Method Article

Wizualizacja adaptacji komórek płuc podczas połączonego ozonu i ostrego mysiego uszkodzenia płuc wywołanego ozonem i LPS

DOI:

10.3791/62097

⸱

March 21st, 2021

 ,  , 
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy narażone na działanie ozonu i endotoksyn bakteryjnych wykazują rozległą śmierć komórek, w tym neutrofili. Zaobserwowaliśmy adaptacje komórkowe, takie jak zakłócenie blaszek cytoszkieletu, zwiększona ekspresja komórkowa podjednostki syntazy ATP kompleksu V β i angiostatyny w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym, supresja odpowiedzi immunologicznej płuc i opóźniona rekrutacja neutrofili.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płuca są nieustannie narażone na bezpośrednie i pośrednie zniewagi w postaci sterylnych (cząsteczki lub reaktywne toksyny) i zakaźnych (bakteryjnych, wirusowych lub grzybiczych) stanów zapalnych. Przytłaczająca odpowiedź gospodarza może skutkować upośledzeniem oddychania i ostrym uszkodzeniem płuc, które charakteryzuje się rekrutacją neutrofili w płucach w wyniku patologicznej odpowiedzi immunologicznej, krzepnięcia i przebudowy tkanek gospodarza. Czułe metody mikroskopowe do wizualizacji i ilościowego określania adaptacji komórkowych płuc myszy w odpowiedzi na niskie dawki (0,05 ppm) ozonu, silnego zanieczyszczenia środowiska w połączeniu z bakteryjnym lipopolisacharydem, agonistą TLR4, mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów zapalnych i naprawczych gospodarza. Opisujemy kompleksową fluorescencyjną analizę mikroskopową różnych przedziałów płucnych i ogólnoustrojowych, a mianowicie płynu z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych, perfuzatu naczyniowego płuc, kriosekcji płuc lewych i perfuzatu szpiku kostnego mostka. Wykazano uszkodzenia makrofagów pęcherzykowych, neutrofili, tkanki miąższowej płuc, a także komórek szpiku kostnego w korelacji z opóźnioną (do 36-72 h) odpowiedzią immunologiczną, która jest zaznaczona dyskretnymi gradientami chemokiny w analizowanych przedziałach. Ponadto przedstawiono macierz zewnątrzkomórkową płuc i interakcje komórkowe cytoszkieletu (aktyna, tubulina), mitochondrialne i reaktywne formy tlenu, antykoagulacyjny plazminogen, jego antyangiogenny fragment peptydu angiostatyna, mitochondrialne podjednostki kompleksu V syntazy ATP, α i β. Te markery zastępcze, po uzupełnieniu odpowiednimi testami in vitro opartymi na komórkach i technikami obrazowania in vivo zwierząt, takimi jak mikroskopia przyżyciowa, mogą dostarczyć istotnych informacji w celu zrozumienia odpowiedzi płuc na nowe czynniki immunomodulujące.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostre uszkodzenie płuc (ALI) jest kluczową patologiczną reakcją płuc na zakaźne lub inne szkodliwe bodźce, która charakteryzuje się jednoczesną aktywacją krzepnięcia, fibrynolitycznego i wrodzonego układu odpornościowego1. Neutrofile natychmiast wykrywają wzorce uszkodzeń mikrobiologicznych i wewnątrzkomórkowych za pośrednictwem rodziny receptorów Toll-like (TLR)2,3,4. Neutrofile uwalniają wstępnie uformowane cytokiny i cytotoksyczną zawartość granulek, które mogą następnie powodować uboczne uszkodzenie tkanek. Wynikające z tego uszkodzenie pęcherzyków płucnych jest naznaczone wtórną śmiercią komórki, co prowadzi do uwolnienia cząsteczek takich jak adenozynotrójfosforan (ATP)5, co rozpoczyna błędne koło rozregulowania układu odpornościowego.

Nierozwiązany problem w zrozumieniu ALI dotyczy pytania, w jaki sposób uraz jest inicjowany w błonie pęcherzykowej. Kompleks transportu elektronów V, syntaza F1F0 ATP, jest białkiem mitochondrialnym, o którym wiadomo, że ulega ekspresji we wszystkich przypadkach na błonie komórkowej (w tym śródbłonka, leukocytów, nabłonka) podczas stanu zapalnego. Cytoszkielet komórkowy, który składa się z aktyny i tubuliny, zawiera wiele białek modulujących kształt i funkcję komórek, a także białek mitochondrialnych. Niedawno wykazaliśmy, że blokada syntazy ATP przez endogenną cząsteczkę, angiostatynę, wycisza rekrutację neutrofili, aktywację i indukowane lipopolisacharydem (LPS) zapalenie płuc 6. Tak więc zarówno mechanizmy biochemiczne (syntaza ATP), jak i immunologiczne (TLR4) mogą regulować barierę pęcherzykową podczas zapalenia płuc.

