Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie aktywowanych węchowych neuronów czuciowych myszy za pomocą skojarzonego barwienia immunologicznego i hybrydyzacji in situ

988 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62150

⸱

11 kwietnia 2021

 ,  , 
1Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of Biology, University of Campinas, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Campinas

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół łączy hybrydyzację in situ z immunofluorescencją w celu identyfikacji genów receptora węchowego i lemieszowo-nosowego wyrażonych w węchowych neuronach czuciowych po aktywacji przez bodźce chemiczne u myszy.

Streszczenie

Zwierzęta polegają na komunikacji chemicznej, aby przekazywać i odbierać istotne informacje środowiskowe, począwszy od oceny jakości żywności, a skończywszy na wykrywaniu dostępnych partnerów do krycia lub zagrożeń. U myszy zadanie to jest wykonywane głównie przez układ węchowy i jego podstawowe podsystemy, w tym główny i dodatkowy układ węchowy. Oba mają narządy obwodowe wypełnione neuronami czuciowymi eksprymującymi receptory sprzężone z białkiem G, zdolne do wiązania sygnałów chemicznych, które docierają do jamy nosowej. Mimo że charakterystyka molekularna tych receptorów jest dobrze poznana, niewiele wiadomo na temat ich pokrewnych specyficznych ligandów. Opisana tutaj metoda łączy wykrywanie hybrydyzacji in situ receptorów węchowych lub lemieszowo-nosowych z immunodetekcją fosforylowanego białka rybosomalnego S6 (pS6) - markera aktywacji neuronów. Protokół ten został opracowany w celu identyfikacji neuronów aktywowanych po pojedynczym zdarzeniu ekspozycji na oczyszczone lub złożone bodźce chemiczne wykryte przez narządy węchowe. Co ważne, technika ta pozwala na badanie neuronów uruchamianych w kontekstach istotnych z biologicznego punktu widzenia. Idealnie byłoby, gdyby ta metoda była stosowana do badania biologii molekularnej układu węchowego i do badania zachowań węchowych.

Wprowadzenie

Chemosygnalizacja jest najbardziej rozpowszechnioną formą komunikacji u zwierząt. U ssaków wykrywanie sygnałów chemicznych odbywa się głównie za pośrednictwem węchu i ma kluczowe znaczenie dla znalezienia pożywienia, zlokalizowania potencjalnych partnerów do krycia i uniknięcia potencjalnych drapieżników1,2,3. Układ węchowy myszy jest dalej podzielony na różne podsystemy, z których każdy ma swoje własne właściwości anatomiczne, fizjologiczne i molekularne4. Wśród nich główny układ węchowy (MOS) i dodatkowy układ węchowy (AOS) są najszerzej badane i lepiej scharakteryzowane.

MOS jest głównie odpowiedzialny za wykrywanie lotnych cząsteczek chemicznych, które docierają do jamy nosowej. Osiąga się to za pomocą węchowych neuronów czuciowych (OSN), które wypełniają interfejs sensoryczny systemu - główny nabłonek węchowy (MOE). Każdy OSN wyraża jeden z tysięcy receptorów węchowych (OR) w sposób monogenowy i monoalleliczny5. Co więcej, OR są zwykle szeroko dostrojone6, a pojedynczy nawaniacz może wiązać się z więcej niż jednym OR, generując kod kombinatoryczny dla odors7.

Z kolei AOS jest głównie odpowiedzialny za wykrywanie feromonów i kairomonów. Ligandy te aktywują nerwice czuciowe lemieszowo-nosowe (VSN) w narządzie lemieszowo-nosowym (VNO). VSN w strefie wierzchołkowej VNO wyrażają receptory z rodziny receptorów lemieszowo-nosowych 1 (V1Rs)8, podczas gdy neurony w strefie podstawowej wyrażają rodzinę receptora lemieszowo-nosowego 2 (V2R)9. Co ważne, wykazano, że niektóre VSN wykazują współekspresję więcej niż jednego receptora lemieszowo-nosowego10,11,12.

