Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Summary

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Abstract

Prawidłowy rozwój mózgu ssaków opiera się na doskonałej równowadze między proliferacją i różnicowaniem nerwowych komórek macierzystych na różne typy komórek nerwowych. Równowaga ta jest ściśle kontrolowana przez ekspresję genów, która jest precyzyjnie dostrojona na wielu poziomach, w tym transkrypcji, po transkrypcji i translacji. W związku z tym coraz więcej dowodów wskazuje na kluczową rolę regulacji translacyjnej w koordynowaniu decyzji dotyczących losu neuronalnych komórek macierzystych. Frakcjonowanie polisomów jest potężnym narzędziem do oceny statusu translacji mRNA zarówno na poziomie globalnym, jak i poszczególnych genów. W tym miejscu przedstawiamy wewnętrzny proces profilowania polisomów w celu oceny wydajności translacji w komórkach z rozwijającej się kory mózgowej myszy. Opisujemy protokoły przygotowania gradientu sacharozy, lizy tkanek, ultrawirowania i analizy stanu translacji mRNA opartej na frakcjonowaniu.

Introduction

Podczas rozwoju mózgu ssaków, nerwowe komórki macierzyste namnażają się i różnicują, tworząc neurony i glej^1,2 . Zaburzenia tego procesu mogą prowadzić do zmian w strukturze i funkcjonowaniu mózgu, co można zaobserwować w wielu zaburzeniach neurorozwojowych^3,4. Prawidłowe zachowanie nerwowych komórek macierzystych wymaga zaaranżowanej ekspresji określonych genów⁵. Podczas gdy kontrola epigenetyczna i transkrypcyjna tych genów była intensywnie badana, ostatnie odkrycia sugerują, że regulacja genów na innych poziomach również przyczynia się do koordynacji proliferacji i różnicowania nerwowych komórek macierzystych6^,7,8,9,10. W związku z tym zajęcie się programami kontroli translacyjnej znacznie poszerzy naszą wiedzę na temat mechanizmów leżących u podstaw decyzji o losie neuronalnych komórek macierzystych i rozwoju mózgu.

Trzy główne techniki o różnej sile były szeroko stosowane do oceny stanu translacji mRNA, w tym profilowanie rybosomów, oczyszczanie powinowactwa do rybosomów (TRAP) i profilowanie polisomów. Profilowanie rybosomów wykorzystuje sekwencjonowanie RNA do określania fragmentów mRNA chronionych rybosomami, umożliwiając globalną analizę liczby i lokalizacji translujących rybosomów na każdym transkryptie w celu pośredniego wywnioskowania szybkości translacji, porównując ją z obfitością transkryptu¹¹. TRAP wykorzystuje białka rybosomalne znakowane epitopami do wychwytywania mRNA związanych z rybosomami¹². Biorąc pod uwagę, że znakowane białka rybosomalne mogą ulegać ekspresji w określonych typach komórek przy użyciu metod genetycznych, projekt TRAP umożliwia analizę translacji w sposób specyficzny dla typu komórki. Dla porównania, profilowanie polisomów, które wykorzystuje frakcjonowanie gradientu gęstości sacharozy w celu oddzielenia wolnych i słabo translowanych części (lżejszych monosomów) od tych aktywnie przekształcanych przez rybosomy (cięższe polisomy), zapewnia bezpośredni pomiar gęstości rybosomów na mRNA¹³. Jedną z zalet tej techniki jest jej wszechstronność w badaniu translacji specyficznego mRNA będącego przedmiotem zainteresowania, a także analizie translatomu całego genomu¹⁴.

W tym artykule opisujemy szczegółowy protokół profilowania polisomów w celu analizy rozwijającej się kory mózgowej myszy. Używamy systemu zmontowanego w domu do przygotowania gradientów gęstości sacharozy i zbierania frakcji do dalszych zastosowań. Przedstawiony tutaj protokół można łatwo dostosować do analizy innych typów tkanek i organizmów.

Protocol

Całe wykorzystanie zwierząt było nadzorowane przez Komitet Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Calgary. Myszy CD1 użyte w eksperymencie zostały zakupione od komercyjnego dostawcy.