Narażenie na ozon (O3), zanieczyszczenie środowiska, upośledza czynność płuc, zwiększa podatność na infekcje płuc, a krótkie niskie poziomy ekspozycji na O3 zwiększają ryzyko zgonu u osób z podstawowymi chorobami układu krążeniowo-oddechowego7,8,9,10,11,12,13,14. Tak więc narażenie na fizjologicznie istotne stężenia O3 zapewnia sensowny model ALI do badania podstawowych mechanizmów zapalenia7,8. Nasze laboratorium niedawno opracowało mysi model ALI3 class="xref">15. Po wykonaniu dawki i czasu reakcji na niskie stężeniaO3 zaobserwowaliśmy, że narażenie na 0,05 ppm O3 przez 2 godziny indukuje ostre uszkodzenie płuc, które jest zaznaczone przez podjednostkę β syntazy ATP w płucach (ATPβ) i ekspresję angiostatyny, podobnie jak w modelu LPS. Przyżyciowe obrazowanie płuc wykazało dezorganizację mikrowłókien aktyny pęcherzyków płucnych wskazujących na uszkodzenie płuc oraz ablację poziomów reaktywnych form tlenu (ROS) przegrody zębodołowej (co wskazuje na zniesienie podstawowej sygnalizacji komórkowej) i potencjału błony mitochondrialnej (wskazującej na ostrą śmierć komórki) po 2 godzinach ekspozycji na 0,05 ppm O315, co korelowało z niejednorodnym płucem 18FDG retention16, rekrutacja neutrofili i uwalnianie cytokin, w szczególności IL-16 i SDF-1α. Wniosek płynący z naszych ostatnich badań jest taki, że O3 powoduje wykładniczo wysoką toksyczność, gdy jest narażony na stężenia poniżej dopuszczalnych limitów 0,063 ppm przez 8 godzin (dziennie) dla ludzi. Co ważne, nie ma jasnego zrozumienia, czy te subkliniczne ekspozycje naO3 mogą modulować mechanizmy pośredniczone przez TLR4, takie jak endotoksyna bakteryjna17. W związku z tym zbadaliśmy model ekspozycji na O3 i LPS z podwójnym uderzeniem i obserwowaliśmy adaptacje komórkowe immunologiczne i nieimmunologiczne.

Opisujemy kompleksową analizę mikroskopową fluorescencyjną różnych przedziałów płucnych i ogólnoustrojowych, a mianowicie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (tj. BAL), który pobiera próbki z przestrzeni pęcherzykowych, perfuzat naczyń płucnych (tj., LVP), który pobiera próbki z naczyń płucnych i śródmiąższu przegrody pęcherzykowej w przypadku naruszenia bariery śródbłonkowej, kriosekcji lewego płuca, aby przyjrzeć się rezydentnym leukocytom miąższowym i przylegającym pozostawionym w płucu z płukaniem tkanka, krew obwodowa, która reprezentuje krążące leukocyty oraz perfuzyjne szpik kostny mostka i kości udowej, które pobierają próbki odpowiednio proksymalnych i dystalnych miejsc mobilizacji komórek krwiotwórczych podczas zapalenia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt badania został zatwierdzony przez Radę Etyki Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Saskatchewan i był zgodny z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami dotyczącymi humanitarnego wykorzystywania zwierząt. Pozyskano sześć-ośmiotygodniowe samce myszy C57BL/6J. UWAGA: Poddać eutanazji wszystkie zwierzęta, u których rozwija się ciężki letarg, niewydolność oddechowa lub inne oznaki ciężkiego niepokoju przed planowanym punktem końcowym.

UWAGA: Przygotuj następujące: 27-18 G igły (zależy to od średnicy tchawicy myszy), rurkę PE o odpowiedniej wielkości, aby pasowała do igły (zrób kaniulę PE dla każdej myszy), kaniulę, 2 ostre nożyczki, 2 kleszcze (małe), 1 ostre kleszcze (małe), 3 strzykawki 1 ml, oznakowane probówki do mikrofuge (do pobierania BAL, krwi, naczyń krwiotwórczych i perfuzatu szpiku kostnego) oraz oznakowane fiolki (do utrwalania tkanek), worki na próbki/kriowiale do pobierania bibułek, rolka nici rzeźniczej (pocięte na ligatury o odpowiedniej wielkości). Wszystkie substancje chemiczne użyte w eksperymentach są wskazane w Tabeli Materiałów.

