Szczurzy model infekcji mózgu EcoHIV

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do stworzenia nowego szczurzego modelu aktywnego zakażenia wirusem HIV za pomocą chimerycznego HIV (EcoHIV), który jest kluczowy dla zwiększenia naszego zrozumienia rezerwuarów wirusa HIV-1 w mózgu i oferuje system do badania zaburzeń neurokognitywnych związanych z HIV i związanych z nimi chorób współistniejących (np. nadużywania narkotyków).

Streszczenie

Zostało dobrze zbadane, że model myszy zakażony EcoHIV jest bardzo przydatny w badaniu powikłań neurologicznych związanych z HIV. Opracowanie modelu szczura zakażonego wirusem EcoHIV do badań nad nadużywaniem narkotyków i zaburzeniami neurokognitywnymi byłoby korzystne w badaniach nad neuroHIV i zaburzeniami neuropoznawczymi związanymi z HIV-1 (HAND). W niniejszej pracy wykazano udane stworzenie szczurzego modelu aktywnego zakażenia wirusem HIV przy użyciu chimerycznego HIV (EcoHIV). Po pierwsze, lentiwirusowy konstrukt EcoHIV umieszczono w hodowanych 293 komórkach FT przez 48 godzin. Następnie pożywka warunkowa została zagęszczona i zbalansowana. Następnie przeprowadziliśmy obustronne stereotaktyczne wstrzyknięcia EcoHIV-EGFP do tkanki mózgowej szczura F344 / N. Tydzień po zakażeniu w zakażonej tkance mózgowej wykryto sygnały fluorescencyjne EGFP, co wskazuje, że EcoHIV skutecznie indukuje aktywne zakażenie wirusem HIV u szczurów. Ponadto przeprowadzono barwienie immunologiczne dla markera komórek mikrogleju, Iba1. Wyniki wskazują, że mikroglej był dominującym typem komórek, w których występuje EcoHIV. Co więcej, szczury z wirusem EcoHIV wykazywały zmiany w przetwarzaniu czasowym, co jest potencjalnym mechanizmem neurobehawioralnym leżącym u podstaw HAND, a także dysfunkcją synaps osiem tygodni po zakażeniu. Reasumując, niniejsze badanie rozszerza model zakażenia HIV-1 EcoHIV na szczury, oferując cenny system biologiczny do badania rezerwuarów wirusa HIV-1 w mózgu, a także HAND i powiązanych chorób współistniejących, takich jak nadużywanie narkotyków.

Wprowadzenie

Systemy biologiczne poszerzyły naszą wiedzę na temat zaburzeń neurokognitywnych związanych z HIV-1 (HAND) i leżących u ich podstaw mechanizmów neuronalnych². Określenie, który system biologiczny jest najbardziej odpowiedni dla danego badania, jest często zależne od interesującego pytania². Ograniczenie zakresu modeli zwierzęcych gospodarzy stanowi wyzwanie dla badań nad rozwojem choroby HIV-1. Aby zbadać replikację i patogenezę wirusa HIV-1, Potash i wsp.³ stworzyli mysi model aktywnego zakażenia HIV-1, zastępując region kodujący glikoproteiny otoczki powierzchniowej HIV, gp120, ekotropowym MLV gp80, co doprowadziło do udanej replikacji wirusa u myszy⁴. Po wstrzyknięciach do żyły ogonowej u chimerycznych myszy zakażonych wirusem HIV (EcoHIV) zaobserwowano wiele cech przypominających cechy osób seropozytywnych HIV-1 (np. zakażone limfocyty i makrofagi, ukierunkowane na przeciwwirusową odpowiedź immunologiczną i stan zapalny^3,5,6).

Chociaż myszy i szczury należą do rodziny Muridae, fundamentalne różnice między gatunkami mogą wpływać na ich przydatność do konkretnych pytań eksperymentalnych⁷. W związku z tym rozszerzenie modelu zakażenia EcoHIV na szczury (powszechnie stosowanego w badaniach nad nadużywaniem narkotyków i zaburzeniami neurokognitywnymi) byłoby korzystne w badaniach nad neuroHIV. Na przykład, ich większy rozmiar sprawia, że implantacja cewnika szyjnego do procedur samodzielnego podawania leków jest bardziej praktyczna⁸. Techniki samodzielnego podawania leków u szczurów zostały wykorzystane do oceny motywacji w HIV-1⁹. Co więcej, wiele zadań neurokognitywno-behawioralnych zostało początkowo zaprojektowanych dla szczurów¹⁰. W tym miejscu donosimy o wykorzystaniu stereotaktycznych zastrzyków EcoHIV u szczurów w celu rozszerzenia modelu infekcji EcoHIV i stworzenia kluczowej okazji do odpowiedzi na nowe pytania związane z neuroHIV i HAND.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Południowej Karoliny (federalny numer gwarancji: D16-00028). Sześć dorosłych samców szczura F344/N trzymano w parze w kontrolowanym środowisku w cyklu 12/12 światło: ciemność z dostępem ad libitum do pożywienia i wody. Wszystkie zwierzęta były pod opieką zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez National Institutes of Health w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych.

