Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezkontaktowy model kohodowli do badania aktywacji wrodzonych komórek odpornościowych podczas infekcji wirusem układu oddechowego

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62115

⸱

28 lutego 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Haartman Institute, Medicum, University of Helsinki, 4Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National University Hospital, National University Health System, 5Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore Immunology Network (SIgN), 6NUHS Infectious Diseases Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje badanie wczesnych interakcji między wirusowo zakażonymi komórkami nabłonka nosa a aktywacją komórek wrodzonych. Poszczególne podzbiory komórek odpornościowych można rozróżnić na podstawie ich aktywacji w odpowiedzi na infekcje wirusowe. Następnie można je dalej badać w celu określenia ich wpływu na wczesne odpowiedzi przeciwwirusowe.

Streszczenie

Wczesne interakcje między warstwą nabłonka nosa a wrodzonymi komórkami odpornościowymi podczas infekcji wirusowych pozostają niedostatecznie zbadanym obszarem. Znaczenie sygnalizacji odporności wrodzonej w infekcjach wirusowych znacznie wzrosło, ponieważ pacjenci z infekcjami dróg oddechowych, którzy wykazują wysoką wrodzoną aktywację limfocytów T, wykazują lepsze wyniki choroby. W związku z tym analiza tych wczesnych wrodzonych interakcji immunologicznych pozwala na wyjaśnienie procesów, które nimi rządzą i może ułatwić opracowanie potencjalnych celów terapeutycznych i strategii tłumienia lub nawet zapobiegania wczesnemu postępowi infekcji wirusowych. Protokół ten szczegółowo opisuje wszechstronny model, który można wykorzystać do badania wczesnych przesłuchów, interakcji i aktywacji wrodzonych komórek odpornościowych przed czynnikami wydzielanymi przez zakażone wirusem komórki nabłonka dróg oddechowych. Wykorzystując wirusa grypy H3N2 (A/Aichi/2/1968) jako reprezentatywny model wirusa, wrodzona aktywacja komórek współhodowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) została przeanalizowana przy użyciu cytometrii przepływowej w celu zbadania podzbiorów komórek, które są aktywowane przez rozpuszczalne czynniki uwalniane z nabłonka w odpowiedzi na infekcję wirusową. Wyniki pokazują strategię bramkowania w celu różnicowania podzbiorów komórek i ujawniają wyraźne różnice między aktywowanymi populacjami PBMC i ich wzajemnym oddziaływaniem z kontrolnym i zakażonym nabłonkiem. Aktywowane podzbiory mogą być następnie dalej analizowane w celu określenia ich funkcji, a także zmian molekularnych specyficznych dla komórek. Wyniki takiego badania przesłuchów mogą ujawnić czynniki, które są ważne dla aktywacji ważnych populacji komórek wrodzonych, które są korzystne w kontrolowaniu i hamowaniu postępu infekcji wirusowej. Co więcej, czynniki te mogą być powszechnie stosowane do różnych chorób wirusowych, zwłaszcza do nowo pojawiających się wirusów, w celu osłabienia wpływu takich wirusów, gdy po raz pierwszy krążą w naiwnych populacjach ludzkich.

Wprowadzenie

Wirusy układu oddechowego są prawdopodobnie jednymi z najbardziej rozpowszechnionych patogenów, powodując poważne obciążenia zdrowotne i ekonomiczne. Od okresowych globalnych wybuchów pojawiających się szczepów epidemicznych (np. H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) po sezonowe szczepy grypy każdego roku, wirusy stanowią stałe zagrożenie dla zdrowia publicznego. Chociaż szczepionki stanowią główną część odpowiedzi na te globalne wyzwania związane ze zdrowiem publicznym, otrzeźwiające jest to, że te środki zaradcze są jedynie responsywne1,2. Co więcej, opóźnienie między pojawieniem się nowego szczepu zakaźnego a pomyślnym opracowaniem jego szczepionki jest nieuniknione3, co prowadzi do okresu, w którym dostępne środki mające na celu ograniczenie rozprzestrzeniania się wirusa są bardzo ograniczone.

Te opóźnienia są dodatkowo podkreślone przez koszty, które są nakładane na społeczeństwo - ekonomicznie i społecznie. Sama grypa sezonowa jest odpowiedzialna za około 8 miliardów dolarów kosztów pośrednich, 3,2 miliarda dolarów kosztów medycznych i 36,3 tysiąca zgonów w Stanach Zjednoczonych Ameryki rocznie4. Ma to miejsce przed rozważeniem kosztów badań, które są niezbędne do sfinansowania opracowania szczepionki. Wybuchy epidemii mają jeszcze poważniejsze skutki dla społeczeństwa, spotęgowane przez rosnące z roku na rok tempo globalizacji, o czym świadczą globalne zakłócenia spowodowane pojawieniem się i szybkim rozprzestrzenianiem się koronowirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.

Ostatnie badania wykazały, że zakażeni pacjenci z większą populacją aktywowanych wrodzonych limfocytów T zwykle mają lepsze wyniki choroby8,9,10. Ponadto wrodzona populacja limfocytów T jest podzielona na wiele podgrup: niezmienne komórki T związane z błoną śluzową (MAIT), limfocyty T Vδ1 γδ, limfocyty T Vδ2 γδ i limfocyty T NK (NKT). Te podgrupy wrodzonych limfocytów T wykazują również heterogeniczność w swoich populacjach, co zwiększa złożoność interakcji między populacjami komórek zaangażowanymi we wrodzoną odpowiedź immunologiczną11. W związku z tym mechanizm, który aktywuje te wrodzone limfocyty T i wiedza o określonych podgrupach wrodzonych limfocytów T mogą stanowić inną drogę badań w celu ograniczenia zakaźnego wpływu tych wirusów na ludzkiego gospodarza, zwłaszcza w okresie opracowywania szczepionki.

