Method Article

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Somitogeneza jest cechą charakterystyczną rozwoju embrionalnego kręgowców. Naukowcy od lat badają ten proces w różnych organizmach, wykorzystując szeroki zakres technik obejmujących podejścia ex vivo i in vitro. Jednak większość badań nadal opiera się na analizie dwuwymiarowych (2D) danych obrazowania, co ogranicza właściwą ocenę procesu rozwojowego, takiego jak wydłużenie osiowe i somitogeneza obejmujące wysoce dynamiczne interakcje w złożonej przestrzeni 3D. W tym miejscu opisujemy techniki, które umożliwiają pozyskiwanie obrazów na żywo na myszach, przetwarzanie zestawów danych, wizualizację i analizę w 3D i 4D w celu badania komórek (np. progenitorów neuromezodermalnych) zaangażowanych w te procesy rozwojowe. Udostępniamy również protokół krok po kroku dla optycznej tomografii projekcyjnej i mikroskopii immunofluorescencyjnej w całości na zarodkach myszy (od przygotowania próbki do akwizycji obrazu) oraz pokazujemy opracowany przez nas potok przetwarzania i wizualizacji danych obrazu 3D. Rozszerzamy zastosowanie niektórych z tych technik i podkreślamy specyficzne cechy różnych dostępnych programów (np. Fiji/ImageJ, Drishti, Amira i Imaris), które można wykorzystać do poprawy naszej obecnej wiedzy na temat rozszerzania osiowego i tworzenia somitów (np. rekonstrukcje 3D). Podsumowując, opisane tutaj techniki podkreślają znaczenie wizualizacji i analizy danych 3D w biologii rozwoju i mogą pomóc innym badaczom w lepszym wykorzystaniu danych obrazowych 3D i 4D w kontekście wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców. W ramach prac wykorzystano również nowatorskie narzędzia ułatwiające nauczanie o rozwoju embrionalnym kręgowców.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie osi ciała kręgowców jest bardzo złożonym i dynamicznym procesem zachodzącym podczas rozwoju embrionalnego. Pod koniec gastrulacji [u myszy, około dnia embrionalnego (E) 8.0], grupa komórek progenitorowych epiblastów, znana jako progenitorzy neuromezodermalni (NMP), staje się kluczowym czynnikiem napędzającym wydłużenie osiowe w sekwencji od głowy do ogona, generując cewę nerwową i przyosiowe tkanki mezodermalne podczas tworzenia szyi, tułowia i ogona1,2,3,4. Co ciekawe, pozycja, jaką te NMP zajmują w epiblastach ogonowych, wydaje s....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experiments involving animals followed the Portuguese (Portaria 1005/92) and European (Directive 2010/63/EU) legislations concerning housing, husbandry, and welfare. The project was reviewed and approved by the Ethics Committee of 'Instituto Gulbenkian de Ciência' and by the Portuguese National Entity, 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (license reference: 014308).

1. Sample preparation for 3D and 4D imaging

NOTE: Here we provide a detailed description on how to dissect and prepare mouse E8.25 to E10.5 embryos for live imaging (1.1), E7.5 to E11.5 embryos for....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki pokazane w tym artykule zarówno dla obrazowania na żywo, jak i immunofluorescencji, zostały uzyskane przy użyciu systemu dwufotonowego, z obiektywem wodnym 20 × 1.0 NA, laserem wzbudzającym dostrojonym do 960 nm i fotodetektorami GaAsP (jak opisano w Dias et al. (2020)43. Optyczna tomografia projekcyjna została wykonana przy użyciu specjalnie zbudowanego skanera OPenT (zgodnie z opisem w Gualda et al. (2013)28.

Obra.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydłużenie osiowe i segmentacja to dwa z najbardziej złożonych i dynamicznych procesów zachodzących podczas rozwoju embrionalnego kręgowców. Obrazowanie 3D i 4D ze śledzeniem pojedynczych komórek jest od pewnego czasu stosowane do badania tych procesów zarówno w zarodkach danio pręgowanego, jak i kurczaków, dla których dostępność i warunki hodowli ułatwiają złożone obrazowanie 19,44,45,46,47,48,49

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Olivierowi Pourquié i Alexandrowi Aulehli za szczep reporterowy LuVeLu, laboratorium SunJin za próbkę testową RapiClear, Hugo Pereirze za pomoc przy użyciu BigStitcher, Nuno Granjeiro za pomoc w ustawieniu aparatury do obrazowania na żywo, ośrodkowi dla zwierząt IGC oraz byłym i obecnym członkom laboratorium Mallo za przydatne komentarze i wsparcie podczas tej pracy.

