Method Article

Wydajne i skalowalne wytwarzanie ludzkich astrocytów brzusznego śródmózgowia z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/62095

⸱

October 2nd, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy metodę powtarzalnego generowania astrocytów z brzusznego śródmózgowia z hiPSC oraz protokoły ich charakterystyki w celu oceny fenotypu i funkcji.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W chorobie Parkinsona postępująca dysfunkcja i degeneracja neuronów dopaminowych w brzusznej części śródmózgowia powoduje objawy zmieniające życie. Zwyrodnienie neuronów ma różne przyczyny w chorobie Parkinsona, w tym niekomórkowe mechanizmy autonomiczne, w których pośredniczą astrocyty. W całym OUN astrocyty są niezbędne do przetrwania i funkcjonowania neuronów, ponieważ utrzymują homeostazę metaboliczną w środowisku nerwowym. Astrocyty oddziałują z komórkami odpornościowymi OUN, mikrogleju, aby modulować zapalenie nerwów, które obserwuje się od najwcześniejszych stadiów choroby Parkinsona i ma bezpośredni wpływ na postęp jej patologii. W chorobach z przewlekłym elementem neurozapalnym, w tym w chorobie Parkinsona, astrocyty nabywają fenotyp neurotoksyczny, a tym samym nasilają neurodegenerację. W związku z tym astrocyty są potencjalnym celem terapeutycznym w celu spowolnienia lub zatrzymania choroby, ale będzie to wymagało głębszego zrozumienia ich właściwości i roli w chorobie Parkinsona. W związku z tym pilnie potrzebne są dokładne modele astrocytów śródmózgowia ludzkiego do badań in vitro.

Opracowaliśmy protokół do generowania wysokiej czystości kultur astrocytów specyficznych dla brzusznego śródmózgowia (vmAstros) z hiPSC, które mogą być wykorzystane do badań nad chorobą Parkinsona. vmAstros może być rutynowo produkowany z wielu linii hiPSC i wyrażać specyficzne markery astrocytowe i brzuszne śródmózgowia. Protokół ten jest skalowalny, a zatem nadaje się do zastosowań o wysokiej przepustowości, w tym do badań przesiewowych leków. Co najważniejsze, vmAstros pochodzące z hiPSC wykazują cechy immunomodulacyjne typowe dla ich odpowiedników in vivo, umożliwiając mechanistyczne badania sygnalizacji neurozapalnej w chorobie Parkinsona.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona dotyka 2%-3% osób powyżej 65 roku życia, co czyni ją najbardziej rozpowszechnionym neurodegeneracyjnym zaburzeniem ruchowym1. Jest to spowodowane degeneracją neuronów dopaminowych brzusznej części śródmózgowia w obrębie istoty czarnej, co skutkuje wyniszczającymi objawami motorycznymi, a także częstymi problemami poznawczymi i psychiatrycznymi2. Patologia Parkinsona charakteryzuje się agregatami białka, α-synukleiny, które są toksyczne dla neuronów i powodują ich dysfunkcję i śmierć1,2,3. Ponieważ neurony dopaminergiczne są populacją degenerującą się w chorobie Parkinsona, historycznie były one przedmiotem badań. Oczywiste jest jednak, że inny typ komórek w mózgu, astrocyty, również wykazują nieprawidłowości w chorobie Parkinsona i uważa się, że przyczyniają się do degeneracji w modelach choroby Parkinsona 4,5,6,7.

Astrocyty to heterogeniczna populacja komórek, która może przekształcać się zarówno fizycznie, jak i funkcjonalnie, w zależności od potrzeb. Wspierają funkcje i zdrowie neuronów poprzez mnóstwo mechanizmów, w tym modulację sygnalizacji neuronalnej, kształtowanie architektury synaptycznej i troficzne wsparcie populacji neuronów poprzez wydzielanie określonych czynników6,8,9,10. Jednak astrocyty odgrywają również istotną rolę immunomodulacyjną, integralną z rozwojem i rozprzestrzenianiem się zapalenia układu nerwowego10,11. Zapalenie nerwów obserwuje się w mózgach pacjentów z chorobą Parkinsona, a ostatnio wykazano, że znacznie zapobiega wystąpieniu objawów choroby Parkinsona12,13,14,15, zajmując tym samym centralne miejsce w badaniach nad chorobą Parkinsona.

Na poziomie komórkowym mówi się, że astrocyty stają się reaktywne w odpowiedzi na uraz, infekcję lub chorobę, co jest próbą ułatwienia neuroprotekcji9,6,10,16. Reaktywność opisuje zmianę w fenotypie astrocytów charakteryzującą się zmianami w ekspresji genów, sekretomie, morfologii i mechanizmach usuwania resztek komórkowych i toksycznych produktów ubocznych9,10,11,17. To reaktywne przesunięcie następuje w odpowiedzi na sygnały indukcyjne z mikrogleju, który jest komórkami odpornościowymi OUN i pierwszymi reakcjami na urazy i choroby9. Zarówno astrocyty, jak i mikroglej reagują na sygnały zapalne, moderując własne funkcje i mogą przekazywać sygnały zapalne, a tym samym bezpośrednio wpływać na zapalenie nerwów9,10. Jednak przewlekły charakter choroby Parkinsona powoduje przejście, w którym reaktywne astrocyty stają się toksyczne dla neuronów i same sprzyjają zwyrodnieniu i patologii chorobowej6,9,10,18,19. Co istotne, niedawno wykazano, że blokowanie transformacji astrocytów w reaktywny fenotyp neurotoksyczny zapobiega postępowi choroby Parkinsona w modelach zwierzęcych11. Reaktywność astrocytów w paradygmacie zapalenia nerwów stała się zatem głównym przedmiotem badań nad chorobą Parkinsona i podobnie odnosi się do szerokiego spektrum chorób OUN. Razem odkrycia te budują obraz znaczącego udziału astrocytów w etiologii choroby Parkinsona, podkreślając potrzebę dokładnych modeli badawczych, które podsumowują fenotyp ludzkich populacji astrocytów, które są zaangażowane w chorobę Parkinsona.