1. Narażenie na ozon i LPS w celu wywołania mysiego uszkodzenia płuc

  1. Narażenie na ozon
    1. Przygotuj niestandardową skrzynkę indukcyjną O3. Dodaj karmę dla myszy, butelkę z wodą, zabawki wzbogacające i czystą pościel w kolejności i naśladuj środowisko mieszkaniowe myszy.
      UWAGA: Te kroki zapewnią myszom swobodny dostęp do jedzenia i wody, gdy są umieszczone w niestandardowym pudełku indukcyjnym i pomogą złagodzić nadmierny stres.
    2. Włącz kalibrator/generator O3 (umieszczony w kierunku portu wlotowego), aby ustabilizować UV lamp przed ręką (około 15 minut przed ekspozycją) i połącz się z wbudowanym monitorem O3.
      UWAGA: MonitorO3 powinien odczytywać średnio 0.05 ppm, zgodnie z próbką z wylotu przy stałej temperaturze powietrza w komorze (72 ±3 °F) i wilgotności względnej (50±15%).
    3. W przypadku ekspozycjiO3 delikatnie umieść myszy w niestandardowym pudełku indukcyjnym i stale wystawiaj myszy na działanie 0.05 ppm O3 przez 2 godziny.
  2. Znieczulenie i donosowe podanie LPS
    1. Przygotować oddzielnie zapasy 10 mg/ml ketaminy i ksylazyny.
    2. Przygotuj koktajl, mieszając 20 części ketaminy i 1 część ksylazyny. Jeśli mysz waży X g, wstrzyknij (X/200) ml koktajlu ketamina/ksylazyna do jamy otrzewnej. Na jedną mysz przygotuj 1 ml koktajlu składającego się z 1000 μl bulionu 10 mg/ml ketaminy i 50 μl bulionu ksylazyny. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół w probówce do mikrofuge.
      UWAGA: Zapasy ketaminy i ksylazyny można przygotować z tygodniowym wyprzedzeniem.
    3. Znieczulenie myszy należy poddać lekkiej mieszance ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (1 mg/kg) (np. w przypadku myszy o wadze 25 g wstrzyknąć 0,125 ml koktajlu).
    4. Przygotować roztwór LPS o stężeniu 1 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej i napełnić pipetą 50 μl roztworu.
    5. Trzymaj mysz pionowo grzbietem/grzbietową stroną dłoni, trzymając uszy tą samą ręką. Teraz delikatnie umieść 50 μl roztworu LPS18 na zewnątrz nozdrzy (tj. 25 μl na każde nozdrze lub 50 μl w jednym nozdrzu; nie ma znaczenia, o ile procedura jest szybka) i pozwól myszom wdychać roztwór LPS.
    6. Wkrapić myszom kontrolnym 50 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
      Uwaga: Nie przekraczaj więcej niż 100 μl do wkraplania, co może być śmiertelne. Zbyt mała objętość (tj. <50 μl) i istnieje ryzyko tylko osadzania się z nosa.
    7. Po podaniu LPS delikatnie połóż myszy, na brzuchu lub plecach, na kopcu ściółki z głową lekko pochyloną w dół.
      UWAGA: Ta orientacja przedłuża retencję roztworu w jamie nosowej 19.
    8. Po 0, 2, 4, 24, 36 i 72 godzinach od ekspozycji znieczulij myszy ip pełną dawką ketaminy (200 mg / kg) / ksylazyny (4 mg / kg) (tj. X / 50 ml koktajlu, gdzie X to waga myszy w gramach lub 0,50 ml dla myszy 25 g).
    9. Obserwuj mysz, aż straci przytomność i prawy odruch (tj. nie odwróci się, gdy leży w pozycji leżącej). Teraz sprawdź mysz pod kątem głębokości znieczulenia, monitorując oddech (rytmiczne ruchy klatki piersiowej) i tętno, które powinno zauważalnie spaść po 1-2 minutach.
    10. Następnie sprawdź, czy nie ma odruchów pedałowania, tj. uszczypnij jeden z palców kończyny tylnej i obserwuj, czy kończyna się cofnęła, jako odruch. Jeśli mysz zareaguje, uzupełnij ją dodatkowymi zastrzykami o pojemności 0,1 ml lub więcej, zgodnie z wymaganiami.
      UWAGA: Aby uzyskać głębokie znieczulenie, należy pamiętać, że niektóre szczepy lub otyłe myszy mają zwykle większą objętość dystrybucji, a zatem można je łatwo przedawkować, jeśli jest wystarczająco dużo czasu, jeśli nie jest to dozwolone do pełnego znieczulenia (co może trwać około 10 minut lub dłużej). W związku z tym niektóre szczepy mogą być odporne na znieczulenie, a tym samym wymagać większej liczby uzupełnień. Wiedza ta jest zdobywana po wielu praktycznych obserwacjach i doświadczeniach z myszami różnych szczepów i w różnym wieku. Ponieważ kilka eksperymentów pilotażowych przeprowadzono również bezpośrednio po ekspozycji naO3 i LPS (tj. w punkcie czasowym 2 godzin), dołączyliśmy również bardzo wczesną analizę komórek BAL z tych eksperymentów, aby podkreślić natychmiastowe skutki połączonej ekspozycji naO3i LPS.