Komórki nabłonkowe zakażone grypą wytwarzają czynniki, które szybko aktywują wrodzone limfocyty T12,13,14. Opierając się na tym odkryciu, ten bezkontaktowy model kohodowli interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ma na celu naśladowanie wczesnych interakcji chemicznych (za pośrednictwem rozpuszczalnych czynników uwalnianych przez zakażoną warstwę nabłonkową) między zakażoną warstwą nabłonka nosa a PBMC podczas wczesnej infekcji. Fizyczne oddzielenie warstwy nabłonka nosa (hodowanej na wkładkach błonowych) i PBMC (w komorze pod spodem) oraz integralność nabłonka zapobiegają bezpośredniemu zakażeniu PBMC przez wirusa, umożliwiając szczegółowe badanie wpływu rozpuszczalnych czynników pochodzenia nabłonkowego na PBMC. Zidentyfikowane czynniki mogą być zatem dalej badane pod kątem ich potencjału terapeutycznego w indukowaniu odpowiedniej wrodzonej populacji limfocytów T, która może chronić przed zakażeniem grypą. W związku z tym w niniejszej pracy szczegółowo opisano metody ustanawiania kokultury do badania aktywacji wrodzonych limfocytów T z rozpuszczalnych czynników pochodzących z nabłonka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z przepisami mediów używanych w tym protokole.
UWAGA: Stwierdzono, że hNECS wyhodowane na 12-dołkowym transwellu osiągają bardziej optymalną grubość, aby rozpuszczalne czynniki łatwo docierały do komory podstawowej po zakażeniu wirusem grypy. Dlatego zaleca się stosowanie 12-dołkowej transwella do wspólnej hodowli.

1. Ustanowienie warstwy zasilającej 3T3

  1. Zakład z zamrożonych zapasów
    1. Rozmrozić kriowialny kriolist fibroblastów NIH/3T3 z zamrożonych zapasów. Dodaj zawartość kriowialu do 2 ml kompletnego Dulbecco's Minimal Essential Media (DMEM) i ponownie zawieś komórki.
    2. Wirować przez 5 minut w temperaturze 300 × g i temperaturze pokojowej (rtp) i usunąć supernatant. Ponownie zawieś komórki w kompletnym DMEM.
    3. Policz komórki, używając barwienia na niebiesko trypanem. Dodać 10 μl błękitu trypanowego do 10 μl zawiesiny zawieszonych komórek. Dokładnie wymieszać i dodać 10 μl zawiesiny do hemocytometru, aby policzyć komórki.
    4. Komórki nasienne o gęstości 1 × 104 komórki/cm2 w odpowiednim naczyniu hodowlanym (np. kolbie T75). Otrzymaną kolbę hodowlaną inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
  2. Leczenie mitomycyną C
    1. Po 3 dniach upewnij się, że konfluacja wynosi 60%-80%, usuń pożywkę i umyj komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS).
      UWAGA: Ważne jest, aby warstwa zasilająca 3T3 nie osiągnęła pełnej zbieżności; w przeciwnym razie leczenie mitomycyną C nie będzie skuteczne.
    2. Dodać do kolby DMEM uzupełniony mitomycyną C i inkubować przez 3,5 godziny w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2. Usuń pożywkę zawierającą mitomycynę C i umyj komórki 2x 1x PBS.
  3. Wysiew komórek 3T3 na płytkach 6-dołkowych
    1. Dodaj 3 ml 1x trypsyna-EDTA do kolby na 3-5 minut, aby oddzielić komórki. Zbierz oddzielone komórki do świeżej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o pojemności 15 ml przez 5 minut przy stężeniu 300 × g, rtp; Odrzucić supernatant. Ponownie zawieś komórki w kompletnym DMEM.
    2. Policz komórki, używając barwienia na niebiesko trypanem. Wysiewaj komórki na 6-dołkowej płytce w temperaturze 7,5 × 10 5-2,5 × 106 komórek/dołek. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2.
      UWAGA: Warstwa zasilająca 3T3 jest uważana za gotową, jeśli komórki są zdrowe. W tym momencie wysiewaj ludzkie komórki macierzyste/progenitorowe nabłonka nosa (hNESPC) na warstwę zasilającą w celu ekspansji.
    3. Dodać Complete DMEM do kolby i inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez noc, aby komórki 3T3 odzyskały sprawność po leczeniu mitomycyną C.

2. Założenie hodowli ludzkich komórek nabłonka nosa (hNEC)

UWAGA: Próbki kliniczne powinny być pobierane od pacjentów, którzy nie mają objawów infekcji górnych dróg oddechowych.