Pomimo wszystkich dostępnych informacji na temat cech molekularnych ORs i VR, wiedza na temat ich pokrewnych ligandów jest nadal bardzo ograniczona. Identyfikacja specyficznych neuronów węchowych odpowiedzialnych za wykrywanie cząsteczki lub złożonego bodźca jest ważnym zadaniem dla osób badających węch, zachowania węchowe i reakcje fizjologiczne. Podjęto kilka prób desierotyzacji receptorów węchowych, w tym obrazowanie wapniowe7, sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki13,14, ekspresja receptora heterologicznego15, oraz strategie oparte na natychmiastowych wczesnych genach (IEGs)16. Ostatnio niektóre techniki zostały zastosowane do oceny modulacyjnego wpływu substancji zapachowych w neuronach czuciowych, przy użyciu obrazowania wapniowego in vivo17,18 i fluorescencyjnych strategii sekwencjonowania RNA oznaczonych białkiem fluorescencyjnym19. Większość z tych technik wymaga sztucznej konfiguracji lub jest wykonywana na zdysocjowanych neuronach, co uniemożliwia jednoczesną ocenę zachowań wywołanych przez używane zapachy.

Opisany tutaj protokół pozwala na identyfikację neuronów czuciowych aktywowanych po pojedynczym zdarzeniu ekspozycji na zapach, poprzez połączenie rybosond wykrywających specyficzne OR lub VR z immunodetekcją fosforylowanego białka rybosomalnego S6 (pS6), proxy dla aktywacji neuronów. Metoda ta jest wiarygodnym sposobem badania tożsamości neuronów czuciowych aktywowanych przez różne chemosygnały w biologicznie istotnym kontekście.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Protokołem Zwierzęcym #1883-1, zatwierdzonym przez Uniwersytet w Campinas (Instytut Biologii Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt - Komitet ds. Etyki w Wykorzystaniu Zwierząt w Badaniach), który przestrzega wytycznych ustanowionych przez federalną Narodową Radę Kontroli Eksperymentów na Zwierzętach (CONCEA).

