Artykuł metodologiczny

Frakcjonowanie komórek U937 przez izopiknowe oczyszczanie w gradimencie gęstości

DOI:

10.3791/62119

⸱

12 sierpnia 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół frakcjonowania pozwoli badaczom wyizolować białka cytoplazmatyczne, jądrowe, mitochondrialne i błonowe z komórek ssaków. Dwie ostatnie frakcje subkomórkowe są dalej oczyszczane za pomocą gradientu gęstości izopikenowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania subkomórkowych frakcji białkowych z komórek ssaków przy użyciu kombinacji detergentów, mechanicznej lizy i wirowania w gradientowym gradicynie gęstości izopiknicznej. Główną zaletą tej procedury jest to, że nie polega ona wyłącznie na użyciu detergentów solubilizujących w celu uzyskania frakcji subkomórkowych. Umożliwia to oddzielenie błony plazmatycznej od innych organelli komórkowych związanych z błoną. Procedura ta ułatwi określenie lokalizacji białek w komórkach za pomocą powtarzalnej, skalowalnej i selektywnej metody. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do izolacji białek cytozolowych, jądrowych, mitochondrialnych i błony plazmatycznej z ludzkiej linii komórkowej monocytów U937. Chociaż zoptymalizowana dla tej linii komórkowej, procedura ta może służyć jako odpowiedni punkt wyjścia do subkomórkowego frakcjonowania innych linii komórkowych. Omówiono potencjalne pułapki procedury i sposoby ich unikania, a także zmiany, które mogą być konieczne do rozważenia w przypadku innych linii komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Frakcjonowanie subkomórkowe to procedura, w której komórki są poddawane lizie i rozdzielane na składniki składowe za pomocą kilku metod. Technika ta może być wykorzystana przez naukowców do określenia lokalizacji białek w komórkach ssaków lub do wzbogacenia białek o niskiej liczebności, które w przeciwnym razie byłyby niewykrywalne. Chociaż obecnie istnieją metody frakcjonowania subkomórkowego, podobnie jak komercyjne zestawy, które można kupić, mają one kilka ograniczeń, które ta procedura próbuje pokonać. Większość metod frakcjonowania komórek jest oparta wyłącznie na detergentach1,2, polegając na użyciu zawierających coraz większe ilości detergentu do rozpuszczania różnych składników komórkowych. Chociaż ta metoda jest szybka i wygodna, powoduje powstanie zanieczyszczonych frakcji. Zostały one zaprojektowane, aby umożliwić naukowcom łatwe wyizolowanie jednego lub dwóch składników komórki, ale nie są wystarczająco złożone, aby wyizolować wiele frakcji subkomórkowych z próbki w tym samym czasie. Poleganie wyłącznie na detergentach zwykle powoduje, że organelle otoczone błoną i błona plazmatyczna są bezkrytycznie rozpuszczone, co utrudnia oddzielenie tych składników. Dodatkową komplikacją wynikającą z zastosowania tych zestawów jest niezdolność badaczy do ich zmiany/optymalizacji pod kątem konkretnych zastosowań, ponieważ większość składników to zastrzeżone preparaty. Wreszcie, zestawy te mogą być zbyt drogie, z ograniczeniami w liczbie zastosowań, które sprawiają, że nie są idealne dla większych próbek.

Pomimo dostępności zestawów do izolacji mitochondriów, które nie opierają się na detergentach, nie są one przeznaczone do izolowania błony plazmatycznej i dostarczają znacznie mniejszych ilości próbki niż standardowe protokoły izolacji3,4. Chociaż metody wirowania różnicowego są bardziej czasochłonne, często prowadzą do uzyskania odrębnych frakcji, których nie można uzyskać wyłącznie za pomocą zestawów na bazie detergentów1. Separacja bez wyłącznego użycia detergentów solubilizujących umożliwia również dalsze oczyszczanie za pomocą ultrawirowania i izopiknowych gradientów gęstości, co skutkuje mniejszym zanieczyszczeniem krzyżowym. Ten protokół frakcjonowania demonstruje izolację frakcji subkomórkowych z monocytów U937 przy użyciu kombinacji podejść opartych na detergentach i wirowaniu z dużą prędkością. Metoda ta ułatwi izolację składników błony jądrowej, cytoplazmatycznej, mitochondrialnej i plazmatycznej komórki ssaków przy minimalnym zanieczyszczeniu między frakcjami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotuj i odczynniki