  1. Przetwarzanie tkanki nosa na zawiesinę jednokomórkową
    1. Przemyć tkankę nosa w 1x PBS (dPBS) firmy Dulbecco (PBS bez Mg2+ i Ca2+) zawierającym 100 μl/ml mieszaniny antybiotykowo-przeciwgrzybiczej. Pociąć tkankę na małe fragmenty i poddać próbkę działaniu obojętnej proteazy w stężeniu 10 mg/ml przez noc w temperaturze 4 °C z wytrząsaniem.
    2. Wirować przez 5 minut w temperaturze 200 × g, a po odwirowaniu usunąć supernatant. Inkubować osad w 1-2 ml 1x trypsyna-EDTA (37 °C, 15 min) i schłodzić, dodając objętość płodowej surowicy bydlęcej równą 10% objętości w probówce.
    3. Mechanicznie zdysocjować strawioną tkankę na agregaty jednokomórkowe za pomocą pipetowania, a następnie przepuścić powstałą zawiesinę przez sitko o wielkości 70 μm. Ponownie zawieś komórki w całym DMEM.
      UWAGA: Po tym etapie zawiesina komórkowa jest mieszaniną terminalnie zróżnicowanych komórek i komórek macierzystych, które są określane jako ludzkie komórki macierzyste / progenitorowe nabłonka nosa (hNESPC). Celem kolejnych etapów jest selekcja i wzbogacenie populacji hNESPC z mieszaniny różnych populacji komórek.
  2. Wysiew zawiesiny jednokomórkowej na warstwie zasilającej 3T3 w celu selekcji hNESPC
    1. Odwirować zawiesinę komórek z kroku 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp) i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 3-5 ml pożywki 3,
      UWAGA: Pożywka 3 została opracowana w celu promowania selektywnego wzrostu hNESPC.
    2. Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Wysiewać 1 x 106 komórek w 2 ml pożywki 3 na dołek na płytkę 6-dołkową zawierającą przygotowaną warstwę podajnika 3T3 po usunięciu pożywki z płytki 6-dołkowej. Otrzymaną kokulturę inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2.
      UWAGA: Po wysianiu należy uważać, aby nie poruszyć płytką, ponieważ wpłynie to na mocowanie hNESPC.
    3. Zmieniaj pożywkę 3 (2 ml) co 2-4 dni, całkowicie usuwając starą pożywkę i zastępując ją świeżą pożywką 3,
      UWAGA: Pożywka jest zmieniana w celu uzupełnienia składników odżywczych i zapobieżenia negatywnemu wpływowi nadmiernie kwaśnych warunków na wzrost hNESPC. Odstęp czasu między każdą zmianą pożywki zależy od tego, jak kwaśne (żółte) staje się podłoże. Odstępy należy skracać, jeśli podłoże szybko staje się kwaśne.
    4. Po 7-10 dniach obserwuj, że hNESPC znajdują się w konfluencji odpowiedniej do przeniesienia ich na wkładki membranowe. Zobacz Rysunek 1 przedstawia reprezentatywną morfologię hNESPC w 3 różnych punktach czasowych (2 dni, 5 dni i 10 dni).
  3. Przenoszenie hNESPC na wkłady membranowe
    UWAGA: Ze względu na leczenie mitomycyną C, warstwa zasilająca 3T3 będzie powoli ulegać degradacji w okresie ekspansji hNESPC. Spowoduje to osłabienie przyczepności do powierzchni studzienki, co pozwoli na ich usunięcie przez przepłukanie pipetą, pozostawiając tylko zdrowe hNESPC.
    1. Usuń pożywkę i dodaj 500 μl 1x dPBS do każdej studzienki. Przepłucz komórki 3x mikropipetą, aby usunąć komórki 3T3 i wyrzuć 1x dPBS. Obserwuj pod mikroskopem, czy okrągłe hNESPC pozostają, podczas gdy warstwa podajnika 3T3 w kształcie wrzeciona jest usuwana.
    2. Dodać 500 μl odczynnika do dysocjacji komórek na studzienkę i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 5-10 minut lub do momentu, gdy hNESPC oderwą się od powierzchni studzienki.
    3. Zebrać zawiesinę hNESPC, odwirować (300 × g, 5 min, rtp) i usunąć supernatant.
    4. Zawiesić pelety w podłożu 3. Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym. Nasiona 3 × 104 komórki w 150 μl pożywki 3 na wkładkę membranową (płytka 24-dołkowa) lub 1 × 105 komórek w 300 μl pożywki 3 na wkładkę membranową (płytka 12-dołkowa) (Rysunek 2). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2
      5. .
    5. Zmieniaj pożywkę (pożywkę 3) komory wierzchołkowej i podstawnej co 2 dni. Przesunąć końcówkę pipety między ramionami podtrzymującymi wkładkę membranową, aby uzyskać dostęp do komory podstawowej, usunąć starą pożywkę, a następnie ponownie wprowadzić świeżą pożywkę tą samą metodą. Chociaż komora wierzchołkowa jest łatwo dostępna, należy uważać, aby nie naruszyć rosnącej warstwy hNESPC.
      UWAGA: Nie należy naruszać podłoża w komorze wierzchołkowej przez co najmniej 2 dni po wysianiu, ponieważ komórki potrzebują czasu, aby przyczepić się do membrany.
  4. Różnicowanie hNESPC na hNEC
    1. Gdy hNESPC osiągną 100% zbieżności (około 3-7 dni od wysiewu na wkładkę membranową), rozpocznij hodowlę ALIA. Zmień podłoże podstawowe na podłoże różnicujące i usuń pożywkę z komory wierzchołkowej. Dodawaj pożywkę tylko do komory podstawowej bez dodawania jej do komory wierzchołkowej podczas zmiany pożywki co 2-3 dni, jak wskazano w Rysunek 3 i krok 2.3.5.
      UWAGA: Pożywka została zmieniona na pożywkę różnicującą w celu promowania różnicowania hNESPC na hNEC w ALI. hNESPC potrzebują około 3-4 tygodni, aby osiągnąć pełną dojrzałość, aby stać się hNEC w ALI, w którym to momencie komórki wyrosłyby na wielowarstwę z różnymi populacjami komórek w każdej warstwie. Rzęski należy również obserwować w powiększeniu 400x (rzęski można rozpoznać po ich ruchu uderzeń, który powoduje, że pole mikroskopu wygląda tak, jakby wibrowało). W tym momencie komórki są gotowe do wykorzystania w eksperymentach z kokulturą. Patrz Rysunek 4, aby zapoznać się z przekrojem w pełni zróżnicowanej warstwy hNEC.
    2. Po uzyskaniu dojrzałych hNEC przemyć komórki w komorze wierzchołkowej 3x 1x dPBS w odstępach 2-3-dniowych przez 1 tydzień przed eksperymentem z kohodowlą. Synergizuj etap mycia ze zmianami podłoża podstawowego i wykonaj pranie w następujący sposób.
      1. Dodać 50 μl (24-dołkowych)/150 μl (12-dołkowych) 1x dPBS do komory wierzchołkowej wkładki membranowej i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Usunąć dPBS po 10 minutach inkubacji w celu usunięcia nagromadzonego śluzu i martwych komórek w trakcie różnicowania.
        UWAGA: W zależności od charakteru eksperymentu, roztwór wodorowęglanu sodu może być użyty do całkowitego zmycia warstwy śluzu. Jednak w przypadku infekcji wirusowej w eksperymentach z kokulturą warstwa śluzu jest zatrzymywana, a tylko nadmiar śluzu jest usuwany za pomocą płukania dPBS. Ta retencja ma naśladować fizjologiczną warstwę śluzu obecną na nabłonku nosa, która będzie wchodzić w interakcje z nadchodzącą infekcją wirusową.

