$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Emory. Myszy C57BL/6 (zarówno samce, jak i samice) w wieku 8-12 tygodni miały swobodny dostęp do pożywienia i wody przed eutanazją.
1. Usunięcie jelita (Dzień 1)
- Poddaj mysz eutanazji metodą uduszenia dwutlenkiem węgla, przy natężeniu przepływu 1,6 ml gazowego dwutlenku węgla, aż do zaobserwowania zaprzestania oddychania przez 2 minuty).
- Umieść mysz na wznak na desce sekcyjnej z przypiętymi kończynami. Wysterylizuj brzuch 70% etanolem. Za pomocą kleszczy rozetnij skórę nożyczkami.
- Delikatnie unieś wątrobę i zidentyfikuj żołądek. Następnie trzymając żołądek kleszczami, odetnij przełyk tuż nad żołądkiem. Trzymając żołądek kleszczami, delikatnie odetnij krezki i odłącz jelito od jamy brzusznej aż do odbytnicy. Odetnij odłączone jelito w odbytnicy.
- Przenieść odłączone jelito do lodowatego roztworu PBS na szalce Petriego. Teraz delikatnie odetnij krezkę między segmentami jelita krętego i wyprostuj jelito tak, aby zaczynając od żołądka, wszystkie krezki zostały odcięte, aż do okrężnicy.
- Wytnij 1-1,5 cm pożądanego obszaru jelita w celu barwienia CLARITY na nowej szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS.
- Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml przymocowanej do końca igły o pojemności 20 g, wypłucz zawartość kału lodowatym PBS.
UWAGA: Każdy obszar jelita może być użyty do barwienia CLARITY przy użyciu tej samej techniki. Odcinek jelita może zostać rozcięty wzdłuż krezki lub wykorzystany w stanie nienaruszonym do kolejnych etapów.
2. Utrwalenie tkanki jelitowej (Dzień 1)
- Utrwal tkankę w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) w PBS.
- Przenieś 1-1,5 cm kawałek interesującego Cię odcinka jelita do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 4% PFA w temperaturze 4 °C przez noc w celu utrwalenia.
3. Osadzanie hydrożelu (Dzień 2)
- Przenieść segment jelita z 4% roztworu PFA za pomocą kleszczyków do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml z roztworem PBS i umyć trzy razy (po 5 minut, na wytrząsarce z prędkością 150-200 obr./min) w celu usunięcia pozostałości PFA.
- Przygotowanie 4% hydrożelu
- Użyj 30% roztworu żelu (ProtoGel) do przygotowania hydrożelu. Aby przygotować 4% roztwór hydrożelu, rozcieńczyć 30% roztwór podstawowy rozcieńczyć w PBS. Aby przygotować 12 ml 4% hydrożelu, weź 1,6 ml 30% roztworu żelu i dodaj 10,4 ml PBS.
- Przenieść utrwaloną tkankę z etapu 3.1. do 4% roztworu hydrożelu w PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
UWAGA: Zdecydowanie zaleca się, aby po całonocnej inkubacji tkanka została umyta z PFA za pomocą PBS. Tkanka przechowywana dłużej w PFA nie daje dobrych rezultatów przy kolejnych krokach i barwieniu. Utrwalona tkanka po przemyciu PBS może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez tydzień.
4. Etap polimeryzacji hydrożelu i delipidacji (oczyszczania) (Dzień 3)
- Wyjąć stożkową probówkę zawierającą tkankę w roztworze hydrożelu z temperatury 4 °C. Przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 1 godzinę. Ten etap pozwala na polimeryzację hydrożelową.
- Po 1 godzinie wyjąć stożkową rurkę zawierającą hydrożelową tkankę zatopioną w łaźni wodnej i odlewać roztwór akrylamidu. Teraz delikatnie spłucz chusteczkę pojedynczym płukaniem PBS w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar hydrożelu.
- Etap delipidacji
- Delipidat przez inkubację tkanki w dodecylosiarczanie sodu (8% SDS) w PBS. Przenieś tkankę zatopioną w hydrożelu z kroku 4.2 do 8% roztworu SDS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w roztworze SDS i że probówka jest zakryta.
- Przenieść zakrytą 50 ml probówkę zawierającą tkankę w SDS do wytrząsarki o temperaturze 37 °C (200 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 2 dni (dni 4 i 5), aby umożliwić odlipidowanie.
UWAGA: Upewnij się, że roztwór SDS jest napełniony do co najmniej 20-25 ml w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aby skompensować parowanie, które może wystąpić w temperaturze 37 °C w ciągu 2 dni inkubacji.
