Ten protokół frakcjonowania pozwoli badaczom wyizolować białka cytoplazmatyczne, jądrowe, mitochondrialne i błonowe z komórek ssaków. Dwie ostatnie frakcje subkomórkowe są dalej oczyszczane za pomocą gradientu gęstości izopikenowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Frakcjonowanie komórek U937 przez izopiknowe oczyszczanie w gradimencie gęstości
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół opisuje metodę uzyskiwania subkomórkowych frakcji białkowych z komórek ssaków przy użyciu kombinacji detergentów, mechanicznej lizy i wirowania w gradientowym gradicynie gęstości izopiknicznej. Główną zaletą tej procedury jest to, że nie polega ona wyłącznie na użyciu detergentów solubilizujących w celu uzyskania frakcji subkomórkowych. Umożliwia to oddzielenie błony plazmatycznej od innych organelli komórkowych związanych z błoną. Procedura ta ułatwi określenie lokalizacji białek w komórkach za pomocą powtarzalnej, skalowalnej i selektywnej metody. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do izolacji białek cytozolowych, jądrowych, mitochondrialnych i błony plazmatycznej z ludzkiej linii komórkowej monocytów U937. Chociaż zoptymalizowana dla tej linii komórkowej, procedura ta może służyć jako odpowiedni punkt wyjścia do subkomórkowego frakcjonowania innych linii komórkowych. Omówiono potencjalne pułapki procedury i sposoby ich unikania, a także zmiany, które mogą być konieczne do rozważenia w przypadku innych linii komórkowych.
Wprowadzenie
Frakcjonowanie subkomórkowe to procedura, w której komórki są poddawane lizie i rozdzielane na składniki składowe za pomocą kilku metod. Technika ta może być wykorzystana przez naukowców do określenia lokalizacji białek w komórkach ssaków lub do wzbogacenia białek o niskiej liczebności, które w przeciwnym razie byłyby niewykrywalne. Chociaż obecnie istnieją metody frakcjonowania subkomórkowego, podobnie jak komercyjne zestawy, które można kupić, mają one kilka ograniczeń, które ta procedura próbuje pokonać. Większość metod frakcjonowania komórek jest oparta wyłącznie na detergentach1,2, polegając na użyciu zaw....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotuj i odczynniki
- Przygotuj świeże roztwory inhibitorów fosfatazy i proteazy.
- Dodaj 17,4 mg fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF) do 1 ml 100% etanolu, aby przygotować 100 mM zapasu.
UWAGA: Podczas obchodzenia się z PMSF należy nosić sprzęt ochronny, ponieważ jest on niebezpieczny po spożyciu lub wdychaniu oraz w kontakcie ze skórą lub oczami. Działa żrąco na oczy i skórę. - Zgodnie z zaleceniami producenta przygotuj dostępny w handlu koktajl inhibitorów proteazy (100x).
- Dodaj 91,9 mg ortowananianu sodu (SOV) do 1 ml wody dejonizowanej, aby przygotować 500 mM bulionu.
UWAGA: Podczas obchodzenia się z S....
- Dodaj 17,4 mg fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF) do 1 ml 100% etanolu, aby przygotować 100 mM zapasu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Schematyczny wykres przebiegu tej procedury (Rysunek 1>) wizualnie podsumowuje kroki podjęte w celu skutecznego frakcjonowania komórek U9375 hodowanych w zawiesinie. Frakcje pobrane z górnej części izopiknicznego gradientu gęstości w równych objętościach (1 mL) obrazują oczyszczanie frakcji mitochondrialnej i błonowej (Rysunek 2). Wykorzystanie przeciwciała przeciwko VDAC, białku zlokalizowanemu w zewnętrznej błonie mitochondrialnej
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda ta jest zmodyfikowaną wersją wcześniej opublikowanego podejścia do frakcjonowania subkomórkowego bez użycia wirowania z dużą prędkością11. Ta zmodyfikowana metoda wymaga bardziej specjalistycznego sprzętu, aby osiągnąć najlepsze wyniki, ale jest bardziej wszechstronna i konsekwentnie powtarzalna.
Opracowanie wstępnego protokołu było konieczne ze względu na brak możliwości oddzielenia próbek mitochondrialnych i błonowych do analizy lokalizacji białek podczas nekro.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez NIH R15-HL135675-01 i NIH 2 R15-HL135675-02 do TL.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nukleaza benzonazowa | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bullet Blender Homogenizator tkankowy | Next Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonina | Sigma | D141 | |
| rotator end-over-end | ThermoFisher | ||
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| Glikol etylenowy-bis(β-aminoetylowy eter)-N,N,N',N'-kwas tetraoctowy (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Technologie sygnalizacji komórkowej | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Glikol heksylenowy | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Niejonowy, niedenaturujący detergent |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Mannitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma S9888 | ||
| Na, K-ATPaza a1 (D4Y7E) | Technologie sygnalizacji komórkowej | 23565 | |
| Otwarte probówki Polyclear, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (jodiksanol) Gradient gęstości Średni | Sigma | D1556-250ML | |
| fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Koktajl inhibitorów proteazy, ogólnego zastosowania | VWR | M221-1ML | |
| ThermoFisher | |||
| S50-ST Wahadłowy wirnik kubełkowy | Eppendorf | ||
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | Sigma | 436143 | |
| Deoksycholan sodu | Sigma | D6750 | |
| orthovanadan sodu (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonikator | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Mikro-ultrawirówka | ThermoFisher | ||
| Koraliki ze stali nierdzewnej 3,2 mm | Next Advance | SSB32 | |
| Sacharoza | Sigma | S0389 | |
| Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | niejonowy detergent w Western Blot | ||
| VDAC (D73D12) | Technologie sygnalizacji komórkowej | 4661 |
Bibliografia
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
- Il Hwang, S., Han, D. K.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 5/31/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