3. Pomiar transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER)

UWAGA: Potwierdzenie integralności nabłonka jest ważne, aby zapewnić uzyskanie nienaruszonej i zdrowej warstwy nabłonka. Nienaruszoną warstwę nabłonka określa się za pomocą pomiaru TEER wykonanego na 4 dołach losowych za pomocą woltoomomierza.

  1. Przepłucz elektrodę 70% etanolem i sterylizuj ją światłem ultrafioletowym przez 15 minut przed użyciem, aby zapewnić sterylność. Po sterylizacji spłukać 1x dPBS.
  2. Dodaj 100 μL (dla 24-dołkowych) lub 300 μL (dla 12-dołkowych) 1x dPBS do komory wierzchołkowej wkładki membranowej. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut; następnie usuń dPBS.
  3. Dla każdej studzienki, która ma być mierzona, należy przygotować niewykorzystaną studzienkę z 1 ml (dla 24-dołka) lub 3 ml (dla 12-dołka) wstępnie podgrzanego (do 37 °C) podłoża różnicującego. Umieścić wkładkę membranową w przygotowanym dołku i dodać 200 μl (dla 24-dołkowych) lub 600 μl (dla 12-dołkowych) wstępnie podgrzanego podłoża różnicującego do komory wierzchołkowej. Zachować równowagę w temperaturze 37 °C (w zależności od temperatury inkubacji dodanego typu wirusa, np. 35 °C w przypadku grypy) przez 15 min.
    UWAGA: W ten sam sposób należy przygotować ślepą próbę (pustą wkładkę membranową) do obliczenia TEER.
  4. Równowaga 15 ml probówki z podgrzaną pożywką różnicującą w tej samej temperaturze również przez 15 minut. Umieść elektrody w probówce o pojemności 15 ml i włącz woltoomomierz.
    UWAGA: W tym momencie odczyt powinien wynosić 0 rezystancji, ponieważ elektrody są w tym samym medium. Jeśli zostanie uzyskany jakikolwiek inny odczyt, zrównoważyć elektrodę w probówce o pojemności 15 ml, aż odczyt wyniesie 0.
  5. Zaczynając od ślepej próby, umieść elektrody w każdej studzience tak, aby jedna elektroda była zanurzona w wierzchołkowym ośrodku komory, a druga w ośrodku w komorze podstawowej. Zapisuj odczyt tylko wtedy, gdy uzyskuje się stały odczyt przez okres co najmniej 5 minut.
  6. Po każdym pomiarze umyj elektrodę PBS przed następnym pomiarem. Dla każdej dobrze przetestowanej studni należy wykonać pomiary dla trzech próbek w różnych pozycjach membrany. Aby obliczyć TEER netto każdej próbki, należy odjąć od każdego pomiaru opór tła wynikający z wkładki ślepej próby.
  7. Oblicz całkowity odczyt TEER dla studni, korzystając z następującego równania:
    Integralność nabłonka (Ωcm2) = TEER netto (omy) × Obszar membrany (cm2)
    UWAGA: Wartości TEER hNEC dla eksperymentów z infekcjami wirusowymi powinny wynosić >1000 Ωcm2 13,15,16.

4. Izolacja monocytów krwi obwodowej i komórek NK

UWAGA: Próbki krwi powinny być pobrane od zdrowych ochotników i wykorzystane w tym samym dniu izolacji.