1. Opakowanie wirusa w 293 komórkach FT

1. Hodować 293 komórki FT (5×10⁵/ml) w pokrytych żelatyną 75 cm² kolbach z DMEM plus 10% FBS¹¹. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C, aby były w 50% zlewane podczas transfekcji.
2. Rozcieńczyć 22,5 μl odczynnika do transfekcji (np. Lipofectamine 3000) w 750 μl pożywki (np. Opti-MEM) w 1,5 ml mikroprobówce wirówkowej i wirować przez 3 s.
3. Rozcieńczyć 20 μg plazmidowego DNA EcoHIV w 750 μl pożywki w 1,5 ml mikroprobówce wirówkowej i dobrze wymieszać.
4. Dodaj rozcieńczone DNA do probówki z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji i delikatnie wymieszaj. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
5. Dodać mieszaninę do 10 ml podgrzanego podłoża DMEM w kolbie o długości^{75 cm2}. Inkubować komórki przez 2 dni w temperaturze 37 °C.
6. Zebrać i połączyć 24 ml pożywki warunkowej z dwóch kolb zawierających dołączonego lentiwirusa.
7. Odwirować całe 24 ml pożywki warunkowej o stężeniu 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść sklarowany supernatant do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
8. Połączyć 8 ml koncentratora Lenti-x z 24 ml sklarowanego supernatantu (w stosunku 1:3). Wymieszaj przez delikatne odwrócenie. Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez dwa dni.
9. Odwirować mieszaninę o stężeniu 1 500 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć sklarowany osad.
10. Delikatnie zawiesić osad w 100 μl 100 mM PBS.
11. Stężenie miana wirusa za pomocą zestawu p24 ELISA.

2. Operacje stereotaktyczne wirusa EcoHIV-EGFP

1. Znieczulenie szczurów za pomocą 3% sewofluranu. Przejdź do kroku 2.2, gdy szczury nie reagują na szkodliwe bodźce i nie mają odruchów.
2. Ogol włosy w okolicy mózgu i dwukrotnie wysterylizuj skórę 70% etanolem i peelingiem na bazie chlorheksydyny. Zabezpiecz szczura w pozycji leżącej w aparacie stereotaktycznym.
3. Wykonaj nacięcie (5-6 cm) przez skórę wzdłuż linii środkowej skóry głowy.
4. Zaznacz dwie pozycje wiercenia na boku 0,8 mm, 1,2 mm rostral do bregma. Wywierć otwór (średnica 0,4 mm) w każdej pozycji czaszki.
5. Napełnić miareczkowany roztwór lentiwirusa EcoHIV (1,04 × 10⁶ j./ml) w strzykawce iniekcyjnej o pojemności 10 μl. Przymocować strzykawkę do aparatu stereotaktycznego.
6. Przesuń igłę w dół blisko powierzchni wierconego otworu. Zmierz i przesuń na głębokość 2,5 mm.
7. Wlać w infuzji 1 μl roztworu wirusa z szybkością 0,2 μl/min. Trzymać igłę w miejscu wstrzyknięcia przez 5 minut. Powoli przesuwać igłę w górę, aż znajdzie się na zewnątrz czaszki szczura.
8. Zszyj skórę jedwabną nicią 4-0.
9. Jednokrotnie wysterylizuj nacięcie 70% etanolem. Podskórnie wstrzyknąć butorfenol (Dorolex, 0,1 mg/kg masy ciała).
10. Przenieś szczura do komory rekonwalescencji z poduszką grzewczą, aż się obudzi.

3. Wizualizacja sekcji mózgu

UWAGA: Poczekaj od jednego do ośmiu tygodni po infuzji wirusa EcoHIV.

