N. J. D. The Chick Chorioallantoic Membrane In vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer. Journal of Visualized Experiments. (148), e1(2019).
  11. Daeichin, V., Bosch, J. G., Needles, A., Foster, F. S., van der Steen, A., de Jong, N. Subharmonic, non-linear fundamental and ultraharmonic imaging of microbubble contrast at high frequencies. Ultrasound in Medicine and Biology. 41 (2), 486-497 (2015).
  12. Maresca, D., et al. Imaging microvasculature with contrast-enhanced ultraharmonic ultrasound. Ultrasound in Medicine and Biology. 40 (6), 1318-1328 (2014).
  13. Lindsey, B. D., et al. High Resolution Ultrasound Superharmonic Perfusion Imaging: In vivo Feasibility and Quantification of Dynamic Contrast-Enhanced Acoustic Angiography. Annals of Biomedical Engineering. 45 (4), 939-948 (2017).
  14. Paproski, R. J., Jovel, J., Wong, G. K. S., Lewis, J. D., Zemp, R. J. Enhanced detection of cancer biomarkers in blood-borne extracellular vesicles using nanodroplets and focused ultrasound. Cancer Research. 77 (1), 3-13 (2017).
  15. Huang, C., et al. Short Acquisition Time Super-Resolution Ultrasound Microvessel Imaging via Microbubble Separation. Scientific Reports. 10, 1-13 (2020).
  16. Lowerison, M. R., Huang, C., Kim, Y., Lucien, F., Chen, S., Song, P. In vivo Confocal Imaging of Fluorescently Labeled Microbubbles: Implications for Ultrasound Localization Microscopy. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 67 (9), 1811-1819 (2020).
  17. Faez, T., Skachkov, I., Versluis, M., Kooiman, K., de Jong, N. In vivo Characterization of Ultrasound Contrast Agents: Microbubble Spectroscopy in a Chicken Embryo. Ultrasound in Medicine and Biology. 38 (9), 1608-1617 (2012).
  18. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. (44), e4(2010).
  19. Kokhuis, T. J. A., et al. Intravital microscopy of localized stem cell delivery using microbubbles and acoustic radiation force. Biotechnology and Bioengineering. 112 (1), 220-227 (2015).
  20. Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development. Journal of Visualized Experiments. (95), e6(2015).
  21. Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. Journal of Visualized Experiments. (33), e2(2010).
  22. Hamburger, V., Hamilton, H. A Series Of Normal Stages In The Developent Of The Chick Embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 231-272 (1951).
  23. Ribatti, D. A morphometric study of the expansion of the chick vasculosa in shell-less culture. Journal of Anatomy. 186, 639-644 (1995).
  24. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Burri, P. H., Djonov, V. Chorioallantoic Membrane Capillary Bed: A Useful Target for Studying Angiogenesis and Anti-Angiogenesis In vivo. Anatomical Record. 324, 317-324 (2001).
  25. DeFouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the Microcirculation in the Chick Chorioallantoic Membrane during Normal Angiogenesis. Microvascular research. 38, 136-147 (1989).
  26. Beekers, I., van Rooij, T., van der Steen, A. F. W., de Jong, N., Verweij, M. D., Kooiman, K. Acoustic characterization of the CLINIcell for ultrasound contrast agent studies. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 66 (1), 244-246 (2019).
  27. Lang, E. R., Rha, C. Apparent shear viscosity of native egg white. Journal of Food Science and Technology. 17, 595-606 (1982).
  28. Daeichin, V., et al. Microbubble Composition and Preparation for Imaging: In Vitro and In vivo Evaluation. IEEE TRANSACTIONS ON ULTRASONICS. 64 (3), 555-567 (2017).
  29. Mcferrin, H. E., Olson, S. D., Gutschow, M. V., Semon, J. A., Sullivan, D. E., Prockop, D. J. Rapidly Self-Renewing Human Multipotent Marrow Stromal Cells (hMSC) Express Sialyl Lewis X and Actively Adhere to Arterial Endothelium in a Chick Embryo Model System. PLoS ONE. 9 (8), 1-11 (2014).
  30. Akiyama, R., Mitsubayashi, H., Tazawa, H., Burggren, W. W. Heart rate responses to altered ambient oxygen in early (days 3-9) chick embryos in the intact egg. Journal of Comparative Physiology - B Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 169 (2), 85-92 (1999).
  31. Foster, F. S., Hossack, J., Adamson, S. L. Micro-ultrasound for preclinical imaging. Interface Focus. 1, 576-601 (2011).
  32. Gabrielli, M. G., Accili, D. The Chick Chorioallantoic Membrane: A Model of Molecular, Structural, and Functional Adaptation to Transepithelial Ion Transport and Barrier Function during Embryonic Development. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-12 (2010).
  33. van der Wagt, I., de Jong, I. C., Mitchell, M. A., Molenaar, R., van den Brand, H. A review on yolk sac utilization in poultry. Poultry Science. 99, 2162-2175 (2020).
  34. Kind, C. The development of the circulating blood volume of the chick embryo. Anatomy and Embryology. 147, 127-132 (1975).
  35. Ribatti, D. Chick Embryo Chorioallantoic Membrane as a Useful Tool to Study Angiogenesis. International Review of Cell and Molecular Biology. 270, 181-224 (2008).
  36. Schneider, M. Characteristics of SonoVue(TM). Echocardiography. 16 (7), 743-746 (1999).
  37. Kitzman, D. W., Goldman, M. E., Gillam, L. D., Cohen, J. L., Aurigemma, G. P., Gottdiener, J. S. Efficacy and Safety of the Novel Ultrasound Contrast Agent Perflutren (Definity) in Patients With Suboptimal Baseline Left Ventricular Echocardiographic Images. American Journal of Cardiology. 86, 669-674 (2000).
  38. Kosareva, A., Abou-Elkacem, L., Chowdhury, S., Lindner, J. R., Kaufmann, B. A. Seeing the Invisible-Ultrasound Molecular Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (3), 479-497 (2020).
  39. Al-Roubaie, S., Jahnsen, E. D., Mohammed, M., Henderson-Toth, C., Jones, E. A. V. Rheology of embryonic avian blood. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (6), 2473-2481 (2011).
  40. Helfield, B., Chen, X., Qin, B., Villanueva, F. S. Individual lipid encapsulated microbubble radial oscillations: Effects of fluid viscosity. The Journal of the Acoustical Society of America. 139 (1), 204-214 (2016).
  41. Metcalfe, J., Stock, M. K. Oxygen exchange in the chorioallantoic membrane, avian homologue of the mammalian placenta. Placenta. 14, 605-613 (1993).
  42. Tazawa, H. Oxygen and CO2 exchange and acid-base regulation in the avian embryo. American Journal of Zoology. 20, 395-404 (1980).
  43. Kooiman, K., et al. Ultrasound-Responsive Cavitation Nuclei for Therapy and Drug Delivery. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  44. Li, M., Pathak, R. R., Lopez-rivera, E., Friedman, S. L., Aguirre-ghiso, J. A., Sikora, A. G. The In ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma. Journal of Visualized Experiments. (104), e1(2015).
  45. Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. Journal of Visualized Experiments. (77), e1(2013).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Model zarodka kurczakadostarczanie leków za pomocą mikropęcherzykównaczynia błony alantoiczno-chorionicznejprzygotowanie ex ovoultradźwiękowe środki kontrastoweobrazowanie naczynioweiniekcja zarodka
Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.