  1. Zbierz 30-40 ml krwi pełnej od każdego dawcy do probówek do pobierania krwi o pojemności 10 ml.
  2. Wyizolować PBMC za pomocą wirowania w gradionym gradieniu gęstości i otrzymać PBMC z powłoki kożuchowej po wykonaniu następujących czynności (patrz również Tabela materiałów).
    1. Dokładnie wymieszaj ~10 ml krwi z probówki do pobierania krwi w odkurzaczu przed rozcieńczeniem równą objętością zbilansowanego roztworu soli (PBS).
    2. Dodaj 15 ml pożywki o gradiencie gęstości do podstawy probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Stosunek pożywki o gradiencie gęstości do rozcieńczonej krwi powinien wynosić 2:3-3,5.
    3. Nałożyć 35 ml rozcieńczonej krwi na podłoże o gradiencie gęstości za pomocą pistoletu do pipetowania (z ustawieniem dozowania ustawionym na najniższą możliwą wartość), przechylając probówkę o 45° i pozwalając, aby rozcieńczona krew opadała kroplami na wewnętrzną ściankę probówki, tak aby warstwa pożywki o gradiencie gęstości nie została naruszona.
    4. Odwirować lizat w temperaturze 500 × g, 18-20 °C przez 30 minut (hamulec: wyłączony). Ostrożnie usuń i wyrzuć górną warstwę plazmy, nie naruszając dolnej warstwy.
    5. Przenieś sierść kożuchową do nowej probówki bez mieszania warstwy czerwonych krwinek, warstwy średniej gęstości gradientowej lub sierści kożuchowej. Po zebraniu kożucha w nowej probówce o pojemności 50 ml, uzupełnij objętość do 50 ml za pomocą 1x PBS.
    6. Odwirować lizat w temperaturze 800 × g, 18-20 °C, 8 min (hamulec: wyłączony) i usunąć supernatant za pomocą pistoletu do pipetowania. Zawiesić osad komórkowy z 50 ml 1x PBS i odwirować w temperaturze 120 × g, 18-20 °C, 10 minut w celu usunięcia płytek krwi.
    7. Usunąć supernatant przez pipetowanie, nie naruszając osadu komórkowego.
      UWAGA: Ponieważ osad komórkowy może być luźny, nie zaleca się wyrzucania supernatantu przez wsypywanie.
    8. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą kompletnego podłoża RPMI (Roswell Park Memorial Institute). Przeprowadzić zliczanie komórek, dodając 10 μl 3% kwasu octowego z błękitem metylenowym do 10 μl zawiesiny komórek. Dokładnie wymieszaj i dodaj 10 μl mieszaniny do hemocytometru, aby policzyć komórki.
  3. Rozcieńczyć PBMC pełną pożywką RPMI do gęstości 2 × 106/ml (dla 24-dołkowych) lub 4 × 106/ml (dla 12-dołkowych).

5. Infekcja wirusowa hNEC i przejście do kokultury hNEC:PBMC

UWAGA: H3N2 (A/Aichi/2/1968) jest używany jako reprezentatywny szczep infekcji w tym protokole. Wielokrotność infekcji (MOI) wynosząca 0,1 jest używana jako reprezentatywna MOI w tym protokole.

  1. Dzień 0 (Zakażenie hNECs)
    UWAGA: Jedna studzienka z hNEC wyhodowanych od tego samego dawcy jest używana do uzyskania reprezentatywnej liczby komórek dla każdej studzienki użytej w eksperymencie.
    1. W basenie reprezentatywnym dodać 150 μl 1x trypsyna-EDTA do komory wierzchołkowej wkładki membranowej i 350 μl 1x trypsyna-EDTA do komory podstawowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut lub do momentu, gdy komórki oderwą się od błony.
    2. Przepłukać komórki na membranie, pipetując w górę i w dół, a następnie zebrać zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodaj 200 μl kompletnego DMEM, aby ugasić aktywność trypsyny. Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym, aby uzyskać liczbę komórek na studzienkę.
    3. Obliczyć wymagany MOI wirusa na podstawie liczby komórek w basenie i odpowiednio rozcieńczyć zapas wirusa za pomocą pełnego RPMI na lodzie.
      UWAGA: MOI 0,1 z 1,26 × 106 hNEC na studzienkę = 1,26 × 105 cząstek wirusa H3N2 na studzienkę w 30 μl (dla 24-dołkowych)/100 μL (dla 12-dołkowych)
    4. W przypadku pozostałych studzienek do eksperymentu z infekcją dodać 50 μl (dla 24-dołka)/150 μL (dla 12-dołka) 1x dPBS do komór wierzchołkowych wkładek membranowych, inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut i usunąć 1x dPBS.
    5. Zmień podłoże podstawowe we wkładkach membranowych na pełne podłoże RPMI, przenosząc wkładki na nową płytkę z pełnym RPMI dodanym do studzienek (350 μL (dla 24-dołkowych)/700 μL (dla 12-dołkowych)).
      UWAGA: Gdy hNESPC w pełni zróżnicują się z hNEC, są tolerancyjne/permisywne na różne podłoża przez okres do 72 godzin, bez zmian w morfologii lub organizacji, gdy podłoże jest przełączone na RPMI12. RPMI jest stosowany do wspomagania wzrostu i utrzymania populacji PBMC.
    6. Dodać przygotowane 30 μl (dla 24-dołka)/100 μl (dla 12-dołka) inokulum wirusa do komory wierzchołkowej wkładki membranowej, inkubować w temperaturze 35 °C w atmosferze 5% CO2 przez 1 godzinę i usunąć inokulum wirusa z komory wierzchołkowej.
    7. Zmienić podłoże podstawowe wkładu membranowego na świeże, kompletne podłoże RPMI i inkubować w temperaturze 35 °C w atmosferze 5%CO2 przez 24 godziny.
  2. Dzień 1 (ustanowienie kokultury hNEC + PBMC)
    1. Wysiewać wymaganą liczbę PBMC w 150 μl (dla 24-dołkowych)/300 μl (dla 12-dołkowych) kompletnego podłoża RPMI, bezpośrednio dodając zawiesinę PBMC do komory podstawowej każdego dołka niezakażonych lub zakażonych hNEC od dnia 0 (1,5 × 106 dla płytek 24-dołkowych i 3 × 106 dla płytek 12-dołkowych). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24/48 h.
      UWAGA: Końcowa objętość w komorze podstawowej po założeniu kokultury wynosi 500 μL (dla 24-dołka)/1000 μL (dla 12-dołka).
  3. Dni 2-3 (zbiór PBMC 48/72 h po zakażeniu wirusowym)
    1. Pobranie supernatantów wierzchołkowych (48/72 h po zakażeniu wirusowym)
      1. Dodać 50 μl (dla 24-dołków)/150 μL (dla 12-dołkówki) 1x dPBS do każdej komory wierzchołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 min. Zebrać 1x dPBS w probówkach 1,5 ml. Podwielokrotność 25 μl (dla 24-dołkówki)/50 μl (dla 12-dołkówki) supernatantu do oznaczania płytek w nowej probówce o pojemności 1,5 ml i natychmiast zamrozić zarówno podstawówkę, jak i podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
    2. Pobieranie komórkowego RNA z hNEC (48/72 h po infekcji wirusowej)
      1. Przenieść wkładkę membranową do czystej studzienki, dodać 300 μl (dla 24-dołkowej)/600 μl (dla 12-dołkowej) buforu do lizy RNA do komory wierzchołkowej i inkubować w temperaturze rtp przez 5 minut. Zebrać supernatant w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA do analizy molekularnej.
    3. Zbiór PBMC (48/72 h po infekcji wirusowej)
      1. Za pomocą szerokiej podstawy sterylnej końcówki pipety delikatnie zeskrob powierzchnię studzienki, aby usunąć aktywowane PBMC, które mogą przylegać do powierzchni studzienki. Zebrać podłoże podstawowe zawierające PBMC w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml.
      2. Przepłukać studzienki 2x 300 μl 1x dPBS i zebrać popłuczyny do tej samej probówki o pojemności 2 ml. Odwirować probówkę o pojemności 2 ml (500 × g, 5 min, rtp) i zebrać supernatant do świeżej probówki o pojemności 2 ml bez naruszania osadu komórkowego. Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C do analizy cytokin i chemokin; Ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μL 1x dPBS.

