Systematyczne ocenianie stanu zapalnego jelit za pomocą darmowego systemu wspomaganego komputerowo jest potężnym narzędziem do ilościowego porównywania zmian histopatologicznych w modelach zapalenia jelita grubego charakteryzujących się obecnością wrzodów i zmian zapalnych. Ocena wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego wzmacnia obserwacje kliniczne i ułatwia interpretację danych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Systematyczna analiza punktacji zapalenia jelit w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego mysim dekstranem sodu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Modele mysiego zapalenia jelita grubego są narzędziami, które są szeroko stosowane w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu patobiologii zaburzeń zapalnych jelit. Nadal jednak nie określono solidnych norm obiektywnej i powtarzalnej kwantyfikacji ciężkości choroby. Większość metod analizy zapalenia jelita grubego opiera się na ograniczonej ocenie histologicznej małych odcinków jelita, co prowadzi do częściowych lub stronniczych analiz. Tutaj łączymy akwizycję obrazu o wysokiej rozdzielczości i analizę podłużną całej okrężnicy w celu ilościowego określenia uszkodzenia jelit i owrzodzenia w modelu mysiego zapalenia jelita grubego wywołanym siarczanem sodu (DSS). Protokół ten pozwala na generowanie obiektywnych i powtarzalnych wyników bez intensywnego szkolenia użytkowników. W tym miejscu podajemy wyczerpujące informacje na temat przygotowania próbki i analizy obrazu na przykładach danych z zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS. Metodę tę można łatwo dostosować do innych modeli mysiego zapalenia jelita grubego, które mają znaczny stan zapalny związany z uszkodzeniem błony śluzowej. Wykazujemy, że frakcja błony śluzowej objętej stanem zapalnym / uszkodzonym i zerodowaną / owrzodzoną w stosunku do całkowitej długości okrężnicy jest ściśle zbieżna z wynikami klinicznymi, takimi jak utrata masy ciała w trakcie progresji choroby wywołanej przez DSS. Ten protokół histologiczny zapewnia niezawodną, efektywną czasowo i kosztowo pomoc w standaryzacji analiz aktywności choroby w bezstronny sposób w eksperymentach z zapaleniem jelita grubego DSS.
Wprowadzenie
Bariera nabłonkowa przewodu pokarmowego odgrywa kluczową rolę w oddzielaniu antygenów luminalnych i patogenów od leżących pod nimi przedziałów tkankowych1. Uszkodzenie nabłonka i rany błony śluzowej obserwowane w stanach patologicznych, takich jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD), niedokrwienie lub uraz chirurgiczny, są związane z objawami klinicznymi, które obejmują biegunkę, utratę masy ciała, krew w stolcu i ból brzucha. W odpowiedzi na uraz komórki nabłonkowe migrują i namnażają się, aby ponownie nabłonkować i naprawić ubytki bariery śluzówkowej. Ustąpienie stanu zapalnego i przywrócenie integralności błony śluzowej ma kluczowe znaczenie dla przywrócenia homeostazy i funkcji błony śluzowej jelit2,3,4.
Różne modele zwierzęce zostały wykorzystane do zbadania podstawowych mechanizmów molekularnych, które są związane z uszkodzeniem bariery nabłonkowej jelit. Dobrze ugruntowane i łatwe do zastosowania modele chemicznie indukowanego zapalenia jelita grubego są szeroko stosowane, szczególnie w badaniach związanych z uszkodzeniami zapalnymi, takimi jak IBD. Powszechny, powtarzalny i niezawodny model mysiego zapalenia jelita grubego wykorzystuje uszkodzenie okrężnicy i stan zapalny za pośrednictwem siarczanu sodu dekstranu (DSS). Nasilenie choroby różni się w zależności od szczepu myszy, dawki DSS, czasu podawania DSS i masy cząsteczkowej DSS5,6,7.