1. Przygotowanie roztworów

UWAGA Aby zapobiec degradacji RNA, spryskaj stół warsztatowy i wszystkie urządzenia roztworem do dekontaminacji RNazy. W eksperymencie używane są końcówki wolne od RNaz. Wszystkie roztwory przygotowuje się w wodzie wolnej od RNaz.

1. Przygotować roztwór podstawowy cykloheksymidu (100 mg/ml) w DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Przygotować 2,2 M roztwór podstawowy sacharozy, dodając 75,3 g sacharozy do wody wolnej od RNaz i uzupełniając objętość do 100 ml (dla preparatu o gradinie ~16). Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
3. Przygotować 10x roztwór soli (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl₂).
4. Przygotować 60% (w/v) roztwór sacharozy, zawierający 30 g sacharozy, 5 ml 10x roztworu soli i uzupełnić objętość do 50 ml wodą wolną od RNaz.
5. Opcjonalnie dodać odrobinę błękitu bromofenolowego lub około 5 μl 1% błękitu bromofenolowego w wodzie wolnej od RNaz do roztworu bruzdy. 1.6. Przechowywać roztwory w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie gradientu sacharozy

UWAGA: Precyzja w przygotowaniu gradientów sacharozy jest kluczowa dla uzyskania spójnych i powtarzalnych wyników.

1. Aby przygotować sześć 10-50% gradientów sacharozy, rozcieńczyć 2,2 M roztwór sacharozy, jak w tabeli 1.

.

Roztwór sacharozy	10%	20%	30%	40 proc	50%
2,2 M sacharoza	2 ml	4 ml	6 ml	8 ml	10 ml
10X roztwór soli	1,5 ml	1,5 ml	1,5 ml	1,5 ml	1,5 ml
Cykloheksymid	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL	15 μL
Woda	11,5 ml	9,5 ml	7,5 ml	5,5 ml	3,5 ml
Całkowita objętość	15 ml	15 ml	15 ml	15 ml	15 ml

Tabela 1: Rozcieńczenia sacharozy do preparatów gradientów sacharozy.

UWAGA: Zawsze przygotowuj gradienty sacharozy w wielokrotnościach dwóch, aby zrównoważyć wagę podczas ultrawirowania.

2. Przetrzyj metalową igłę z końcem roztworem do odkażania RNazy. Krótko przepłukać probówki ultrawirówki, rurki i strzykawkę wodą wolną od RNaz. Wysuszyć probówki na powietrzu, tak aby w probówkach nie pozostała kropla wody, ponieważ pozostała woda zmieni stężenie sacharozy.
3. Umieść metalową igłę na uchwycie zaciskowym, a probówkę wirówkową na zmotoryzowanym stoliku. Aby konsekwentne przygotowanie gradientów, użyto systemu zmontowanego w domu, który zawiera zmotoryzowany stolik do utrzymywania probówki ultrawirówki i pompę strzykawkową do wstrzykiwania roztworów sacharozy (Rysunek 1, szczegóły w kroku 9).
4. Napełnij strzykawkę o pojemności 30 ml ~16 ml 10% sacharozy (wystarcza na sześć gradientów), umieść ją na pompie strzykawkowej i podłącz do igły. Upewnij się, że w strzykawce, rurki i igle nie ma pęcherzyków powietrza. Wytrzeć końcówkę z igły, aby usunąć resztki roztworu.
5. Przesuń zmotoryzowany stolik w górę tak, aby końcówka igły dotykała środka rurki na dole.
6. Ustawić pompę strzykawkową na natężenie przepływu 2 ml/min dla objętości 2,3 ml.
7. Po dozowaniu 2,3 ml 10% roztworu sacharozy, przejdź do etapu zmotoryzowanego i powtórz proces dla wszystkich sześciu gradientów.
8. Powtórz kroki 2.4-2.7, aby dodać 20% roztwór sacharozy na dno probówek, a następnie podobnie 30%, 40% i 50% roztwory sacharozy.
9. Po przygotowaniu gradientu uszczelnij probówkę ultrawirówki za pomocą folii parafinowej.
10. Pozostawić probówki na noc w temperaturze 4 °C, tak aby różne warstwy sacharozy dyfundowały się razem, tworząc ciągły gradient.