W mózgu embrionalnym, najpierw pojawiają się neurony, z linią astroglejową, czyli astrocytami i oligodendrocytami, pojawiając się później w fazie rozwoju6. Badania in vivo i in vitro zwróciły uwagę na szereg szlaków sygnałowych, które wydają się kontrolować siłę działania nerwowych komórek progenitorowych od pochodnych neuronalnych po astroglejowe. W szczególności sygnalizacja JAK/STAT, EGF i BMP odgrywa rolę w proliferacji, różnicowaniu i dojrzewaniu astrogleju20,21. Szlaki te były przedmiotem protokołów in vitro do generowania astrocytów z komórek pluripotencjalnych, w tym hiPSC6,22,23. Było wiele udanych przykładów generowania astrocytów z hiPSCs6,24,25. Oczywiste jest jednak, że astrocyty in vivo w OUN posiadają specyficzne tożsamości regionalne, które odnoszą się bezpośrednio do ich funkcji, zgodnie ze specyficznymi wymaganiami tych astrocytów w stosunku do ich wyspecjalizowanych sąsiadów neuronalnych17,24,25,26. Na przykład, odnosząc się konkretnie do brzusznej części śródmózgowia, wykazano, że astrocyty w tym regionie wyrażają określone zestawy białek, w tym receptory dopaminy umożliwiające komunikację z lokalną populacją neuronów dopaminowych śródmózgowia26. Co więcej, astrocyty brzusznej części śródmózgowia wykazują unikalne właściwości sygnalizacyjne26. Dlatego, aby zbadać rolę astrocytów brzusznego śródmózgowia w chorobie Parkinsona, potrzebujemy modelu in vitro, który odzwierciedla ich unikalny zestaw cech.

Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy protokół do generowania astrocytów brzusznych śródmózgowia (vmAstros) z hiPSC. Powstałe w ten sposób vmAstros wykazują cechy swoich brzusznych odpowiedników w śródmózgowiu in vivo, takie jak ekspresja określonych białek, a także funkcje immunomodulacyjne. Przedstawione wyniki pochodzą z różnicowania linii hiPSC NAS2 i AST23, które zostały nam wyprowadzone i podarowane przez dr Tilo Kunath27. NAS2 został wygenerowany od zdrowego podmiotu kontrolnego, podczas gdy AST23 pochodzi od pacjenta z chorobą Parkinsona z potrójną replikacją locus kodującego α-synukleinę (SNCA). Te linie hiPSC zostały wcześniej scharakteryzowane i wykorzystane w wielu opublikowanych pracach naukowych, w tym do generowania różnych typów komórek nerwowych27,28,29,30,31.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rozmrażanie, konserwacja i kriokonserwacja ludzkiej linii hiPSC

  1. W celu powlekania płytek hodowlanych hiPSC należy rozcieńczyć witronektynę do 5 μg/ml (1:100) w PBS w stężeniu 1 ml na 10cm2 powierzchni płytki do hodowli komórkowej. Pozostawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Usunąć witronektynę i natychmiast przystąpić do dodawania hiPSC/pożywki do płytki hodowlanej.
    UWAGA Podczas usuwania witronektyny z płytki ważne jest, aby powierzchnia hodowli nie mogła wyschnąć.
  3. W celu rozmrożenia hiPSC należy usunąć kriowiale zawierające hiPSC z ciekłego azotu i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do momentu całkowitego rozmrożenia zawartości.
  4. Przygotuj 9 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych (np. E8 lub E8 Flex) zawierającej 1x suplement komórkowy (np. Revitacell). Dodać 1 ml kroplami do zawartości kriowialu. Umieść pozostałe 8 ml pożywki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj do niej rozcieńczoną zawartość kriowialu.
    UWAGA: Nie rozcierać zawartości.
  5. Wirować przy 150 x g przez 3 min. Odessać ciecz bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości pożywki do hodowli komórkowych (np. E8 lub E8 Flex) zawierającej 1x suplement komórkowy (np. Revitacell). Na przykład 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej.
  6. Dodać zawieszone hiPSC do naczyń pokrytych witronektyną i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .
    UWAGA: hiPSC powinny zacząć przyczepiać się do wyrobów z tworzywa sztucznego pokrytego witronektyną w ciągu 30 min-2 godzin po rozmrożeniu.
  7. Utrzymuj hiPSC w pożywce do hodowli komórkowych (np. E8 lub E8 Flex). Codziennie podawaj komórki poprzez wymianę pożywki. Zawsze podgrzewaj pożywkę hodowlaną przez 30 minut przed karmieniem.
    UWAGA W przypadku korzystania z E8 Flex, hiPSC nie wymagają wymiany pożywek co 24 godziny, a w razie potrzeby przyrosty podawania można wydłużyć do 48 godzin. Zarówno pożywki E8 Flex, jak i E8 dają równie wysokiej jakości kultury hiPSC. Komórki HiPSC należy hodować przez co najmniej 14 dni po rozmrożeniu, a przed rozpoczęciem etapów różnicowania. Wydaje się, że okresy hodowli krótsze niż 14 dni mają negatywny wpływ na przeżywalność hiPSC w początkowym okresie różnicowania. Przejście hiPSC przy około 80% zbiegalności (Rysunek 1A: 3-4 dniowy interwał przejścia).
  8. Na 1 godzinę przed rozpoczęciem dodać 1x suplement komórkowy (np. Revitacell) do hodowli hiPSC.
  9. Przemyj hiPSC raz PBS (bez wapnia i magnezu) i dodaj 0,5 mM EDTA (rozcieńczony z zapasu w PBS bez wapnia i magnezu).
  10. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub do momentu, gdy hiPSC zaczną się od siebie odłączać i nabierać bardziej zaokrąglonego wyglądu, przy czym granice każdego iPSC będą jaśniejsze pod mikroskopem jasnego pola.
  11. Dodać 200 μl EDTA do skoncentrowanego obszaru hiPSC za pomocą pipety. Jeśli łatwo się odłączają, tworząc wolną przestrzeń w warstwie komórek, są gotowe do zbioru. Jeśli nie odłączają się łatwo, pozostaw w EDTA i powtórz po 1 minutach.
  12. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, delikatnie usuń EDTA i za pomocą pipety delikatnie przemyj hiPSC dwukrotnie pożywką do hodowli komórkowych (np. E8 lub E8 Flex).
    UWAGA: Aby osiągnąć to bez odrywania się hiPSC, przechyl płytkę i dodawaj pożywkę kroplami po boku płytki hodowlanej.
  13. Do pobrania hiPSC należy użyć 1 ml pożywki do hodowli komórkowych (np. E8 lub E8 Flex) zawierającej 1x suplement komórkowy (np. Revitacell). Uwolnij pożywkę bezpośrednio na warstwę hiPSC, a komórki powinny się odczepić. W razie potrzeby powtórzyć z kolejnym 1 ml pożywki.
  14. Obejrzyj hiPSC pod mikroskopem. Idealnie byłoby, gdyby hiPSC pojawiały się w stosunkowo jednorodnych klastrach, jak pokazano na rysunku Rysunek 1B. Jeśli klastry hiPSC są znacznie większe lub mają bardzo różną wielkość, użyj pipety, aby rozbić większe klastry hiPSC (Rysunek 1B).
    UWAGA: Nie należy nadmiernie rozcierać hiPSC. Chociaż suplement zwiększa ogólną przeżywalność komórek, nadmierne roztarcie negatywnie wpływa na przeżycie hodowli hiPSC. Zalecane są 1-4 przejścia pipetą.
  15. Za pomocą pipety serologicznej przenieść zawiesinę hiPSC na płytkę pokrytą witronektyną, jak przygotowano w kroku 1.1. Umieścić kulturę hiPSC z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .
    UWAGA: Kriokonserwuj hiPSC przy około 80% konfluencji.
  16. Na 1 godzinę przed rozpoczęciem dodać 1x suplement komórkowy (np. Revitacell) do hodowli hiPSC.
  17. Odłączyć hiPSC od płytek hodowlanych za pomocą 0,5 mM EDTA, jak opisano w kroku 1.4, zbierając komórki w pożywce do hodowli komórkowej (np. E8 lub E8 Flex) zawierającej 1x suplement komórkowy (np. Revitacell). Wirować przy 150 x g przez 3 min.
  18. Zawiesić granulowane hiPSC w pożywkach do zamrażania komórek (patrz tabela materiałów). Użyć 700 μl na 10 cm2 obszar hodowli, co odpowiada 1 kriowialnemu komórkom na studzienkę 6-dołkowej płytki.
  19. Przenieść kriowiale do odpowiedniego naczynia do zamrażania komórek (szczegóły patrz Tabela materiałów).
  20. Przenieść naczynie do zamrażarki o temperaturze -80 °C na 24 godziny. Po 24 godzinach kriowiale można przenieść do ciekłego azotu (-196 °C) w celu długotrwałego przechowywania.