- W dniach 4 i 5 inkubować tkankę w SDS w wytrząsarce o temperaturze 37 °C (200 obr./min) w temperaturze pokojowej.
5. Zmywanie detergentu z oczyszczonej chusteczki (Dzień 6)
- Pobrać tkankę z roztworu SDS. Tkanka będzie wydawała się "przezroczysta" lub przezroczysta.
- Przenieś tkankę do nowej probówki komicznej o pojemności 50 ml z roztworem PBS i myj w ciągu dnia na wytrząsarce (150-200 obr./min) w temperaturze pokojowej z kilkoma zmianami PBS, aby upewnić się, że wszystkie ślady SDS zostały usunięte. Co najmniej 10 zmian roztworu PBS zapewni, że tkanka zostanie wolna od SDS, a dobrą zasadą jest sprawdzenie, czy końcowe pranie PBS nie ma śladów piany/piany z SDS. Jest to krytyczny krok, ponieważ SDS może zakłócać kolejne etapy barwienia.
UWAGA: Pod koniec dnia oczyszczona tkanka po kilku płukaniach w PBS jest teraz gotowa do barwienia immunologicznego lub może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni.
- Przechowywanie oczyszczonych tkanek jelitowych przez ponad miesiąc w roztworze PBS wpłynie na integralność tkanek i jakość barwienia. Użyj oczyszczonej tkanki jelitowej natychmiast lub w ciągu 1-2 tygodni od oczyszczenia, aby uzyskać najlepsze wyniki.
6. Barwienie immunofluorescencyjne neuronów, komórek glejowych i enteroendokrynnych
- Przenieść oczyszczoną tkankę do probówki o pojemności 1,5 lub 2 ml i inkubować w objętości 500 μl odpowiednich pierwszorzędowych przeciwciał rozcieńczonych w 0,5% normalnej surowicy osła w PBS zawierającej 0,3% Triton X-100) przez noc w temperaturze 4 °C. Zastosowane przeciwciała (Ab): Tuj1 lub β-3-tubulina (marker neuronalny Pan, 1: 1000), białko kwasu fibrylarnego glejowego (GFAP, 1: 500), chromogranina A (1: 250).
- Po całonocnej inkubacji poddaj tkankę 3 płukaniom PBS (po 5 minut przy użyciu 1-1,5 ml PBS) w celu usunięcia niezwiązanego pierwotnego Ab.
- Przenieś tkankę do nowej probówki, a następnie inkubuj z 500 μl odpowiedniego wtórnego Alexa Fluor Ab (AF) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Stosowane wtórne Ab to AF 488 dla Tuj1 (1: 1000), AF-555 dla GFAP (1: 500) i AF 555 (1: 250) dla chromograniny A.
- Po inkubacji przemyć tkankę trzykrotnie PBS, jak w kroku 6.2.
- W celu barwienia jąder inkubować tkankę w DAPI (rozcieńczenie 1: 10000 lub 0,2 μl w 2 ml PBS) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Na koniec przenieś zabarwioną tkankę na czyste szkiełko podstawowe, nałóż szkiełko nakrywkowe na chusteczkę i zamontuj za pomocą 100 μl VectaShield do obrazowania konfokalnego.
- Umieść szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej w uchwycie na szkiełka na 30 minut w celu wyschnięcia, po czym można je zobrazować lub przechowywać w temperaturze -20 °C. Ściana jelita myszy jest dość cienka i po otwarciu wzdłuż krezki można ją zamontować na szkiełkach podstawowych bezpośrednio za pomocą szkiełka nakrywkowego. W przypadku pracy z większymi tkankami, takimi jak śledziona, nerki, komory (jamy) można zastosować preparaty lub przekładki. W przypadku większych tkanek, takich jak szkiełko wnękowe, można użyć szkiełka wnękowego.
UWAGA: Należy zauważyć, że jeśli odcinek jelitowy nie został rozcięty na początku kroku (patrz uwaga w kroku 1), zaleca się rozcięcie rurki jelitowej mikronożyczkami, które ułatwią kroki związane z montażem.
7. Obrazowanie konfokalne
UWAGA: Oczyszczona, poplamiona i zamontowana tkanka może być natychmiast zobrazowana lub może być przechowywana w pudełkach na slajdy w temperaturze -20°C.
- Obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego (np. Olympus FV1000).
- Weź stosy z na grubości 50 μm tkanki jelitowej, aby uwidocznić obszary od światła jelita w kierunku warstwy surowiczej.
- Przechowuj obrazy stosu z jako pliki obrazów, .avi pliki filmowe lub konwertuj na obraz 3D za pomocą oprogramowania5.