  1. Przygotuj świeże roztwory inhibitorów fosfatazy i proteazy.
    1. Dodaj 17,4 mg fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF) do 1 ml 100% etanolu, aby przygotować 100 mM zapasu.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z PMSF należy nosić sprzęt ochronny, ponieważ jest on niebezpieczny po spożyciu lub wdychaniu oraz w kontakcie ze skórą lub oczami. Działa żrąco na oczy i skórę.
    2. Zgodnie z zaleceniami producenta przygotuj dostępny w handlu koktajl inhibitorów proteazy (100x).
    3. Dodaj 91,9 mg ortowananianu sodu (SOV) do 1 ml wody dejonizowanej, aby przygotować 500 mM bulionu.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z SOV należy nosić sprzęt ochronny, ponieważ jest on niebezpieczny w przypadku połknięcia, wdychania lub kontaktu z oczami. Poważne nadmierne narażenie może spowodować śmierć.
  2. Przygotuj bufor do lizy A, bufor do izolacji cytoplazmatycznej (CI), bufor do solubilizacji komórek (CS), bufor do lizy jądrowej (NL), bufor do lizy B, bufor do homogenizacji komórek (CH), rozcieńczalnik jodiksanolu i detergenty.
    1. Dodać 8,7 g chlorku sodu (NaCl) i 50 ml kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, 1 M, pH 7,4) do 950 ml wody dejonizowanej w celu przygotowania buforu do lizy A (końcowe stężenia 150 mM NaCl i 50 mM HEPES).
    2. Przygotować roztwory podstawowe detergentów w następujący sposób: dodać 0,1 g dodecylosiarczanu sodu (SDS) do 10 ml buforu do lizy A (końcowe stężenie 1% SDS), dodać 0,1 g deoksycholanu sodu do 10 ml buforu do lizy A (końcowe stężenie 1%), dodać 2,5 mg digityniny do 10 ml buforu do lizy A (końcowe stężenie 250 μg/ml), i dodać 1 ml niejonowego, niedenaturującego detergentu (patrz tabela materiałów) do 9 ml buforu do lizy A (końcowe stężenie 10% (v/v)).
    3. Przygotować bufor CI dodając 10 μl podstawowego PMSF (100 mM), 10 μl inhibitora proteazy (100x), 2 μl zapasu SOV (500 mM) i 100 μl wyjściowej digitoniny (250 μg/ml) do 878 μl buforu do lizy A (końcowe stężenia 1 mM PMSF, 1x inhibitor proteazy, 1 mM SOV i 25 μg/ml digitoniny). Utrzymuj roztwór na lodzie do momentu dodania do osadu komórkowego.
    4. Przygotować bufor CS, dodając 10 μl prestau PMSF (100 mM), 10 μl inhibitora proteazy (100x), 2 μl sov (500 mM), 100 μl niejonowego, niedenaturującego detergentu (patrz tabela materiałów) (10%) i 118 μl glikolu heksylenowego (8,44 M) do 760 μl buforu do lizy A (końcowe stężenie 1 mM PMSF), 1x inhibitor proteazy, 1 mM SOV, 1% niejonowy, niedenaturujący detergent i 1 M glikol heksylenowy). Utrzymuj roztwór na lodzie do momentu dodania do osadu komórkowego.
    5. Przygotować bufor NL dodając 10 μl prestau PMSF (100 mM), 10 μl inhibitora proteazy (100x), 2 μl bulionu SOV (500 mM), 50 μl deoksycholanu sodu (10%), 100 μl SDS (1%) i 118 μl glikolu heksylenowego (8,44 M) do 710 μl buforu do lizy A (końcowe stężenia 1 mM PMSF, 1x inhibitor proteazy, 1 mM SOV, 0,5% deoksycholan sodu (v/v), 0,1% SDS (w/v) i 1 M glikol heksylenowy). Utrzymuj roztwór na lodzie aż do dodania do granulatu jądrowego.
    6. Dodać 20 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 0,74 g chlorku potasu (KCl), 0,19 g chlorku magnezu (MgCl2), 2 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (0,5 M EDTA), 2 ml glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego eteru)-N,N,N',N'-tetraoctowego (0,5 M EGTA), 38,3 g mannitolu i 23,9 g sacharozy do 980 ml wody dejonizowanej w celu przygotowania buforu do lizy B (końcowe stężenia 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol i 70 mM sacharozy).
    7. Przygotować bufor CO, dodając 10 μl zapasu PMSF (100 mM) i 2 μl zapasu SOV (500 mM) do 988 μl buforu do lizy B (końcowe stężenia 1 mM PMSF i 1 mM SOV; dostosować końcową objętość do liczby komórek poddawanych lizie). Utrzymuj roztwór na lodzie do momentu dodania do osadu komórkowego.
    8. Przygotować rozcieńczalnik jodiksanolu przez dodanie 12 ml HEPES (1 M, pH 7,4), 447 mg KCl, 114 g MgCl2, 1,2 ml 0,5 M EDTA, 1,2 ml 0,5 M EGTA, 21,3 g mannitolu i 14,4 g sacharozy do 88 ml wody dejonizowanej (końcowe stężenia 120 mM HEPES, 60 mM KCl, 12 mM MgCl2, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 1200 mM mannitol i 420 mM sacharozy).
    9. Przechowywać w temperaturze 4 °C, a digitoninę w temperaturze -20 °C.