2. Protokół różnicowania vmAstro

UWAGA: Schematyczne podsumowanie protokołu różnicowania vmAstros jest pokazane w Rysunek 1A. Szczegółowy wykaz odczynników wymaganych do sporządzenia protokołu i ich przygotowania znajduje się w tabeli 1.

  1. Indukcja vmNPCs
    UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany, aby rozpocząć się od minimum z 1x dołkiem 6-dołkowej płytki (10 cm2) o konfluencji hiPSC 70%-80%, czyli około 4-5 x 104 komórek/cm2 (Rysunek 1B)30. Początkowa liczba komórek i gęstość muszą być zoptymalizowane dla każdej linii hiPSC, ponieważ znacząco wpływają na przeżywalność i efektywność różnicowania.
    1. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z hiPSC i przemyć 3x w DMEM/F12 + glutamax. Zastąp pożywkę 2 ml pożywką indukcyjną vmNPC (N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH(C24ii) + LDN193189. Patrz Tabela 1 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat przygotowania pożywek i odczynników).
    2. Karma co drugi dzień z połową wymiany pożywki po 24 godzinach i pełną wymianą pożywki po 48 godz. UWAGA: Po 3-4 dniach kultura vmNPC będzie wymagała pasażowania. Zalecany jest standardowy współczynnik przejścia 1:3 lub 1:4 - należy go zoptymalizować dla każdej używanej linii hiPSC.
    3. 1 godzinę przed pasażacją dodać 1x suplement komórkowy (np. Revitacell) do vmNPC i przygotować 1x plastik do hodowli tkankowych pokryty matrycą błony podstawnej (np. Geltrex) (sekcja 2.2 Przygotowanie matrycy błony podstawnej i powlekanie plastiku hodowlanego rissue).
    4. Wyjmij pożywkę z vmNPC i umyj 2x za pomocą D-PBS. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu do oddzielania komórek (np. Accutazy) na 10cm2 obszar hodowli (1 ml na dołek na płytce 6-dołkowej).
    5. Umieścić w temperaturze 37 °C na 1 minutę, a następnie zbadać vmNPC za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.
      UWAGA: vmNPC zaczną się zaokrąglać, ich procesy zostaną cofnięte, a w warstwie komórkowej pojawią się luki. Może to zająć od 1 do 3 minut, w zależności od gęstości komórek.
    6. Gdy vmNPC przybiorą taki wygląd, dodaj 100 μl roztworu do oddzielania komórek (np. Accutase) na warstwę vmNPCs.
      UWAGA: Jeśli vmNPC są gotowe do odłączenia, pojawi się w warstwie komórek. Jeśli tak się nie stanie, vmNPC wymagają dalszej inkubacji z roztworem do odłączania komórek.
    7. Jeśli vmNPC łatwo się odłączają, delikatnie usuń roztwór do odłączania komórek i umyj vmNPC 2x pożywką N2B27. Delikatnie dodaj pożywkę N2B27 po boku studzienki lub naczynia hodowlanego i delikatnie zamieszaj, aby przepłukać, upewniając się, że vmNPC nie odczepiają się.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać szybko, aby upewnić się, że vmNPC nie przyczepią się ponownie do powierzchni komórki. Jeśli vmNPC zaczną odrywać się na etapach mycia, należy je zebrać przez wirowanie w stężeniu 150 x g przez 3 minuty. vmNPC nie są standardowo odwirowywane podczas przechodzenia, ponieważ może to zmniejszyć ich przeżywalność.
    8. Na koniec usuń vmNPC za pomocą pipety, energicznie wyrzucając pożywkę indukcyjną vmNPC zawierającą 1x suplement komórkowy (np. Revitacell) bezpośrednio na warstwę komórkową. Powinno to usunąć vmNPC, które można następnie przenieść bezpośrednio do nowych, powlekanych matrycowo naczyń hodowlanych.
      UWAGA: Nie należy ponownie używać pożywek zawierających już zawieszone vmNPC do usuwania kolejnych komórek, ponieważ spowoduje to ich nadmierne rozproszenie, co zmniejsza ich przeżywalność.
    9. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 . vmNPC powinny zacząć przyczepiać się do powierzchni pokrytej matrycą po 20-30 minutach. Po 24 godzinach należy wymienić połowę pożywki na świeżą pożywkę indukcyjną vmNPC (bez dodatku do komórek) i kontynuować schemat karmienia jak wcześniej.
    10. Kontynuuj reżim karmienia i pasażowania przez 10 dni.
  2. Przygotowanie matrycy błony podstawnej i powlekanie hodowli tkankowej plastic
    UWAGA: Do konserwacji vmNPC stosuje się 1x matrycę membrany podstawnej (np. Geltrex) do powlekania wyrobów z tworzyw sztucznych. Do utrzymania vmAPC lub vmAstros można użyć 0,25x macierzy błony podstawnej.
    1. Wyjmij bulion z membraną podstawną z zamrażarki w temperaturze -80 °C i umieść na noc w lodówce o temperaturze 4 °C do rozmrożenia.
    2. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 lodowatym DMEM/F12 + glutamax, podwielokrotnością i przechowywać w temperaturze -80 °C jako 10x bulion.
    3. Podczas powlekania wyrobów z tworzyw sztucznych rozcieńczyć ten 10x do 1x (dla vmNPC) lub 0,25x (dla vmAPC lub vmAstros) za pomocą lodowatego DMEM/F12 + glutamax.
    4. Natychmiast dodać do plastiku do hodowli tkankowej w ilości 1 ml na 10 cm2, na przykład 1 ml na zagłębienie płytki 6-dołkowej.
    5. Umieszczać w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Roztworu matrycy membrany podstawnej nie należy wyjmować z tworzywa sztucznego, dopóki nie będzie gotowy do dodania mediów/komórek, aby zapewnić, że powlekane naczynia z tworzywa sztucznego nie wyschną. Płytki pokryte matrycą nie wymagają mycia przed dodaniem komórek.
  3. Rozbudowa vmNPC
    1. W 10 dniu protokołu należy zastąpić pożywkę indukcyjną pożywką ekspandacyjną vmNPC (N2B27 + GDNF + BDNF + kwas askorbinowy. Patrz Tabela 1 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat przygotowania pożywek i odczynników).
      UWAGA: vmNPC nie wymagają dodawania mitogenów w celu wywołania proliferacji. BDNF, GDNF i kwas askorbinowy wspomagają przetrwanie i utrzymanie vmNPCs30.
    2. Karma co drugi dzień z połową wymiany pożywki po 24 godzinach i pełną wymianą pożywki po 48 godz. UWAGA: Po 3-4 dniach kultura vmNPC będzie wymagała pasażowania. W przypadku pasażu zalecany jest standardowy współczynnik przejścia 1:3 lub 1:4 (należy go zoptymalizować dla każdej używanej linii hiPSC). Określ stosunek, który zapewnia najlepszą przeżywalność, proliferację i generowanie vmNPC).
    3. 1 godzinę przed pasażowaniem dodać 1x suplement komórkowy (np. Revitacell) do vmNPC i przygotować 1x płytki/kolby pokryte matrycą wcześniej (sekcja 2.2 Przygotowanie matrycy błony podstawnej i powlekanie plastiku hodowlanego). Podgrzej roztwór do oddzielania komórek (np. Accutase) do 37 °C. Podgrzej świeżą pożywkę ekspandującą vmNPC zawierającą 1x suplement komórkowy (np. Revitacell).