2. Pobieranie próbek

  1. Umieść mysz na tacy chirurgicznej. Teraz delikatnie nałóż smarującą maść do oczu na oba oczy, aby uniknąć utraty płynów i zdezynfekuj mysz za pomocą sprayu z 70% etanolem.
    1. Wykonaj małe nacięcia przez górną i dolną błonę skóry nożyczkami, aby odsłonić tchawicę i klatkę piersiową.
    2. Wykonaj nacięcie tuż pod mostkiem i odsłoń serce.
  2. Nakłucie serca
    1. Umieścić igłę 25G przymocowaną do strzykawki z heparyną do prawej komory i pobrać krew przez punkcję serca.
      UWAGA: Krew jest zwykle pobierana przy minimalnym pobraniu tłoka, jeśli czas od wystawienia serca na nakłucie serca jest krótszy niż minuta. Po zebraniu około 0,4-0,5 ml może być konieczna przerwa na kilka sekund przed pobraniem pozostałej krwi. Ma to na celu umożliwienie sercu przepompowania pozostałej objętości do prawej komory komory. Pod koniec pobierania krwi serce przestaje pompować.
    2. Zbierz krew i przechowuj ją w probówkach do mikrofuge do dalszej obróbki.
  3. Tracheostomii
    1. Ostrożnie użyj pęsety/kleszczy, aby usunąć obszar tchawicy z leżącej nad nim tkanki. Używaj rąk w rękawiczkach częściej niż narzędzi chirurgicznych, aby uniknąć krwawienia. Jeśli sączy się dużo krwi, istnieje ryzyko zanieczyszczenia próbek BAL. W razie potrzeby użyj bawełnianych wacików, chociaż nie jest to preferowane. Kimwipes są lepszą alternatywą.
    2. Teraz przetnij klatkę piersiową, aby odsłonić płuca. Ponownie należy uważać, aby nie przeciąć mostka i tętnic międzyżebrowych ani aorty wstępującej; Wykonuj mniejsze nacięcia, przechodząc przez klatkę piersiową)
    3. Przełóż bawełnianą ligaturę poniżej wycinka tchawicy i pozostaw na razie w takim stanie.
    4. Przeciąć tchawicę w odpowiednim miejscu w dystalnej 1/3 części, skierowaną w stronę płuc, aby umożliwić dostęp do kaniuli tchawicy 28 G.
    5. Włóż kaniulę PE 28 G (minimalna długość 3-5 mm i dystalny koniec przycięty w celu ułatwienia wprowadzenia) do tchawicy. Uważaj na koniec tchawicy przed rozwidleniem, a następnie pociągnij około mm do tyłu, aby uniknąć pobierania próbek tylko z pojedynczego płata.
    6. Mocno zawiąż bawełnianą ligaturę, aby utrzymać kaniulę na miejscu. Nie składaj kaniuli.
  4. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL)
    1. Napełnij 0,5 ml PBS w strzykawce o pojemności 1 ml.
    2. Teraz stopniowo wstrzykuj 0,5 ml PBS do kaniuli za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml.
    3. Po wstrzyknięciu PBS należy odessać strzykawkę tak długo, aby nie opierała się ssaniu.
      UWAGA: Jeśli występuje opór podczas zasysania płynu BAL, oznacza to zapadnięcie się tkanki pęcherzykowej lub oskrzelowej. W takim przypadku odciągnij kaniulę minimalnie, aby oderwać kaniulę od ścian tkanki.
    4. Zbierz zasysany płyn do oznaczonej probówki do mikrofuge i umieść na lodzie.
    5. Wykonaj dwie kolejne płukania w podobny sposób, zbierając je w tej samej fiolce (tj. w sumie 0,5 X 3 = 1,5 ml płukania).
    6. Zmierz objętość zebranego płynu BAL. Odzysk z płukania powinien być bliski 90%.
  5. Perfuzat naczyniowy płuc (LVP)
    1. Przeciąć zstępującą aortę piersiową w miejscu między połową klatki piersiowej i brzucha, aby uniknąć cofania się perfuzatu w płucach podczas przenikania przez prawą komorę.
    2. Osusz jamę w pobliżu przeciętego końca aorty, pozbawiając ją krwi.
    3. Następnie przeprowadź perfuzję płuc 0,5 ml heparynizowanej soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej wstrzykniętej przez prawą komorę.