6. Cytometria przepływowa

UWAGA: Ta sekcja protokołu jest bezpośrednio kontynuowana z poprzedniej sekcji przy użyciu zawieszenia komórek PBMC z kroku 5.3.3.2. Upewnij się, że podczas wykonywania kolejnych czynności w tym rozdziale jest minimalna ekspozycja na światło. Przykładowy panel markerów do barwienia powierzchni można znaleźć w tabeli 2.

  1. Barwienie powierzchni
    1. Przenieś zawieszone osady komórek PBMC do płytki dennej 96 V. Odwirować lizat w stężeniu 800 × g przez 3 minuty i usunąć supernatant.
    2. Inkubować wszystkie PBMC (z wyjątkiem "niebarwionych") ze 100 μl barwnika żywotności przez 15 minut w temperaturze rtp. Uzupełnij do 200 μl 150 μl buforem do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Odwirować lizat o stężeniu 800 × g przez 3 minuty i odrzucić supernatant.
    3. Przygotować panel z badanych przeciwciał barwiących powierzchnię o odpowiednich proporcjach rozcieńczenia i końcowej objętości 50 μl na reakcję (uzupełnić buforem MACS w celu uzyskania końcowej objętości). Barwienie powierzchni należy przeprowadzić, dodając do komórek 50 μl przygotowanej mieszaniny przeciwciał za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut w ciemności.
    4. Przemyć dodając 150 μl buforu MACS. Odwirować lizat o stężeniu 800 × g przez 3 minuty i odrzucić supernatant. Jeśli barwienie wewnątrzkomórkowe nie jest wymagane, należy przejść bezpośrednio do 15-minutowej inkubacji w kroku 6.3.
  2. Barwienie wewnątrzkomórkowe (w razie potrzeby)
    1. Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu utrwalającego i przepuszczalnego. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności. Uzupełnij studzienki 100 μl 1x buforu MACS.
    2. Odwirować (800 × g, 3 min, 25 °C) i usunąć supernatant. Powtórz pranie, dodając 200 μl 1x bufor do płukania przepuszczalności. Odwirować (500 × g, 3 min, 25 °C) i usunąć supernatant.
    3. Przygotować rozcieńczenia dla panelu przeciwciał, aby osiągnąć końcową objętość 50 μl, używając 1x buforu do przemywania permeabilizacji. Inkubować na lodzie przez 30 minut w ciemności. Dodaj 200 μl 1x bufor do przemywania przepuszczalności.
    4. Odwirować komórki (800 × g, 3 min, 4 °C) i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl bufora do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.
  3. Odpipetować 200 μl roztworu lizującego do każdego dołka. Inkubować przez 15 minut w rtp. Odwirować lizat o stężeniu 800 × g przez 3 minuty i odrzucić supernatant.
  4. Zawiesić osady komórkowe w 200 μl buforu MACS. Wykonać cytometrię przepływową zgodnie z ustawieniami opisanymi wcześniej13 lub przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.

7. Oznaczanie poziomów cytokin i chemokin.

  1. Poddać 25 μl supernatantu z komory podstawowej, stosując multipleksowy test immunologiczny zgodnie z protokołem producenta18.
  2. Oblicz stężenie każdego analitu za pomocą oprogramowania do zarządzania multipleksami wykorzystującego algorytm dopasowania krzywej (5 parametrów) dla krzywej standardowej.

8. Ocena skażenia wirusowego

  1. Ekstrahuj wirusowe RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji na 4 zestawach roztworów: podstawowy roztwór H3N2, rozcieńczenie MOI 0,1 do infekcji, 10-krotne seryjne rozcieńczenia MOI 0,1 i podłoże podstawowe z próbek (zarówno 48, jak i 72 godziny po infekcji wirusowej)12.
  2. Wybrać gen niestrukturalny (NS1) i matrycę (M1) jako cele dla reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) (patrz Tabela materiałów dla starterów użytych w reprezentatywnym doświadczeniu).
  3. Przeprowadzić PCR Z ODWROTNĄ TRANSKRYPCJĄ (RT-PCR) (42 °C, 60 min) w celu przekształcenia wirusowego RNA w cDNA przed wykonaniem ilościowego PCR (qPCR) w celu zmierzenia poziomów NS1 i M1 jako wskaźnika obecności wirusa i skorelować poziomy z krzywą wzorcową uzyskaną z RT-qPCR przeprowadzonego na 10-krotnym seryjnym rozcieńczeniu podwielokrotności MOI 0,1. Patrz tabela 3 w celu zapoznania się ze składem mieszanin reakcyjnych i należy zastosować następujące warunki: wstępna inkubacja w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie 3-stopniowa amplifikacja przez 40 cykli: 95 °C przez 10 s, 60 °C przez 10 s, 72 °C przez 30 s; krzywa topnienia: 95 °C przez 10 s, 65 °C przez 60 s i 97 °C przez 1 s.