1. Znieczulij szczura 5% sewofluranem. Kontynuuj do kroku 3.2, gdy szczury nie reagują na szkodliwe bodźce i nie mają odruchów.
2. Zamocuj szczura w pozycji leżącej na plecach w okapie.
3. Naciąć skórę wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej. Przetnij membranę i otwórz klatkę piersiową.
4. Wprowadzić igłę o masie 20 g × 25 mm do lewej komory.
5. Natychmiast otwórz prawe przedsionek nożyczkami.
6. Ukrwić 50 ml wstępnie schłodzonego 100 mM PBS z szybkością 5 ml/min.
7. Perfaktor 100 ml zimnego 4% paraformaldehydu z szybkością 5 ml/min.
8. Odetnij głowę szczurowi, otwórz skórę głowy i usuń mózg.
9. Postfix na noc z 4% paraformaldehydem.
10. Przenieś mózg do 40 ml 30% sacharozy w 100 mM PBS w probówce o pojemności 50 ml, aż mózg opadnie na dno (około 3 dni).
11. Błyskawicznie zamrozić mózg w metylobutanolu na 2 minuty w temperaturze -80 °C.
12. Zabezpiecz tkankę mózgową na metalowej platformie wewnątrz kriostatu o temperaturze -20 °C.
13. Wytnij skrawki koronalne o grubości 50 μm za pomocą kriostatu.
14. Przenieś plastry mózgu na szkiełka za pomocą cienkiego pędzelka.
15. Zamontuj sekcje w 0,3 ml podłoża zapobiegającego blaknięciu i przykryj szkiełkami nakrywkowymi 22 mm 50 mm.
16. Szkiełka podstawowe należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej do wyschnięcia.
17. Zobrazuj docelowe neurony za pomocą mikroskopu konfokalnego za pomocą stosu Z w oparciu o granice regionów mózgu i cechy morfologiczne neuronów.
    UWAGA: Zastosowano ustawienia mikroskopu konfokalnego: powiększenie 60 x (A/1,4, olej) i interwał w płaszczyźnie Z 0,15 μm (rozmiar otworka 30 μm; promień otworka rzutowanego wstecznie 167 nm) przy długości fali 488 nm.

Wyniki

Pożywka warunkowana została zebrana z komórek 293FT zainfekowanych lentiwirusem EcoHIV-EGFP. Następnie została ona skoncentrowana i określono jej miano, po czym wstrzyknięto ją stereotaktycznie do mózgu (obszaru kory) szczurów F344/N. Siedem dni po iniekcji szczury zostały uśpione, a następnie wykonano obrazy koronalnych przekrojów mózgu w zakresie od bregma 5,64 mm do bregma -4,68 mm. Na Rysunku 1A widoczne są znaczące sygnały EcoHIV-EGFP w całym mózgu, szczególnie w korze oraz w zakręcie z...

Dyskusja

W tym protokole ustaliliśmy model zakażenia wirusem HIV wywołanego przez EcoHIV u szczurów. W szczególności opisaliśmy obustronne stereotaktyczne wstrzyknięcie EcoHIV do kory mózgowej, które skutecznie wywołało aktywne zakażenie wirusem HIV w mózgu szczura 7 dni po wstrzyknięciu. Co więcej, wykazaliśmy, że zakażenie EcoHIV u szczurów może być dobrym systemem biologicznym do badania kluczowych aspektów HAND. Osiem tygodni po zakażeniu EcoHIV szczury wykazywały znaczne zaburzenia neurokognitywne, które obejmowały zmiany w ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ogniwa 293FT	ThermoFisher Scientific	R70007
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczy	roztwór Cellgro	30004CI	100X
Corning BioCoatŻelatyna 75cm² Prostokątna kolba do hodowli komórkowych z przechyloną szyjką i wentylowaną nasadką	Life Technologies	354488
Corning DMEM z L-glutaminą, 4,5 g/l glukozy i pirogronianem sodu	Life Technologies	10013CV
Szkło osłonowe	VWR	637-137
wiertarka
Dumont #5 Kleszcze	World Precision Instruments	14095
Dumont #7 Kleszcze	World Precision Instruments	14097
Eppendorf Mikrowirówka zatrzaskowa Biopur Safe-Lock Probówki	Technologies	22600028
Ethicon Vicryl Plus Antybakteryjny, 4-0 Polyglactin 910 Szew, 27in. FS-2	Med Vet International	VCP422H
Strzykawka Hamilton	Hamilton	1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcji	Technologie życia	L3000015
Kleszczyki do tęczówki	World Precision Instruments	15914
Nożyczki do tęczówki	World Precision Instruments	500216
Zestaw ELISA p24 związany z lentiwirusem Cell	Biolabs, inc.	VPK-107-5
Koncentrator Lenti-X	Takara	PT4421-2
Opti-MEM I Zredukowane technologie surowicy o średniej	żywotności	11058021
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127-500G
Paraformaldehyd	Sigma	P6148
ProLong Gold	Fisher Scientific	P36930
Sevoflurane	Merritt Zaopatrzenie weterynaryjne	347075
aparat stereotaktyczny	Instrumenty Kopf Model	900
Prowadnice SuperFrost Plus Fisher	Scientific	12-550-154%
Vannas Nożyczki	Świat Instrumenty precyzyjne	500086

Life