1. Przygotowanie materiału

  1. Przygotować 1 l 3% H2O2 (v/v) w 1x PBS. Rozcieńczyć 100 ml 10× PBS i 100 ml 30% H2O2 w 500 ml ultraczystej wody. Uzupełnij objętość ultraczystą wodą. Przygotuj ten roztwór bezpośrednio przed użyciem.
  2. Przygotuj wilgotną komorę zawierającą kawałki niestrzępiących się chusteczek laboratoryjnych zwilżonych roztworem 5× SSC.
  3. Przygotować roztwory myjące do hybrydyzacji: 5× SSC (w 55 °C), 2× SSC (55 °C), 0,2× SSC (55 °C) i 0,1× SSC (55 °C i w temperaturze pokojowej). Rozpuścić odpowiednie objętości 20× roztworu podstawowego SSC w ultraczystej wodzie wolnej od RNaz. Przygotuj rozcieńczone roztwory na świeżo przed rozpoczęciem każdego eksperymentu.
  4. Przygotować roztwór blokujący immunohistochemię: 1× PBS/1% BSA/0,1% Triton X-100. W przypadku 100 ml rozcieńczyć 10 ml 10× PBS, 10 ml 10% BSA i 3,33 ml 3% Triton X-100 w 70 ml ultraczystej wody. Uzupełnij objętość ultraczystą wodą. Przygotuj rozcieńczone roztwory na świeżo przed rozpoczęciem każdego eksperymentu.
  5. Przygotuj roztwór PTw: 1× PBS/0,1% Tween-20. W przypadku 100 ml rozcieńczyć 1 ml 10% Tween-20 i 10 ml 10× PBS w 70 ml ultraczystej wody. Uzupełnij objętość ultraczystą wodą. Przygotuj ten roztwór na świeżo przed rozpoczęciem każdego eksperymentu.
  6. Przygotować wolny od RNaz 0,1 M roztwór trietanoloaminy. W przypadku 250 ml rozcieńczyć 3,33 ml odczynnika trietanoloaminy w 200 ml ultraczystej wody wolnej od RNaz pod mieszaniem (do przygotowania tego roztworu należy użyć szkła bez RNaz i mieszadła magnetycznego). Dostosuj pH do 8,0 za pomocą HCl. Uzupełnij objętość ultraczystą wodą wolną od RNaz i przechowuj w bezpiecznym miejscu przed światłem do czasu użycia. Przygotuj ten roztwór na świeżo przed rozpoczęciem każdego eksperymentu.
  7. Przygotować 0,1% H2O2 (v/v) bez RNaz w 1× PBS. Na 1 l rozcieńczyć 100 ml 10× PBS i 3,3 ml 30% H2O2 w 500 ml ultraczystej wody wolnej od RNaz. Uzupełnij objętość ultraczystą wodą wolną od RNaz. Przygotuj ten roztwór bezpośrednio przed użyciem.
  8. Przygotować roztwory wolne od RNaz: 0,2 M HCl; 1 M Tris-HCl pH 8,0; 10 mg/ml tRNA drożdży; 10% SDS; 10× PBS; 100× roztwór Denhardta; 20× SSC; 50% siarczan dekstranu; 6 M HCl
  9. Przygotuj 4% roztwór utrwalający paraformaldehyd bez RNaz. Na 100 ml rozpuść 4 g paraformaldehydu w 80 ml 1× PBS. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 10 M NaOH. Uzupełnij wolumin o 1× PBS. Roztwór ten musi być przygotowany na świeżo przed rozpoczęciem każdego doświadczenia.
    ostrożność: Paraformaldehyd jest substancją niebezpieczną, która może potencjalnie wyrządzić szkody w przypadku wdychania. Przygotować roztwór pod wyciągiem i założyć rękawice ochronne, maskę i okulary ochronne.
  10. Przygotować roztwór preparacyjny wolny od RNaz: 30% sacharoza/0,45 M EDTA pH 8,0/1× PBS. Na 100 ml rozpuść 30 g sacharozy w 60 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 bez RNaz. Dodaj 10 ml 10× PBS. Uzupełnij objętość za pomocą 0,5 M EDTA pH 8,0 bez RNaz.
  11. Przygotuj szklane lub plastikowe cylindry i zlewki z podziałką bez RNaz.
