Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

3.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62086

⸱

28 lutego 2021

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Streszczenie

Somitogeneza jest cechą charakterystyczną rozwoju embrionalnego kręgowców. Naukowcy od lat badają ten proces w różnych organizmach, wykorzystując szeroki zakres technik obejmujących podejścia ex vivo i in vitro. Jednak większość badań nadal opiera się na analizie dwuwymiarowych (2D) danych obrazowania, co ogranicza właściwą ocenę procesu rozwojowego, takiego jak wydłużenie osiowe i somitogeneza obejmujące wysoce dynamiczne interakcje w złożonej przestrzeni 3D. W tym miejscu opisujemy techniki, które umożliwiają pozyskiwanie obrazów na żywo na myszach, przetwarzanie zestawów danych, wizualizację i analizę w 3D i 4D w celu badania komórek (np. progenitorów neuromezodermalnych) zaangażowanych w te procesy rozwojowe. Udostępniamy również protokół krok po kroku dla optycznej tomografii projekcyjnej i mikroskopii immunofluorescencyjnej w całości na zarodkach myszy (od przygotowania próbki do akwizycji obrazu) oraz pokazujemy opracowany przez nas potok przetwarzania i wizualizacji danych obrazu 3D. Rozszerzamy zastosowanie niektórych z tych technik i podkreślamy specyficzne cechy różnych dostępnych programów (np. Fiji/ImageJ, Drishti, Amira i Imaris), które można wykorzystać do poprawy naszej obecnej wiedzy na temat rozszerzania osiowego i tworzenia somitów (np. rekonstrukcje 3D). Podsumowując, opisane tutaj techniki podkreślają znaczenie wizualizacji i analizy danych 3D w biologii rozwoju i mogą pomóc innym badaczom w lepszym wykorzystaniu danych obrazowych 3D i 4D w kontekście wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców. W ramach prac wykorzystano również nowatorskie narzędzia ułatwiające nauczanie o rozwoju embrionalnym kręgowców.

Wprowadzenie

Tworzenie osi ciała kręgowców jest bardzo złożonym i dynamicznym procesem zachodzącym podczas rozwoju embrionalnego. Pod koniec gastrulacji [u myszy, około dnia embrionalnego (E) 8.0], grupa komórek progenitorowych epiblastów, znana jako progenitorzy neuromezodermalni (NMP), staje się kluczowym czynnikiem napędzającym wydłużenie osiowe w sekwencji od głowy do ogona, generując cewę nerwową i przyosiowe tkanki mezodermalne podczas tworzenia szyi, tułowia i ogona1,2,3,4. Co ciekawe, pozycja, jaką te NMP zajmują w epiblastach ogonowych, wydaje się odgrywać kluczową rolę w decyzji o różnicowaniu się na mezodermę lub neuroektodermę5. Chociaż obecnie brakuje nam precyzyjnego molekularnego odcisku palca dla NMP, ogólnie uważa się, że komórki te wykazują współekspresję T (Brachyury) i Sox25,6. Dokładne mechanizmy regulujące decyzje o losie NMP (tj. czy obierają one szlaki neuronalne, czy mezodermalne) dopiero zaczynają być precyzyjnie określone. Ekspresja Tbx6 w regionie prymitywnej smugi jest wczesnym markerem decyzji o losie NMP, ponieważ gen ten jest zaangażowany w indukcję i specyfikację mezodermy6,7. Co ciekawe, wczesne komórki mezodermy wydają się wyrażać wysokie poziomy Epha18, a sygnalizacja Wnt/β-katenina, a także Msgn1 również okazały się odgrywać ważną rolę w różnicowaniu mezodermy przyosiowej i tworzeniu somitów9,10. Pełna analiza przestrzenno-czasowa NMP na poziomie pojedynczej komórki z pewnością będzie miała zasadnicze znaczenie dla pełnego zrozumienia mechanizmów molekularnych kontrolujących specyfikację mezodermy.