Uszkodzenie błony śluzowej jelit podczas zapalenia jelita grubego DSS jest zwykle oceniane za pomocą Indeksu Aktywności Choroby (DAI), złożonego wyniku określanego na podstawie utraty wagi, zawartości krwi w kale i konsystencji stolca. Zawartość krwi w kale może być mikroskopijna (wykrywana za pomocą testu kwasu gwajakowego w kale) lub makroskopowa; Konsystencja kału jest klasyfikowana jako twarda, miękka lub płynna (tj. biegunka)5,8. Ocena tych parametrów klinicznych może być subiektywna i może się różnić w zależności od doświadczenia i uprzedzeń użytkownika, chociaż ogólnie rzecz biorąc, dane dostarczają wiarygodnych informacji i dlatego są szeroko stosowane przez badaczy IBD. Nie ma natomiast ogólnie przyjętej metody histologicznej oceny uszkodzenia błony śluzowej. Najczęściej wybrane obszary jelita grubego są sprawdzane przez przeszkolonego patologa i oceniane na podstawie kilku parametrów, które zwykle obejmują uszkodzenie krypty i infiltrację leukocytów9,10,11. Jednak ze względu na to, że liczba badanych parametrów i ilość analizowanej tkanki różni się znacznie w zależności od poszczególnych raportów, porównywalność wielu opublikowanych badań jest ograniczona. Aby zmniejszyć stronniczość obserwatora i zwiększyć zgodność między badaniami, idealny protokół oceny histologicznej powinien: 1) obejmować całą długość jelita grubego, ponieważ zapalenie błony śluzowej jelit jest najczęściej zmienne i często dochodzi do pominiętych zmian, 2) ograniczać analizę do określonych kluczowych i łatwych do interpretacji parametrów w celu zmniejszenia subiektywności, 3) ułatwiać szybkie, spójne przetwarzanie dużej liczby próbek, oraz 4) korzystać z powszechnie dostępnych i przystępnych cenowo narzędzi do pozyskiwania, analizy i prezentacji danych.
Tutaj opisujemy technikę przetwarzania całego jelita grubego lub długich odcinków jelita cienkiego w konfiguracji "szwajcarskiej bułki" wraz z użyciem darmowego, wspomaganego komputerowo systemu punktacji do analizy zapalenia i uszkodzenia błony śluzowej jelit z powodu zapalenia jelita grubego wywołanego przez DSS.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Wykorzystania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Michigan.
1. Pobieranie tkanek
- Humanitarnie uśmierć myszy, stosując anestezyję izofluranem, a następnie zwichnięcie stawów szyjnych, zgodnie z zatwierdzonymi protokołami. Dla wszystkich eksperymentów na zwierzętach uzyskano zgodę certyfikowanej komisji rewizyjnej zgodnie z krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi postępowania ze zwierzętami.
- Umieść mysz na podkładce sekcyjnej w pozycji na plecach. Unieruchom kończyny myszy za pomocą igieł 20 G x 1 1/2-inch G.
- Za pomocą pęsety i nożyczek wykonaj niewielkie nacięcie skóry brzucha i odsuń ją na bok, aby odsłonić otrzewną.
- Otwórz jamę brzuszna, wykonując nacięcie w linii środkowej otrzewnej od kości łonowej do boków brzucha.
- Ostrożnie usuń tkanki i organy, aż do momentu uwidocznienia jelita grubego. Przetnij kość miednicy po obu stronach okrężnicy, aby w pełni uwidocznić narząd, rozciągający się od odbytu w stronę kątnicy.
- Delikatnie usuń tłuszcz, małe żyły i tętnice przyczepione do okrężnicy, ostrożnie preparując narząd i przecinając go tuż powyżej odbytu oraz tuż poniżej kątnicy.
UWAGA: Wypreparowana okrężnica powinna pozostać w temperaturze pokojowej podczas przeprowadzania procedury Swiss roll. - Ostrożnie wypłucz okrężnicę za pomocą 1x PBS, używając giętkiej plastikowej igły do gavage wprowadzonej przez odbyt, aby usunąć treść kałową.