  12. Przygotuj roztwory wstępnej hybrydyzacji i hybrydyzacji bez RNaz: 50% dejonizowany formamid (v/v)/600 mM NaCl/200 μg/ml tRNA drożdży/0,25% SDS (w/v)/10 mM Tris-HCl pH 8,0/1× roztwór Denhardta/1 mM EDTA pH 8,0/10% siarczan dekstranu (w/v). Na 10 ml w cylindrze z podziałką dodać 5 ml dejonizowanego formamidu, 1,2 ml 5 M NaCl, 200 μl 10 mg/ml tRNA drożdży, 250 μl 10% SDS, 100 μl 1 M Tris-HCl pH 8,0, 200 μL 50× roztworu Denhardta, 20 μL 500 mM EDTA pH 8,0, i 2 ml 50% siarczanu dekstranu (MW, 500 000). Uzupełnij objętość ultraczystą wodą wolną od RNaz. Przygotuj ten roztwór na świeżo przed rozpoczęciem każdego eksperymentu.
    UWAGA: Siarczan dekstranu jest bardzo lepki. Zaleca się przygotowanie dodatkowych 20% całkowitej objętości roztworów do hybrydyzacji/wstępnej hybrydyzacji, aby uwzględnić błędy pipetowania. W razie potrzeby tRNA drożdży można pominąć w roztworze przed hybrydyzacją.
  13. Przygotuj szkiełka nakrywkowe z termoplastycznej folii laboratoryjnej. Wytnij prostokątne kawałki termoplastycznej folii laboratoryjnej o 1-2 mm krótsze niż długość i szerokość szkiełka mikroskopowego.
  14. Przygotować bufor TN: 100 mM Tris-HCl/150 mM NaCl. W przypadku 100 ml rozcieńczyć 10 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5 i 3 ml 5 M NaCl w 70 ml ultraczystej wody. Uzupełnij objętość ultraczystą wodą. Przygotuj ten roztwór na świeżo przed rozpoczęciem każdego eksperymentu.
  15. Przygotować bufor blokujący TNB: 0,5% odczynnik blokujący A (w/v) w buforze TN. W przypadku 200 ml rozpuść 1 g odczynnika blokującego A w 200 ml buforu TN (patrz Tabela materiałów dla komercyjnego źródła odczynnika blokującego A).
  16. Przygotuj bufor TNT: 0,05% Tween-20 w buforze TN. Na 1 l rozcieńczyć 5 ml 10% Tween-20 w 950 ml buforu TN. Powoli uzupełnij objętość buforem TN, aby uniknąć pienienia. Przygotuj ten roztwór na świeżo przed rozpoczęciem każdego eksperymentu.
  17. Przygotuj roztwór roboczy Tyramide-Alexa 488: 1× bufor wzmacniający A/0,0015% H2O2/1:100 tyramide-Alexa 488. Dla 100 μl rozcieńczyć 1 μl 0,15% H2O2 i 1 μl tyramide-Alexa 488 w 98 μl buforu amplifikacyjnego A (patrz Tabela materiałów dla komercyjnych źródeł tyramide-Alexa 488 i buforu wzmacniającego A). Przygotuj ten roztwór bezpośrednio przed użyciem.
  18. Przygotuj roztwór roboczy Tyramide-Alexa 555: 1× bufor wzmacniający A/0,0015% H2O2/1:100 tyramide-Alexa 555. Dla 100 μl rozcieńczyć 1 μl 0,15% H2O2 i 1 μl tyramide-Alexa 555 w 98 μl buforu amplifikacyjnego A (patrz Tabela materiałów dla komercyjnych źródeł tyramide-Alexa 555 i buforu wzmacniającego A). Przygotuj ten roztwór bezpośrednio przed użyciem.
  19. Przygotować roztwór roboczy tyramid-biotyna: 1× bufor amplifikacyjny B/0,0015% H2O2/1:50 tyramide-biotyna. Dla 100 μl rozcieńczyć 1 μl 0,15%H2O2i 2 μl tyramidu-biotyny w 97 μl buforu amplifikacyjnego B (patrz Tabela materiałów dla komercyjnych źródeł tyramide-biotyny i buforu wzmacniającego B). Przygotuj ten roztwór bezpośrednio przed użyciem.
  20. Piec szklane naczynia w temperaturze 200 °C przez co najmniej 4 godziny. Jednorazowe naczynia z tworzyw sztucznych (w tym stojaki na szkiełka, słoiki z kopliny i strzykawki) należy traktować 3% H2O2 przez 15-30 minut, a następnie dokładnie umyć pod wodą wolną od RNaz. Metalowe narzędzia ze stali nierdzewnej, takie jak narzędzia do preparowania, kleszcze i uchwyty na próbki kriostatu, należy traktować 3% H2O2 przez 15 minut, a następnie dokładnie umyć pod wodą wolną od RNaz. Oczyść powierzchnie stołu, podgrzewaną płytę i suche bloki roztworem czyszczącym RNaza.

