Artykuł metodologiczny

Obrazowanie jelit z "CLARITY"

DOI:

10.3791/62143

⸱

11 czerwca 2021

 , 
1Department of Pathology & Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, GA

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół pasywnego barwienia CLARITY (PACT) jelita myszy, aby umożliwić wizualizację tkanek podnabłonkowych, w tym neuronów, komórek glejowych i enteroendokrynnych (EEC) bez podziału na tkanki. Protokół polega na zatopieniu hydrożelu w tkance utrwalonej formaldehydem, a następnie odlipidowaniu za pomocą anionowego detergentu w celu "oczyszczenia" tkanki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) rozwinęła się ostatnio jako cenna technika polegająca na osadzaniu akrylamidu w celu delipidacji tkanki (bez sekcji) i zachowania struktury tkanki 3D do barwienia immunologicznego. Technika ta jest bardzo przydatna w obrazowaniu dynamicznego środowiska jelitowego, w którym różne typy komórek oddziałują na siebie podczas homeostazy i stanów chorobowych. Ta metoda zoptymalizowana pod kątem jelit myszy jest opisana tutaj, która pomaga śledzić typy komórek, takie jak nabłonek, enteroendokrynny, neurony, glej i projekcje neuronalne w nabłonku lub komórkach enteroendokrynnych, które pośredniczą odpowiednio w wykrywaniu mikrobiologicznym lub chemicznym składnikach odżywczych. Tkanka jelitowa (1-1,5 cm) jest utrwalana w 4% paraformaldehydzie (PFA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C przez noc pierwszego dnia. W dniu 2 PFA jest odrzucany, a tkanka jest trzykrotnie przemywana PBS. Tkanka jest zatopiona w hydrożelu w celu zachowania jej integralności przez inkubację w 4% roztworze hydrożelu (akrylamidu) w PBS (rozcieńczonym z 30% ProtoGel) przez noc w temperaturze 4 °C. W dniu 3 roztwór tkankowo-hydrożelowy inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić polimeryzację hydrożelu. Tkanka jest następnie delikatnie przemywana trzykrotnie PBS w celu usunięcia nadmiaru hydrożelu. Kolejny etap delipidacji (oczyszczania) obejmuje inkubację tkanek w dodecylosiarczanie sodu (8% SDS w PBS) w temperaturze 37 °C przez 2 dni (dni 4 i 5) na wytrząsarce w temperaturze pokojowej (RT). W 6 dniu oczyszczona tkanka jest dokładnie myta PBS w celu usunięcia SDS. Tkanka może być wybarwiona immunologicznie przez inkubację w przeciwciałach pierwszorzędowych (rozcieńczonych w 0,5% normalnej surowicy osła w PBS zawierającej 0,3% Triton X-100), przez noc w temperaturze 4°C, a następnie inkubację w odpowiednich drugorzędowych przeciwciałach Alexa Fluor przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej oraz barwienie jądrowe DAPI (1: 10000). Tkanka jest przenoszona na czyste szkiełko podstawowe i montowana za pomocą VectaShield do obrazowania konfokalnego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) rozwinęła się ostatnio jako cenna technika polegająca na zatapianiu akrylamidu (hydrożelu) i delipidacji tkanek w celu zachowania struktury tkanki 3D do barwienia immunologicznego (bez sekcji)1,2. Tkanka zatopiona w hydrożelu jest optycznie przezroczysta i przepuszczalna dla makrocząsteczek, a białka i kwasy nukleinowe są zakonserwowane po usunięciu lipidów przez detergent. W 2013 roku CLARITY została uznana za jedno z dziesięciu znaczących przełomów przez Science3. Chociaż t....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Emory. Myszy C57BL/6 (zarówno samce, jak i samice) w wieku 8-12 tygodni miały swobodny dostęp do pożywienia i wody przed eutanazją.

1. Usunięcie jelita (Dzień 1)

  1. Poddaj mysz eutanazji metodą uduszenia dwutlenkiem węgla, przy natężeniu przepływu 1,6 ml gazowego dwutlenku węgla, aż do zaobserwowania zaprzestania oddychania przez 2 minuty).
  2. Umieść mysz na wznak na desce sekcyjnej z przypiętymi kończynami. Wysterylizuj brzuch 70% etanolem. Za pomocą kleszczy rozetnij skórę nożyczkami.
    3. ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazy z tkanki jelitowej myszy oczyszczonej za pomocą CLARITY są przedstawione w Rysunek 1. Pomyślne zakończenie protokołu zapewnia wysokiej jakości, wyraźne obrazy, na których wszystkie szczegóły sieci komórkowej mogą być wyraźnie wizualizowane. Barwienie DAPI jąder jest bardzo dobrym wskaźnikiem do oceny jakości protokołu CLARITY i późniejszego barwienia immunologicznego, ponieważ może obrazować integralność tkanki. Co więcej, kształt komórki stanowi również wskazówkę, w jaki sposób proto.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda CLARITY jest bardzo przydatna do barwienia jelit myszy w celu wizualizacji różnych typów komórek, w tym nabłonka, neuronów i komórek glejowych w 3D, zwłaszcza sieci wypustek neuronalnych, które rozciągają się przez ścianę jelita do światła5 i ich unerwienia do komórek glejowych i EWG. Przedstawiona tutaj metoda została zmodyfikowana zgodnie z oryginalnym badaniem przeprowadzonym przez Yang i wsp. 20141.

Krytyczne kroki w protokole obejmują.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Amerykańskiego Towarzystwa Gastroenterologicznego (AGA) AGA-Rome Functional Gi motorility Disorders Pilot Research Award (dla BC), grantu U.S. National Institutes of Health AI64462 (ASN) oraz Emory University Integrated Cellular Imaging Microscopy Core.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% paraformaldehyd (PFA)  w PBSThermoFischer ScientificJ19943Stosowany do utrwalania tkanek
4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)ThermoFischer ScientificD13061/10 000 rozcieńczenie
Alexa Fluor-488ThermoFischer ScientificA-110341/1000 rozcieńczenie
Alexa Fluor-555ThermoFischer ScientificA-21428Rozcieńczenie 1/500
Anti-GFAP (białko kwasu fibrylarnego glejowego)Abcamab7260Rozcieńczenie 1/500
Anty-beta III Tubulina (lub Tuj1)Abcamab18207Rozcieńczenie 1/1000
Chromogranina AAbcamab15160Rozcieńczenie 1/250
ProtoGel  30%National DiagnosticsEC-890Toksyczny, niebezpieczny, należy obchodzić się z nim ostrożnie- przygotować 4% roztwór w PBS do użycia
Dodecylosiarczan soduThermoFischer Scientific283648% w podłożu montażowym
PBS VectashieldVector LaboratoriesH-1000

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 33....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

obrazowanie CLARITYobrazowanie jelitzatapianie w akrylamidziedelipidacja tkanektr jwymiarowa struktura tkankiimmunobarwieniejelito mysieobrazowanie konfokalnekom rki enteroendokrynneprojekcje neuronalne
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły