Artykuł metodologiczny

Ustalenie szczurzego modelu niedrożności zatoki strzałkowej górnej za pomocą metody zatorowości gwintowanej

DOI:

10.3791/62118

⸱

4 lipca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital and Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, 2Rehabilitation Department, Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 3Department of Neurosurgery, the Hospital of Changle, 4Pediatrics Ward 2, Shouguang Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 6National-Local Joint Engineering Research Center of Rehabilitation Medicine Technology, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 7Rehabilitation Industry Institute, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 8Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj tworzymy nowatorski szczurzy model zakrzepicy zatoki strzałkowej (SSS) metodą Sprague'a-Dawleya (SD) za pomocą metody embolizacji nici, a stabilność i niezawodność modelu zostały zweryfikowane.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechanizmy przyczyniające się do naturalnego wystąpienia zakrzepicy zatok żylnych mózgu (CVST) są w większości nieznane, a w przebieg choroby zaangażowane są różne niekontrolowane czynniki, co skutkuje dużymi ograniczeniami w badaniach klinicznych. W związku z tym ustanowienie stabilnych modeli zwierzęcych CVST, które mogą standaryzować różne niekontrolowane czynniki zakłócające, pomogło obejść niedociągnięcia w badaniach klinicznych. W ostatnich dziesięcioleciach skonstruowano różne modele zwierzęce CVST, ale wyniki oparte na tych modelach były niespójne i niekompletne. W związku z tym, w celu dalszego zbadania patofizjologicznych mechanizmów CVST, konieczne jest stworzenie nowego i wysoce kompatybilnego modelu zwierzęcego, który ma ważną wartość praktyczną i znaczenie naukowe dla diagnozy i leczenia CVST. W niniejszym badaniu ustalono nowy szczurzy model zakrzepicy zatoki strzałkowej górnej (SSS) Sprague'a-Dawleya (SD) za pomocą metody embolizacji nici, a stabilność i wiarygodność modelu zweryfikowano. Dodatkowo oceniliśmy zmiany w przepływie krwi żylnej w mózgu u szczurów po utworzeniu CVST. Reasumując, model zakrzepicy SSS u szczura SD reprezentuje nowatorski model zwierzęcy CVST, który jest łatwy do ustalenia, minimalizuje uraz, zapewnia dobrą stabilność i pozwala na dokładną kontrolę czasu i lokalizacji niedokrwienia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakrzepica zatok żylnych mózgu (CVST) jest rzadką chorobą układu żylnego mózgu, która stanowi tylko 0,5-1,0% wszystkich przyczyn udaru, ale ma stosunkowo wysoki wskaźnik występowania u dzieci i młodych dorosłych1. Podczas autopsji stwierdzono, że CVST jest przyczyną 10% zgonów z powodu chorób naczyń mózgowych2. Zakrzepica może wystąpić w dowolnej części wewnątrzczaszkowego układu żylnego. Zatoka strzałkowa górna (SSS) jest jednym z najczęściej dotkniętych obszarów w CVST i może obejmować wiele naczyń krwionośnych. Z powodu zwężenia lub niedrożności zatok żylnych wewnątrzczaszkowy powrót żylny jest zablokowany, czemu często towarzyszy wzrost ciśnienia śródczaszkowego3. Objawy kliniczne CVST są złożone i zmieniają się w czasie; Chociaż brakuje swoistości objawów, najczęstsze objawy to ból głowy (77,2%), drgawki (42,7%) i deficyty neurologiczne (39,9%). W ciężkich przypadkach może dojść do śpiączki, a nawet śmierci4,5. W ostatnich latach, ze względu na ogólną poprawę standardów medycznych i zdrowotnych oraz świadomość zdrowia publicznego, proporcja powiązanych czynników ryzyka uległa zmianie, zmniejszył się odsetek urazów i infekcji, a odsetek CVST spowodowanych ciążą, połogiem, doustnymi środkami antykoncepcyjnymi i innymi przyczynami stopniowo wzrastał5.

Obecnie patogeneza CVST nie jest jeszcze dobrze poznana. Aby dogłębnie zbadać CVST, potrzebne są dalsze badania patofizjologiczne. Jednak większość z tych metod badawczych jest inwazyjna, a przez to trudna do wdrożenia klinicznego. Ze względu na wiele ograniczeń badań klinicznych, modele zwierzęce mają niezastąpione zalety w zakresie badań podstawowych i translacyjnych.