Powstawanie somitów (prekursorów kręgów) jest kluczową cechą kręgowców. Podczas wydłużania osiowego mezoderma przyosiowa ulega segmentacji w szeregu dwustronnych powtarzających się jednostek zwanych somitami. Liczba somitów i czas potrzebny do powstania nowych segmentów różnią się w zależności od gatunku11,12. Somitogeneza obejmuje okresowe oscylacje sygnalizacyjne (znane jako "zegar segmentacyjny"), które można zaobserwować poprzez cykliczną ekspresję kilku genów szlaków sygnałowych Notch, Wnt i Fgf w mezodermie presomomitycznej (np. Lfng)11,12. Obecny model somitogenezy postuluje również istnienie "czoła fali dojrzewania", serii złożonych gradientów sygnałowych obejmujących sygnalizację Fgf, Wnt i kwasu retinowego, które określają położenie tylnej granicy każdego nowego somitu. Skoordynowana interakcja między "zegarem segmentacji" a "czołem fali dojrzewania" ma zatem fundamentalne znaczenie dla generowania tych modułów prekursorowych kręgów, ponieważ zaburzenia w tych kluczowych procesach morfogenetycznych mogą skutkować śmiertelnością zarodka lub powstawaniem wrodzonych wad rozwojowych (np. skoliozy)13,14,15.

Pomimo znacznych postępów w technikach obrazowania, metodach analizy bioobrazów i oprogramowaniu, większość badań nad wydłużeniem osiowym i somitogenezą nadal opiera się na jednodniowych/izolowanych dwuwymiarowych danych obrazowych (np. przekrojach), co nie pozwala na pełną wielowymiarową wizualizację tkanek i komplikuje wyraźne rozróżnienie między patologicznymi wadami rozwojowymi (np. z powodu mutacji) a normalną zmiennością morfologiczną występującą podczas rozwoju embrionalnego16. Obrazowanie w 3D już odkryło nowe ruchy morfogenetyczne, wcześniej niezidentyfikowane standardowymi metodami 2D17,18,19,20, podkreślając moc obrazowania in toto w zrozumieniu mechanizmów somitogenezy kręgowców i wydłużenia osiowego.

Mikroskopia 3D i 4D embrionów myszy, szczególnie obrazowanie na żywo, są technicznie trudne i wymagają krytycznych kroków podczas przygotowywania próbek, pozyskiwania obrazu i wstępnego przetwarzania danych, aby umożliwić dokładną i znaczącą analizę czasoprzestrzenną. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół obrazowania na żywo i barwienia immunofluorescencyjnego zarodków myszy w całości, który można wykorzystać do badania zarówno NMP, jak i komórek mezodermalnych podczas wydłużania osiowego i segmentacji. Ponadto opisujemy również protokół optycznej tomografii projekcyjnej (OPT) starszych zarodków i płodów, który umożliwia wizualizację 3D in toto i ilościową ocenę patologicznych nieprawidłowości, które mogą wynikać z problemów podczas somitogenezy (np. zrost kostny i skolioza)13,21,22. Na koniec ilustrujemy moc rekonstrukcji obrazowania 3D w badaniu i nauczaniu segmentacji kręgowców i wydłużenia osiowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzano zgodnie z portugalską (Portaria 1005/92) i europejską (Dyrektywa 2010/63/UE) ustawą dotyczącą zakwaterowania, hodowli i dobrostanu zwierząt. Projekt został przejrzany i zatwierdzony przez Komitet Etyczny 'Instituto Gulbenkian de Ciência' oraz portugalską Narodową Jednostkę, 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (numer licencji: 014308).

1. Przygotowanie próbek do obrazowania 3D i 4D

UWAGA: Poniżej opisano szczegółowo, jak przeprowadzić sekcje i przygotować zarodki myszy od E8.25 do E10.5 do obrazowania in vivo (1.1), od E7.5 do E11.5 do mikroskopi mikroskopii immunofluorescencyjnej w całym zarodku (1.2) i płodów do tomografii projekcyjnej optycznej (1.3).