- Ułóż okrężnicę w linii prostej i rozetnij wzdłużnie wzdłuż tętnicy krezkowej. Przecięcie okrężnicy wykonaj wzdłużnie od końca dystalnego do proksymalnego (Rycina 1A). Połowę tkanki można wykorzystać do analizy histologicznej, natomiast drugą połowę można poddać analizie western blot, PCR lub zwinąć w drugą rolkę Swiss roll do immunofluorescencyjnej mikroskopii mrożonych próbek12.
2. Przygotowanie roladek (swiss rolls)
- Odetnij nadmiar tkanki z proksymalnej części okrężnicy za pomocą żyletki, aż do uzyskania w przybliżeniu tej samej szerokości na całej długości okrężnicy.
- Ułóż okrężnicę tak, aby światło było skierowane do góry, i całkowicie rozpłaszcz tkankę za pomocą giętkiej igły do zgłębnikowania. W razie potrzeby dodaj więcej PBS, aby utrzymać tkankę w stanie wilgotnym przez cały czas trwania procedury.
- Usuń nadmiar PBS za pomocą ręcznika papierowego. Za pomocą strzykawki i igły do zgłębnikowania nanieś 10% neutralny buforowany formalin na tkankę na 2-3 min, aby ją utrwalić i rozpłaszczyć.
- Używając pęsety prostej, chwyć koniec dystalnej części okrężnicy i zwijaj okrężnicę w koncentryczne kręgi od końca dystalnego do proksymalnego (Rysunek 1B).
UWAGA: Podczas zwijania można przesuwać wnętrze tzw. Swiss roll palcem wskazującym, aby upewnić się, że tkanka znajduje się wewnątrz rulonu. - Wprowadź igłę 27 G, aby przypiąć okrężnicę w środku i utrzymać kształt Swiss roll (Rysunek 1C).
- Umieść Swiss roll z igłą w kasecie do zatapiania wewnątrz pojemnika na próbki histologiczne.
UWAGA: Przed utrwaleniem tkanka musi być zorientowana równolegle do kasety (Rysunek 1D). - Utrwal tkankę w 10% neutralnym buforowanym formalinie przez noc w temperaturze 4 °C13.
- Po nocnym utrwaleniu przemyj tkankę 3x w PBS.
- Przed procesem zatapiania w parafinie dodaj do tkanki 70% etanol. Przed przejściem do kolejnego kroku wyjmij igłę z Swiss roll. Tkankę można przechowywać w etanolu w temperaturze pokojowej aż do momentu zatopienia w parafinie13.
- Umieść próbki w procesorze tkanek, zatop w parafinie i przygotuj skrawki o grubości 4 µm, zamontowane na pozytywnie naładowanych szkiełkach mikroskopowych (Rysunek 1E). Może to być opcjonalny punkt przerwania procedury.
UWAGA: Prawidłowa orientacja tkanki jest kluczowa dla uzyskania skrawków odpowiednich do analizy obrazu. Równoległe zatapianie Swiss roll w kasecie Parafinowej pozwoli uzyskać pełne skrawki odpowiednie do analizy obrazu (Rysunek 1F-1H). Należy unikać cięcia ukośnego, aby zapobiec uzyskaniu niepełnych skrawków (Rysunek 1I-1K). Więcej szczegółów znajduje się w sekcji Dyskusja. - Przebarw skrawki hematoksyliną i eozyną (H&E)13.
3. Skanowanie cyfrowe i analiza
UWAGA: Aby zapewnić dokładną ocenę zmian śluzówkowych, należy wybierać wyłącznie preparaty obejmujące co najmniej 90% całkowitej długości jelita grubego.