Przyczyna CVST jest złożona, ponieważ jego początkowy początek jest często nierozpoznany, a miejsce powstawania skrzepliny jest bardzo zmienne. Na szczęście modele zwierzęce mogą osiągnąć lepszą kontrolę nad tymi czynnikami. W ciągu ostatnich kilku dekad powstało wiele modeli zwierzęcych CVST, a każdy model ma swoje wady. Ze względu na różne metody produkcji można je z grubsza podzielić na następujące kategorie: prosty model ligacji SSS6,7; model wewnętrznego akceleratora wtrysku SSS8; model zakrzepicy SSS indukowanej chlorkiem żelaza9; model zakrzepicy SSS wywołanej fotochemicznie10; oraz samodzielnie wykonany model SSS do zatorowości i okluzji11. Jednak większość z tych modeli nie jest w stanie obejść inwazyjnych uszkodzeń kory mózgowej zwierzęcia i nie jest w stanie dokładnie kontrolować czasu i lokalizacji niedokrwienia. W niektórych modelach skrzeplina ulega samoistnej reanalizacji; w innych modelach SSS zostaje trwale zablokowany. Ponadto skomplikowane operacje i/lub poważne urazy mogą wpływać na późniejsze wyniki patofizjologiczne w tych modelach.

W obecnym badaniu, do SSS szczurów Sprague-Dawley (SD) została wprowadzona zatyczka gwintowana, aby skutecznie stworzyć model CVST, który minimalizował uszkodzenia, umożliwiał precyzyjną kontrolę i zapewniał dobrą stabilność. Ponadto połączono obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) małych zwierząt i laserowe obrazowanie przepływu krwi w celu zweryfikowania skuteczności modelu. Oceniliśmy zmiany w przepływie krwi w mózgu przed i po ustanowieniu naszego modelu, a także oceniliśmy stabilność naszego modelu, kładąc podwaliny pod dalsze badania badające występowanie, rozwój i powiązane mechanizmy patofizjologiczne CVST.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Norm Medycznych i Etyki Uniwersytetu Medycznego w Wenzhou i są zgodne z chińskim ustawodawstwem dotyczącym użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi.

1. Przygotowanie zatyczki gwintowanej, szczurów SD i sprzętu eksperymentalnego

  1. Użyj nylonowego gwintu o średnicy 0,28 mm jako głównego korpusu zaślepki gwintu.
    UWAGA: Miękkość i twardość nici nylonowej powinna być umiarkowana.
  2. Przykryj jeden koniec nylonowej nici materiałem silikonowym. Długość silikonowej części zatyczki gwintowanej wynosi około 1,2 cm, a średnica około 1,2 mm. Końcówka głowicy jest zwężana, a część silikonowa jest cylindryczna. Zarezerwuj kolejne 5-7 cm. Nylonowa nić jest łatwa do zaciśnięcia i może być cięta zgodnie z konkretnymi potrzebami po operacji.
  3. Użyj 75% etanolu do namoczenia korka gwintowanego na 3 minuty przed operacją i spłucz resztki etanolu zwykłą solą fizjologiczną przed zatkaniem.
  4. Wybierz 12 samców szczurów SD o wadze od 280 do 320 g i losowo podziel je na grupę pozorowaną i grupę eksperymentalną (n = 6 na grupę). Po tygodniu adaptacji do warunków środowiskowych szczury poszczą przez 12 godzin i pozbawiają je wody przez 4 godziny przed operacją.
  5. Przygotuj następujący sprzęt doświadczalny potrzebny do eksperymentu: aparat do znieczulania małych zwierząt, przyrząd stereotaktyczny mózgu, mikroskop preparacyjny, szybkie wiertło do czaszki, nożyczki, pęsetę, kleszcze naczyniowe, uchwyt igły, nić do igły, strzykawkę o pojemności 2 ml, laserowy system obrazowania przepływu krwi i skaner MRI małych zwierząt.

