Odkrycie regulatorów przerzutów przy użyciu szybkiego i ilościowego modelu błony nazębiowej przyżyciowej kurcząt

Podsumowanie

To jest skuteczna metoda do wykrywania supresorów lub czynników powodujących przerzuty raka. Komórki, transdukowane biblioteką ekspresji, są wstrzykiwane do układu naczyniowego błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu utworzenia kolonii przerzutowych. Kolonie o zmniejszonej lub zwiększonej inwazyjności są wycinane, namnażane, ponownie wstrzykiwane w celu potwierdzenia ich fenotypu, a na koniec analizowane przy użyciu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

Streszczenie

Ostatnie postępy w badaniach nad rakiem zilustrowały bardzo złożoną naturę przerzutów nowotworowych. Stwierdzono, że wiele genów lub sieci genów jest zaangażowanych w różnicową regulację przerzutowych genów kaskadowych raka i produktów genowych w zależności od typu nowotworu, tkanki i indywidualnych cech pacjenta. Stanowią one potencjalnie ważne cele dla terapii genetycznych i podejść medycyny spersonalizowanej. Opracowanie platform do szybkich badań przesiewowych ma zasadnicze znaczenie dla identyfikacji tych celów genetycznych.

Błona kosmówkowo-omoczniowa piskląt (CAM) jest wysoce unaczynioną, bogatą w kolagen błoną znajdującą się pod skorupką jaja, która pozwala na wymianę gazową w rozwijającym się zarodku. Ze względu na lokalizację i unaczynienie CAM, opracowaliśmy go jako przyżyciowy model przerzutów raka u ludzi, który pozwala na solidny ksenograf ludzkich komórek rakowych i obrazowanie w czasie rzeczywistym interakcji komórek rakowych z macierzą bogatą w kolagen i naczyniami krwionośnymi.

Korzystając z tego modelu, zaprojektowano ilościową platformę przesiewową do identyfikacji nowych czynników powodujących lub supresorów przerzutów raka. Przetransdukowaliśmy pulę komórek nowotworowych głowy i szyi HEp3 z kompletną biblioteką genów shRNA ludzkiego genomu, a następnie wstrzyknęliśmy komórki, o niskiej gęstości, do układu naczyniowego CAM. Komórki namnażały się i tworzyły kolonie pojedynczych komórek nowotworowych. Poszczególne kolonie, które nie były w stanie zaatakować tkanki CAM, były widoczne jako zwarty fenotyp kolonii i wycinane w celu identyfikacji transdukowanego shRNA obecnego w komórkach. Obrazy poszczególnych kolonii oceniano pod kątem ich inwazyjności. Przeprowadzono wiele rund selekcji w celu zmniejszenia liczby wyników fałszywie dodatnich. Indywidualne, izolowane klony komórek rakowych lub nowo zmodyfikowane klony, które wyrażają interesujące geny, poddano pierwotnemu testowi tworzenia guza lub analizie kooptacji unaczynienia komórek rakowych. Podsumowując, przedstawiamy platformę do szybkich badań przesiewowych, która pozwala na identyfikację celu przeciwprzerzutowego i analizę przyżyciowej dynamicznej i złożonej kaskady zdarzeń.

Wprowadzenie

Przerzuty są główną przyczyną zgonów pacjentów z rakiem^1,2,3. Przerzutowe komórki rakowe wykorzystują odrębne szlaki sygnałowe, w zależności od rodzaju nowotworu, na pięciu etapach kaskady przerzutów: inwazja miejscowa, wynaczynienie, przeżycie w krążeniu, wynaczynienie i ekspansja kolonii w odległych miejscach przerzutów. Obecna wiedza na temat tego procesu przerzutowego sugeruje, że istnieją dwa etapy wąskiego gardła, jeden to kierunkowa inwazja komórki rakowej z guza pierwotnego, a drugi to ustalenie odległej zmiany przerzutowej^4,5,6. Oba etapy wymagają, aby komórki rakowe aktywnie oddziaływały z kolagenem i naczyniami krwionośnymi w miejscach początkowej inwazji lub tworzenia odległych zmian przerzutowych. Dlatego przerzutowe komórki rakowe muszą być w stanie przyczepiać się do komórek, przebudowywać włókna kolagenowe i kierunkowo atakować wzdłuż ścian naczyniowych⁷. Największe znaczenie mają modele przesiewowe, które mogą szybko zidentyfikować cele terapeutyczne leków przeciwprzerzutowych w celu zablokowania komórek rakowych przed wykonaniem tych etapów. Istniejące modele badań przesiewowych in vitro nie naśladują w pełni złożonego środowiska żywych tkanek. Modele myszy są kosztowne i czasochłonne. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na platformy do badań przesiewowych przyżyciowych, które zapewniają złożone środowisko żywych tkanek i szybką identyfikację celów.