  1. Przygotowanie próbek do obrazowania in vivo
    1. Sekcja i przygotowanie zarodka myszy do obrazowania in vivo (np. reporter LuVeLu 23).
      1. Przeprowadzić sekcję zarodka myszy w okresie od E8.25 do E10.5 w podgrzanym do 37 °C medium M2. Delikatownie usunąć woreczek żółtkowy za pomocą czystych kleszczy i przepłukać zarodek świeżym medium M2, aby usunąć krew i zanieczyszczenia powstałe podczas sekcji.
        UWAGA: Ważne jest, aby w żaden sposób uszkodzić zarodka, w przeciwnym razie nie będzie się on prawidłowo rozwijać podczas procedury obrazowania in vivo.
      2. Podczas procedury obrazowania in vivo inkubować zarodka w ogrzewanej komorze (37 °C), w środowisku 65% O2 i 5% CO2 (N2 zrównoważony), w medium DMEM z niskim poziomem glukozy uzupełnionym o 10% HyClone zdefiniowane surowicy wołowej, 2 mM L-glutaminy i 1% penicyliny-streptomycyny.
        UWAGA: Takie warunki hodowli pozwalają na rozwój zarodka przez około 10 godzin. Inne protokoły9,10, korzystające z różnych warunków hodowli, mogą pozwolić na jeszcze dłuższy okres.
  2. Przygotowanie próbek do mikroskopi immunofluorescencyjnej
    1. Sekcja i utrwalanie zarodka myszy
      1. Przeprowadzić sekcję zarodka myszy od E7.5 do E11.5 w zimnym (4 °C) buforowanym chlorkiem sodu (PBS) lub w medium M2. Po usunięciu wszystkich błon poza zarodkowymi (np. błony Reicharta lub woreczek żółtkowy) przepłukać zarodek w świeżym PBS, aby usunąć krew i zanieczyszczenia powstałe podczas sekcji.
      2. Utrwalić zarodka w 4 °C w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS na okres określony w Tabeli 1.
        UWAGA - PFA należy obsługiwać w komorze wyciągowej.
        3. Etap rozwojowyZalecana długość utrwalania (PFA 4%)
        E7.51h30
        E8.52h
        E9.53h
        E10.54h
        E11.54h
        Tabela 1 - Czasy utrwalania zarodków na różnych etapach rozwoju
      3. Po utrwaleniu, przepłukać zarodka co najmniej dwa razy (5-10 min każdy) w PBS, aby całkowicie usunąć PFA. W tym momencie zarodki można bezpośrednio przenieść do protokołu barwienia immunofluorescencyjnego (Krok 1.2.2) lub wysuszyć i przechować na przyszłość (Krok 1.2.1.4).
      4. W razie potrzeby przechowywać zarodka w -20 °C w 100% metanolu na dłuższy czas.
        1. Aby poprawić zachowanie tkanki, delikatownie odwadniać zarodek z 10% zwiększeniem stężenia metanolu (rozcieńczonego w PBS), każdy krok po 10 min w temperaturze pokojowej na shakerze, aż do osiągnięcia 100% metanolu. Wymienić 100% metanol raz za pomocą świeżego alikotu.
        2. Odbić zamrożone zarodka poprzez odwodnienie w odwrotnej serii metanolu/PBS, każdy krok po 10 min w temperaturze pokojowej na shakerze i z końcowymi przepłukiwaniami w PBS (dwa razy, 5-10 min każdy) przed wejściem do protokołu immunobarwienia.
          UWAGA - Metanol należy obsługiwać w komorze wyciągowej.
    2. Immunofluorescencyjne barwienie całozarodkowe
      UWAGA: Poniższy protokół immunofluorescencyjnego barwienia został przystosowany z procedury opisanej w Osorno i wsp.24. Wszystkie przepłukiwania należy przeprowadzić na shakerze. Po etapie blokowania, inkubacje wykonuje się w 4 °C, aby zapewnić integralność/ochronę przeciwciał.
      1. Przepłukać zarodka trzy razy (30 min każdy) w PBS zawierającym 0,1% Triton X-100 (0,1% PBST), a następ

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki przedstawione w niniejszej pracy, zarówno dla obrazowania żywych komórek, jak i immunofluorescencji, uzyskano przy użyciu systemu dwufotonowego z obiektywem wodnym 20 × 1.0 NA, laserem wzbudzającym dostrojonym do 960 nm oraz fotodetektorami GaAsP (zgodnie z opisem w Dias et al. (2020)43). Tomografię projekcyjną wykonano przy użyciu skanera OPenT zbudowanego na zamówienie (zgodnie z opisem w Gualda et al. (2013)28.

O...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wydłużenie osiowe i segmentacja to dwa z najbardziej złożonych i dynamicznych procesów zachodzących podczas rozwoju embrionalnego kręgowców. Obrazowanie 3D i 4D ze śledzeniem pojedynczych komórek jest od pewnego czasu stosowane do badania tych procesów zarówno w zarodkach danio pręgowanego, jak i kurczaków, dla których dostępność i warunki hodowli ułatwiają złożone obrazowanie 19,44,45,46,47,48,49

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Olivierowi Pourquié i Alexandrowi Aulehli za szczep reporterowy LuVeLu, laboratorium SunJin za próbkę testową RapiClear, Hugo Pereirze za pomoc przy użyciu BigStitcher, Nuno Granjeiro za pomoc w ustawieniu aparatury do obrazowania na żywo, ośrodkowi dla zwierząt IGC oraz byłym i obecnym członkom laboratorium Mallo za przydatne komentarze i wsparcie podczas tej pracy.