    4. Usuń pożywkę z vmNPC i umyj 2x za pomocą D-PBS. Dodać 1 ml roztworu do oddzielania komórek (np. Accutase) na 10cm2 obszar hodowli (1 ml na dołek na płytce 6-dołkowej). Umieścić w temperaturze 37 °C na 1 minutę, a następnie zbadać vmNPC za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.
      UWAGA: vmNPC zaczną się zaokrąglać, ich procesy zostaną cofnięte, a w warstwie komórkowej pojawią się luki. Może to zająć od 1 do 3 minut, w zależności od gęstości komórek.
    5. Gdy vmNPC nabierze zaokrąglonego wyglądu, dodaj 100 μl roztworu do oddzielania komórek (np. Accutase) na warstwę vmNPCs.
      UWAGA: Jeśli vmNPC są gotowe do odłączenia, pojawi się w warstwie komórek. Jeśli tak się nie stanie, vmNPC wymagają dalszej inkubacji z roztworem do odłączania komórek.
    6. Jeśli vmNPC łatwo się odłączają, delikatnie usuń roztwór odłączający komórki i umyj vmNPC 2x pożywką N2B27. Delikatnie dodaj pożywkę N2B27 po boku studzienki lub naczynia hodowlanego i delikatnie zamieszaj, aby przepłukać, upewniając się, że vmNPC nie odczepiają się.
      UWAGA: Jeśli vmNPC zaczną odrywać się w dużych ilościach na etapach mycia, należy je zebrać przez wirowanie w stężeniu 150 x g przez 3 minuty. vmNPC nie są standardowo odwirowywane podczas przechodzenia, ponieważ może to zmniejszyć ich przeżywalność. Ten krok należy wykonać szybko, aby upewnić się, że vmNPC nie przyczepią się ponownie do powierzchni komórki.
    7. Usuń vmNPC za pomocą pipety i energicznie wyrzuć pożywkę ekspandującą vmNPC zawierającą 1x suplement komórkowy (np. Revitacell) bezpośrednio na warstwę komórkową. Powinno to usunąć vmNPC, które można następnie przenieść bezpośrednio do wstępnie przygotowanych płytek/kolb pokrytych matrycą (patrz sekcja 2.2 "Przygotowanie matrycy błony podstawnej i powlekanie tworzywa sztucznego do hodowli tkankowych").
      UWAGA: Nie należy ponownie używać pożywek zawierających już zawieszone vmNPC do usuwania kolejnych komórek, ponieważ spowoduje to ich nadmierne rozproszenie, co zmniejsza ich przeżywalność.
    8. Wymienić w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 . vmNPC powinny zacząć przyczepiać się do powierzchni pokrytej matrycą po 20-30 minutach. Po 24 godzinach zastąp połowę pożywki hodowlanej świeżą pożywką ekspansywną vmNPC (bez dodatku komórkowego) i kontynuuj poprzedni schemat karmienia.
    9. Kontynuuj ten reżim karmienia i pasażowania przez 10 dni. vmNPC można rozszerzać do 50 dnia.
  4. Różnicowanie i rozbudowa vmAPCs
    UWAGA: vmNPC mogą być z powodzeniem używane do generowania vmAPCs/vmAstros w dowolnym miejscu od 30 do 50 dni od początkowego etapu hiPSC (Rysunek 1A).
    1. Weź zlewającą się kulturę vmNPC i umyj vmNPC 3x w zaawansowanym DMEM/F12, aby usunąć ślady składników pożywki ekspandującej vmNPC. Wymień nośnik na nośnik rozszerzający vmAPC (ASTRO media +EGF +LIF. Patrz Tabela 1 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat przygotowania pożywek i odczynników).
    2. Po upływie 72 godzin kultura vmNPC jest w wysokim stosunku (1:7,5). Na przykład, zakładając, że vmNPC były utrzymywane w pojedynczym dołku na płytce 6-dołkowej, powinny teraz zostać przeniesione do kolby o średnicy 75 cm2 pokrytej 1x matrycą (pokrytej zgodnie z opisem w sekcji 2.2 "Przygotowanie matrycy błony podstawnej i powlekanie plastiku do hodowli tkankowej"). Pasaż przy użyciu roztworu do odłączania komórek, zgodnie z opisem dla vmNPC w sekcji 2.3 "Ekspansja vmNPC".
    3. Ponownie zawiesić vmNPC w odpowiedniej objętości pożywki rozszerzającej vmAPC (7,5-15 ml pożywki na 75 cm2 kolba. Uzupełniaj wymianę pożywki co 3 dni lub zgodnie z wymaganiami komórek.
      UWAGA: Od tego momentu vmNPC są określane jako vmAPC i powinny być pasażowane jako pojedyncze komórki, a nie klastry komórek. vmAPC powinny być przepasywane co 3-7 dni lub w trakcie zlewania się, aby uniknąć nadmiernego zlewania się. Od tego momentu do powlekania wyrobów z tworzyw sztucznych należy stosować zredukowane stężenie matrycy 0,25x (jak opisano w sekcji 2.2 Przygotowanie matrycy błony podstawnej i powlekanie plastiku do hodowli tkankowych).
    4. Rozwijaj vmAPC aż do osiągnięcia 90 dnia (od etapu hiPSC), kriokonserwując vmAPC w różnych momentach ich ekspansji.
  5. Generowanie dojrzałych vmAstros z vmAPCs
    UWAGA: Na tym etapie vmAPC można hodować w kolbach do hodowli tkankowych o długości 175cm2. Może to zostać rozszerzone w celu generowania dużej liczby dojrzałych vmAstros.
    1. Gdy vmAPC osiągną 80% konfluencji, przemyj 3x pożywką ASTRO i zastąp pożywką do dojrzewania vmAstros (pożywka ASTRO +BMP4 +LIF. Patrz Tabela 1 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat przygotowania pożywek i odczynników).
    2. Przeprowadzaj pełną wymianę pożywki co 3 dni lub w zależności od potrzeb komórek przez 10 dni.
      UWAGA: a) W tym momencie charakterystyka wskazuje, że vmAstros są dojrzałe, co potwierdza immunocytochemia (Rysunek 2G - I) oraz analiza ekspresji genów (manuskrypt w przygotowaniu). b) vmAstros stosowany bezpośrednio po dojrzewaniu powinien być ponownie posiany na nowo przygotowanej powierzchni pokrytej matrycą. Utrzymywanie vmAPC lub vmAstros na tej samej powierzchni hodowli przez ponad 14 dni może prowadzić do nieoptymalnych hodowli, w których komórki zaczynają się kurczyć, a nawet odklejać. c) W przypadku zastosowań badających modulację neurozapalną, BMP i LIF są usuwane 72 godziny przed stymulacją neurozapalną. Ma to na celu uniknięcie potencjalnej interakcji między sygnalizacją BMP/LIF a indukowaną sygnalizacją neurozapalną.
    3. vmAstros można teraz ponownie posiać do testów eksperymentalnych, na przykład na szkiełkach nakrywkowych do celów immunocytochemicznych lub kriokonserwować do przyszłych zastosowań (sekcje 3, 4).
      UWAGA: Na tym etapie protokołu pasażowanie nie powinno być konieczne, ponieważ proliferacja powinna następować tylko w bardzo niskim tempie. Zbyt gęsto posiane na tym etapie vmAPC utrzymują wyższy poziom proliferacji. W takim przypadku należy przejść i podzielić komórki, aby uzyskać gęstość, jak pokazano na Rysunek 1F.