W ciągu ostatniej dekady zarodek kurczaka stał się solidnym i opłacalnym modelem przerzutów raka u ludzi^8,9,10,11,12. Tkanka błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jest cienka i przezroczysta, co czyni ją idealną do przyżyciowego obrazowania mikroskopowego zachowań komórek i kolonii w guzie pierwotnym i/lub miejscach przerzutów¹². Pierwotny wzrost guza z wielu linii komórek raka ludzkiego może zostać zainicjowany i przerzutowany w ciągu zaledwie kilku dni po mikrowstrzyknięciu do tkanki CAM. Komórki nowotworowe mogą być podawane do tkanki CAM na kilka sposobów, w tym dożylnie, dożylnie, dożylnie lub jako kolagen na roślinach, ta elastyczność pozwala badaczowi skupić się na określonych etapach progresji raka, na przykład tworzeniu się zmian przerzutowych, inwazji guza pierwotnego lub angiogenezie.

Tutaj opisujemy ilościową platformę przesiewową, która może być wykorzystana do pomiaru zdolności komórek rakowych do tworzenia inwazyjnych zmian przerzutowych. Komórki rakowe, które zostały transdukowane za pomocą biblioteki ekspresji, są wstrzykiwane dożylnie do układu naczyniowego CAM o niskiej gęstości. Kolonie przerzutowe tworzą się przez 4-5 dni, następnie ocenia się zdolność inwazji i interakcję naczyniową powstałych kolonii. Poszczególne kolonie, którym nie udaje się dokonać inwazji, są wycinane, rozmnażane, a ich fenotyp jest potwierdzany w CAM poprzez ponowne wstrzyknięcie i ilościowe określenie zwartości kolonii i kontaktów komórek rakowych z naczyniami krwionośnymi. Konstrukty biblioteki ekspresji odpowiedzialne za fenotyp mutacji pojedynczej kolonii przerzutowej są identyfikowane na podstawie izolowanego genomowego DNA kolonii za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Ta sama platforma może być dalej wykorzystywana do walidacji związku przyczynowego między genem a obserwowanym fenotypem lub do przeprowadzania dogłębnych badań mechanistycznych obserwowanego fenotypu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami i wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Alberty. Wiele instytutów badawczych nie uważa ptasich zarodków za żywe zwierzęta i nie są wymagane żadne protokoły na zwierzętach. Przyjmuje się jednak, że ptasie embriony mogą odczuwać ból i dlatego muszą być traktowane w sposób jak najbardziej humanitarny. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek prac badawczych należy skontaktować się z lokalnym organem ds. badań na zwierzętach, aby upewnić się, że przestrzegane są odpowiednie przepisy.

1. Hodowla jaj bez skorupek

1. Kup zapłodnione jaja kurze od lokalnego dostawcy. W tym eksperymencie wykorzystano rasę kurczaków White Leghorn; Można jednak również używać innych ras.
   UWAGA: Zaleca się pozyskanie o 10% więcej komórek jajowych niż jest to konieczne w przypadku, gdy niektóre zarodki zostaną uszkodzone podczas pękania i nie mogą być wykorzystane w tym protokole.
2. Przenieś wymaganą liczbę jaj do 60% wilgotnego inkubatora na biegunach. Reszta jaj może być przechowywana przez okres do dwóch tygodni w temperaturze 12 °C bez utraty żywotności.
3. Inkubuj jaja w wilgotnym inkubatorze na biegunach przez cztery dni.
   UWAGA: Dzień 1 to moment, w którym jaja są przenoszone do inkubatora na biegunach.
4. Przygotuj naczynia do ważenia i plastikowe pokrywki do hodowli jaj bez skorupek. Odetnij jeden z rogów każdej z naczyń do ważenia, aby umożliwić skuteczny dostęp powietrza do zarodka (Rysunek 1A).
5. Przygotowane naczynia wagowe ułóż w rzędach w okapie przepływowym. (Rysunek 1B).
6. W osobnym naczyniu wagowym przygotuj 70% etanolu do płukania jaj.
7. Zanurz jajko na krótko w 70% etanolu, a następnie użyj elektrycznego narzędzia obrotowego, aby ostrożnie wykonać cztery nacięcia o średnicy 2-3 mm równolegle do największej równoleżnikowej średnicy jajka (Rysunek 1C).
8. Przenieś pokrojone jajko do naczynia wagowego i delikatnie dociśnij jajko do dna naczynia, aż w skorupce jajka utworzy się pęknięcie (Rysunek 1D).
9. Rozsuń połówki skorupki jajka, pozwalając zarodkowi wsunąć się do naczynia do ważenia. Wyrzuć skorupkę jajka i przykryj naczynie do ważenia pokrywką.
10. Przenieś zarodki do wilgotnego, niekołyszącego się inkubatora (Rysunek 1E).
    UWAGA: Szalki wagowe zawierające zarodki umieszcza się w oddzielnych pojemnikach z tworzywa sztucznego (12 zarodków/pojemnik). Zwiększa to żywotność zarodka i pozwala na organizację zarodka specyficzną dla eksperymentu.
11. Inkubuj zarodki jeszcze przez 6 dni (do 10 dnia życia). Codziennie sprawdzaj, czy nie ma martwych lub skażonych zarodków i wyjmij je z inkubatora.
    UWAGA: Zarodki mogą być skażone unoszącymi się w powietrzu zarodnikami pleśni. Zanieczyszczenie pleśnią początkowo objawia się białymi plamkami na powierzchni CAM zarodka. Natychmiast usuń zanieczyszczone zarodki i co tydzień przecieraj inkubator 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Z naszego doświadczenia wynika, że poziomy zanieczyszczenia są bardzo niskie ~1-3%.
12. Użyj tych zarodków do wstrzyknięcia komórek rakowych rano 10 dnia.