Dziękujemy za wsparcie techniczne Zaawansowanego Ośrodka Obrazowania IGC, które jest wspierane przez portugalskie fundusze ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 i ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, współfinansowane przez Regionalny Program Operacyjny Lizbona (Lizbona 2020), na mocy Umowy Partnerstwa Portugalia 2020, za pośrednictwem Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (FEDER) oraz Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugalia). Prace opisane w tym manuskrypcie były wspierane przez granty LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugalia) i SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugalia) dla M.M., infrastrukturę badawczą Congento, projekt LISBOA-01-0145-FEDER-022170 oraz stypendium doktoranckie PD/BD/128426/2017 dla A.D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agaroza niska temperatura żelowaniaSigmaA9414Służy do montowania zarodków (np. dla OPT)
Oprogramowanie Amiraprogramowe Thermofisher-Commerial
Anti-Brachyury (kozie poliklonalne)Systemy R i DAF2085 RRID:AB_2200235Do immunofluorescencji
Anti-Sox2 (monoklonalny królik)Abcamab92494 RRID:AB_10585428Dla immunofluorescencja
Anty-Tbx6 (poliklonalny koza)Systemy R i DAF4744 RRID:AB_2200834Do immunofluorescencji
Anty-Laminin111 (poliklonalny królik)SigmaL9393 RRID:AB_477163Do immunofluorescencji
Anty-koza 488 (poliklonalny osioł)Sondy molekularneA11055 RRID:AB_2534102Do immunofluorescencji
Anty-królik 568 (poliklonalny osioł)ThermoFisher   ScientificA10042 RRID:AB_2534017Do immunofluorescencji
Alkohol benzylowy (99 + %)(dowolny)-Używany do usuwania zarodków (składnik BABB)
Benzoesan benzylu (99 +%) (dowolny)-Używany do usuwania zarodków (składnik BABB)
Albumina surowicy bydlęcejBiowestP6154Do immunofluorescencji
Szkło nakrywkowe 20x20 mm #0(dowolne)-
Szkło nakrywkowe o grubości 100um 20x20 mm #1(dowolne)-grubości 170um
20x60 mm #1.5(dowolne)-Do użycia jako " slajdy"
DAPI (4',6-dichlorowodorek dimidyno-2-fenyloindolu)Life TechnologiesD3571Do immunofluorescencji
Oprogramowanie Drishti(open source)-Darmowe narzędzie programowe
EDTASigmaED2SSDo demineralizacji
Fidżi / Oprogramowanie ImageJ(open source)-Darmowe narzędzie programowe
GlycineNZYtechMB01401Do immunofluorescencji
Oprogramowanie HuygensScientific Volume Imaging-Komercyjnenarzędzie programowe
HyClone zdefiniowana płodowa surowica bydlęcaGE Healthcare#HYCLSH30070.03Do obrazowania na żywo
Roztwór nadtlenku wodoru 30 %Milipore1085971000Do czyszczenia
oprogramowania ImarisInstrumenty Bitplane / Oxford-Komercyjne narzędzie programowe
iSpacersSunJin Lab(varies)Używaj jako przekładek do preparatów
L-glutaminyGibco#25030– 024Do pożywki do obrazowania na żywo
DMEM o niskim poziomie glukozyGibco11054020Do podłoża do obrazowania na żywo
M2 mediumSigmaM7167Do preparowania zarodków
MetanolVWRVWRC20847.307Do etapów odwodnienia i nawodnienia
Salicylan metyluSigmaM6752Stosowany do usuwania zarodków
ParaformaldehydSigmaP6148Stosowany w roztworze do utrwalania zarodków
Penicylina-streptomycynaSigma#P0781Do żywego podłoża
obrazowego PBS (roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem)BiowestL0615-500-RapiClear
Laboratorium SunJinRapiClear 1.52Służy do usuwania zarodków
Komory hybrydyzacyjne Secure-SeaSigmaC5474Stosować jako przekładki do preparaty
oprogramowanie simLabSimLabsoft-Komercyjnenarzędzie programowe
Zjeżdżalnia, wgłębienie wklęsłe szkło - 75x25 mm(dowolne)-Do montażu grubych zarodków.
Triton X-100SigmaT8787Do immunofluorescencji
Narzędzie Szkło nakrywkowe o