3. Sekcja tkanek

UWAGA: Ciężarne myszy zostały poddane eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy poprzedzone znieczuleniem 5% izofluranem.

1. Zbierz zarodki myszy CD1 w 12 dniu embrionalnym lub w innych punktach czasowych w razie potrzeby i umieść zarodki na płytce Ø 10 cm zawierającej lodowaty roztwór soli Hanka (HBSS) na lodzie, aby zachować żywotność komórek.
2. W ramach sekcji należy przenieść jeden zarodek na płytkę Ø 6 cm zawierającą lodowaty HBSS.
3. Użyj igieł 21-23 G, aby ustalić pozycję głowy, penetrując przez oczy pod kątem około 45° i przyłóż siłę, aby upewnić się, że igły są przymocowane do płytki (Rysunek 2A).
4. Użyj kleszczy nr 5, aby usunąć skórę i czaszkę, od środka do boków.
5. Użyj kleszczy, aby przeciąć opuszki węchowe i usunąć opony mózgowe, aby odsłonić tkanki korowe.3.6. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby pociąć tkanki korowe na 2-3 ml podłoża neurobazalnego na lodzie (Rysunek 2B). W razie potrzeby należy pobrać tkanki korowe z różnych zarodków. Tkanki z 8-10 zarodków dają zwykle ~200 μg całkowitego RNA.

4. Liza komórek

1. W dniu rozbioru tkanek należy przygotować świeży bufor do lizy komórek, jak opisano w Tabeli 2.

rozwiązanie	Końcowe stężenie	głośność
Tris-HCl (pH 7,5)	20 mM	100 μL
Kcl	100 mM	250 μL
MgCl2	5 mM	25 μL
Tryton X-100	1% (v/v)	500 μL
Deoksycholan sodu	0,5% (w/v)	500 μL
Ditiotreitol (DTT)	1 mM	5 μL
Cykloheksymid	100 μg/ml	5 μL
Woda wolna od RNaz		Uzupełnij do 5 ml
łączny	5 ml	5 ml

Tabela 2: Przygotowanie buforu do lizy polisomów.

UWAGA: Bufor do lizy uzupełnij inhibitorami proteazy i fosfatazy.

2. Dodać cykloheksymid do podłoża neurobazalnego z wypreparowanymi tkankami do końcowego stężenia 100 μg/ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Cykloheksymid blokuje wydłużenie translacji, a tym samym zapobiega spływaniu rybosomów ¹⁵.
3. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
4. Przemyć tkanki dwukrotnie lodowatym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 100 μg/ml cykloheksymidu.
5. Dodać 500 μl buforu do lizy komórek uzupełnionego 4 μl inhibitora RNazy. Pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić tkankę w buforze do lizy. Użyj igły do insuliny, aby delikatnie zlizować tkankę.
6. Inkubować tkanki na lodzie przez 10 minut z krótkim wirowaniem co 2-3 min.
   UWAGA: Aby zapobiec degradacji tkanek, upewnij się, że wszystkie etapy lizy tkanek są przeprowadzane na lodzie.
7. Wirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
8. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej na lodzie.
9. Wirować przy ~13 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
10. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej na lodzie.
11. Zmierzyć stężenie RNA w lizacie tkankowym za pomocą spektrofotometru UV-Vis.
    UWAGA: Jeśli w eksperymencie uwzględniono wiele próbek, rozcieńczyć próbki do tego samego stężenia za pomocą dodatkowego buforu do lizy komórek, aby zminimalizować zmienność.