2. Przygotowanie komórek rakowych do wstrzyknięcia

UWAGA: Wybór kolonii przerzutowych opiera się na fenotypie ustalonym przez fluorescencyjne komórki rakowe, pochodzącym z biblioteki ekspresji lub wektora oznaczonego białkiem fluorescencyjnym, takim jak zielone lub czerwone białko fluorescencyjne (zobacz cały przebieg ekranu w Rysunek 2A). Nie zaleca się stosowania komórek przejściowo transfekowanych białkami fluorescencyjnymi lub znakowanych przepuszczalnymi dla komórek barwnikami fluorescencyjnymi ze względu na szybkie zanikanie sygnału spowodowane proliferacją komórek rakowych i nierównomiernym barwieniem.

1. Hodowla komórek rakowych do 60-70% zbiegu w momencie wstrzyknięcia. Używanie komórek rakowych na wyższych poziomach konfluencji zmniejszy ich żywotność, co spowoduje niską skuteczność tworzenia kolonii przerzutowych. Upewnij się, że użyte komórki rakowe są wolne od mykoplazmy, ponieważ zanieczyszczenie mykoplazmą może prowadzić do zmniejszenia żywotności zarodków kurzych.
2. Przepłucz komórki dwukrotnie 1x PBS pH 7,4. Usunąć pozostały PBS, następnie dodać 0,5% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut, aż wszystkie komórki zostaną podniesione z powierzchni szalki hodowlanej.
3. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować komórki w temperaturze pokojowej przy 200 x g przez 5 minut.
4. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml PBS i ponownie odwirować komórki, jak w kroku 2.3, w celu usunięcia trypsyny i innych składników pożywki hodowlanej, takich jak antybiotyki.
   UWAGA: Obecność trypsyny lub składników kultur komórkowych, takich jak antybiotyki, w zawiesinie komórek rakowych może powodować zmniejszenie żywotności zarodków kurzych.
5. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml lodowatego PBS.
6. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub innego dostępnego sprzętu do liczenia komórek.
   UWAGA: Ten protokół przesiewowy wymaga, aby każda kolonia przerzutowa była inicjowana przez pojedynczą komórkę. Podczas liczenia komórek upewnij się, że komórki są w pełni trypsynizowane i występują jako zawiesina pojedynczej komórki (nie ma grudek komórek).
7. Do wstrzykiwań dożylnych (IV) koncentratu komórek do 0,5 x 10 6 do 1,0 x 10⁶ komórek/ml. Użyj lodowatego 1x PBS do rozcieńczenia i/lub ponownego zawieszenia koncentratów komórkowych. Należy się spodziewać, że na każde dziesięć zarodków potrzeba około 1 ml zawiesiny komórek.
   UWAGA: Niezbędne stężenie zawiesiny komórkowej w zawiesinie zależy głównie od poziomu doświadczenia eksperymentatora. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz następną sekcję.

3. Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych w celu tworzenia kolonii przerzutowych

UWAGA: Zgodnie z tym protokołem można wstrzyknąć nawet sto zarodków w ciągu jednego dnia. Na ogół izolowanie kolonii przerzutowych zajmuje więcej czasu (krok 5), niż wstrzyknięcie komórek rakowych, dlatego zaleca się przeprowadzenie wstępnego eksperymentu w celu oszacowania czasu potrzebnego do wykonania wszystkich kroków. Stosowanie różnicowych znaczników fluorescencyjnych komórek rakowych pomaga zmniejszyć liczbę zwierząt i czas potrzebny na każdy eksperyment. Na przykład komórki kontrolne mogą być znakowane RFP (czerwone białko fluorescencyjne), podczas gdy zmutowane komórki nowotworowe mogą być alternatywnie znakowane GFP (zielone białko fluorescencyjne). W tym przypadku każdy eksperyment ma wbudowaną kontrolę, która koryguje zmienność między zarodkami.