- Zeskanuj zabarwione przekrojey przy użyciu skanera do preparatów lub obrazera (patrz Tabela materiałów). Uzyskane obrazy muszą mieć rozdzielczość 0,25 mikrona na piksel przy użyciu obiektywu 40x i powiększeniu 40x.
- Zainstaluj i pobierz odpowiednie oprogramowanie do cyfrowej analizy zeskanowanych preparatów (patrz Tabela materiałów).
- Otwórz zeskanowane obrazy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów (Rysunek 2A). Upewnij się, że cały okrężnica jest widoczna i że w próbce nie brakuje żadnych obszarów.
- Aktywuj narzędzia obrazowania etykiet i paska skali, aby prawidłowo zidentyfikować zeskanowane preparaty, klikając Label imager (Rysunek 2A).
- Otwórz narzędzie adnotacji, klikając Annotations (Rysunek 2A), i utwórz 3 różne warstwy, klikając New layer (Rysunek 2B), aby ilościowo określić całkowitą długość tzw. swiss roll (rolowanego preparatu), obszary stanu zapalnego/uszkodzenia oraz erozji/owrzodzenia. Wybierz inny kolor dla każdej warstwy, klikając Layer color (Rysunek 2B).
- Zmierz długość każdej warstwy/kategorii, klikając narzędzie Pióro (Rysunek 2A), przyjmując muscularis mucosa jako punkt odniesienia:
- Wyświetl obraz przy powiększeniu 400 µm (lub większym), aby ułatwić odpowiednią wizualizację muscularis mucosa.
UWAGA: Powiększeniem można łatwo sterować za pomocą kółka myszy; będzie ono wymagało dostosowania w miarę przesuwania się po przekroju w celu narysowania wszystkich linii. - Kliknij narzędzie Pen, aby narysować linię wzdłuż muscularis mucosa (Rysunek 2A). Przesuwaj kursor w razie potrzeby, aby zwizualizować sąsiedni obszar do analizy.
UWAGA: Za każdym razem, gdy pióro zostanie zatrzymane, zostanie wygenerowany mały, nowy obszar warstwy. Można go zwizualizować i edytować w zakładce Layer regions (wybierz żądany segment i kliknij Delete Layer w przypadku błędów lub korekt, Rysunek 2B).
- Wyświetl obraz przy powiększeniu 400 µm (lub większym), aby ułatwić odpowiednią wizualizację muscularis mucosa.
- Po zdefiniowaniu wszystkich warstw (Rysunek 2C) wyeksportuj dane za pomocą przycisku Export Grid to Text File w opcjach obszarów warstw (Rysunek 2B).
UWAGA: Często zapisuj pliki podczas tworzenia warstw, aby zapewnić prawidłowe przechowywanie danych. - Otwórz pliki tekstowe i skopiuj dane do oprogramowania arkusza kalkulacyjnego. Zsumuj wszystkie segmenty z każdego regionu i oblicz procent uszkodzeń i owrzodzeń w stosunku do całkowitej długości.
- Aby obliczyć wynik histologicznego zapalenia jelita grubego (Histological Colitis Score, HCS) i ocenić stopień zaawansowania choroby, weź pod uwagę trzy główne cechy opisane poniżej.
- Sprawdź, czy występuje zdrowa błona śluzowa jelita, która charakteryzuje się zorganizowanymi komórkami nabłonkowymi w osi kryptowo-światłowej, blaszka własna z niewielką liczbą komórek odpornościowych oraz leżąca poniżej muscularis mucosa, która oddziela błonę śluzową od błony podśluzowej (Rysunek 3A).
- Sprawdź obecność stanu zapalnego/uszkodzeń, które charakteryzują się kryptami nabłonkowymi, w których komórki nabłonkowe są zanikłe lub częściowo nieobecne, oraz zapaleniem błony śluzowej z infiltracją neutrofili do krypt (Rysunek 3B).