9. Test płytki nazębnej

  1. Dzień 0: wysiew MDCK (Madin Darby Canine Kidney) w płytkach 24-dołkowych
    1. Usunąć pożywkę z kolby T75 z konfluentnymi komórkami MDCK. Przemyj 2x 1x PBS, aby usunąć wszelkie ślady serum. Trypsynizować komórki MDCK, dodając 10 ml trypsyny i inkubując w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 20-30 minut, aż komórki się oderwą.
      UWAGA: Nie należy stukać w kolbę, ponieważ może to spowodować zbrylanie.
    2. Odpipetować zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml kompletnego podłoża Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM). Odwirować (300 × g, 5 min, rtp) i usunąć supernatant.
    3. Zawiesić komórki w 6 ml kompletnego EMEM. Policz komórki przez barwienie trypanem na niebiesko.
    4. Rozcieńczyć zawiesinę komórek MDCK do stężenia 1 × 105 komórek/ml i zasiać 1 ml rozcieńczonej zawiesiny w każdym dołku sterylnej płytki 24-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 24 godziny w celu uzyskania zlewającej się monowarstwy komórek MDCK w każdym dołku.
  2. Dzień 1: zakażenie komórek MDCK
    1. Przygotuj pożywkę infekcyjną. Usunąć pożywkę z monowarstwy MDCK na płytce 24-dołkowej i przemyć 2x 1x dPBS. Do drugiego płukania pozostaw PBS w studzienkach, przygotowując seryjne rozcieńczenia wirusa.
    2. Rozmrozić próbki wirusa na lodzie i seryjnie rozcieńczyć je na 24-dołkowej płytce, aby uzyskać seryjne rozcieńczenia od 10-1 do 10-6,
      UWAGA: Na przykład napełnij każdą studzienkę na 24-dołkowej płytce 270 μl pożywki infekcyjnej.
    3. Dodać 30 μl próbki wirusa do pierwszego dołka w rzędzie. Za pomocą nowej końcówki pipety dobrze wymieszaj i przenieś do następnego dołka w rzędzie, aby rozcieńczyć próbkę 10-krotnie. Postępować do momentu uzyskania rozcieńczenia 10-6; Wykonaj kroki 9.2.1-9.2.3 dla wszystkich próbek wirusów.
    4. Usunąć PBS z płytki MDCK i zainfekować w dwóch egzemplarzach 100 μl przygotowanych rozcieńczeń wirusa. W przypadku studzienek kontrolnych dodać 100 μl pożywki infekcyjnej (bez próbki wirusa). Inkubować w temperaturze 35 °C w atmosferze 5%CO2 przez 1 godzinę, potrząsając płytką w celu wyeliminowania suchych plam co 15 minut.
    5. Usuń inokulum wirusa i dodaj 1 ml płynnej nakładki do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 35 °C w atmosferze 5% CO2 przez 72 godziny.
  3. Dzień 4 (72 godziny po zakażeniu): wizualizacja blaszki miażdżycowej
    1. Usuń płynną nakładkę i utrwal komórki 4% formaldehydem w 1x PBS przez 1 godzinę. Usuń roztwór formaldehydu i umyj raz 1x PBS lub wodą destylowaną.
    2. Zabarwić utrwalone komórki, dodając 1% roztwór fioletu krystalicznego przez 15 minut. Usuń barwnik fioletu krystalicznego i umyj komórki pod bieżącą wodą. Wysuszyć płytkę w temperaturze rtp.
    3. Po wyschnięciu policz blaszki i oblicz miano wirusa zgodnie z następującym wzorem:
      Liczba blaszek × współczynnik rozcieńczenia = liczba jednostek tworzących płytkę nazębną w 100 μl