2. Budowa modelu embolizacji SD-Rat SSS za pomocą embolizacji nici

  1. Umieść szczura SD w pudełku do znieczulenia i użyj maszyny do znieczulania dla małych zwierząt, aby dostarczyć 4% izofluranu w celu wywołania znieczulenia. Następnie użyj kleszczy, aby potwierdzić, że tylne kończyny i palce u nóg szczura SD nie reagują na umiarkowane szczypanie.
  2. Szybko napraw szczura SD z ogolonymi włosami na górze w pozycji leżącej na urządzeniu stereotaktycznym mózgu. Utrzymuj znieczulenie 1,5-2,0% izofluranem (z prędkością 0,5 l/min) i stabilizuj częstość oddechów na poziomie 40-60 oddechów/min. Ustabilizuj temperaturę ciała szczura za pomocą poduszki grzewczej na poziomie 37±0,2 °C.
    1. Nałóż sterylny okulistyczny lubrykant do oczu po umieszczeniu szczura na ramie stereotaktycznej, aby chronić rogówki przed wysuszeniem podczas znieczulenia.
  3. Wysterylizuj powierzchnię na czubku głowy szczura 5% jodowidonu na przemian trzy razy z 75% etanolem. Wykonaj nacięcie skóry (o długości 2,0 cm) na środku głowy, a następnie ostrożnie oderwij górną powięź i okostną, aby całkowicie odsłonić czaszkę.
    1. Potwierdź pozycje ciemiączka przedniego, ciemiączka tylnego, szwu koronalnego, szwu strzałkowego i szwu w jodełkę.
  4. Użyj obszaru między szwem koronalnym a szwem w jodełkę jako obszaru obserwacyjnego przepływu krwi. Aby zapobiec wpływowi czaszki na obserwację podczas obrazowania przepływu krwi za pomocą lasera, należy rozrzedzić czaszkę w obszarze obserwacji, aż naczynia krwionośne będą wyraźnie widoczne. Rozmiar przerzedzonej czaszki powinien wynosić około 1,0 cm × 1,0 cm. Ten i następne kroki są wykonywane pod mikroskopem preparacyjnym.
    1. Podczas szlifowania czaszki należy wielokrotnie płukać wiertło solą fizjologiczną o normalnej temperaturze, aby uniknąć oparzeń kory mózgowej w wysokiej temperaturze.
  5. Użyj wiertła szybkoobrotowego, aby zeszlifować czaszkę w okienku kostnym o wymiarach 6,0 mm x 4,0 mm wyśrodkowanym w bregmie, aby odsłonić SSS obszaru bregmy.
    1. Użyj zwykłej soli fizjologicznej, aby schłodzić czaszkę podczas mielenia. Kiedy czaszka stanie się cienka, użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć pozostałe kawałki kości, aby uniknąć rozerwania SSS.
  6. Wybierz odpowiednią zatyczkę gwintowaną, użyj punktu SSS bregma jako punktu wtyczki, ostrożnie nakłuj go igłą strzykawkową o pojemności 2 ml i szybko włóż główkę zatyczki gwintowanej do punktu wtyczki.
    1. W tym czasie kąt między końcem główki zaślepki gwintowanej a SSS powinien wynosić około 30-45 °; następnie wyreguluj kąt między końcem zaślepki gwintowanej a SSS na 0-10 stopni i powoli włóż SSS do środka, aż głowa osiągnie tylną krawędź zbiegu zatok. Następnie odetnij nadmiar ogona.
      UWAGA: Po przebiciu SSS może wystąpić szybkie krwawienie. Jeśli końca zaślepki gwintowanej nie można szybko włożyć do punktu wtyczki za jednym razem, użyj małej gazy lub wacika, aby delikatnie docisnąć końcówkę wtyczki, powoli przesuwając się w dół, aby ostrożnie odsłonić punkt wtyczki, a następnie szybko włóż koniec drucianej do SSS. Po włożeniu zatyczki gwintowanej, jeśli w miejscu zatyczki występuje krwawienie, można użyć materiałów hemostatycznych, takich jak gąbka żelatynowa, aby zatrzymać krwawienie.