    4. Zbierz perfuzat naczyniowy z jamy na odciętym końcu zstępującej aorty piersiowej do probówki do mikrofuge, umieszczonej na lodzie i zmierz jej objętość.
    5. Podwiązać prawe oskrzela proksymalnie do jego rozgałęzienia od tchawicy (za pomocą nici bawełnianej).
  6. Stabilizacja lewego płuca in situ
    1. Podłącz strzykawkę o pojemności 1 ml do kaniuli tchawicy, która jest wystarczająco długa, aby wprowadzić ją przez poprzednie nacięcie tchawicy.
    2. Pobrać powietrze z powrotem do strzykawki do oznaczenia 0,6 ml.
    3. Następnie napełnij pozostałą strzykawkę (do samego końca) 2% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że tłok jest gotowy do wyskoczenia bez zasysania powietrza z kaniuli.
    4. Teraz przymocuj strzykawkę taśmą klejącą do pionowego pojemnika o wysokości do 20 cm.
    5. Delikatnie wyciągnąć tłok, aby utrwalacz mógł spłynąć w kierunku tchawicy. W przypadku, gdy w kaniuli znajduje się kilka pęcherzyków powietrza, delikatnie umieść tłok na strzykawce, a płyn zacznie płynąć po kilku sekundach.
    6. Pozwól lewemu płucu nadmuchać się do całkowitej pojemności in situ, przez 5 minut, z wysokości 20 cm, tworząc 20 cm słupa wody.
    7. Podczas tej procedury należy upewnić się, że chronisz prawe płaty płuc przed kontaktem z paraformaldehydem, ponieważ wpłynie to na dalsze testy.
    8. Umieść złożone tkanki laboratoryjne, aby wchłonąć paraformaldehyd, który może mieć kontakt z prawym płatem płuc.
      UWAGA: Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny. Dlatego nie wdychaj ani nie dotykaj żadnych odsłoniętych części ciała. Zachowaj szczególną ostrożność podczas obsługi.
    9. W czasie wkraplania paraformaldehydu należy zdezynfekować brzuch.
    10. Odetnij prawe płaty płuc od tchawicy, upewniając się, że usunąłeś wszelkie nitki i natychmiast umieść płaty w oznakowanym kriowiale i wrzuć go do ciekłego azotu w celu dalszej analizy cytokin molekularnych/biochemicznych/RT-PCR/western blot homogenatu płuc.
    11. Ostrożnie przyciąć lewe płuco w poszukiwaniu tkanki łącznej lub błon opłucnowych i zanurzyć je w 2% paraformaldehydzie na 24 godziny w temperaturze 4 °C.
    12. Osadź nieruchome płuco w parafinie zgodnie ze standardowym protokołem zatapiania.
      Ostrzeżenie: Nie należy przegrzewać próbek płuc.
    13. Wytnij część brzuszną i usuń ją ze skóry z kości miednicy (biodra).
    14. Oddziel lewą i prawą kość udową od części miednicy na wypełnionej solą fizjologiczną szalce Petriego trzymanej na lodzie.
  7. Pobieranie aspiratu szpiku kostnego mostka i kości udowej
    1. Oczyść tkanki i mięśnie z kości za pomocą tkanek laboratoryjnych.
    2. Zbierz brzuszną klatkę piersiową i mostek na wypełnioną solą fizjologiczną szalkę Petriego trzymaną na lodzie.
    3. Przetnij dystalne i proksymalne końcówki kości mostka i kości udowej.
    4. Przetnij kości 4 razy 0,5 ml soli fizjologicznej, używając dobrze dopasowanych igieł (24 do 28 g) na strzykawkach o pojemności 1 ml i zbierz frakcje z każdej kości do oznakowanych probówek wyposażonych w filtry i umieszczonych na lodzie.
      UWAGA: Rozstaw igieł różni się w zależności od wielkości zwierzęcia. Po zaczerwienieniu kość udowa powinna być przezroczysta.
    5. Po pobraniu próbek zapakuj mysz w plastikową torbę i włóż do zamrażarki na zwłoki zwierząt w celu prawidłowej utylizacji, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego zakładu dla zwierząt.