2. Izolacja białka cytozolowego

UWAGA: Następujące kroki pozwolą na wzrost i ekspansję komórek U937, a następnie ekstrakcję białek cytozolowych. Przy zastosowanym stężeniu digitonina przenika przez błonę plazmatyczną, nie przerywając jej, umożliwiając uwalnianie białek cytozolowych i zatrzymywanie innych białek komórkowych.

  1. Hodować komórki w RPMI 1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Upewnij się, że komórki są wyhodowane do końcowej sumy 6 x 108 komórek.
    UWAGA: W tym protokole komórki zostały policzone za pomocą standardowego hemocytometru i mikroskopu.
  2. Odwirować wyhodowane komórki w temperaturze 400 × g przez 10 minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w temperaturze pokojowej o końcowym stężeniu 4 × 106 komórek/ml i delikatnie odpipetować w celu rozbicia grudek.
  3. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 400 × g przez 10 minut w celu osadzenia komórek. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w lodowatym buforze do lizy A (przygotowanym w kroku 1.2.1) w końcowym stężeniu 2 × 10,7 komórek/ml.
  4. Usunąć 7,5 ml komórek zawieszonych w buforze do lizy A (3 × 107 komórek) i przechowywać na lodzie w celu ekstrakcji białka jądrowego (sekcja 6). Odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 4 °C, 400 × g przez 10 minut w celu osadzenia komórek.
    UWAGA: Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w temperaturze 4 °C lub na lodzie i wstępnie schłodzić wszystkie.
  5. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w buforze CI o końcowym stężeniu 2 × 107 komórek/ml i delikatnie odpipetować w celu rozbicia grudek. Obracać zawiesinę ogniw od końca do końca w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  6. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 4 °C, 400 × g przez 10 minut i przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej. Zachowaj osad komórkowy i przechowuj na lodzie. Odwirować zebrany supernatant w temperaturze 4 °C, 18 000 × g przez 20 minut w celu osadzenia resztek komórkowych.
    UWAGA: Ten etap wirowania z dużą prędkością ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania zanieczyszczeniu frakcji cytozolowej organellami i białkami związanymi z błoną.
  7. Wyrzucić osad po przeniesieniu supernatantu do czystej probówki wirówkowej. Powtarzać oba etapy wirowania w kroku 2.6 do momentu, gdy po odwirowaniu nie zostanie uzyskany osad
    8. .
  8. Zbierz supernatant, który jest frakcją cytozolową. W przypadku krótkotrwałego przechowywania (1 miesiąc) należy upewnić się, że supernatant jest przechowywany w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania (>1 miesiąc) połączyć supernatant z 1x buforem Laemmli zawierającym 1x środek redukujący, podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 7 minut i przechowywać w temperaturze -20 lub -80°C.
  9. Zawiesić osad komórkowy (od kroku 2.6) w buforze do lizy A o końcowym stężeniu 4 × 106 komórek/ml; delikatnie odpipetować, aby rozbić grudki.