5. Ładowanie próbki i ultrawirowanie

1. Wstępnie schłodzić wirnik ultrawirówki i wiadra wahadłowe do temperatury 4 °C i ustawić temperaturę ultrawirówki na 4 °C.
2. Zachowaj 20 μl lizatu tkankowego jako całkowity wkład RNA.
3. Załaduj próbki (50-300 μg RNA o równej objętości) na wierzch gradientów sacharozy, powoli dozując lizat do ścianek probówek ultrawirówek.
4. Delikatnie umieść probówki ultrawirówki w wiadrze wahadłowym. Upewnij się, że wszystkie średnicowo przeciwległe łyżki są wyważone.
5. Załaduj wiadra obrotowe na wirnik. Ustawić ultrawirówkę na 190 000 x g (~39 000 obr./min) w temperaturze 4 °C na 90 min.
6. Po odwirowaniu delikatnie umieść gradienty na lodzie.

6. Frakcjonowanie i pobieranie próbek

UWAGA: Do analizy i pobierania próbek z gradientów używany jest domowy system frakcjonowania, rejestracji i zbierania próbek (Rysunek 3, zobacz Komponenty urządzenia).

1. Umieść pustą probówkę ultrawirówki na przebijaczu probówki i delikatnie przebij probówkę igłą od dołu.
2. Włącz monitor UV i otwórz oprogramowanie do nagrywania sygnału cyfrowego.
3. Napełnij strzykawkę o pojemności 30 ml 25 ml 60% roztworu sacharozy. Delikatnie nacisnąć strzykawkę tak, aby roztwór chase wypełnił pustą probówkę i przejść przez monitor UV 254 nm, aby ustawić linię bazową do wykrywania.
4. Naciśnij automatyczne zerowanie na monitorze UV, aby zarejestrować linię bazową do wykrywania. Naciśnij przycisk odtwarzania w oprogramowaniu, aby rozpocząć nagrywanie.
5. Gdy system ustali linię bazową, wstrzymaj nagrywanie w oprogramowaniu i wycofaj rozwiązanie pościgu. Upewnij się, że w systemie nie pozostały żadne resztki roztworu bruzdy.
   UWAGA: Przepłucz system wodą wolną od RNaz, aby usunąć pozostałości roztworów sacharozy pozostałych po poprzednim przebiegu.
6. Załaduj jedną probówkę z próbką do przebijacza do probówki. Delikatnie wbić igłę w rurkę od dołu.
7. Rozpocznij nagrywanie w oprogramowaniu. Uruchomić pompę strzykawkową (natężenie przepływu 1 ml/min dla objętości 25 ml) i kolektor frakcji w celu zebrania frakcji polisomowych. Ustaw frakcjonator na 30 s.
   UWAGA: Przed każdym uruchomieniem upewnij się, że w strzykawce lub rurce nie ma pęcherzyków powietrza, delikatnie naciskając strzykawkę, aby roztwór chase przepływał w sposób ciągły przez igłę.
8. Zebrać frakcje do probówek o pojemności 1,5 ml (każda po 500 μl) za pomocą kolektora frakcji.
9. Frakcje mogą być przetwarzane natychmiast lub przechowywane w temperaturze -80 °C.
10. Po zebraniu frakcji przepłucz system wodą wolną od RNaz, aby usunąć resztki sacharozy.

7. Ekstrakcja RNA

1. Do każdej frakcji dodaj 10 ng kontroli skoków mRNA lucyferazy.
2. Do każdej frakcji dodać trzy objętości komercyjnego odczynnika do izolacji RNA na bazie hydrocholku guanidu.
3. Wiruj krótko przez 15 s.
4. Ekstrahować RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnego z roztworem użytym w ppkt 7.2.

8. Odwrotna transkrypcja i PCR w czasie rzeczywistym

1. Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis.
2. Poddaj RNA odwrotnej transkrypcji za pomocą zestawu do syntezy cDNA, zgodnie z protokołem producenta.
3. Jako przykład użyj ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), aby zbadać rozkład polisomalny mRNA gapdh. qPCR przeprowadzono przy użyciu systemu detekcji qPCR i odczynnika qPCR mastermix, w następujących warunkach cyklicznych: 95 °C przez 10 min, następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 40 s, a następnie 95 °C przez 60 s.
4. Uzyskać wartości cyklu progowego (Ct) z wykresów amplifikacji i wykorzystać do obliczenia zmiany krotności przy użyciu metody ΔΔCt.