3. Przetwarzanie próbek

  1. Całkowita (TLC) i różnicowa (DLC) liczba leukocytów
    1. Odwirować próbki krwi obwodowej, BAL, perfuzatu naczyń płucnych i szpiku kostnego (mostka i kości udowej) przez 10 minut przy 500 g.
    2. Zebrać supernatanty, błyskawicznie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.
    3. Rozpuścić komórki w co najmniej 200 μl PBS.
    4. Wykonaj TLC, licząc BAL, krew, perfuzat naczyń płuc i komórki szpiku kostnego na hemocytometrze.
    5. Wybarwić kolejne 9 μl podwielokrotności BAL mieszanką 1 μl zieleni kalceinowej i czerwonego homodimeru etydyny-1 w celu ilościowego określenia żywych (zielonych) komórek z powodu wewnątrzkomórkowej aktywności esterazy i wszelkich uszkodzonych komórek BAL (na czerwono) z powodu utraty integralności błony plazmatycznej.
    6. Dodać 2% kwasu octowego do lizy erytrocytów, w stosunku 1:10 dla TLC we krwi i w stosunku 1:2 dla TLC.
      UWAGA: Dostosuj stężenia komórek, rozcieńczając w PBS, jeśli stężenie jest większe niż 1x106 komórek na ml (bardzo ważne dla próbek szpiku kostnego).
    7. Odwirować komórki, aby przygotować cytospiny na szkiełkach i wybarwić, jak wyjaśniono poniżej dla DLC. Policz co najmniej 100 komórek do różnicowej liczby komórek leukocytów (DLC).
      UWAGA: Zazwyczaj na jednym szkiełku można przygotować dwie cytospiny. A po 10-15 minutach suszenia na powietrzu przystąp do etapu barwienia.
    8. Podziel zebrany BAL od trzech myszy pilotażowych na grupę na dwie cytospiny każda i wybarwij aktynę / tubulinę i mitochondria aktywną fosforylacją oksydacyjną (zredukowany mitotracker). Wykorzystaj BAL z trzech kolejnych myszy, aby podzielić się na dwie cytospiny każda, dla szkiełek barwionych NK1.1 / Gr1 / CX3CR1 i ATPβ / Ki-67 / CD61 / angiostatyną. Podziel BAL od trzech kolejnych myszy na dwie cytospiny każda, aby wybarwić ATPα / Ly6G i CX3CR1 / Siglec-F.
  2. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) i oznaczanie ilościowe całkowitego białka perfuzatu naczyń płucnych (LVP)
    1. W celu ilościowego określenia zaburzeń bariery naczyniowej wywołanych przezO3 i LPS lub względnego ciśnienia onkotycznego w dwóch przedziałach płucnych (tj. przedziałach przegrody pęcherzykowej (śródmiąższowej) i perfuzatu naczyniowego płuc (naczyniowego)) należy zmierzyć całkowitą zawartość białka w pobranych płynach.
    2. Przeanalizować rozmrożone frakcje supernatantu pod kątem ich całkowitego stężenia białka przy użyciu standardowego testu kolorymetrycznego odpornego na detergenty.
    3. Analiza chemokiny w postaci płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL) i perfuzatu naczyń płucnych (LVP)
      1. Następnie przeanalizuj chemokiny w supernatantach BAL i pernatantu naczyniowego płuc (LVP) za pomocą 33-pleksowego testu immunologicznego opartego na kulkach magnetycznych. Będzie to informować o kierunkowości gradientów chemokiny dróg oddechowych/śródmiąższu w porównaniu z chemokinami naczyniowymi, ustalonych po łącznej ekspozycji.
      2. Przeanalizuj następujący panel chemokin: CXCL13 (chemoatraktant limfocytów B), CCL27 (chemokina R-alfa-locus IL-11 (ILC)), CXCL5 (peptyd aktywujący neutrofile 78 pochodzenia nabłonkowego (ENA-78)), CCL-11 (eotaksyna-1), eotaksyna-2 (CCL-24), CX3CL1 (frakcja talkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukina-10), IL-16 (interleukina-16), IL-1β (interleukina-1 beta), IL-2 (interleukina-2), IL-4 (interleukina-4), IL-6 (interleukina-6), CXCL-10 (interferon indukowany gamma białko 10 (IP-10)), CXCL11 (białko indukowane interferonem gamma 9 (IP-9)), KC (chemoatraktant keratynocytów), MCP-1 (białko chemoatraktantu monocytów-1), MCP-3 (białko chemoatraktantu monocytów-3), MCP-5 (białko chemoatraktantu monocytów-5), MDC (chemokina pochodząca z makrofagów (CCL22)), MIP-1α (białko zapalne makrofagów-1 alfa), MIP-1β (białko zapalne makrofagów-1 beta), MIP-2 (białko zapalne makrofagów-2), MIP-3α (białko zapalne makrofagów-3 alfa), MIP-3β (białko zapalne makrofagów-3 beta), RANTES (regulowane przy aktywacji, normalna ekspresja i wydzielanie limfocytów T (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12 / SDF-1alpha (czynnik 1 pochodzący z komórek zrębu), TARC (chemokina regulowana grasicą i aktywacją (TARC)), TECK (chemokina wyrażana przez grasicę (CCL25)) i TNFα (czynnik martwicy nowotworu alfa).

