Obrazowanie jelit z "CLARITY"

Podsumowanie

Opisujemy protokół pasywnego barwienia CLARITY (PACT) jelita myszy, aby umożliwić wizualizację tkanek podnabłonkowych, w tym neuronów, komórek glejowych i enteroendokrynnych (EEC) bez podziału na tkanki. Protokół polega na zatopieniu hydrożelu w tkance utrwalonej formaldehydem, a następnie odlipidowaniu za pomocą anionowego detergentu w celu "oczyszczenia" tkanki.

Streszczenie

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) rozwinęła się ostatnio jako cenna technika polegająca na osadzaniu akrylamidu w celu delipidacji tkanki (bez sekcji) i zachowania struktury tkanki 3D do barwienia immunologicznego. Technika ta jest bardzo przydatna w obrazowaniu dynamicznego środowiska jelitowego, w którym różne typy komórek oddziałują na siebie podczas homeostazy i stanów chorobowych. Ta metoda zoptymalizowana pod kątem jelit myszy jest opisana tutaj, która pomaga śledzić typy komórek, takie jak nabłonek, enteroendokrynny, neurony, glej i projekcje neuronalne w nabłonku lub komórkach enteroendokrynnych, które pośredniczą odpowiednio w wykrywaniu mikrobiologicznym lub chemicznym składnikach odżywczych. Tkanka jelitowa (1-1,5 cm) jest utrwalana w 4% paraformaldehydzie (PFA) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C przez noc pierwszego dnia. W dniu 2 PFA jest odrzucany, a tkanka jest trzykrotnie przemywana PBS. Tkanka jest zatopiona w hydrożelu w celu zachowania jej integralności przez inkubację w 4% roztworze hydrożelu (akrylamidu) w PBS (rozcieńczonym z 30% ProtoGel) przez noc w temperaturze 4 °C. W dniu 3 roztwór tkankowo-hydrożelowy inkubuje się w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić polimeryzację hydrożelu. Tkanka jest następnie delikatnie przemywana trzykrotnie PBS w celu usunięcia nadmiaru hydrożelu. Kolejny etap delipidacji (oczyszczania) obejmuje inkubację tkanek w dodecylosiarczanie sodu (8% SDS w PBS) w temperaturze 37 °C przez 2 dni (dni 4 i 5) na wytrząsarce w temperaturze pokojowej (RT). W 6 dniu oczyszczona tkanka jest dokładnie myta PBS w celu usunięcia SDS. Tkanka może być wybarwiona immunologicznie przez inkubację w przeciwciałach pierwszorzędowych (rozcieńczonych w 0,5% normalnej surowicy osła w PBS zawierającej 0,3% Triton X-100), przez noc w temperaturze 4°C, a następnie inkubację w odpowiednich drugorzędowych przeciwciałach Alexa Fluor przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej oraz barwienie jądrowe DAPI (1: 10000). Tkanka jest przenoszona na czyste szkiełko podstawowe i montowana za pomocą VectaShield do obrazowania konfokalnego.

Wprowadzenie

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) rozwinęła się ostatnio jako cenna technika polegająca na zatapianiu akrylamidu (hydrożelu) i delipidacji tkanek w celu zachowania struktury tkanki 3D do barwienia immunologicznego (bez sekcji)^1,2. Tkanka zatopiona w hydrożelu jest optycznie przezroczysta i przepuszczalna dla makrocząsteczek, a białka i kwasy nukleinowe są zakonserwowane po usunięciu lipidów przez detergent. W 2013 roku CLARITY została uznana za jedno z dziesięciu znaczących przełomów przez Science³. Chociaż technika ta została początkowo opracowana do obrazowania bogatych w lipidy tkanek mózgowych, w których lipidy wpływają na rozpraszanie światła i jakość obrazowania, jest obecnie szeroko stosowana do obrazowania innych tkanek, takich jak jelita, wątroba, nerki i serce. Technika ta oferuje możliwość barwienia i obrazowania tkanki poprzez wyeliminowanie potrzeby cięcia, co w przeciwnym razie mogłoby skutkować stronniczą oceną interakcji komórka-komórka z powodu nieregularnego rozmieszczenia typów komórek. Technika ta daje również możliwość wykonania konfokalnych stosów z i odtworzenia trójwymiarowego obrazu tkanki, co może pomóc w określeniu gęstości, mikroarchitektury i interakcji komórka-komórka między różnymi typami komórek bardziej realistycznie niż na podstawie przekroju tkanki. Co więcej, technika została zmodyfikowana, aby umożliwić barwienie immunologiczne gęstych tkanek, takich jak kości, a także badania hybrydyzacji in situ. Hydrożelowa osadzona tkanka 3D stanowi atrakcyjną platformę do wyjaśniania interakcji między komórkami nabłonkowymi, enteroendokrynnymi, glejowymi i neuronalnymi, które zostały ostatnio uznane za kluczowe dla zrozumienia patofizjologii chorób takich jak choroba Parkinsona, choroba Alzheimera, zaburzenia ze spektrum autyzmu itp⁴.