3. Homogenizacja komórek

UWAGA: Następujące kroki pozwolą na mechaniczną homogenizację komórek traktowanych digitoniną (od kroku 2.9), co jest niezbędne do izolacji mitochondrialnych i błonowych frakcji białkowych.

  1. Odwirować zawiesinę komórkową w buforze do lizy A (przygotowanym w kroku 2.9), zachować osad i wyrzucić supernatant w celu usunięcia nadmiaru digitoniny i zanieczyszczeń cytozolowych z osadu komórkowego.
    UWAGA: Można przeprowadzić wielokrotne płukanie w buforze do lizy A w celu usunięcia nadmiaru zanieczyszczeń cytozolowych.
  2. Zawiesić osad komórkowy w lodowatym buforze CH (przygotowanym w kroku 1.2.7) o końcowym stężeniu 4 × 106 komórek/ml. Inkubować zawiesinę komórkową na lodzie przez 30 minut.
  3. Jeśli używasz metody mechanicznej opartej na kulkach, umieść 30 g wstępnie umytych kulek ze stali nierdzewnej o średnicy 3,2 mm w probówce o pojemności 50 ml, napełnij 15 ml buforu do lizy B i umieść na lodzie do schłodzenia. Jeśli używasz homogenizatora Dounce (z ciasno dopasowanym tłuczkiem B), napełnij odpowiednią objętością buforu do lizy B, włóż tłuczek i umieść na lodzie do schłodzenia.
  4. Po inkubacji (etap 3.2) wyrzucić bufor do lizy B z probówek perełkowych (lub homogenizatora Dounce) i przenieść 15 ml zawiesiny komórek do probówki z kulkami (lub odpowiednią objętość do homogenizatora).
  5. W przypadku stosowania metody opartej na kulkach umieść rurki z kulkami z listwą zawierającą zawiesinę komórek w urządzeniu blenderowym i skonfiguruj tak, aby działały przez 5 minut z prędkością 8. Jeśli używasz homogenizatora Dounce, trzymaj go na lodzie i wykonaj 40 przejść tłuczkiem, wykonując powolne, równe ruchy (lub zastosuj alternatywną metodę mechanicznej lizy komórek, jak opisano w sekcji dyskusji).
    UWAGA: W przypadku korzystania z urządzenia blendera innego niż użyte tutaj, może być konieczne empiryczne określenie prędkości i czasu.
  6. Przenieść homogenat do czystej probówki wirówkowej i odwirować go przy 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej i zaoszczędzić; wyrzucić osad.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a homogenat przechowywać w temperaturze 4 °C przez krótki okres (24 godziny).