- Sprawdź obecność erozji/owrzodzeń, które charakteryzują się obszarami pozbawionymi nabłonka powierzchniowego lub obszarami całkowicie pozbawionymi krypt nabłonkowych, z towarzyszącymi leukocytami lub bez nich (Rysunek 3C).
- Oblicz HCS dla regionów uszkodzonych i owrzodzenia, wyrażony jako procent całkowitej długości, stosując następujący wzór:
UWAGA: HCS łączy procent zapalenia/uszkodzenia i erozji/owrzodzenia, dodając mnożnik dwa do tego drugiego, w oparciu o uzasadnione założenie, że całkowita utrata nabłonka prowadzi do maksymalnej utraty integralności bariery, a tym samym do cięższego przebiegu choroby. HCS spójnie reprezentuje zmiany morfologiczne spowodowane eksperymentalnym zapaleniem jelita grubego indukowanym przez DSS. Co ciekawe, nie zaobserwowano wyraźnej korelacji między liczbą agregatów limfatycznych lub mieszków w jelicie grubym a klinicznym stopniem zaawansowania choroby w zapaleniu jelita grubego indukowanym DSS, dlatego nie uwzględniono tej kwantyfikacji w niniejszej analizie. - Zrób zrzut ekranu reprezentatywnych obrazów (kliknij Snapshot, Rysunek 2A) i zapisz. W razie potrzeby dołącz paski skali, klikając Show/Hide Scale Bar (Rysunek 2A).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zilustrować wiarygodność tej analizy wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego (Histological Colitis Score Analysis) w kontekście uszkodzeń błony śluzowej po wywołaniu zapalenia za pomocą DSS i następującej po nim regeneracji, podawano 2,5% DSS w wodzie pitnej ośmiu 10-tygodniowych samców myszy linii C57BL6 typu dzikiego przez 5 dni, po czym nastąpił 5-dniowy okres regeneracji z dostępem do zwykłej wody. Podczas ostrej administracji DSS, od dnia 0 do 5, nie odnotowano zmian w ma...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nasz system oceny histologicznego zapalenia jelita grubego stanowi niezawodne narzędzie do ilościowego określania stanu zapalnego i uszkodzeń tkanek w jelicie. Takie podejście zapewnia lepsze zrozumienie stanu histopatologicznego całego narządu bez uprzedzeń związanych z wybieraniem małych obszarów lub niekompletnych odcinków. Wśród kluczowych kroków do pomyślnego wykonania tego protokołu jest właściwe przygotowanie szwajcarskich bułek, które pozwalają na analizę co najmniej 90% długości jelita grubego; równoległa orient...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony NIH finansujących DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 oraz University of Michigan Pathology Slide Scanning Services.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Aperio AT2 – Wysokoobjętościowe, cyfrowe skanowanie całych slajdów | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Podkłady chłonne z wodoodporną barierą dla wilgoci | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Lemiesz jednoostrzowy, 100 sztuk w opakowaniu | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Jednorazowe strzykawki bez igieł | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Nożyczki do zeza z Bonn - Narzędzia ToughCut | Fine Science | 11103-09 | |
| Nożyczki do zeza z Bonn - Narzędzia do nauki o | 14084-09 | ||
| Kleszcze Dumont #5 | Narzędzia do nauki | 11251-20 | |
| Roztwór formaliny, neutralny buforowany, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denaturowany alkohol etylowy | |
| ImageScope | Aperio | Wersja 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Pojemniki na próbki: Sterylne | Starplex Scientific | B120210 | |
| sól fizjologiczna z buforem fosforanowym, bez wapnia i magnezu | Corning | 21-040-CV | |
| Plastikowe rurki zasilające, 20 GA x 30 mm | Igła Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide, rozmiar: 20 g x 1 1/2 cala | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| Igła PrecisionGlide, rozmiar: 27 g x 1/2 cala | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Strzykawka, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Kasety na chusteczki Unisette | Simport | M505-2 |
Bibliografia
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617(2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , Blakiston Division. (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004(2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