1. Zmontuj aparat iniekcyjny tak, jak pokazano na Rysunek 2B. Najpierw zamontuj igłę na strzykawce, a następnie przedłuż igłę strzykawki kawałkiem rurki o długości 3-5 cm.
2. Odłam końcówkę igły borokrzemianowej za pomocą cienkich kleszczyków (o szerokości ~20-60 μL).
3. Załadować strzykawkę zawiesiną komórek rakowych (50-200 μl) i włożyć igłę borokrzemianową do rurki (Rysunek 2B).
4. Sprawdzić igłę borokrzemianową pod kątem zatkania komórek i pęcherzyków powietrza. Bardzo ważne jest, aby wstrzykiwać komórki w postaci zawiesiny pojedynczej komórki, aby zapewnić, że każda kolonia przerzutów jest inicjowana przez pojedynczą komórkę.
   UWAGA: Komórki rakowe mają tendencję do agregacji w PBS w ciągu 1-2 godzin po trypsynizacji i dlatego powinny być przygotowane bezpośrednio przed wstrzyknięciem. W razie potrzeby komórki można okresowo ponownie zawiesić za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml używanej do wstrzykiwań (bez igły borokrzemianowej).
5. Jeśli w kapilarze zaobserwuje się zatkanie komórek, usuń kapilarę, ponownie zawieś komórki i zastąp ją nową kapilarą. Użyj tłoka, aby wypchnąć wszelkie bąbelki. Jeśli nie zaobserwuje się zatkania komórek ani pęcherzyków, przejdź do następnego kroku.
6. Zdejmij pokrywę i przenieś zarodek pod stereoskop. Zidentyfikuj odpowiednią żyłę, która ma zostać wstrzyknięta na powierzchnię CAM. Żyły i tętnice tworzą skomplikowaną sieć w tkance CAM (Rysunek 2C). Żyły wyróżniają się jaśniejszym czerwonym kolorem, ponieważ przenoszą do zarodka krew bogatą w tlen.
   UWAGA: Do ogólnej manipulacji zarodkami, wstrzykiwania komórek rakowych i wycinania kolonii przerzutowych należy użyć fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w obiektywy 0,8x i 1,5x oraz okulary 10x do wizualizacji. Mniej zaawansowany mikroskop może być również z powodzeniem stosowany do tych zabiegów, w zależności od poziomu doświadczenia użytkowników. Czytelnicy mogą skontaktować się z autorami w celu uzyskania bardziej szczegółowych rekomendacji.
7. Znajdź idealną żyłę do wstrzyknięcia komórek, która zwykle jest tylko nieznacznie szersza (10-20%) niż średnica końcówki igły borokrzemianowej i znajduje się w połowie odległości między zarodkiem a ścianką szalki wagowej. Na ogół łatwiej jest wstrzyknąć w miejsce bezpośrednio przylegające do rozwidlenia żyły.
   UWAGA: Wstrzyknięcie do większej żyły może wydawać się łatwiejsze, ale prowadzi do nadmiernego krwawienia i zmniejszenia przeżywalności zarodka.
8. Dociśnij końcówkę igły do ściany naczynia krwionośnego i delikatnie uciskaj w tym samym kierunku, co przepływ krwi. W razie potrzeby użyj bawełnianego wacika (trzymanego w drugiej ręce), aby pomóc zakotwiczyć lub ustabilizować wstrzykiwane naczynie.
9. Delikatnie wcisnąć tłok strzykawki. Udane wstrzyknięcie można sobie wyobrazić, obserwując "oczyszczanie" naczynia krwionośnego, gdy zawiesina komórek rakowych dostaje się do krwiobiegu.
10. Kontynuować wciskanie tłoka strzykawki przez 2-10 s, aż do wstrzyknięcia żądanej objętości zawiesiny do krwiobiegu żyły. W sumie wstrzyknięcie pojedynczego zarodka może trwać od 1 do 10 minut, w zależności od poziomu doświadczenia użytkownika. Jeśli w miejscu wstrzyknięcia pojawi się nadmierne krwawienie lub nagromadzenie klarownego płynu, należy wyrzucić zarodek.
    UWAGA: Łatwo jest "przesadzić" z zarodkiem. Ogólną kwestią, o której należy pamiętać, jest to, że kolonie przerzutowe nie powinny stykać się ze sobą po 4-5 dniach wzrostu. Idealnie ~5-10% końcowych naczyń włosowatych żył CAM powinno mieć komórki unieruchomione w nich po udanym wstrzyknięciu (Rysunek 2D, E). Jak wspomniano w kroku 2, można zastosować zakres stężeń komórek (0,5 x 10⁶ - 1,0 x 10⁶ komórek/ml). Niższe stężenia będą wymagały dłuższego czasu wstrzyknięcia, ale zmniejszą zatykanie się igły. Wyższe stężenia będą wymagały krótszego czasu wstrzykiwania, ale zwiększą zatykanie się igły. Zaleca się wypróbowanie kilku stężeń, aby znaleźć ten, który jest najbardziej komfortowy dla operatora. Ogólnie rzecz biorąc, preferowane jest wyższe stężenie (1,0 x 10⁶ komórek/ml) w celu skrócenia czasu wstrzyknięcia.
11. Wyjąć igłę z kamery i delikatnie przetrzeć miejsce wstrzyknięcia bawełnianym wacikiem, aby usunąć krew lub nadmiar komórek rakowych.
12. Przykryć zarodek w naczyniu wagowym pokrywką i włożyć wstrzyknięty zarodek kurczaka z powrotem do inkubatora.
13. Powtarzaj procedurę z następnym zarodkiem, aż wszystkie zarodki zostaną wstrzyknięte.