4. Usuwanie zanieczyszczeń i izolacja surowych frakcji mitochondrialnych i błonowych

UWAGA: Następujące kroki pozwolą na usunięcie resztek komórkowych poprzez odwirowanie homogenatu z coraz większą prędkością. Następnie przeprowadza się wirowanie różnicowe w celu wyizolowania surowych frakcji mitochondrialnych i błonowych.

  1. Odwirować homogenat (z kroku 3.6) w temperaturze 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej i wyrzucić wszelkie osady.
  2. Odwirować supernatant (od etapu 4.1) w temperaturze 1 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej i wyrzucić wszelkie osady.
  3. Odwirować supernatant (z kroku 4.2) w temperaturze 2 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej i wyrzucić wszelkie osady.
  4. Odwirować supernatant (od kroku 4.3) w temperaturze 4 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej i zachować osad, który jest surową frakcją mitochondrialną.
  5. Odwirować supernatant (od etapu 4.4) w temperaturze 18 000 × g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i zachować osad, który jest surową frakcją membranową.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać stosowanie protokołu, a próbki granulowane przechowywać w temperaturze 4 °C przez krótki okres (24 godziny).

5. Oczyszczanie gradientu gęstości izopiknowej

UWAGA: Poniższe kroki wykorzystują wirowanie z gradientu gęstości izopiknowej do oczyszczenia surowych frakcji mitochondrialnych i błonowych.

  1. Przygotować 50% (v/v) roztwór roboczy jodiksanolu, mieszając 1 część rozcieńczalnika (przygotowanego w kroku 1.1.3) z 5 częściami jodiksanolu (60% roztwór podstawowy (w/v)). Przygotować 10%, 15%, 20%, 25%, 30% i 35% roztwory jodiksanolu (v/v) mieszając 50% roztwór roboczy (v/v) z buforem do lizy B w odpowiednich ilościach.
  2. Zawiesić surowe granulki mitochondrialne i błonowe (z etapów 4.4 i 4.5) w 200 μl buforu do lizy B. Dostosować do 45% jodiksanolu (v/v) przez dodanie 1800 μl roboczego roztworu jodiksanolu (50% (v/v)) do 200 μl zawieszonego osadu.
  3. Utwórz nieciągły gradient jodiksanolu w następujący sposób (dostosuj objętości odpowiednio do pojemności probówki ultrawirówki): Dodaj 1 ml 15% jodiksanolu (v/v) na dno 8 ml, otwartej, cienkościennej probówki ultrawirówki, umieść 1 ml 20% jodiksanolu (v/v) poniżej pierwszej warstwy (techniką podkładową), a następnie umieść 1 ml 25%, 1 ml 30% i 1 ml 35% jodiksanolu (v/v).
    UWAGA: Na tym etapie powinny zostać utworzone 2 gradienty, 1 dla frakcji mitochondrialnej i 1 dla frakcji błonowej.
  4. W 1 gradiencie dodać 2 ml surowego osadu mitochondrialnego (zawieszonego w 45% jodiksanolu (v/v)) przy użyciu techniki podkładania na dno probówki poniżej 35% jodiksanolu (v/v). W drugim gradiencie dodać 2 ml surowego granulatu membranowego (zawieszonego w 45% jodiksanolu (v/v)) przy użyciu techniki podkładania na dno probówki poniżej 35% jodiksanolu (v/v).
  5. Dodaj 1 ml 10% jodiksanolu (v/v) do górnej części każdej probówki gradientowej, nakładając ją na wierzch warstwy 15%. Zrównoważyć probówki w odległości 0,1 g od siebie, dodając 10% jodiksanolu (v/v).
  6. Obracaj rurki gradientu gęstości w temperaturze 4 °C przez 18 godzin w temperaturze 100 000 × g. Upewnij się, że przyspieszenie i opóźnienie zostały ustawione na minimalne wartości dla używanej ultrawirówki.
    UWAGA: W gradieniu mitochondrialnym na granicy faz będzie widoczne pasmo między 25% a 30% jodiksanolu (v/v). Jest to czysta frakcja mitochondrialna. W gradiencie błony będzie widoczne pasmo we frakcji 15% jodiksanolu (v/v). Jest to czysta frakcja membranowa. W 25% i 30% frakcjach jodiksanolu (v/v) w gradiencie błony mogą występować dodatkowe prążki. Jest to zanieczyszczenie mitochondrialne.
  7. Frakcje należy pobrać z górnej części probówki w porcjach o pojemności 1 ml, uważając, aby zminimalizować objętość frakcji zawierającej widoczne prążki i zmieniając końcówkę pipety po pobraniu każdej warstwy. Alternatywnie przebij bok cienkościennej rurki igłą i zbierz widoczne pasma.
  8. Próbki należy przechowywać w sposób opisany w kroku 2.8 do czasu weryfikacji za pomocą testu białka i western blot.