3. Kriokonserwacja vmNPC, vmAPC i vmAstros

UWAGA: Kriokonserwacja vmNPCs/vmAPCs/vmAstros przy pełnej konfluencji.

  1. 1 godzinę przed rozpoczęciem dodaj 1x suplement komórkowy (np. Revitacell) do hodowli. Napełnić naczynie do krioprzechowywania (patrz Tabela materiałów) izopropanolem w temperaturze pokojowej.
  2. Odłączyć komórki od płytek hodowlanych za pomocą roztworu do oddzielania komórek, jak opisano wcześniej, zbierając komórki w odpowiednich podłożach (N2B27 lub pożywkach ASTRO) zawierających 1x suplement komórkowy (np. Revitacell). Wirować przy 150 x g przez 3 min.
  3. Zawiesić granulowane vmNPC/vmAPCs/vmAstros w objętościach pożywki do zamrażania komórek (patrz Tabela materiałów) w następujący sposób (kroki 3.3.1. - 3.3.3.)
    1. W przypadku vmNPC: użyć 700 μl na 10 cm2 obszar hodowli, do 1 kriowiala.
    2. W przypadku vmAPC: użyć 700 μl na 60cm2 obszaru hodowli, do 1 kriowialu (około 1/3 kolby hodowlanej T175).
    3. W przypadku vmAstros: ponownie umieścić w 2 ml pożywki i policzyć liczbę vmAstros. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić w pożywkach do zamrażania komórek (patrz Tabela materiałów) w liczbie na kriowial, odpowiedniej dla przyszłych zastosowań. Zakładając przybliżoną utratę komórek o 15% w wyniku zamrażania i rozmrażania, nowo rozmrożone vmAstros są liczone i powlekane 15% nadmiarem liczby komórek, aby skompensować śmierć komórki w procesie zamrażania i rozmrażania. Jest to zatem równoznaczne z 74 750 vmAstros nacm2. Rozmrożone vmAstros są przechowywane przez 72 godziny w pożywce ASTRO przed testem.
  4. Przenieść kriowiale do naczynia do zamrażania komórek (szczegóły patrz Tabela materiałów) i przenieść naczynie do zamrażania w temperaturze -80 °C na 24 godziny. Po 24 godzinach kriowiale można przenieść do ciekłego azotu (-196 °C) w celu długotrwałego przechowywania.