3. Wykrywanie przepływu krwi na powierzchni mózgu szczurów SD

  1. Użyj laserowego źródła światła, aby równomiernie oświetlić obszar obserwacji przepływu krwi. Odbite światło jest zbierane przez kamerę i przesyłane do komputera w celu analizy. Dla laserowego systemu obrazowania przepływu krwi należy użyć następujących ustawień parametrów: długość fali: λ = 785 nm; i czas naświetlania obrazu: T = 10 ms.
  2. Wyśrodkuj obszar obserwacyjny przepływu krwi u szczura SD w polu widzenia systemu obrazowania przepływu krwi z plamkami laserowymi i prowadź ciągłe monitorowanie przepływu krwi na powierzchni mózgu przez 2 minuty. Zbierz i przetwórz dane dotyczące przepływu krwi przed i po embolizacji dla każdego szczura SD i uzyskaj laserową mapę przepływu krwi w obserwowanym obszarze.
  3. Wielokrotnie spłucz operowany obszar zwykłą solą fizjologiczną, aby zmyć resztki kości i pozostałości. Zszyj skórę (nić 0#) i zdezynfekuj jodoforem.
  4. Utrzymuj temperaturę ciała, dopóki szczur nie obudzi się po operacji, a następnie trzymaj go w pojedynczej klatce z jedzeniem i wodą dostarczanymi ad libitum. Nie można podłączyć grupy pozornej.
  5. Po zakończeniu zbierania danych wykonaj przetwarzanie końcowe.
    1. Pełny wybór obszaru zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzi dostarczanych przez oprogramowanie systemu obrazowania przepływu krwi w laserze. Uzyskane wartości to średnia wartość przepływu krwi w ROI oraz lokalne wartości przepływu krwi w mózgu przed i po embolizacji. Jako wartość wyjściową należy użyć wartości przepływu krwi przed embolizacją.
    2. Wybierz cztery ROI i zmierz względną zmianę przepływu krwi w mózgu w każdym ROI, wyrażoną jako procentowa zmiana w stosunku do wartości wyjściowej.

4. Wykrywanie pozycji nici na rezonansie magnetycznym małych zwierząt

  1. Użyj następujących parametrów obrazowania T2-zależnego (T2WI) dla systemu obrazowania MRI: czas echa (TE) = 33 ms, czas powtórzenia (TR) = 3000 ms, liczba wzbudzeń (NEX) = 4, warstwy = 28, grubość warstwy = 0,8 mm, rozmiar matrycy = 256*256 mm2, kąt odwrócenia = 80°, pole widzenia (FOV) = 30*30 mm2, czas skanowania = 6 min 24 s; parametry angiografii rezonansu magnetycznego (MRA) ustawiono w następujący sposób: TE = 4,4 ms, TR = 12 ms, NEX = 4, plastry = 80, grubość warstwy = 0,4 mm, rozmiar matrycy = 256*256 mm2, kąt odwrócenia = 80°, FOV = 30*30 mm2, czas skanowania = 16 min 23 s 40 ms.
  2. Zamocuj zwierzę na stole do skanowania MRI, skalibruj pozycję mózgu poprzez skanowanie pozycjonowania i wykonaj skanowanie sekwencji T2WI i MRA po potwierdzeniu pozycji.
  3. Podczas wykrywania należy stosować ciągłe znieczulenie za pomocą aparatu do znieczulenia zwierząt. Następnie należy poddać eutanazji szczury SD poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie nadmiernej ilości pentobarbitalu.
  4. Akwizycja obrazu i przetwarzanie końcowe: po zebraniu danych obrazu, w celu wyraźniejszej obserwacji stanu wtyczki gwintu w SSS, użyj metody pseudo poprawy kolorów, aby wyświetlić obraz T2WI mózgu szczura.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ustalić model zakrzepicy SSS u szczura SD metodą szwową, szew powinien być przygotowany wcześniej (Rysunek 1A), a sprzęt wymagany do eksperymentu (Rysunek 1B) powinien być przygotowany. Ze względu na delikatny charakter operacji, przygotowanie modelu musi zostać zakończone pod mikroskopem preparacyjnym. Główne kroki są pokazane w Rysunek 2. Aby ułatwić opis szczegółowych informacji na temat obserwacji przepływu krwi w modelu, R...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu udało się ustalić nowy typ modelu CVST poprzez włożenie samodzielnie wykonanej zatyczki gwintowanej do SSS szczurów SD. Dodatkowo, laserowe obrazowanie przepływu krwi i rezonans magnetyczny małych zwierząt połączono w celu monitorowania zmian w przepływie krwi na powierzchni mózgu szczurów SD przed i po embolizacji w celu standaryzacji czasu i lokalizacji niedokrwienia.