9. Montaż systemu do produkcji gradientu sacharozy

UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby złożyć każdy komponent (jak opisano w Tabeli 3) ekspresu do gradientu sacharozy (Rysunek 1).

1. Zamontuj dwa wsporniki pionowe (A2) na płytce stykowej podstawy (A1).
2. Użyj dwóch wąskich wsporników kątowych (B2), aby zamontować siłownik stolika liniowego na płytce stykowej podstawy (A1).
3. Użyj dociskowej na aluminiowym słupku Ø12,7 mm (C2), aby przymocować go do płytki stykowej podstawy uchwytu rurki (C1) jako podstawki dla uchwytu rury.
4. Zamontuj słupek pod kątem prostym Ø1/2" do Ø6 mm clamp (C3) ze słupkiem (C2) i słupkiem optycznym serii mini (C4).
5. Użyj ustalającej na słupku optycznym (C4), aby podłączyć mały zacisk V-clamp (C5) jako uchwyt rury.
6. Umieść probówkę wirówkową w uchwycie probówki i wyreguluj kąt, aby ustawić ją w pionie. Zaznacz położenie rury i zamontuj uchwyt słupka cokołu (C6) na płycie stykowej podstawy (C1), aby podeprzeć rurę.
7. Po drugiej stronie płytki stykowej (A1) użyj dociskowej aluminiowego słupka Ø12,7 mm (D1), aby go zamocować i podłącz słupek optyczny serii mini (D3) za pomocą kąta prostego Ø1/2" do Ø6 mm zacisku słupka (D2).
8. Podłącz miniaturowy zacisk V (D4) za pomocą igły (D5) do słupka (D3). Dostosuj kąt zacisku, aby ustawić igłę w pionie i wyreguluj długość słupka, aby upewnić się, że igła styka się z probówką wirówkową.
9. Podłącz siłownik (B1) do sterownika silnika krokowego (E1) i użyj płytki sterownika UNO R3 oraz modułu joysticka z zestawu startowego UNO (E2) do sterowania siłownikiem. Zasilacz (np. zasilacz z regulacją 9-24 V AC/DC) może być używany do oddzielnego napędzania silnika.
10. Umieścić pompę strzykawkową (F) obok stacji do tworzenia gradientu i połączyć strzykawkę z igłą.
11. Steruj stopniem uchwytu rurki w górę iw dół za pomocą joysticka.

składnik	przedmiot
Klasa B1	Siłownik stolika liniowego
Klasa E1	Sterownik silnika krokowego
Klasa E2	Super zestaw startowy projektu UNO
Klasa A1	Makiet
Klasa A2	Wspornik pionowy
Klasa B2	Wąski wspornik kątowy
Klasa C1	Płytka stykowa z serii Mini
Zobacz materiał C5	Mały zacisk V
Klasa D4	Miniaturowy zacisk V-clamp
Klasa C2	Słupek aluminiowy Ø12,7 mm
C4, D3	Słupek optyczny serii Mini
Klasa D1	Słupek aluminiowy Ø12,7 mm
C3, D2	Zacisk słupka kątowego Ø1/2" do Ø6 mm
Zobacz materiał C6	Podstawa uchwytu na cokół z serii Mini
Zobacz materiał D5	Igła z końcem
Z	Pompa strzykawkowa

Tabela 3: Elementy systemu tworzenia gradientów.

10. Frakcjonowanie i wykrywanie montażu systemu (Rysunek 2).

1. Użyj zwykłej biurety z okrągłymi szczękami clamp do zamontowania modułu optycznego monitora UV na przekłuwaczu rurowym. Podłącz jeden koniec rurki (o długości 1 cm i średnicy wewnętrznej 0.56 mm) do łącznika przekłuwacza rurek, a drugi koniec do portu Fluid In modułu optycznego. Podłącz port Fluid Out do frakcjonatora.
2. Połącz moduł optyczny z jednostką sterującą monitora UV zgodnie z instrukcją producenta.
3. Za pomocą rozdzielającego podłącz gniazdo wyjściowe sygnału do konwertera cyfrowego na masie i złączach wejść analogowych, zgodnie z instrukcją producenta.
4. Podłącz konwerter cyfrowy do laptopa za pomocą zwykłego USB i nagrywaj przekonwertowane sygnały cyfrowe za pomocą oprogramowania do akwizycji danych.