4. Utrzymanie zarodka podczas wzrostu kolonii przerzutowej

1. Sprawdź wzrokowo zarodki. Jeśli są martwe i/lub skażone bakteriami lub pleśnią, należy je usunąć z inkubatora, a następnie przelać do autoklawu i wyrzucić zgodnie z procedurami utylizacji laboratoryjnej.
   UWAGA: Zaleca się, aby zarodki były sprawdzane co drugi dzień (1, 3, 5 dzień po wstrzyknięciu komórek rakowych) pod kątem wzrostu kolonii z przerzutami. Należy unikać niepotrzebnego przesuwania wstrzykniętych zarodków, ponieważ może to spowodować uszkodzenie zarodka i/lub śmierć.
2. Jeśli komórki wykazują przerost (kolonie przerzutowe nakładają się na siebie) lub nierównomierne rozmieszczenie w tkance CAM (kolonie przerzutowe zlokalizowane w małym podobszarze powierzchni CAM), należy usunąć ten zarodek z doświadczenia. Poddaj eutanazji odrzucone zarodki poprzez zamrożenie w temperaturze -20 °C (lub inną zatwierdzoną metodę) natychmiast po usunięciu z eksperymentu. Liczba żywotnych komórek przerzutowych w tkance CAM początkowo zmniejszy się (dni 1-2), a następnie wzrośnie (dni 2-5).
   UWAGA: Niektóre zarodki mogą "odrzucić" komórki rakowe, tj. wszystkie komórki rakowe znikną z tkanki CAM. Zarodki te powinny zostać usunięte z doświadczenia. Zwykle kolonie komórek rakowych można zobaczyć przez przezroczystą pokrywę pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym bez otwierania szalki wagowej.
3. Upewnij się, że kolonie przerzutów mają jednolity kształt (pierwsze 1-3 dni po wstrzyknięciu). Identyfikacja inwazyjnych lub nieinwazyjnych kolonii przerzutów w 4-5 dniach po wstrzyknięciu (więcej informacji, patrz punkt 5).