Dziękujemy za wsparcie techniczne Zaawansowanego Ośrodka Obrazowania IGC, które jest wspierane przez portugalskie fundusze ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 i ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, współfinansowane przez Regionalny Program Operacyjny Lizbona (....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agaroza niska temperatura żelowaniaSigmaA9414Służy do montowania zarodków (np. dla OPT)
Oprogramowanie Amiraprogramowe Thermofisher-Commerial
Anti-Brachyury (kozie poliklonalne)Systemy R i DAF2085 RRID:AB_2200235Do immunofluorescencji
Anti-Sox2 (monoklonalny królik)Abcamab92494 RRID:AB_10585428Dla immunofluorescencja
Anty-Tbx6 (poliklonalny koza)Systemy R i DAF4744 RRID:AB_2200834Do immunofluorescencji
Anty-Laminin111 (poliklonalny królik)SigmaL9393 RRID:AB_477163Do immunofluorescencji
Anty-koza 488 (poliklonalny osioł)Sondy molekularneA11055 RRID:AB_2534102Do immunofluorescencji
Anty-królik 568 (poliklonalny osioł)ThermoFisher   ScientificA10042 RRID:AB_2534017Do immunofluorescencji
Alkohol benzylowy (99 + %)(dowolny)-Używany do usuwania zarodków (składnik BABB)
Benzoesan benzylu (99 +%) (dowolny)-Używany do usuwania zarodków (składnik BABB)
Albumina surowicy bydlęcejBiowestP6154Do immunofluorescencji
Szkło nakrywkowe 20x20 mm #0(dowolne)-
Szkło nakrywkowe o grubości 100um 20x20 mm #1(dowolne)-grubości 170um
20x60 mm #1.5(dowolne)-Do użycia jako " slajdy"
DAPI (4',6-dichlorowodorek dimidyno-2-fenyloindolu)Life TechnologiesD3571Do immunofluorescencji
Oprogramowanie Drishti(open source)-Darmowe narzędzie programowe
EDTASigmaED2SSDo demineralizacji
Fidżi / Oprogramowanie ImageJ(open source)-Darmowe narzędzie programowe
GlycineNZYtechMB01401Do immunofluorescencji
Oprogramowanie HuygensScientific Volume Imaging-Komercyjnenarzędzie programowe
HyClone zdefiniowana płodowa surowica bydlęcaGE Healthcare#HYCLSH30070.03Do obrazowania na żywo
Roztwór nadtlenku wodoru 30 %Milipore1085971000Do czyszczenia
oprogramowania ImarisInstrumenty Bitplane / Oxford-Komercyjne narzędzie programowe
iSpacersSunJin Lab(varies)Używaj jako przekładek do preparatów
L-glutaminyGibco#25030– 024Do pożywki do obrazowania na żywo
DMEM o niskim poziomie glukozyGibco11054020Do podłoża do obrazowania na żywo
M2 mediumSigmaM7167Do preparowania zarodków
MetanolVWRVWRC20847.307Do etapów odwodnienia i nawodnienia
Salicylan metyluSigmaM6752Stosowany do usuwania zarodków
ParaformaldehydSigmaP6148Stosowany w roztworze do utrwalania zarodków
Penicylina-streptomycynaSigma#P0781Do żywego podłoża
obrazowego PBS (roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem)BiowestL0615-500-RapiClear
Laboratorium SunJinRapiClear 1.52Służy do usuwania zarodków
Komory hybrydyzacyjne Secure-SeaSigmaC5474Stosować jako przekładki do preparaty
oprogramowanie simLabSimLabsoft-Komercyjnenarzędzie programowe
Zjeżdżalnia, wgłębienie wklęsłe szkło - 75x25 mm(dowolne)-Do montażu grubych zarodków.
Triton X-100SigmaT8787Do immunofluorescencji
Narzędzie Szkło nakrywkowe o

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vertebrate SomitogenesisAxial Elongation3D Visualization4D ImagingMouse EmbryosOptical Projection TomographyWhole Mount ImmunofluorescenceNeuromesodermal ProgenitorsTissue Clearing3D Reconstruction

Related Articles