W 1989 roku Longa i in. stworzyli odwracalny model okluzji MCA, wprowadzając wstecznie samodzielnie wykonany sz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant Fundacji Badań Naukowych dla Talentów Wysokiego Poziomu, Fujian University of Traditional Chinese Medicine (X2019002-talents).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 2 mlBecton, Dickinson and Company301940
stereotaktyczny instrument do mózguShenzhen RWD Life Technology Co., Ltd68025
preparacyjnyWuhan SIM Opto-technology Co.czaszki SIM BFI-HR PRO Shenzhen
RWD Life Technology Co., Ltd78046
laserowy system obrazowania przepływu krwiWuhan SIM Opto-technology Co.SIM BFI-HR PRO Shenzhen
RWD Life Technology Co., LtdF31022-12
nić igłyShenzhen RWD Life Technology Co., LtdF33303-08
nożyczkiShenzhen RWD Life Technology Co., LtdS13029-14
żel krzemionkowyHeraeus Kulzer302785
maszyna doznieczulania małych zwierzątShenzhen RWD Life Technology Co., LtdR540
rezonans magnetyczny małych zwierzątBruker Medical GmbHBiospec 94/30 Pęseta USR
Shenzhen RWD Life Technology Co., LtdF11029-11
kleszcze naczynioweShenzhen RWD Life Technology Co., LtdF22003-09
mikroskop Szybka wiertarka do Uchwyt igły

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bousser, M. G., Ferro, J. M. Cerebral venous thrombosis: an update. Lancet Neurology. 6 (2), 162-170 (2007).
  2. Guenther, G., Arauz, A. Cerebral venous thrombosis: A diagnostic and treatment update. Neurologia. 26 (8), 488-498 (2011).
  3. Stam, J. Thrombosis of the cerebral veins and sinuses. New England Journal of Medicine. 352 (17), 1791-1798 (2005).
  4. Einhäupl, K., et al. EFNS guideline on the treatment of cerebral venous and sinus thrombosis in adult patients. European Journal of Neurology. 17 (10), 1229-1235 (2010).
  5. Coutinho, J. M., Zuurbier, S. M., Stam, J. Declining mortality in cerebral venous thrombosis: a systematic review. Stroke. 45 (5), 1338-1341 (2014).
  6. Gotoh, M., Ohmoto, T., Kuyama, H. Experimental study of venous circulatory disturbance by dural sinus occlusion. Acta Neurochir (Wien). 124 (2-4), 120-126 (1993).
  7. Miyamoto, K., Heimann, A., Kempski, O. Microcirculatory alterations in a mongolian gerbil sinus-vein thrombosis model. Journal of Clinical Neuroscience. 8 (4), (2001).
  8. Ungersböck, K., Heimann, A., Kempski, aO. Cerebral Blood Flow Alterations in a Rat Model of Cerebral Sinus Thrombosis. Stroke. 24 (4), (1993).
  9. Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
  10. Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306, 39-49 (2015).
  11. Yang, H., Meng, Z., Zhang, C., Zhang, P., Wang, Q. Establishing a new rat model of central venous sinus thrombosis and analyzing its pathophysiological and apoptotic changes. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 130-135 (2012).
  12. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  13. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  14. Wang, E., et al. Mapping tissue pH in an experimental model of acute stroke - Determination of graded regional tissue pH changes with non-invasive quantitative amide proton transfer MRI. Neuroimage. 191, (2019).
  15. Liu, C., et al. Identification of Vigilin as a Potential Ischemia Biomarker by Brain Slice-Based Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment. Analytical Chemistry. 91 (10), 6675-6681 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zakrzepica y m zguszczurzy model zakrzepicyembolizacja niciszczury Sprague Dawleychirurgia stereotaktycznaobrazowanie przep ywu krwiskanowanie MRIcie czenie czaszkiustanawianie modelu zwierz cego

Powiązane artykuły