4. Barwienie cytospinowe i histologia płuc

  1. Barwienie biochemiczne cytospinowe
    1. Owiń cytospiny hydrofobowym długopisem, aby zawierał substancje chemiczne do inkubacji podczas zabiegu.
    2. Nawadniaj cytospiny w PBS przez 5 minut.
    3. Utrwal próbki cytospiny w 2% paraformaldehydzie na 10 minut, przemyj trzy razy PBS przez 5 minut każda.
    4. Przepuszczać lodowatym 70% acetonem przez 7 minut i ponownie przemyć trzykrotnie PBS przez 5 minut każdy.
    5. Barwienie aktyny i tubuliny lub zredukowanego Mitotrackera (inkubować z mieszanką 2 μg/50 μL sprzężonej falloidyny Alexa 488 pokazanej na zielono i 2 μg/μL skoniugowanej mysiej tubuliny anty-α Alexa 555 lub zredukowanego Mitotrackera pokazanego na czerwono) przez 15 minut.
      UWAGA: Użyj mysiego przeciwciała kontrolnego izotypu IgG1 w oddzielnej cytospinie, aby zwalidować protokół barwienia tubuliny. Wykonać te same kroki, jak wyjaśniono w 4.1.1 do 4.1.8, ale dla kontroli izotypu.
    6. Usuń plamy, delikatnie odsuwając mieszankę od szkiełka. Inkubować szkiełka z DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindol) przez 5-10 minut w celu wybarwienia jąder.
    7. Umyj cytospiny 3 razy PBS przez 5 minut każde, nakryj szkiełko z pożywką montażową zapobiegającą blaknięciu i przechowuj przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem.
    8. Uzyskuj obrazy pod pionowym mikroskopem szerokokątnym wyposażonym w kamerę naukową. Upewnij się, że podczas obrazowania slajdów ustawiono spójne czasy ekspozycji aparatu dla różnych kanałów fluorescencyjnych.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne cytospinowe:
    1. Owiń cytospiny hydrofobowym długopisem, aby zawierał substancje chemiczne do inkubacji podczas zabiegu. Nawadniaj cytospiny w PBS przez 5 minut.
    2. Utrwal próbki cytospinowe przez inkubację w 2% paraformaldehydzie przez 10 minut, przemyj trzy razy PBS przez 5 minut każda.
    3. Przepuszczać 0,1% zimnego trytonu X-100 przez 2 minuty, przemywać trzykrotnie PBS po 5 minut.
    4. Następnie blokuj Fc przez 15 minut, inkubując cytospinę z rozcieńczeniem 1:50 zapasu przeciwciał blokowych Fc (aby upewnić się, że pierwszorzędowe przeciwciało myszy nie reaguje krzyżowo nieswoistie z mysimi przeciwciałami Fc).
    5. Przechylić szkiełka, aby usunąć blok Fc i zmienić na 1% BSA dla i inkubować cytospinę z mieszaniną 3 pierwszorzędowych przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania (patrz Tabela 1 dla różnych kombinacji) przez 30 minut.
      UWAGA: Upewnij się, że uruchamiasz przeciwciała kontrolne izotypu (inkubować z mieszanką mysich przeciwciał pierwotnych IgG1 i szczurzych IgG2b kappa, wykonując kroki od 4.2.1 do 4.2.9 i zastępując przeciwciała kontrolnymi izotypami) równolegle z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi, jak omówiono w naszym ostatnim badaniu20.
    6. Umyj 3 razy PBS przez 5 minut każde. Inkubować cytospiny z mieszaniną odpowiednio zaprojektowanych przeciwciał drugorzędowych (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1).
    7. Usuń plamy, delikatnie przechylając mieszankę ze szkiełka, inkubuj z DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindolem) przez 5-10 minut, aby wybarwić jądra. Umyj 3 razy PBS przez 5 minut każde.
    8. Szkiełko nakrywkowe z nośnikiem montażowym zapobiegającym blaknięciu i przechowywać przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem.
    9. Uzyskuj obrazy pod pionowym mikroskopem szerokokątnym wyposażonym w kamerę naukową. Upewnij się, że ustawione są spójne czasy ekspozycji kamery dla wszystkich kanałów fluoroforowych podczas obrazowania preparatów.
  3. Histologia hematoksyliny i eozyny (H&E)
    1. Wykonaj zmodyfikowane barwienie H&E 3 na kriosekcjach płuc dla wszystkich grup.
  4. Analiza obrazu
    1. Przetwarzaj i analizuj pliki danych obrazu (.tiff) w otwartym oprogramowaniu Fiji ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Sprawdź wymagane parametry (Powierzchnia, Obwód, Zintegrowana gęstość, Deskryptory kształtu, Średnica Fereta, Kołowość, Etykieta wyświetlacza), które mają być rejestrowane w zakładce Analiza i Ustaw pomiary.
    3. Korzystając z menedżera ROI, ręcznie obrysuj około 50-200 komórek w panelu scalonego obrazu za pomocą narzędzia "zaznaczanie odręczne". Zapisz obszary zainteresowania (ROI) za pomocą polecenia Ctrl + T i skopiuj zapisane ROI dla każdej komórki do wszystkich kanałów fluoroforowych.
    4. Następnie naciśnij Ctrl+M, aby zmierzyć wstępnie ustawione parametry dla wszystkich kanałów fluorescencyjnych (np. 405 nm (DAPI lub ATPβ na niebiesko), 488 nm (aktyna lub NK1.1 lub Ki-67 na zielono), 568 nm (tubulina lub Gr1 lub CD61 na czerwono) i 633 nm (CX3CR1 lub angiostatyna w kolorze magenta)).
    5. Zapisz wyniki jako plik .csv pod odpowiednią nazwą, która reprezentuje analizę. Skopiuj wyniki z pliku .csv do arkusza kalkulacyjnego i podziel intensywność fluorescencji (FI) (która jest kolumną Raw Integrated Density z pliku Results) barwionej cząsteczki przez intensywność DAPI lub CD61 FI, zgodnie z projektem barwienia. Wskaźniki te są określane jako "znormalizowane współczynniki FI DAPI lub CD61".
    6. Następnie wykreśl te znormalizowane proporcje, okrągłość, obwód komórki i średnicę Fereta, aby ocenić wszelkie zmiany wielkości komórek po połączonej ekspozycji na O3 i LPS.
    7. Użyj odpowiedniego oprogramowania statystycznego, aby sprawdzić normalność zebranych danych i przetestować hipotezę zerową (patrz sekcja analizy statystycznej poniżej).
  5. analiza statystyczna
    1. Wyrażaj wyniki jako średnią ± SEM. Na grupę wykorzystano co najmniej trzy myszy.
    2. W przypadku analizy danych chemokiny dostosuj jednokierunkowe wartości p ANOVA dla współczynnika fałszywych odkryć zgodnie z poprawką Benjaminiego i Hoshberga.
    3. Analizuj parametry obrazu, komórkowość, średnicę Fereta, obwód, znormalizowane współczynniki intensywności fluorescencji DAPI lub CD61 za pomocą testu U Manna-Whitneya (do porównania dwóch grup) lub testu Kruskala Wallisa (do porównania wielu grup), ponieważ dane te nie miały rozkładu normalnego.