6. Izolacja białka jądrowego

UWAGA: Używając jonowych i niejonowych detergentów, a także technik takich jak sonikacja i wirowanie, następujące kroki pozwolą na rozpuszczenie wszystkich błon komórkowych i pozwolą na izolację białek jądrowych.

  1. Odwirować 7,5 ml porcji komórek zawieszonych w buforze do lizy A (od kroku 2.4) i odrzucić supernatant. Dodać 800 μl lodowatego buforu CS (przygotowanego w kroku 1.2.4) i ponownie zawiesić osad przez pipetowanie i wirowanie. Próbki należy inkubować na lodzie (lub w temperaturze 4 °C) przez 30 minut, aby rozerwać błony plazmy i organelli, jednocześnie chroniąc białka jądrowe.
  2. Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 7 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Dodać 800 μl lodowatego buforu NL (przygotowanego w kroku 1.2.5) do osadu jądrowego po dodaniu 1U/μl benzonazy. Zawiesić osad przez delikatne pipetowanie. Inkubować na rotatorze typu end-of-end przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu rozerwania błony jądrowej.
  3. Sonikuj przez 5 s przy 20% mocy z probówkami z próbkami schłodzonymi w łaźni lodowej (3x, z 5-sekundowymi przerwami między impulsami), które wraz z benzonazą (dodaną w kroku 6.2) ścinają kwasy nukleinowe.
  4. Odwirować sonikat przy 7 800 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać i zachować supernatant, który jest frakcją jądrową. Należy pamiętać, aby nie naruszyć nierozpuszczalnego osadu podczas zbierania supernatantu. Do przechowywania próbki można przygotować w sposób opisany w kroku 2.8.

7. Kwantyfikacja białek i analiza western blot

UWAGA: Poniższe kroki pozwolą określić ilościowo całkowitą zawartość białka w każdej frakcji i potwierdzić czystość frakcji subkomórkowych.