4. Charakterystyka fenotypu vmAstro

  1. Immunocytochemia
    1. Umieść 100-200 szkiełek nakrywkowych ze szkła 13 mm w szklanych szalkach Petriego na warstwie bibuły filtracyjnej i wysterylizuj je w suchym autoklawie.
    2. Przenieś szkiełka nakrywkowe do dołków z płytkami 4- lub 24-dołkowymi za pomocą sterylnych kleszczyków. Dodać 1x roztwór matrycowy (np. Geltrex) na szkiełka nakrywkowe w postaci kropelek o objętości 50 μl i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Przejście lub rozmrożenie vmAstros, ponowne zawieszenie w pożywce ASTRO i przeprowadzenie liczenia. Płytka vmAstros w ilości 25-100 000 komórek na szkiełko nakrywkowe w kropli o pojemności 50 μl.
    4. Usunąć matrycę z szkiełka nakrywkowego i natychmiast dodać vmAstros w kropli podłoża. Umieścić w temperaturze 37 °C na 30 minut, a następnie zalać studnie dodatkowymi 250 μl pożywki ASTRO.
      UWAGA: Jeśli przeprowadzasz immunocytochemię, aby po prostu sprawdzić ekspresję markerów astrocytów i śródmózgowia, vmAstros można naprawić 24 godziny po posiewie.
    5. Przygotować 4% roztwór formaldehydu, rozcieńczając 36% roztwór formaldehydu 1:9 w D-PBS.
    6. Umyj vmAstros 1x za pomocą D-PBS. Natychmiast dodaj 4% formaldehydu do studzienek i pozostaw w temperaturze pokojowej na 10 minut.
    7. Usuń formaldehyd i zastąp go D-PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub przejść do immunocytochemii.
    8. Szkiełka nakrywkowe myć w studzienkach 3x za pomocą D-PBS. Przepuszczać i blokować w 10% koziej surowicy, 1% BSA w 0,1% PBTx (D-PBS + 1:1000 Triton-X) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    9. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe (tabela materiałów) w 1% surowicy koziej, 0,1% BSA w 0,1% PBTx (D-PBS + 1:1000 Triton-X) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na bujaku.
    10. Następnego dnia należy usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć szkiełka nakrywkowe 3x preparatem D-PBS.
    11. Dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (tabela materiałów) w 1% surowicy koziej, 0,1% BSA w 0,1% PBTx i inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem na bujaku. Umyj szkiełka nakrywkowe 3x za pomocą D-PBS.
    12. Dodać roztwór DAPI (0,1 μg/ml DAPI w D-PBS) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min. Umyć szkiełka nakrywkowe 3x za pomocą D-PBS.
    13. Aby zamontować szkiełko nakrywkowe, dodać kroplę 5 μl podłoża montażowego Mowiol/DABCO [12% Mowiol (w/v), 12% glicerolu (w/v) rozpuszczone przez noc, mieszając w 0,2 M Tris (pH 8,5) z 25 mg/ml 1,4-diazabicylo[2.2.2]oktanu (DABCO)] do szklanego szkiełka mikroskopowego. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe ze studni; Przetrzyj krawędź szkiełka nakrywkowego na chusteczce, aby usunąć nadmiar płynu i umieść vmAstros stroną do dołu na kropli Mowiol/DABCO.
    14. Powtórzyć dla każdego szkiełka nakrywkowego i pozostawić do wyschnięcia na 8 godzin przed badaniem mikroskopowym.
  2. Pomiar ELISA wydzielania IL-6 przez vmAstros w odpowiedzi na leczenie cytokinami
    UWAGA: Po 10-dniowym dojrzewaniu z BMP4 i LIF, vmAstros należy pasażować, policzyć i posiać na 0,25-krotnie pokrytym matrycą plastikowym naczyniu do kultur tkankowych (jak opisano w sekcji 2.2 Przygotowanie macierzy błony podstawnej i powlekanie plastiku do hodowli tkankowych), w gęstości 65 000 vmAstros nacm2 w pożywce ASTRO. BMP4 i LIF należy usunąć z vmAstros 72 h przed leczeniem cytokinami, ponieważ aktywna sygnalizacja z tych czynników może zakłócać skuteczność leczenia cytokinami. Alternatywnie, kriokonserwowany vmAstros można rozmrozić i wykorzystać do testów.
    1. W dniu testu delikatnie przemyć vmAstros 3x w pożywkach bez redoks (DMEM/F-12 + glutamax + N2).
    2. Dla porównania użyj nieleczonej kontroli i dobrze traktowanej cytokinami. Dodaj wybraną cytokinę w optymalnym stężeniu. Dane w Rysunek 2J - L zostały wygenerowane przy użyciu IL-1α przy 3 ng/ml9 w pożywkach nieredoks w ilości 1 ml na 10 cm2 obszar hodowli komórkowej.
    3. Umieść vmAstros w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 na 24 godziny. Po 24 godzinach zebrać pożywkę hodowlaną do sterylnych probówek do mikrofuge.
    4. Jeśli test ELISA nie zostanie przeprowadzony natychmiast, należy zamrozić próbki pożywki, zanurzając probówki do mikrofuge w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy.
      UWAGA: Poniższy protokół jest zoptymalizowany specjalnie do użytku z zestawem IL-6 ELISA wyszczególnionym w Tabeli materiałów. Przeciwciała i wzorce dostarczone w postaci liofilizowanego proszku w nowym zestawie ELISA muszą zostać odtworzone przed pierwszym użyciem i podane do wykorzystania w przyszłości. Karta katalogowa dołączona do zestawu zawiera szczegółowe informacje na temat odczynników i objętości wymaganych do rozpuszczenia. Wychwytywane przeciwciało musi być odtworzone w PBS (bez białka nośnikowego).
    5. Wykonaj test ELISA na płytce 96-dołkowej i oblicz objętości odczynników zgodnie z użytymi studzienkami. W dniu testu ELISA przygotować przeciwciało wychwytujące, rozcieńczając zapas w stosunku 1:120 w PBS. Pokryć płytkę, ładując 50 μl przeciwciała wychwytującego do każdego dołka. Przykryj płytkę paskiem samoprzylepnym i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej.
    6. Następnego dnia umyj płytkę 3x preparatem D-PBS-Tween (D-PBS z 0,05% Tween-20), 100 μL na dołek. Osuszyć do sucha.
    7. Zablokuj płytkę, ładując 150 μL D-PBS/1% BSA na studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę. Umyj płytę zgodnie z opisem.
    8. Rozmrozić próbki na lodzie (może to zająć 1-2 godziny). Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:5, ładując 10 μl próbki i 40 μL D-PBS/1% BSA. Wirować każdą próbkę przed załadowaniem.
      UWAGA: Podczas przeprowadzania testu IL-6 ELISA konieczne jest rozcieńczenie próbek, należy zoptymalizować rozcieńczenia.
    9. Przygotować górny wzorzec (1,000 ρg/ml), rozcieńczając materiał w stosunku 1:180 w D-PBS/1% BSA. Przygotuj 7 wzorców, przeprowadzając seryjne rozcieńczanie najwyższego standardu. Wirować między każdym rozcieńczeniem.