Results

Jako demonstracja, lizat korowy zawierający 75 μg RNA (zebrany z 8 zarodków) został podzielony przez gradient sacharozy na 12 frakcji. Piki absorbancji UV przy 254 nm zidentyfikowały frakcje zawierające podjednostkę 40S, podjednostkę 60S, monosom 80S i polisomy (Rysunek 4A). Analiza frakcji metodą western blot dla dużej podjednostki rybosomalnej, Rpl10 wykazała jej obecność w podjednostce 60S (frakcja 3), monosomach (frakcja 4) i polisomach (frakcje 5-12) (Rysunek 4B). W przeciwień...

Discussion

Profilowanie polisomów jest powszechnie stosowaną i skuteczną techniką oceny stanu translacji zarówno na poziomie pojedynczego genu, jak i całego genomu¹⁴ . W niniejszym raporcie przedstawiamy protokół profilowania polisomów z wykorzystaniem domowej platformy i jej zastosowania do analizy rozwijającej się kory myszy. Ta ekonomiczna platforma jest łatwa w montażu i generuje solidne, powtarzalne gradienty sacharozy i profilowanie polisomów z wysoką czułością.

Warto zauważ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 ml mikroprobówki bez RNA	Axygen	MCT-150-C
10 cm naczynie	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
igła 21-23G	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
30 mL strzykawka	BD	302832
koniec igła	VWR	20068-781
Płytka stykowa	Thorlabs	MB2530/M
Bromofenol niebieski	Sigma	115-39-9
Mysz CD1 Charles		River Laboratory Kleszczyki
z zakrzywioną końcówką	Sigma	#Z168785
Cykloheksymid		Sigma	66-81-9
Oprogramowanie do akwizycji danych TracerDAQ	Measurement Computing
Konwerter		Measurement Computing	USB-1208LS
Zestaw do miniprepu Direct-zol RNA	Zymo	R2070
Dithiothreitol (DTT)	Bio-basic	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Kleszcze Dumont No.5	Sigma	#F6521
Kolektor frakcji	Bio-Rad	Model 2110
HBSS	Żubr	311-513-CL
Siłownik stopnia liniowego	Rattmmotor	CBX1605-100A
Kontrola lucyferazy RNA	Promega	L4561
Maxima zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA	Themo Fisher	M1681
Miniaturowy zacisk V-clamp	Thorlabs	VH1/M
Podstawa uchwytu postumentu serii Mini	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Podłoże neurobazalne	Gibco	21103-049
Słupek aluminiowy 12,7 mm	Thorlabs	TRA150/M Parafilm
	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR zielony fastmix	Quanta Bio	CA101414-274
Solanka buforowana fosforanami (PBS)	Żubr	311-010-CL
Puromycin	Bioshop	58-58-2
Klema kątowa	Thorlabs	RA90/M
Kąt prosty i Oslash; 1/2" na Ø Zacisk słupkowy 6 mm	Thorlabs	RA90TR/M Rnase
AWAY	Molecular BioProducts	7002
Końcówki bez RNaz	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
Woda bez RNaz	Żubr	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Wąski kątownik	Thorlabs	AB90B/M
Mały zacisk V-clamp	Thorlabs	VC1/M
Deoksycholan sodu	Sigma	302-95-4
Sterownik silnika krokowego	SongHe	TB6600
Sacharoza	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Pompa strzykawkowa	Harvard Apparatus	70-4500
Pompa strzykawkowa	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Przekłuwacz rurkowy	Brandel	BR-184
Ultrawirówka		Beckman Coulter	L8-70M
Probówki ultrawirówkowe	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7,5	Invitrogen	15567-027
Zestaw startowy projektu UNO	Elegoo	EL-KIT-003
Monitor UV	Bio-Rad	EM-1 Econo
Wspornik pionowy	Thorlabs	VB01A/M