Bibliografia

  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biology. , 131-158 (2020).
  3. Tzouanacou, E., Wegener, A., Wymeersch, F. J., Wilson, V., Nicolas, J. F. Redefining the Progression of Lineage Segregations during Mammalian Embryogenesis by Clonal Analysis. Developmental Cell. 17 (3), 365-376 (2009).
  4. Aires, R., Dias, A., Mallo, M. Deconstructing the molecular mechanisms shaping the vertebrate body plan. Current Opinion in Cell Biology. 55, 81-86 (2018).
  5. Wymeersch, F. J., et al. Position-dependent plasticity of distinct progenitor types in the primitive streak. eLife. 5, 10042(2016).
  6. Koch, F., et al. Antagonistic Activities of Sox2 and Brachyury Control the Fate Choice of Neuro-Mesodermal Progenitors. Developmental Cell. 42 (5), 514-526 (2017).
  7. Chapman, D. L., Papaioannou, V. E. Three neural tubes in mouse embryos with mutations in the T-box gene Tbx6. Nature. 391 (1991), 695-697 (1998).
  8. de Lemos, L., Dias, A., Nóvoa, A., Mallo, M. Epha1 is a cell surface marker for neuromesodermal progenitors and their early mesoderm derivatives. bioRxiv. , 584524(2020).
  9. Takada, S., Stark, K. L., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes and Development. 8 (2), 174-189 (1994).
  10. Chalamalasetty, R. B., et al. Mesogenin 1 is a master regulator of paraxial presomitic mesoderm differentiation. Development. 141 (22), 4285-4297 (2014).
  11. Pais-de-Azevedo, T., Magno, R., Duarte, I., Palmeirim, I. Recent advances in understanding the mechanisms determining longevity. F1000Research. 7, 97(2018).
  12. Hubaud, A., Pourquié, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).
  13. Pourquié, O. Vertebrate segmentation: From cyclic gene networks to scoliosis. Cell. 145 (5), 650-663 (2011).
  14. Mallo, M. Revisiting the involvement of signaling gradients in somitogenesis. FEBS Journal. 283 (8), 1430-1437 (2016).
  15. Boulet, A. M., Capecchi, M. R. Signaling by FGF4 and FGF8 is required for axial elongation of the mouse embryo. Developmental Biology. 371 (2), 235-245 (2012).
  16. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  17. McDole, K., et al. In toto Imaging and Reconstruction of Post-Implantation Mouse Development at the Single-Cell Level. Cell. 175, 859-876 (2018).
  18. McColl, J., Mok, G. F., Lippert, A. H., Ponjavic, A., Muresan, L., Münsterberg, A. 4D imaging reveals stage dependent random and directed cell motion during somite morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 12644(2018).
  19. Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis. PLoS ONE. 4 (10), 7429(2009).
  20. Bénazéraf, B., et al. Multi-scale quantification of tissue behavior during amniote embryo axis elongation. Development. 144, 4462-4472 (2017).
  21. Sharpe, J. Optical Projection Tomography. Advanced Imaging in Biology and Medicine. , 199-224 (2009).
  22. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296 (5567), 541-545 (2002).
  23. Aulehla, A., et al. A beta-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation. Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).
  24. Osorno, R., et al. The developmental dismantling of pluripotency is reversed by ectopic Oct4 expression. Development. 139 (13), 2288-2298 (2012).
  25. Bryson-Richardson, R. J., Currie, P. D. Optical projection tomography for spatio-temporal analysis in zebrafish. Methods in Cell Biology. 76, 37-50 (2004).
  26. Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (6), 586-594 (2011).
  27. Cho, A., Suzuki, S., Hatakeyama, J., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. A Method for Rapid Demineralization of Teeth and Bones. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 223-229 (2010).
  28. Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijó, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: An open-source integrated microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 599-600 (2013).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Weigert, M., et al. Content-aware image restoration: pushing the limits of fluorescence microscopy. Nature Methods. 15 (12), 1090-1097 (2018).
  31. Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. Noise2void-learning denoising from single noisy images. 2019 IEEE. CVF Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR). , 2124-2132 (2018).
  32. Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
  33. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: Visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12 (6), 481-483 (2015).
  34. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51086(2014).
  35. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  36. Ohser, J., et al. Attenuation correction for confocal laser scanning microscopy and its application in chromatography. Journal of Microscopy. 278, 76-88 (2020).