    10. Dodać 50 μl wzorców/próbek do studzienek. Użyj D-PBS/1% BSA jako ślepej próby. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny na wytrząsarce orbitalnej, aby właściwie wymieszać rozcieńczone próbki. Umyć płytę zgodnie z opisem.
    11. Przygotować przeciwciało detekcyjne, rozcieńczając zapas w stosunku 1:60 w D-PBS/1% BSA. Załadować 50 μl przeciwciała detekcyjnego na studzienkę. Przykryć płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Umyć płytkę zgodnie z opisem.
    12. Przygotować streptawidynę sprzężoną z peroksydazą chrzanową (Strep-HRP), rozcieńczając materiał podstawowy w stosunku 1:40 w D-PBS/1% BSA. Załadować 50 μl Strep-HRP do dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności. Umyć płytę zgodnie z opisem.
    13. Reakcję barwy należy zainicjować, ładując 50 μl roztworu podłoża TMB do studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 20 minut (lub do momentu, gdy wzorce i próbki nabiorą niebieskiego koloru).
      UWAGA: TMB jest przechowywany w temperaturze 4 °C, ale powinien być używany w temperaturze pokojowej.
    14. Zatrzymać reakcję, dodając 25 μl roztworu zatrzymującego (1 M H2SO4) do studzienki i odnotować zmianę koloru z niebieskiego na żółty.
    15. Odczytać płytkę przy absorbancji 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Ustaw korekcję długości fali na absorbancję 540 nm, aby zmaksymalizować dokładność. Obliczyć stężenia białka w próbkach z otrzymanej krzywej wzorcowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodologia różnicowania i postęp<br /> W tym miejscu przedstawiamy szczegóły zarówno metod zastosowanych do generowania vmAstros, jak i protokołów wykorzystywanych do ich późniejszej charakterystyki fenotypowej. Metoda generowania vmAstros składa się z kilku odrębnych etapów różnicowania, które mogą być monitorowane za pomocą mikroskopii i identyfikacji różnych cech morfologicznych (Rysunek 1A-F). Hodowla hiPSC bez karmienia (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda generowania vmAstros z hiPSC jest bardzo wydajna, generując czyste kultury vmAstros i jest powtarzalna w przypadku generowania vmAstros z różnych linii hiPSC. Protokół ten został opracowany wokół rekapitulacji zdarzeń rozwojowych wymaganych w zarodku do prawidłowego wzorcowania rozwijającego się śródmózgowia i generowania astrocytów i obejmuje trzy zdefiniowane etapy: 1) neuronalną indukcję brzusznej śródmózgowia w celu wygenerowania vmNPC, 2) generowanie i ekspansję vmAPC i wreszcie 3) dojrzewanie vmAstros.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantu na projekt Parkinsona w Wielkiej Brytanii (G-1402) i stypendium. Autorzy dziękują Wolfson Bioimaging Facility za wsparcie i pomoc w tej pracy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Odczynniki
0,2M Tris-Cl (pH 8,5)n/dn/dSkłada się z zasady Tris i plus HCl
0,5M EDTA, PH 8ThermoFisher  15575-0201:1000 w D-PBS do 0,5 mM końcowy 
1,4-diazabicylo[2.2.2]oktan (DABCO)SigmaD27802-  25 mg/ml w roztworze montażowym Mowiol
13 mm szkiełka nakrywkoweVWR631-0149
2-merkaptoetanol (50 mM)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634010Ma 1x NEAA, ale dodajemy do końcowego stężenia 2x (0,2 mM)
Kwas askorbinowySigmaA5960200 mM zapas, 1:1000 do 200 &mikro; M final
B27 SuplementThermoFisher17504-04450x kolba
BSASigma5470
Media do zamrażania komórekSigmaC2874Cryostor CS10
Naczynie do zamrażania komórekNalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem13860,8 mM, rozcieńczenie 1:1000 do 0,8 &mikro; M final
Cryovials  SigmaCLS430487
DAPI SigmaD95421 mg/ml, 1:10 000 do 100 ng/ml końcowy (w PBS)
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS (D-PBS bez Mg lub Ca)ThermoFisher14190144pH 7,2
E8 Flex medium kitThermoFisherA2858501
Formaldehyd (36% roztwór)Sigma47608
GeltrexThermoFisherA14133021:100 lub 1:400 w lodowatym DMEM/F12
GlutamaxThermoFisher35050038zapas 2 mM (1:200 w N2B27, 1:100 w mediach ASTRO do 20 &mikro; M końcowy) 
GlicerolSigmaG5516
Ludzki BDNF  Peprotech450-0220 &mikro; g/ml zapasu, 1:1000 do 20 ng/ml końcowy
Human BMP4Peprotech120-0520 µ g/ml zapasu, 1:1000 do 20 ng/ml końcowy
ludzki EGFPeprotechAF-100-1520 &mikro; g/ml zapasu, 1:1000 do 20 ng/ml końcowy
ludzki GDNFPeprotech450-1020 &mikro; g/ml zapasu, 1:1000 do 20 ng/ml końcowy
roztwór insuliny ludzkiejSigma I9278Zapas 10 mg/ml, 1:2000 do 5 &mikro; g/ml final
Human LIFPeprotech300-0520 µ g/ml, 1:1000 do 20 ng/ml końcowy
zestaw IL-6 ELISABiotechneDY206
IsopropanolSigma  I9516-4LDo napełniania naczynia kriogenicznego Mr Frosty
LDN193189SigmaSML0559100 µ M stock, rozcieńczenie 1:10 000 do 10 nM final
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 SuplementThermoFisher17502048 100x kolba
NEAAThermoFisher1114003510 mM, 1:100 do 0,1 mM final 
Pożywka neuropodstawowaThermoFisher21103049
Normalna surowica koziaVector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501100x zapas, 1:100 do 1x końcowy
SB431542Tocris161410 mM, rozcieńczenie 1:1000 do 10 &mikro; M final
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 &mikro; g/ml zapasu, 1:1000 do 200 ng/ml końcowy
Tris-HClSigma PHG0002 
Triton-XSigmaX100
Tween-20Sigma P7949
VitronectinThermoFisherA147001:50 w D-PBS
strong>Przeciwciała do immunocytochemii  CompanyNumer katalogowyGatunek żywiciela
Przeciwciało przeciwko S100bSigmaSAB4200671Mouse; 1:200
Przeciwciało przeciwko FOXA2SCBTNB600501Mouse; 1:50
Przeciwciało przeciwko LMX1AProSci7087Rabbit; 1:300
Przeciwciało przeciwko LMX1AMilliporeAB10533Rabbit; 1:2000
Przeciwciało przeciwko LMX1BProteintech18278-1-APRabbit; 1:300
Przeciwciało przeciwko GLASTProteintech20785-1-APRabbit; 1:300
Przeciwciało przeciwko GFAPDakoZ0334Rabbit; 1:400
Przeciwciało przeciwko CD49fProteintech27189-1-APRabbit; 1:100
Przeciwciało przeciwko MSI1Abcamab52865Królik; 1:400
Alexa Fluor 488 Koza Anty-Królik ThermoFisherA32731Koza; 1:500
Alexa Fluor 488 Koza Anty-MyszThermoFisherA32723Koza; 1:500
Alexa Fluor 568 Koza Anty-KrólikThermoFisherA11036Koza; 1:500
Alexa Fluor 488 Koza Anty-MyszThermoFisherA11031Koza; 1:500
<