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Choć konwencjonalne limfocyty T tworzą główny repertuar adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko infekcjom wirusowym, ułatwiając eliminację wirusa, populacja wrodzonych limfocytów T działa w szerszym zakresie, aby ograniczyć ładunek wirusowy, co umożliwia skuteczną eliminację na późniejszym etapie. Dlatego niniejszy protokół tworzy specyficzne, optymalne warunki do badania wrodzonych limfocytów T, ich aktywacji oraz ich populacji funkcjonalnej po zakażeniu grypą, bez konieczności...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wrodzona odpowiedź immunologiczna przeciwko wirusom jest niedostatecznie zbadaną dziedziną badań w leczeniu przeciwwirusowym. Komórki nabłonka dróg oddechowych i wrodzone komórki odpornościowe współpracują ze sobą, aby zahamować replikację wirusa podczas infekcji, oprócz tego, że służą jako wyznacznik nadaktywnej odpowiedzi adaptacyjnej, jeśli miano wirusa nie jest kontrolowane 12,13,17. Jednak opracowanie odpowiedniego modelu l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować personelowi badawczemu z Zakładu Otolaryngologii NUS oraz Zakładu Mikrobiologii i Immunologii za pomoc w pracach związanych z hodowlą hNEC i kulturą wirusów. Chcielibyśmy również podziękować chirurgom i zespołowi chirurgicznemu z National University Hospital, Department of Otolaryngology, za ich pomoc w dostarczeniu próbek komórek i krwi wymaganych do badania.
Badanie to zostało sfinansowane przez National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (do De Yun Wang) i MOH-OFYIRG19may-0007 (do Kai Sen Tan). Kai Sen Tan jest stypendystą stypendium European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5% Trypsyna-EDTAGibco15400-054
0,5 M Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), pH 8,0, bez RNazThermofisherAM9260G0,5 M EDTA
1,5 ml Probówki SafeLockEppendorf00301200861,5 ml
10 ml K3EDTA Probówki próżnioweBD36664310 ml probówki do pobierania krwi 10x
dPBSGibco14200-075
10x PBSVivantisPC0711
12-dołkowa płytkaCorning 3513
12-dołkowa wkładka Transwell Corning Wkładka membranowa3460
1x FACS Lysing SolutionBD349202
2,0 ml probówki SafeLockEppendorf00301200942 ml probówka wirówkowa
24-dołkowa płytkaCorning 3524
24-dołkowa wkładka Transwell Corning 3470
3% Kwas octowy z błękitem metylenowymSTEMCELL Technologies07060
3,3',5-triiodo-l-tyroninaSigmaT-074
37% roztwór formaldehydu w 15% metanolu jako stabilizator w wirówce H2OSigma533998
5810REppendorf5811000320
5 mL polipropylenu rurki przepływowe BD352058
70 i mikro; m Sitko do komórekCorning 
A-4-62 RotorEppendorf5810709008
AccutaseGibcoA1110501Odczynnik do dysocjacji komórek
Antybiotyk-AntybiotykGibco15240-062
Avicel CL-611FMC BiopolimerNAPłynna nakładka
Bio-Plex Manager 6.2 Standardowe oprogramowanieBio-Rad Laboratories, Inc171STND01Multiplex Manager Software
Igła motylkowa 21 GBD367287
ToksynaSigmaC8052
Kryształ Fioletowy MerckC6158
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722Roztwór do utrwalania i przepuszczalności
Dispase IISigmaD4693Neutralna proteaza
DMEM/Wysoki poziom glukozyGE Healthcare Life SciencesSH30243.01
DMEM/Mieszanka składników odżywczych F-12Gibco-Invitrogen11320033
dNTP MixPromegaU1515dNTP Mix
EMEM (z L-glutaminą)ATCC30-2003
EVOM woltomierzWPI, Sarasota, FL, USA300523
FACS Roztwór do lizyBD3492021x Roztwór do lizy
Falcon probówka 15 mlCellStar18827115 ml Probówka
Falcon 50 mlCellStar22726150 ml Rurka
szybkiego startu Niezbędne sondy DNA MasterRoche6402682001qPCR Master Mix
Ficoll Paque PremiumInstrumenty badawcze17544203Media gradientowe gęstości
H3N2 (A/AICHI/2/1968) ATCCVR547
H3N2 M1 Sekwencja starterów do przoduSigma5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'H3N2
M1 Odwrotna sekwencja starterówSigma5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'H3N2
NS1 Sekwencja starterów do przoduSigma5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'H3N2
NS1 Odwrotna sekwencja starterówSigma5'- CCTCTTCGGTGAAAAGCCCTT-3'Inaktywowana
termicznie płodowa surowica bydlęcaGibco10500-064
hNESPCLudzcy dawcyNA
Ludzki nabłonkowy czynnik wzrostuGibco-InvitrogenPHG0314
HydrokortyzonSTEMCELL Techonologies7925Pobrane z biopsji nosa podczas operacji
skrzywienia przegrodyInsulinaSigmaI3536
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR Instrument
Żywy/MARTWY zestaw do barwienia niebieskich komórek * do wzbudzenia UVThermofisherL23105Barwienie żywotności
MILLIPLEX MAP Ludzka cytokina / chemokina Panel magnetyczny II - Wstępnie zmieszany 23 PlexMerck Pte LtdHCP2MAG-62K-PX23Test immunologiczny Multiplex
Mitomycyna CSigmaM4287
M-MLV 5x BuforPromegaM1705RT-PCR 5x Bufor
M-MLV Odwrotna transkryptazaPromegaM1706Suplement odwrotnej transkryptazy
N-2Gibco-Invitrogen17502-048
NIH/3T3ATCCCRL1658
Trwała trwała/płuczka BuforBD554723Permeabilizacja Bufor do płukania
PneumaCult-ALI 10x SuplementSTEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI Basal MediumSTEMCELL Techonologies5001
PneumaCult-ALI Suplement podtrzymujący (100x)Technologie STEMCELL5001
Losowe starteryPromegaC1181Losowe startery
Rekombinowany inhibitor rnazy rnazyPromegaN2511Bufor
do lizy RNA inhibitora RNazyQiagenCzęść 52904
RPMI 1640 (w L-glutamina)ATCC30-2001
Elektrody STX2WPI, Sarasota, FL, USAElektrodaSTX2
T25 KolbaCorning430639
T75Kolba Corning430641U
TPCK TrypsinSigmaT1426
Trypan BlueHycloneSV30084.01
Zestaw do ekstrakcji wirusowego RNAQiagen52904Zestaw do ekstrakcji wirusowego RNA
96-dołkowa płytka w kształcie litery VCorning3894
431751

Bibliografia

  1. Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
  2. Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364(2013).
  3. Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
  4. Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
  5. Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132(2020).
  6. Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11(2020).
  7. Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
  8. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653(2016).
  9. Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
  10. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706(2018).
  11. Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
  12. Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
  13. Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514(2018).
  14. Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986(2019).
  15. Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
  16. Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
  17. Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685(2018).
  18. Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation (2020).
  19. Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130(2020).
  20. Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywacja odporności wrodzonejkomórki nabłonka nosawrodzone limfocyty Tmononuklearne komórki krwi obwodowejcytometria przepływowazakażenie wirusem grypyinterakcja immunologiczna nabłonkaanaliza cytokin
Bezkontaktowy model kohodowli do badania aktywacji wrodzonych komórek odpornościowych podczas infekcji wirusem układu oddechowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.