  37. Hell, S., Reiner, G., Cremer, C., Stelzer, E. H. K. Aberrations in confocal fluorescence microscopy induced by mismatches in refractive index. Journal of Microscopy. 169, 391-405 (1993).
  38. Kuypers, L. C., Decraemer, W. F., Dirckx, J. J. J., Timmermans, J. A procedure to determine the correct thickness of an object with confocal microscopy in case of refractive index mismatch. Journal of Microscopy. 218, 68-78 (2005).
  39. Meijering, E. H. W., Niessen, W. J., Viergever, M. A. Quantitative evaluation of convolution-based methods for medical image interpolation. Medical Image Analysis. 5 (2), 111-126 (2001).
  40. Limaye, A. Drishti: a volume exploration and presentation tool. Developments in X-Ray Tomography VIII. , 85060(2012).
  41. Thermofisher.com. , Available from: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/3d-visualization-analysis-software-resource-center.html (2020).
  42. Simlab-soft.com. , Available from: https://www.simlab-soft.com/3d-products/Tutorials/simlab-composer-all-Tutorials.aspx?t=3 (2020).
  43. Dias, A., et al. A TgfbRI/Snai1-dependent developmental module at the core of vertebrate axial elongation. eLife. 9, 56615(2020).
  44. Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Developmental Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
  45. Attardi, A., et al. Neuromesodermal progenitors are a conserved source of spinal cord with divergent growth dynamics. Development. 145 (21), (2018).
  46. Romanos, M., et al. Cell-to-cell heterogeneity in Sox2 and Brachyury expression guides progenitor destiny by controlling their movements. bioRxiv. , 388611(2020).
  47. Guillot, C., Michaut, A., Rabe, B., Pourquié, O. Dynamics of primitive streak regression controls the fate of neuro-mesodermal progenitors in the chicken embryo. bioRxiv. , 077586(2020).
  48. Steventon, B., Duarte, F., Lagadec, R., Mazan, S., Nicolas, J. F., Hirsinger, E. Species-specific contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates. Development. 143 (10), 1732-1741 (2016).
  49. Lawton, A. K., et al. Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation. Development. 140 (3), 573-582 (2013).
  50. Huang, Q., et al. Intravital imaging of mouse embryos. Science. 368 (6487), 181-186 (2020).
  51. Van Den Brink, S. C., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organisation in aggregates of mouse embryonic stem cells. Development. 141 (22), 4231-4242 (2014).
  52. Baillie-Johnson, P., vanden Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias, A. Generation of aggregates of mouse embryonic stem cells that show symmetry breaking, polarization and emergent collective behaviour in vitro. Journal of Visualized Experiments. (105), e53252(2015).
  53. Moris, N., et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development. Nature. 582, 410-415 (2020).
  54. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166 (1), 11-15 (2004).
  55. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  56. Jost, A. P. -T., Waters, J. C. Designing a rigorous microscopy experiment: Validating methods and avoiding bias. Journal of Cell Biology. 218 (5), 1452-1466 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  58. Stauber, M., Sachidanandan, C., Morgenstern, C., Ish-Horowicz, D. Differential axial requirements for Lunatic fringe and Hes7 transcription during mouse somitogenesis. PLoS ONE. 4 (11), 7996(2009).
  59. Turnpenny, P. D., et al. Abnormal vertebral segmentation and the notch signaling pathway in man. Developmental Dynamics. 236 (6), 1456-1474 (2007).
  60. Andrade, R. P., Palmeirim, I., Bajanca, F. Molecular clocks underlying vertebrate embryo segmentation: A 10-year-old hairy-go-round. Birth Defects Research (Part C). 81 (2), 65-83 (2007).
  61. Sparrow, D. B., et al. Mutation of the LUNATIC FRINGE gene in humans causes spondylocostal dysostosis with a severe vertebral phenotype. American Journal of Human Genetics. 78 (1), 28-37 (2006).
  62. Giampietro, P. F., et al. Progress in the understanding of the genetic etiology of vertebral segmentation disorders in humans. Annals of the New York Academy of Sciences. 1151, 38-67 (2009).
  63. Blecher, R., et al. The Proprioceptive System Masterminds Spinal Alignment: Insight into the Mechanism of Scoliosis. Developmental Cell. 42 (4), 388-399 (2017).
  64. Vianello, S. Exploring and illustrating the mouse embryo virtual objects to think and create with. bioRxiv. , 393991(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Somitogeneza kręgowcówwizualizacja 3Dobrazowanie 4Dembriony mysieoptyczna tomografia projekcyjnaimmunofluorescencja całych preparatówprogenitory neuromezodermalneutopienie tkankirekonstrukcja 3D
Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.