  1. Wykonaj standardowy test Bradforda, aby określić ilościowo całkowite białko w każdej frakcji. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z oczekiwaną wydajnością białka.
    UWAGA: Inne testy białek, takie jak test kwasu bicinchoninowego (BCA) lub absorbancja przy 280 nm, mogą być stosowane do pomiaru całkowitego białka zamiast testu Bradforda.
  2. Połączyć frakcje z 1x buforem Laemmli zawierającym 1x środek redukujący i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 7 min. Załadować 10 μg każdej frakcji do standardowego żelu do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (PAGE) i uruchamiać żel w temperaturze 20 mA przez 1 godzinę.
  3. Przenieść rozwiązane białka do membrany z polifluorku winylu (PVDF), wykonując standardowy transfer immunoblot przy 100 V przez 30 minut. Zablokuj membranę PVDF 5% mlekiem w 1x soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS) zawierającej 0,1% niejonowego detergentu (v/v) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe w celu wykrycia białek porządkowych specyficznych dla każdej frakcji subkomórkowej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć membranę 5% mlekiem w 1x TBS zawierającym 0,1% detergentu niejonowego (v/v) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W tym protokole zastosowano przeciwciała przeciwko dehydrogenazie gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH, 1:10000), histonowi H3 (1:2000), zależnemu od napięcia kanałowi anionowemu (VDAC, 1:1000) i Na,K+-ATPazie odpowiednio dla frakcji cytozolowych, jądrowych, mitochondrialnych i błonowych.
  5. Dodać do błony odpowiednie przeciwciała drugorzędowe sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczyć zgodnie z instrukcjami producenta) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przemyć membranę 5% mlekiem w 1x TBS zawierającym 0,1% niejonowego detergentu (v/v) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Rozwiń blot przy użyciu standardowej chemiluminescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczny schemat tej procedury (Rysunek 1) wizualnie podsumowuje kroki, które zostały podjęte w celu pomyślnego frakcjonowania U9375 komórek hodowanych w zawiesinie. Frakcje zebrane z wierzchołka gradientu gęstości izopiknowej w równych objętościach (1 ml) pokazują oczyszczanie frakcji mitochondrialnej i błonowej (Rysunek 2). Wykorzystanie przeciwciała przeciwko VDAC, białku zlokalizowanemu na zewnętrznej błonie mitochondrialnej

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda ta jest zmodyfikowaną wersją wcześniej opublikowanego podejścia do frakcjonowania subkomórkowego bez użycia wirowania z dużą prędkością11. Ta zmodyfikowana metoda wymaga bardziej specjalistycznego sprzętu, aby osiągnąć najlepsze wyniki, ale jest bardziej wszechstronna i konsekwentnie powtarzalna.

Opracowanie wstępnego protokołu było konieczne ze względu na brak możliwości oddzielenia próbek mitochondrialnych i błonowych do analizy lokalizacji białek podczas nekro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez NIH R15-HL135675-01 i NIH 2 R15-HL135675-02 do TL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nukleaza benzonazowaSigma-AldrichE1014
Bullet Blender Homogenizator tkankowyNext Advance61-BB50-DX
digitoninaSigmaD141
rotator end-over-endThermoFisher
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)SigmaE9884
Glikol etylenowy-bis(β-aminoetylowy eter)-N,N,N',N'-kwas tetraoctowy (EGTA)SigmaE3889
GAPDH (14C10) Technologie sygnalizacji komórkowej2118
HEPESVWR97064-360
Glikol heksylenowySigma68340
IgepalSigmaI7771Niejonowy, niedenaturujący detergent
KClSigmaP9333
MannitolSigmaM9647
MgCl2SigmaM8266
NaClSigma S9888
Na, K-ATPaza a1 (D4Y7E)Technologie sygnalizacji komórkowej23565
Otwarte probówki Polyclear, 16 x 52 mmSeton Scientific7048
OptiPrep (jodiksanol)  Gradient gęstości ŚredniSigmaD1556-250ML
fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)SigmaP7626
Koktajl inhibitorów proteazy, ogólnego zastosowaniaVWRM221-1ML
ThermoFisher
S50-ST Wahadłowy wirnik kubełkowyEppendorf
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma436143
Deoksycholan soduSigmaD6750
orthovanadan sodu (SOV)Sigma567540
sonikatorThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Mikro-ultrawirówkaThermoFisher
Koraliki ze stali nierdzewnej 3,2 mmNext AdvanceSSB32
SacharozaSigmaS0389
Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS)VWR97062-370
Tween 20niejonowy detergent w Western Blot
VDAC (D73D12)Technologie sygnalizacji komórkowej4661
Wirówka z chłodzeniem

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
  2. Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
  4. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  5. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  6. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  7. Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
  8. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  9. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  10. Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
  11. McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022(2019).
  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 5/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Tagi

frakcjonowanie subkom rkowelokalizacja bia ekliza mechanicznaizolacja b ony plazmatycznejfrakcjonowanie mitochondri wWestern blotizolacja bia ek cytozolowych

Powiązane artykuły