Method Article

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

DOI:

10.3791/62088

⸱

May 22nd, 2021

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology; Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Medical Genetics, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prawidłowy rozwój mózgu ssaków opiera się na doskonałej równowadze między proliferacją i różnicowaniem nerwowych komórek macierzystych na różne typy komórek nerwowych. Równowaga ta jest ściśle kontrolowana przez ekspresję genów, która jest precyzyjnie dostrojona na wielu poziomach, w tym transkrypcji, po transkrypcji i translacji. W związku z tym coraz więcej dowodów wskazuje na kluczową rolę regulacji translacyjnej w koordynowaniu decyzji dotyczących losu neuronalnych komórek macierzystych. Frakcjonowanie polisomów jest potężnym narzędziem do oceny statusu translacji mRNA zarówno na poziomie globalnym, jak i poszczególnych genów. W tym miejscu przedstawiamy wewnętrzny proces profilowania polisomów w celu oceny wydajności translacji w komórkach z rozwijającej się kory mózgowej myszy. Opisujemy protokoły przygotowania gradientu sacharozy, lizy tkanek, ultrawirowania i analizy stanu translacji mRNA opartej na frakcjonowaniu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas rozwoju mózgu ssaków, nerwowe komórki macierzyste namnażają się i różnicują, tworząc neurony i glej1,2 . Zaburzenia tego procesu mogą prowadzić do zmian w strukturze i funkcjonowaniu mózgu, co można zaobserwować w wielu zaburzeniach neurorozwojowych3,4. Prawidłowe zachowanie nerwowych komórek macierzystych wymaga zaaranżowanej ekspresji określonych genów5. Podczas gdy kontrola epigenetyczna i transkrypcyjna tych genów była intensywnie badana, ostatnie odkrycia sugerują, że regulacja genów na innych poziomach również przy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Całe wykorzystanie zwierząt było nadzorowane przez Komitet Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Calgary. Myszy CD1 użyte w eksperymencie zostały zakupione od komercyjnego dostawcy.

1. Przygotowanie roztworów

UWAGA Aby zapobiec degradacji RNA, spryskaj stół warsztatowy i wszystkie urządzenia roztworem do dekontaminacji RNazy. W eksperymencie używane są końcówki wolne od RNaz. Wszystkie roztwory przygotowuje się w wodzie wolnej od RNaz.

  1. Przygotować roztwór podstawowy cykloheksymidu (100 mg/ml) w DMSO i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować 2,2 M roztwór podstawowy sacharozy, dod....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako demonstracja, lizat korowy zawierający 75 μg RNA (zebrany z 8 zarodków) został podzielony przez gradient sacharozy na 12 frakcji. Piki absorbancji UV przy 254 nm zidentyfikowały frakcje zawierające podjednostkę 40S, podjednostkę 60S, monosom 80S i polisomy (Rysunek 4A). Analiza frakcji metodą western blot dla dużej podjednostki rybosomalnej, Rpl10 wykazała jej obecność w podjednostce 60S (frakcja 3), monosomach (frakcja 4) i polisomach (frakcje 5-12) (Rysunek 4B). W przeciwień.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Profilowanie polisomów jest powszechnie stosowaną i skuteczną techniką oceny stanu translacji zarówno na poziomie pojedynczego genu, jak i całego genomu14 . W niniejszym raporcie przedstawiamy protokół profilowania polisomów z wykorzystaniem domowej platformy i jej zastosowania do analizy rozwijającej się kory myszy. Ta ekonomiczna platforma jest łatwa w montażu i generuje solidne, powtarzalne gradienty sacharozy i profilowanie polisomów z wysoką czułością.

Warto zauważ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 dla G.Y.). G.Y. jest Kanadyjskim Kierownikiem Badań. S.K. został ufundowany przez Mitacs Globalink Graduate Fellowship i ACHRI Graduate Student Scholarship.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5 ml mikroprobówki bez RNAAxygenMCT-150-C
10 cm naczynieGreiner-Bio664160
1M MgCl2InvitrogenAM9530G
igła 21-23GBD305193
2M KClInvitrogenAM8640G
30 mL strzykawkaBD302832
koniec igłaVWR20068-781
Płytka stykowaThorlabsMB2530/M
Bromofenol niebieskiSigma115-39-9
Mysz CD1 CharlesRiver Laboratory Kleszczyki
z zakrzywioną końcówkąSigma#Z168785
CykloheksymidSigma66-81-9
Oprogramowanie do akwizycji danych TracerDAQMeasurement Computing
KonwerterMeasurement ComputingUSB-1208LS
Zestaw do miniprepu Direct-zol RNAZymoR2070
Dithiothreitol (DTT)Bio-basic12-03-3483
DMSOBioshop67-68-5
Kleszcze Dumont No.5Sigma#F6521
Kolektor frakcjiBio-RadModel 2110
HBSSŻubr311-513-CL
Siłownik stopnia liniowegoRattmmotorCBX1605-100A
Kontrola lucyferazy RNAPromegaL4561
Maxima zestaw do syntezy pierwszej nici cDNAThemo FisherM1681
Miniaturowy zacisk V-clampThorlabsVH1/M
Podstawa uchwytu postumentu serii MiniThorlabsMBA1
NaClBio-basic7647-14-5
Podłoże neurobazalneGibco21103-049
Słupek aluminiowy 12,7 mmThorlabsTRA150/M Parafilm
BemisPM992
PerfeCTa SYBR zielony fastmixQuanta BioCA101414-274
Solanka buforowana fosforanami (PBS)Żubr311-010-CL
PuromycinBioshop58-58-2
Klema kątowaThorlabsRA90/M
Kąt prosty i Oslash; 1/2" na Ø Zacisk słupkowy 6 mmThorlabsRA90TR/M Rnase
AWAYMolecular BioProducts7002
Końcówki bez RNazFrogga BioFT10, FT200, FT1000
Woda bez RNazŻubr809-115-CL
RNasinPromegaN2111
Wąski kątownikThorlabsAB90B/M
Mały zacisk V-clampThorlabsVC1/M
Deoksycholan soduSigma302-95-4
Sterownik silnika krokowegoSongHeTB6600
SacharozaBioshop57501
SW 41 Ti rotorBeckman Coulter331362
Pompa strzykawkowaHarvard Apparatus70-4500
Pompa strzykawkowaHarvard Apparatus70-4500
Triton-X-100Bio-basic9002-93-1
TrizolThermofisher Scientific15596018
Przekłuwacz rurkowyBrandelBR-184
UltrawirówkaBeckman CoulterL8-70M
Probówki ultrawirówkoweBeckman Coulter331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7,5Invitrogen15567-027
Zestaw startowy projektu UNOElegooEL-KIT-003
Monitor UVBio-RadEM-1 Econo
Wspornik pionowyThorlabsVB01A/M
cyfrowy Płytka stykowa serii Mini Thorlabs MSB7515/M Słupek optyczny serii Mini Thorlabs MS2R/M Ø

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
  2. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polysome ProfilingTranslational RegulationMouse Brain DevelopmentSucrose GradientNeural Stem CellsmRNA TranslationUltracentrifugationFraction CollectionRibosomal SubunitsWestern Blot

Related Articles