5. Izolacja kolonii przerzutowych

1. W 5 dniu po wstrzyknięciu należy usunąć zarodki z inkubatora i sprawdzić CAM zarodków pod kątem rozmieszczenia kolonii z przerzutami. Zidentyfikuj zarodki o równomiernym rozmieszczeniu kolonii, w których obecne są zwarte (lub nadmiernie inwazyjne) kolonie.
   UWAGA: Proces hodowli zarodków kurczaków nie jest sterylny, dlatego wszystkie etapy badań przesiewowych muszą być wykonywane w bardzo czystych warunkach, aby uniknąć przyszłego zanieczyszczenia kultur tkankowych. Zanieczyszczenie jest dość rzadkie i można go łatwo uniknąć, nosząc rękawiczki i maskę oraz używając tylko sterylnych narzędzi podczas procedur wstrzykiwania komórek i izolacji kolonii. Zaleca się badanie zarodków jeden po drugim, aby zmniejszyć ich narażenie na temperaturę otoczenia w laboratorium i zapobiec zakażeniu.
2. Zlokalizuj interesującą Cię kolonię przerzutową. Zwartą kolonię można opisać jako taką, w której większość komórek rakowych znajduje się na ograniczonym obszarze w tkance CAM (komórki wydają się "zlepione razem"). Kolonię inwazyjną można opisać jako kolonię, w której komórki rakowe "rozpraszają się" w tkance CAM (Rysunek 3A,B).
   UWAGA: "Zwartość" kolonii przerzutowej można wytłumaczyć albo hamowaniem inwazji komórek rakowych, hamowaniem proliferacji komórek rakowych, albo jednym i drugim. Należy zwrócić uwagę na wszystkie scenariusze, a kolonie kontaktowe powinny być odizolowane (Rysunek 3A,B). Prosty fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy może być używany do rozróżniania zwartych i inwazyjnych fenotypów kolonii przerzutowych.
3. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie pociągnij tkankę CAM, która zawiera interesującą nas kolonię przerzutów, w górę za pomocą cienkich kleszczyków (Rysunek 3C).
4. Odetnij tkankę CAM, która zawiera kolonię przerzutów, za pomocą nożyczek chirurgicznych.
5. Przenieść tkankę CAM, która zawiera kolonię przerzutów, do pustej, sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml (na lodzie) i zamknąć pokrywę probówki.
   UWAGA: Izolowane kolonie mogą być trzymane na lodzie do 3 godzin bez utraty żywotności.
6. Powtarzaj procedurę wycinania, aż wszystkie interesujące kolonie zostaną zebrane do oddzielnych probówek. Aby uniknąć cierpienia zwierząt, nie wycinaj więcej niż 2-3 kolonie z jednego zarodka. Eutanazja zarodków poprzez zamrożenie w temperaturze -20 °C (lub inna zatwierdzona metoda) natychmiast po wycięciu kolonii.
7. Delikatnie zmielić tkankę CAM w probówce do mikrowirówki za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 18. Użyj osobnej igły dla każdej kolonii.
8. Dodać 100 μl 1x roztworu kolagenazy i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
9. Odwiruj komórki i tkankę CAM w odległości 300 x g przez 5 minut w temperaturze otoczenia.
10. Odessać roztwór kolagenazy i ponownie zawiesić komórki w kompletnych pożywkach używanych dla interesującej linii komórkowej.
    UWAGA: Zwykle tkanka CAM nie ulega całkowitej dysocjacji po leczeniu kolagenazą, a komórki rakowe najpierw namnażają się w kawałkach tkanki CAM, a dopiero później migrują na naczynie do hodowli tkankowej.
11. Ponownie wirować komórki i tkankę CAM przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze otoczenia.
12. Ponownie zawiesić komórki i fragmenty tkanek CAM w 1 ml kompletnej pożywki wraz ze współczynnikiem selekcyjnym (jeśli występuje), a następnie przenieść do pojedynczego 12-dołkowego naczynia do hodowli tkankowej.
    UWAGA: Fibroblasty CAM kurczaka mogą utrzymywać się w hodowli tkankowej przez wiele pasaży hamujących ekspansję klonalną. Zdolność do rozszerzania kolonii przerzutowych w obecności czynnika selekcyjnego (tj. jeśli wektor, który został użyty do wytworzenia komórek rakowych fluorescencyjnych, koduje również gen oporności ssaków na antybiotyki) może znacznie przyspieszyć ekspansję klonalną. Przed badaniem przesiewowym należy przeprowadzić eksperyment z krzywą zabijania, aby upewnić się, że stosowane jest odpowiednie stężenie antybiotyku.
13. Przez następne 1-3 tygodnie codziennie monitoruj komórki rakowe pod kątem wzrostu i zanieczyszczenia.
14. Gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, przenieś komórki do naczynia hodowlanego o większej objętości.
    UWAGA: Zaleca się namnażanie komórek do momentu, aż będzie można zamrozić co najmniej dwie fiolki kriogeniczne z każdego klonu. Utrzymanie dużych ilości hodowli tkankowej może być pracochłonne i niepotrzebne.
15. Przejdź do sekwencjonowania lub następnej rundy selekcji, gdy tylko zostanie osiągnięta wystarczająca liczba komórek rakowych. Ogólnie rzecz biorąc, 1 x 10⁶ komórek rakowych jest wystarczająca dla nowoczesnych technik sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.
16. Przejdź do ponownego wstrzyknięcia klonu oraz obrazowania i kwantyfikacji zwartości kolonii lub kontaktu komórki rakowej z naczyniem krwionośnym (Rysunek 2A). Alternatywnie przejdź do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości lub powtórz wybór kolonii.
    UWAGA: Aby zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich, zalecane są co najmniej dwie rundy selekcji. Z powodzeniem zastosowano dwa podejścia. 1) Rozwiń każdy klon i wstrzyknij ponownie indywidualnie, aby potwierdzić fenotyp kolonii. 2) Wymieszaj wszystkie rozszerzone klony w stosunku 1:1 każdy, wstrzyknij ponownie jako mieszaninę i powtórz cykl selekcji.

6. Wstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanych lektyn do układu krwionośnego CAM.

1. Zidentyfikuj żyłę, która ma zostać wstrzyknięta. Łatwiej jest użyć tego samego miejsca wstrzyknięcia lektyny, które było używane do wstrzykiwania komórek nowotworowych.
2. Rozcieńczyć fluorescencyjny roztwór podstawowy lektyny (5 mg / ml) 50-100x 1x PBS i załadować go do tego samego aparatu do wstrzykiwań, który jest używany do wstrzykiwania komórek rakowych.
   UWAGA: Ilość lektyny, którą należy wstrzyknąć (zwykle 20-100 μl) w celu wizualizacji naczyń krwionośnych, zależy od czułości mikroskopu i powinna być określona eksperymentalnie przed badaniem przesiewowym.
3. Lektynę należy wstrzykiwać tą samą techniką, co w przypadku wstrzykiwania komórek nowotworowych (patrz kroki 3.6.-3.10.).
4. Po wstrzyknięciu lektyny należy umieścić zarodek w inkubatorze, aby doszedł do siebie przez 5 minut. Należy wstrzykiwać tylko jeden zarodek na raz i bezpośrednio przed obrazowaniem zarodka.
   NUTA. Zarodki, które mają 12 dni lub więcej, na ogół dobrze regenerują się po wstrzyknięciach lektyny i mogą być ponownie wstrzyknięte z lektyną następnego dnia w celu sekwencyjnego obrazowania. Młodsze zarodki są bardziej wrażliwe i mogą wykazywać krzepliwość krwi.