Protokół

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Emory. Myszy C57BL/6 (zarówno samce, jak i samice) w wieku 8-12 tygodni miały swobodny dostęp do pożywienia i wody przed eutanazją.

1. Usunięcie jelita (Dzień 1)

1. Poddaj mysz eutanazji metodą uduszenia dwutlenkiem węgla, przy natężeniu przepływu 1,6 ml gazowego dwutlenku węgla, aż do zaobserwowania zaprzestania oddychania przez 2 minuty).
2. Umieść mysz na wznak na desce sekcyjnej z przypiętymi kończynami. Wysterylizuj brzuch 70% etanolem. Za pomocą kleszczy rozetnij skórę nożyczkami.
3. Delikatnie unieś wątrobę i zidentyfikuj żołądek. Następnie trzymając żołądek kleszczami, odetnij przełyk tuż nad żołądkiem. Trzymając żołądek kleszczami, delikatnie odetnij krezki i odłącz jelito od jamy brzusznej aż do odbytnicy. Odetnij odłączone jelito w odbytnicy.
4. Przenieść odłączone jelito do lodowatego roztworu PBS na szalce Petriego. Teraz delikatnie odetnij krezkę między segmentami jelita krętego i wyprostuj jelito tak, aby zaczynając od żołądka, wszystkie krezki zostały odcięte, aż do okrężnicy.
5. Wytnij 1-1,5 cm pożądanego obszaru jelita w celu barwienia CLARITY na nowej szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS.
6. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml przymocowanej do końca igły o pojemności 20 g, wypłucz zawartość kału lodowatym PBS.
   UWAGA: Każdy obszar jelita może być użyty do barwienia CLARITY przy użyciu tej samej techniki. Odcinek jelita może zostać rozcięty wzdłuż krezki lub wykorzystany w stanie nienaruszonym do kolejnych etapów.

2. Utrwalenie tkanki jelitowej (Dzień 1)

1. Utrwal tkankę w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) w PBS.
2. Przenieś 1-1,5 cm kawałek interesującego Cię odcinka jelita do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 4% PFA w temperaturze 4 °C przez noc w celu utrwalenia.

3. Osadzanie hydrożelu (Dzień 2)

1. Przenieść segment jelita z 4% roztworu PFA za pomocą kleszczyków do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml z roztworem PBS i umyć trzy razy (po 5 minut, na wytrząsarce z prędkością 150-200 obr./min) w celu usunięcia pozostałości PFA.
2. Przygotowanie 4% hydrożelu
   1. Użyj 30% roztworu żelu (ProtoGel) do przygotowania hydrożelu. Aby przygotować 4% roztwór hydrożelu, rozcieńczyć 30% roztwór podstawowy rozcieńczyć w PBS. Aby przygotować 12 ml 4% hydrożelu, weź 1,6 ml 30% roztworu żelu i dodaj 10,4 ml PBS.
3. Przenieść utrwaloną tkankę z etapu 3.1. do 4% roztworu hydrożelu w PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
   UWAGA: Zdecydowanie zaleca się, aby po całonocnej inkubacji tkanka została umyta z PFA za pomocą PBS. Tkanka przechowywana dłużej w PFA nie daje dobrych rezultatów przy kolejnych krokach i barwieniu. Utrwalona tkanka po przemyciu PBS może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez tydzień.