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  2. Lees, A. J., Hardy, J., Revesz, T. Parkingson's disease. Lancet. 373, 2055-2066 (2009).
  3. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
  4. Booth, H. D. E., Hirst, W. D., Wade-Martins, R. The role of astrocyte dysfunction in Parkinson's disease pathogenesis. Trends in Neurosciences. 40, 358-370 (2017).
  5. Lindstrom, V., et al. Extensive uptake of alpha-synuclein oligomers in astrocytes results in sustained intracellular deposits and mitochondrial damage. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 143-156 (2017).
  6. Crompton, L. A., Cordero-Llana, O., Caldwell, M. A. Astrocytes in a dish: Using pluripotent stem cells to model neurodegenerative and neurodevelopmental disorders. Brain Pathology. 27, 530-544 (2017).
  7. di Domenico, A., et al. Patient-specific iPSC-derived astrocytes contribute to non-cell-autonomous neurodegeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 12, 213-229 (2019).
  8. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Current Opinions in Neurobiology. 20, 588-594 (2010).
  9. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
  10. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: production, function, and therapeutic Potential. Immunity. 46, 957-967 (2017).
  11. Yun, S. P., et al. Block of A1 astrocyte conversion by microglia is neuroprotective in models of Parkinson's disease. Nature Medicine. 24, 931-938 (2018).
  12. Stokholm, M. G., et al. Assessment of neuroinflammation in patients with idiopathic rapid-eye-movement sleep behaviour disorder: a case-control study. The Lancet Neurology. 16, 789-796 (2017).
  13. Williams-Gray, C. H., et al. Serum immune markers and disease progression in an incident Parkinson's disease cohort (ICICLE-PD). Movement Disorders. 31, 995-1003 (2016).
  14. Gelders, G., Baekelandt, V., Vander Perren, A. Linking neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease. Journal of Immunology Research. 2018, 4784268(2018).
  15. Hall, S., et al. Cerebrospinal fluid concentrations of inflammatory markers in Parkinson's disease and atypical parkinsonian disorders. Scientific Reports. 8, 13276(2018).
  16. Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32, 6391-6410 (2012).
  17. Clarke, B. E., et al. Human stem cell-derived astrocytes exhibit region-specific heterogeneity in their secretory profiles. Brain. 143 (10), 85(2020).
  18. Sevenich, L. Brain-resident microglia and blood-borne macrophages orchestrate central nervous system inflammation in neurodegenerative disorders and brain cancer. Frontiers in Immunology. 9, 697(2018).
  19. Friedman, B. A., et al. Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models. Cell Reports. 22, 832-847 (2018).
  20. Viti, J., Feathers, A., Phillips, J., Lillien, L. Epidermal growth factor receptors control competence to interpret leukemia inhibitory factor as an astrocyte inducer in developing cortex. Journal of Neuroscience. 23, 3385-3393 (2003).
  21. Nakashima, K., Yanagisawa, M., Arakawa, H., Taga, T. Astrocyte differentiation mediated by LIF in cooperation with BMP2. FEBS Letters. 457, 43-46 (1999).
  22. Serio, A., et al. Astrocyte pathology and the absence of non-cell autonomy in an induced pluripotent stem cell model of TDP-43 proteinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 4697-4702 (2013).
  23. Gupta, K., et al. Human embryonic stem cell derived astrocytes mediate non-cell-autonomous neuroprotection through endogenous and drug-induced mechanisms. Cell Death and Differentiation. 19, 779-787 (2012).
  24. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 25(2013).
  25. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 528-534 (2011).
  26. Xin, W., et al. Ventral midbrain astrocytes display unique physiological features and sensitivity to dopamine D2 receptor signaling. Neuropsychopharmacology. 44, 344-355 (2019).
  27. Devine, M. J., et al. Parkinson's disease induced pluripotent stem cells with triplication of the alpha-synuclein locus. Nature Communications. 2, 440(2011).
  28. Chen, Y., et al. Engineering synucleinopathy-resistant human dopaminergic neurons by CRISPR-mediated deletion of the SNCA gene. European Journal of Neuroscience. 49, 510-524 (2019).
  29. Crompton, L. A., et al. non-adherent differentiation of human pluripotent stem cells to generate basal forebrain cholinergic neurons via hedgehog signaling. Stem Cell Research. 11, 1206-1221 (2013).
  30. Stathakos, P., et al. A monolayer hiPSC culture system for autophagy/mitophagy studies in human dopaminergic neurons. Autophagy. , 1-17 (2020).
  31. Stathakos, P., et al. Imaging autophagy in hiPSC-derived midbrain dopaminergic neuronal cultures for Parkinson's disease research. Methods in Molecular Biology. 1880, 257-280 (2019).
  32. Bilican, B., et al. Mutant induced pluripotent stem cell lines recapitulate aspects of TDP-43 proteinopathies and reveal cell-specific vulnerability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 5803-5808 (2012).
  33. Cordero-Llana, O., et al. Clusterin secreted by astrocytes enhances neuronal differentiation from human neural precursor cells. Cell Death and Differentiation. 18, 907-913 (2011).
  34. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128, 3585-3594 (2001).
  35. Namihira, M., et al. Committed neuronal precursors confer astrocytic potential on residual neural precursor cells. Developmental Cell. 16, 245-255 (2009).
  36. Ochiai, W., Yanagisawa, M., Takizawa, T., Nakashima, K., Taga, T. Astrocyte differentiation of fetal neuroepithelial cells involving cardiotrophin-1-induced activation of STAT3. Cytokine. 14, 264-271 (2001).
  37. Nakashima, K., Yanagisawa, M., Arakawa, H. Synergistic signaling in fetal brain by STAT3-Smad1 complex bridged by p300. Science. 284 (5413), 479-482 (1999).
  38. Nakashima, K., et al. Developmental requirement of gp130 signaling in neuronal survival and astrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 19, 5429-5434 (1999).
  39. Barbar, L., et al. CD49f is a novel marker of functional and reactive human iPSC-derived astrocytes. Neuron. 107, 436-453 (2020).
  40. Barbar, L., Rusielewicz, T., Zimmer, M., Kalpana, K., Fossati, V. Isolation of human CD49f(+) astrocytes and in vitro iPSC-based neurotoxicity assays. STAR Protocols. 1, 100-172 (2020).
  41. Gao, H. M., et al. Neuroinflammation and alpha-synuclein dysfunction potentiate each other, driving chronic progression of neurodegeneration in a mouse model of Parkinson's disease. Environmental Health Perspectives. 119, 807-814 (2011).
  42. Gao, H. M., et al. Neuroinflammation and oxidation/nitration of alpha-synuclein linked to dopaminergic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 28, 7687-7698 (2008).
  43. Horvath, I., et al. Co-aggregation of pro-inflammatory S100A9 with alpha-synuclein in Parkinson's disease: ex vivo and in vitro studies. Journal of Neuroinflammation. 15, 172(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ventral Midbrain AstrocytesHuman Astrocyte GenerationInduced Pluripotent Stem CellsParkinson s Disease ModelsAstrocyte NeuroinflammationAstrocyte NeurotoxicityAstrocyte Drug ScreeningAstrocyte ImmunomodulationAstrocyte Marker ExpressionHigh Throughput Protocol
Video Coming Soon

Related Articles