7. Wizualizacja kontaktów komórek nowotworowych z naczyniami krwionośnymi

1. Ustaw obudowę mikroskopu o regulowanej temperaturze na 37 °C na około 6 godzin przed obrazowaniem. Ustabilizuje to temperaturę mikroskopu i pomoże zminimalizować dryft XYZ podczas obrazowania.
   NUTA. W tym eksperymencie użyto specjalistycznej komory do obrazowania zarodków kurzych^{9,10,11,12,13}. Prosty fluorescencyjny mikroskop preparacyjny może być używany do wszystkich etapów, począwszy od wstrzyknięcia komórki rakowej, po selekcję klonu i ponowne wstrzyknięcie klonu, a także ocenę zwartości kolonii. Mikroskop konfokalny, który jest wyposażony w komorę obrazowania, jest niezbędny do obrazowania i ilościowego oznaczania kontaktów komórek rakowych z naczyniami krwionośnymi. Nie jest konieczne ogrzewanie przez okres do 1 godziny i na ogół zarodki przeżywają co najmniej dwie sekwencyjne sesje obrazowania bez wpływu na ich żywotność.
2. Upewnij się, że zainstalowano niezbędną soczewkę obiektywu (zalecana jest soczewka obiektywowa zanurzona w wodzie 20x lub 25x).
3. Nałóż cienką warstwę smaru próżniowego na spód pokrywy komory obrazowania, aby uzyskać bezpieczne uszczelnienie ze szkiełkiem nakrywkowym.
4. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe w pokrywce i zetrzyj nadmiar tłuszczu próżniowego.
5. Wyjąć zarodek z wstrzykniętą lektyną z inkubatora i w razie potrzeby odciąć brzegi naczynia wagowego.
6. Umieścić zarodek w komorze obrazowania z szkiełkiem nakrywkowym opuszczonym bezpośrednio na obszar CAM, w którym znajdują się interesujące nas kolonie przerzutowe. Powoli opuść pokrywkę na zarodek, aż szkiełko nakrywkowe zetknie się z CAM. Dokręć, aby zamocować pokrywę na miejscu, upewnij się, że pokrywa jest wypoziomowana i że szkiełko nakrywkowe nie wywiera żadnego nacisku w dół na CAM.
7. Pozyskaj obrazy wielu, losowych kolonii z grup kontrolnych i eksperymentalnych (10-20) z kilku (5-10) zarodków.
   NUTA. Zaleca się pozyskiwanie losowych stosów 3D (1-5um Z-steps; 50-100um zakres; 25x) z każdego pola.
8. Użyj opcji zszywania w polu w oprogramowaniu do akwizycji mikroskopu, jeśli jest dostępna. Ponieważ obrazy używane do oznaczania ilościowego nie będą miały jakości publikacji, należy używać szybkich trybów akwizycji, takich jak skanowanie rezonansowe, jeśli są dostępne. Użyj obiektywu 25x i szwów 3 x 3 z krokiem Z 5-10 μm, całkowitym zakresem 100 μm. Wyobraź sobie co najmniej 100 komórek (~20 kolonii) na warunek.

8. Kwantyfikacja kontaktów naczyń krwionośnych komórek rakowych

1. Otwórz plik 3D jako stos Z za pomocą niezbędnego oprogramowania.
   NUTA. Do pozyskiwania i analizowania obrazów o wysokiej rozdzielczości należy używać specjalistycznego oprogramowania w celu ilościowego określenia kontaktu komórek rakowych z naczyniami krwionośnymi. Dostępnych jest kilka pakietów oprogramowania, które są zdolne do analizy obrazu 3D. Więcej informacji można znaleźć w Tabeli materiałów.
2. Jeśli podczas akwizycji obrazu wystąpił znaczny ruch XY, wyrównaj stos Z za pomocą wtyczki ImageJ StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
3. Zlokalizuj interesujące Cię komórki.
4. Przewiń obraz XYZ w kierunku Z i zidentyfikuj przekrój optyczny, który zawiera maksymalną długość kontaktu naczynia krwionośnego komórki rakowej dla komórki będącej przedmiotem zainteresowania (Rysunek 2E).
5. Zmierz kontakt komórki rakowej z naczyniem krwionośnym za pomocą "funkcji ręcznego pomiaru długości".
6. Wprowadź pomiary do pakietu oprogramowania do danych, który jest używany do analizy statystycznej.
   UWAGA: Zdolność komórek rakowych do przyczepiania się do naczyń krwionośnych może być mierzona jako długość kontaktów komórka rakowa z naczyniem krwionośnym lub procent komórki stykającej się z naczyniami krwionośnymi dla określonego klonu komórek rakowych (lub obu).
7. Przejdź do następnej interesującej Cię komórki.
8. Analizuj dane pod kątem istotności statystycznej, porównując zmutowane klony (klony) i zestawy danych kontrolnych.

9. Kwantyfikacja zwartości kolonii

1. Ponownie wstrzyknij komórki z rozszerzonego klonu, stosując tę samą technikę, co w kroku 2.
2. Pięć dni po wstrzyknięciu uzyskaj obrazy 10-50 losowych kolonii przerzutów dla każdego klonu.
   UWAGA: Do ilościowego określenia zwartości kolonii przerzutowych nie są potrzebne obrazy wysokiej jakości. Wystarczą monochromatyczne obrazy z mikroskopu stereoskopowego (10-krotne powiększenie). Należy zwrócić uwagę na jasność obrazu (większość komórek w kolonii powinna być widoczna) i kontrast (różnica między jedną lub dwiema komórkami).
3. Cyfrowo wyizoluj obraz kolonii (patrz Rysunek 2C,D) i przejdź do kwantyfikacji zwartości kolonii za pomocą samodzielnego modułu kwantyfikacji zwartości kolonii lub ślepej punktacji¹³.
4. Udaj się do następnej interesującej Cię kolonii.
5. Przeanalizuj dane pod kątem istotności statystycznej, porównując zestawy danych zmutowanych klonów (klonów) i kontrolnych (tj. zaszyfrowanych shRNA).

Wyniki

Wstrzyknięcie komórek rakowych uważa się za udane, jeśli większość komórek umieszczonych w naczyniach włosowatych jest pojedyncza i znajduje się w znacznej odległości od siebie (~0,05-0,1 cm), więc kolonie nie będą się nakładać po 5-6 dniach okresu inkubacji (Rysunek 3A). Wstrzyknięcie nie powiodło się, jeśli nagromadzenie komórek rakowych można zaobserwować w większości naczyń włosowatych, zarodki wykazujące to należy wyrzucić (Ryc. 2E). Znaczna li...

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokół szybkich badań przesiewowych opartych na mikroskopii fluorescencyjnej, który można wykorzystać do ważnych zastosowań, takich jak badania przesiewowe genetyczne lub kandydatów na leki. Komórki rakowe, które zostały transdukowane za pomocą biblioteki genetycznej będącej przedmiotem zainteresowania lub transfekowane indywidualnymi konstruktami ekspresyjnymi, mogą być szybko badane i określane ilościowo pod kątem fenotypu zainteresowania przy użyciu tego modelu CAM piskląt. Ponieważ protokoły...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Jednorazowe strzykawki 1 ml	BD	BD309659
stożkowe probówki wirówkowe 15 ml.	Corning	CLS430791-500EA
18 miernik x 1 1/2  Precyzyjna igła BD	BD	BD305196	używamy 1,2 mm x 40 mm, w razie potrzeby można użyć krótszych igieł
2,5% roztworu trypsyny			jest wiele źródeł
piersi myszy 4T1	ATCC	CRL-2539
B16F10 mysia linia komórkowa czerniaka	ATCC	CRL-6475
Wirówka stołowa.		jest wiele źródeł	wirówka kompatybilna z TC, która może być używana do wirowania komórek, jest odpowiednia
Okrągłe szkiełka nakrywkowe, 22 mm.	Fisher Scientific	12-545-101
Kolagenaza	Sigma	C0130-100MG
		konfokalny	bawełnianych Nikon A1r
,	dostępnych		należy je wysterylizować przed użyciem
Pożywki hodowlane odpowiednie dla użytych linii komórkowych	dostępnych jest		Hodujemy linie komórkowe HT1080, HEp3 i b16 w DMEM, 10% nośniki FBS
Inkubator jaj		jest wiele źródeł	Dokładny model, który jest niezbędny, zależy od skali ekranu. Dostępne źródła to MGF Company Inc., Savannah, GA, lub  Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA
probówki eppendor, 1,5 ml	Sigma	T4816-250EA
Zapłodnione białe jaja Leghorn	każdy lokalny dostawca
drobne kleszcze	dostępne wiele		musi być wysterylizowany przed użyciem
Hemocytometr	Millipore-Sigma	MDH-4N1-50PK
HT1080 ludzka linia komórkowa włókniakomięsaka	ATCC	CCL-121
		do analizy obrazu	Używamy Nikon Elements
Lectin Lens Culinary Aglutynina (LCA) sprzężona z fluoresceiną lub rodaminą	Vector Laboratories	RL-1042, FL-1041	Rozcieńczony materiał (5 mg / ml) 50-100x w zależności od czułości mikroskopu. Musi mieć inny kolor niż kolor linii komórkowej używanej do badań przesiewowych
MDA-MB-468 ludzkiego raka piersi	ATCC	HTB-132
PBS (1x)			jest wiele źródeł
Plastikowe naczynia do ważenia	Simport	CA11006-614	wymiary to 78x78x25mm; dostępnych jest wiele innych źródeł
małe nożyczki chirurgiczne		jest wiele źródeł	które należy wysterylizować przed użyciem
Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego sodu, średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm, długość 10 cm	Sutter Instrument	BF100-58-10
Kwadratowe szalki Petriego (używane jako pokrywki do szalek ważących).	Firma VWR	CA25378-115	wymiary to 100x100x15mm; dostępnych jest wiele innych źródeł
Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny			Zeiss Lumar v12
Tygon R-3603	Cole-Parmer	AAC00001	średnicy wewnętrznej, 3/32 cala średnicy zewnętrznej, grubości ścianki 1/32 cala
U-118 MG glejak ludzki	ATCC	HTB-15
U-87 MG glejak wielopostaciowy	ATCC	HTB-14
Pionowy ściągacz do pipet		jest wiele źródeł	, używamy David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Wzór 720