4. Etap polimeryzacji hydrożelu i delipidacji (oczyszczania) (Dzień 3)

1. Wyjąć stożkową probówkę zawierającą tkankę w roztworze hydrożelu z temperatury 4 °C. Przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 1 godzinę. Ten etap pozwala na polimeryzację hydrożelową.
2. Po 1 godzinie wyjąć stożkową rurkę zawierającą hydrożelową tkankę zatopioną w łaźni wodnej i odlewać roztwór akrylamidu. Teraz delikatnie spłucz chusteczkę pojedynczym płukaniem PBS w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar hydrożelu.
3. Etap delipidacji
   1. Delipidat przez inkubację tkanki w dodecylosiarczanie sodu (8% SDS) w PBS. Przenieś tkankę zatopioną w hydrożelu z kroku 4.2 do 8% roztworu SDS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w roztworze SDS i że probówka jest zakryta.
   2. Przenieść zakrytą 50 ml probówkę zawierającą tkankę w SDS do wytrząsarki o temperaturze 37 °C (200 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 2 dni (dni 4 i 5), aby umożliwić odlipidowanie.
      UWAGA: Upewnij się, że roztwór SDS jest napełniony do co najmniej 20-25 ml w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aby skompensować parowanie, które może wystąpić w temperaturze 37 °C w ciągu 2 dni inkubacji.
4. W dniach 4 i 5 inkubować tkankę w SDS w wytrząsarce o temperaturze 37 °C (200 obr./min) w temperaturze pokojowej.

5. Zmywanie detergentu z oczyszczonej chusteczki (Dzień 6)

1. Pobrać tkankę z roztworu SDS. Tkanka będzie wydawała się "przezroczysta" lub przezroczysta.
2. Przenieś tkankę do nowej probówki komicznej o pojemności 50 ml z roztworem PBS i myj w ciągu dnia na wytrząsarce (150-200 obr./min) w temperaturze pokojowej z kilkoma zmianami PBS, aby upewnić się, że wszystkie ślady SDS zostały usunięte. Co najmniej 10 zmian roztworu PBS zapewni, że tkanka zostanie wolna od SDS, a dobrą zasadą jest sprawdzenie, czy końcowe pranie PBS nie ma śladów piany/piany z SDS. Jest to krytyczny krok, ponieważ SDS może zakłócać kolejne etapy barwienia.
   UWAGA: Pod koniec dnia oczyszczona tkanka po kilku płukaniach w PBS jest teraz gotowa do barwienia immunologicznego lub może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni.
3. Przechowywanie oczyszczonych tkanek jelitowych przez ponad miesiąc w roztworze PBS wpłynie na integralność tkanek i jakość barwienia. Użyj oczyszczonej tkanki jelitowej natychmiast lub w ciągu 1-2 tygodni od oczyszczenia, aby uzyskać najlepsze wyniki.

6. Barwienie immunofluorescencyjne neuronów, komórek glejowych i enteroendokrynnych

1. Przenieść oczyszczoną tkankę do probówki o pojemności 1,5 lub 2 ml i inkubować w objętości 500 μl odpowiednich pierwszorzędowych przeciwciał rozcieńczonych w 0,5% normalnej surowicy osła w PBS zawierającej 0,3% Triton X-100) przez noc w temperaturze 4 °C. Zastosowane przeciwciała (Ab): Tuj1 lub β-3-tubulina (marker neuronalny Pan, 1: 1000), białko kwasu fibrylarnego glejowego (GFAP, 1: 500), chromogranina A (1: 250).
2. Po całonocnej inkubacji poddaj tkankę 3 płukaniom PBS (po 5 minut przy użyciu 1-1,5 ml PBS) w celu usunięcia niezwiązanego pierwotnego Ab.
3. Przenieś tkankę do nowej probówki, a następnie inkubuj z 500 μl odpowiedniego wtórnego Alexa Fluor Ab (AF) przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Stosowane wtórne Ab to AF 488 dla Tuj1 (1: 1000), AF-555 dla GFAP (1: 500) i AF 555 (1: 250) dla chromograniny A.
4. Po inkubacji przemyć tkankę trzykrotnie PBS, jak w kroku 6.2.
5. W celu barwienia jąder inkubować tkankę w DAPI (rozcieńczenie 1: 10000 lub 0,2 μl w 2 ml PBS) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Na koniec przenieś zabarwioną tkankę na czyste szkiełko podstawowe, nałóż szkiełko nakrywkowe na chusteczkę i zamontuj za pomocą 100 μl VectaShield do obrazowania konfokalnego.
7. Umieść szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej w uchwycie na szkiełka na 30 minut w celu wyschnięcia, po czym można je zobrazować lub przechowywać w temperaturze -20 °C. Ściana jelita myszy jest dość cienka i po otwarciu wzdłuż krezki można ją zamontować na szkiełkach podstawowych bezpośrednio za pomocą szkiełka nakrywkowego. W przypadku pracy z większymi tkankami, takimi jak śledziona, nerki, komory (jamy) można zastosować preparaty lub przekładki. W przypadku większych tkanek, takich jak szkiełko wnękowe, można użyć szkiełka wnękowego.
   UWAGA: Należy zauważyć, że jeśli odcinek jelitowy nie został rozcięty na początku kroku (patrz uwaga w kroku 1), zaleca się rozcięcie rurki jelitowej mikronożyczkami, które ułatwią kroki związane z montażem.

7. Obrazowanie konfokalne

UWAGA: Oczyszczona, poplamiona i zamontowana tkanka może być natychmiast zobrazowana lub może być przechowywana w pudełkach na slajdy w temperaturze -20°C.

1. Obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego (np. Olympus FV1000).
2. Weź stosy z na grubości 50 μm tkanki jelitowej, aby uwidocznić obszary od światła jelita w kierunku warstwy surowiczej.
3. Przechowuj obrazy stosu z jako pliki obrazów, .avi pliki filmowe lub konwertuj na obraz 3D za pomocą oprogramowania⁵.

Wyniki

Obrazy z tkanki jelitowej myszy oczyszczonej za pomocą CLARITY są przedstawione w Rysunek 1. Pomyślne zakończenie protokołu zapewnia wysokiej jakości, wyraźne obrazy, na których wszystkie szczegóły sieci komórkowej mogą być wyraźnie wizualizowane. Barwienie DAPI jąder jest bardzo dobrym wskaźnikiem do oceny jakości protokołu CLARITY i późniejszego barwienia immunologicznego, ponieważ może obrazować integralność tkanki. Co więcej, kształt komórki stanowi również wskazówkę, w jaki sposób proto...

Dyskusja

Metoda CLARITY jest bardzo przydatna do barwienia jelit myszy w celu wizualizacji różnych typów komórek, w tym nabłonka, neuronów i komórek glejowych w 3D, zwłaszcza sieci wypustek neuronalnych, które rozciągają się przez ścianę jelita do światła⁵ i ich unerwienia do komórek glejowych i EWG. Przedstawiona tutaj metoda została zmodyfikowana zgodnie z oryginalnym badaniem przeprowadzonym przez Yang i wsp. 2014¹.

Krytyczne kroki w protokole obejmują...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
4% paraformaldehyd (PFA)  w PBS	ThermoFischer Scientific	J19943	Stosowany do utrwalania tkanek
4',6-Diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek (DAPI)	ThermoFischer Scientific	D1306	1/10 000 rozcieńczenie
Alexa Fluor-488	ThermoFischer Scientific	A-11034	1/1000 rozcieńczenie
Alexa Fluor-555	ThermoFischer Scientific	A-21428	Rozcieńczenie 1/500
Anti-GFAP (białko kwasu fibrylarnego glejowego)	Abcam	ab7260	Rozcieńczenie 1/500
Anty-beta III Tubulina (lub Tuj1)	Abcam	ab18207	Rozcieńczenie 1/1000
Chromogranina A	Abcam	ab15160	Rozcieńczenie 1/250
ProtoGel  30%	National Diagnostics	EC-890	Toksyczny, niebezpieczny, należy obchodzić się z nim ostrożnie- przygotować 4% roztwór w PBS do użycia
Dodecylosiarczan sodu	ThermoFischer Scientific	28364	8% w podłożu montażowym
PBS Vectashield	Vector Laboratories	H-1000