    4. W przypadku pozostałych eksperymentów obrazowych przeanalizuj wyniki za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji, a następnie wielokrotnych porównań Sidaka. Wartości p <0,05 uznano za istotne.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łączna ekspozycja na O3 i LPS prowadzi do ogólnoustrojowego stanu zapalnego i mobilizacji szpiku kostnego po 72 godzinach: Liczba komórek w różnych przedziałach ujawniła znaczące zmiany we krwi obwodowej i całkowitej liczbie komórek szpiku kości udowej przy łącznej ekspozycji na O3 i LPS. Chociaż połączone ekspozycje na O3 i LPS nie wywołały żadnych zmian w całkowitej liczbie komórek BAL (Figura 1A) lub LVP (<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody przedstawione w obecnym badaniu podkreślają przydatność analizy wieloprzedziałowej do badania wielu zdarzeń komórkowych podczas zapalenia płuc. Wyniki podsumowaliśmy w tabeli 2. Wraz z wieloma laboratoriami intensywnie badaliśmy mysią reakcję na donosowe wkraplanie LPS, która charakteryzuje się szybką rekrutacją neutrofili w płucach, która osiąga szczyt między 6-24 godzinami, po czym zaczyna się rozdzielczość. Ostatnio wykazaliśmy, że subklinicznyO3 (w stężeniu 0,05 ppm przez 2 godziny)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów ani ujawnień.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prowadzone badania są finansowane z grantu NSERC przyznanego przez prezydenta, a także z funduszy na rozpoczęcie działalności przez Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Kanadyjskie Centrum Innowacji Jądrowych im. Sylvii Fedoruk jest finansowane przez Innovation Saskatchewan. Obrazowanie fluorescencyjne wykonano w Centrum Obrazowania WCVM, które jest finansowane przez NSERC. Jessica Brocos (studentka studiów magisterskich) i Manpreet Kaur (studentka studiów magisterskich) zostali sfinansowani z funduszy start-upowych z Kanadyjskiego Centrum Innowacji Jądrowych Sylvii Fedoruk.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
33-plex Bioplex panel chemokinowyBiorad12002231
63X olej (NA 1,4-0,6) Obiektywy mikroskopoweLeicaHCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 sprzężona koza anty-mysia IgG (H+L)InvitrogenA11045
Alexa 488 sprzężona koza anty-mysia IgG (H+L)InvitrogenA11002
Alexa 488 sprzężona falloidynaInvitrogenA12370
Alexa 555 sprzężony mysz anty-α klon tubuliny DM1AMillipore05-829X-555
Alexa 568 sprzężona koza anty-chomik IgG (H+L)InvitrogenA21112
Alexa 568 sprzężona koza anty-szczura IgG (H+L)InvitrogenA11077
Alexa 633 sprzężona koza anty-królik IgG (H+L)InvitrogenA21070
Chomik ormiański anty-CD61 (klon 2C9. G2) IgG1 kappaBD Pharmingen553343
C57BL/6 J MyszyJackson Laboratories64
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyLeica LeicaTCS SP5
DAPI (4&,6-diamidino-2-fenyloindol)InvitrogenD1306podwielokrotność w 2 &mikro; l zapasy i przechowywać w temperaturze -20° C
Odwrócony fluorescencyjny mikroskop szerokokątnyOlympusOlympus IX83
Ketamina (Narketan)Vetoquinol100 mg/mlRozcieńczyć 10 razy, aby uzyskać 10 mg/ml zapasu
Żywy (kalceina)/martwy (Ethidium homodimer-1) zestaw cytotoksycznościInvitrogenL3224
Mysz anty-ATP5A1 IgG2b (klon 7H10BD4F9)Invitrogen459240
Mysz anty-ATP5β IgG2b (klon 3D5AB1)InvitrogenA-21351
Mysz anty-NK1.1 IgG2a kappa (klon PK136)Invitrogen16-5941-82
Test białka Pierce 660 nmThermoscientific22660
Antyangiostatyna królika (mysz aa 98-116) IgGAbcamab2904
Królik anty-CX3CR1 IgG (RRID 467880)Invitrogen14-6093-81
Szczur anty-Ki-67 (klon SolA15) IgG2a kappaInvitrogen14-5698-82
Szczur anty-Ly6G IgG2a kappa (klon 1A8)Invitrogen16-9668-82
Szczur anty-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (klon RB6-8C5)Invitrogen53-5931-82
Szczurzy blok anty-mysi CD16/CD32 Fc (klon 2.4G2)BD Pharmingen553142
Zredukowany mitotracker pomarańczowyInvitrogenM7511
Ksylazyna (Rompun)Bayer20 mg/mlRozcieńczyć 2 razy, aby uzyskać 10 mg/ml bulionu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
  2. Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017).
  3. Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
  4. Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
  5. Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
  6. Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
  7. Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
  8. Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
  9. Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
  10. Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
  11. Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
  12. Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
  13. Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
  14. Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
  15. Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463(2020).
  16. Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699(2020).
  17. Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24(2008).
  18. Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
  19. Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
  20. Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
  21. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  22. Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
  23. Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
  24. Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
  25. Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
  26. Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
  27. Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056(2015).
  28. Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
  29. Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
  30. Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
  31. Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Acute Lung InjuryOzone ExposureLPS Induced InjuryMurine Lung ModelFluorescent MicroscopyBronchoalveolar LavageNeutrophil RecruitmentChemokine GradientsAlveolar MacrophagesIntravital Microscopy

Related Articles