2. Synteza rybosondy

UWAGA: Poniższa procedura syntezy sond cRNA znakowanych digoksygeniną o wielkości 1 kb do hybrydyzacji in situ poprzez transkrypcję in vitro opiera się na wcześniej opublikowanych protokołach20,21,22,23.

  1. Użyj odpowiednich par starterów oligonukleotydowych, aby amplifikować fragment DNA o wielkości 1 kb z genu będącego przedmiotem zainteresowania (np. genu receptora węchowego). Wybierz pary starterów, które amplifikują region obecny w dojrzałym mRNA, który ma zostać wykryty (na przykład sekwencję kodującą gen). Wybór starterów dla różnych receptorów węchowych znajduje się w tabeli materiałów. Szczegółowe informacje na temat sond do wykrywania innych receptorów węchowych lemieszowo-nosowych można znaleźć w poprzednich publikacjach16,21.
  2. Uruchom produkty PCR na 0,8% żelu agarozowym i usuń żądaną opaskę 1 kb.
  3. Oczyść fragment DNA za pomocą odpowiedniego zestawu do oczyszczania żelu na bazie mini kolumny zgodnie z protokołem producenta.
  4. Określ ilościowo oczyszczony fragment DNA i sklonuj go do odpowiedniego wektora klonowania PCR zgodnie z protokołem producenta. Zaleca się stosowanie wektorów klonujących zawierających promotory polimerazy RNA T7 i SP6 otaczające sklonowany amplikon.
  5. Przekształć rekombinowany plazmid w kompetentne bakterie wolne od rekombinacji poprzez przemianę chemiczną lub elektroporację zgodnie z protokołem producenta.
  6. Wysiewaj izolowane transformujące kolonie bakteryjne do bogatej pożywki i izoluj plazmid za pomocą minipreparatu DNA zgodnie z protokołem producenta.
  7. Przeprowadzić analizę trawienia restrykcyjnego z odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i/lub sekwencjonowaniem Sangera, aby sprawdzić tożsamość i orientację wstawionego fragmentu DNA zgodnie z protokołem producenta.
  8. Przeprowadzić trawienie restrykcyjne w celu linearyzacji 10 μg plazmidu przy użyciu odpowiedniego enzymu restrykcyjnego. Aby wytworzyć rybosondę antysensowną po transkrypcji in vitro, użyj enzymu restrykcyjnego, który trawi plazmidowy DNA na końcu wstawki przeciwnej do promotora polimerazy RNA znajdującego się poniżej sekwencji kodującej gen. Aby wytworzyć sensowne rybosondy po transkrypcji in vitro, użyj enzymu restrykcyjnego, który trawi plazmidowe DNA na końcu wstawki przeciwnej do promotora polimerazy RNA znajdującego się przed sekwencją kodującą gen
    9. .
  9. Uruchom podwielokrotność produktu reakcji linearyzacji plazmidu na 0,8% żelu agarozowym, aby potwierdzić kompletność trawienia. Po potwierdzeniu pełnej linearyzacji należy oczyścić pozostałą część reakcji za pomocą zestawu do czyszczenia PCR opartego na kolumnie zgodnie z protokołem producenta.
  10. Zsyntetyzuj sondy cRNA znakowane digoksygeniną przez transkrypcję in vitro przy użyciu 1-2 μg zlinearyzowanego plazmidu jako matrycy, odpowiedniego enzymu (np. polimerazy RNA T7 lub SP6) i odpowiedniego zestawu do znakowania digoksygeniny (DIG).
  11. Usunąć matrycę DNA z reakcji, trawiąc ją DNazą I w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  12. Oczyść sondy cRNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA opartego na mini kolumnie lub zestawu do oczyszczania na bazie filtracji żelowej. Otrzymaną sondę należy eluować w 50 μl wody wolnej od RNaz.
  13. Określ ilościowo otrzymaną rybosondę, najlepiej przy użyciu metod fluorometrycznych. Zwykle oczekiwany plon wynosi powyżej 100 ng/μL.
  14. Uruchom rybosondę w automatycznym systemie elektroforezy lub w 0,8% żelu agarozowym wolnym od RNaz, aby sprawdzić jakość i degradację sondy.
  15. Zsyntetyzowaną sondę należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.

3. Ekspozycja myszy na bodźce węchowe

  1. Każde zwierzę należy umieścić indywidualnie w czystej klatce przez co najmniej 24 godziny przed narażeniem. Usuń siatkę spożywczą co najmniej 2 godziny przed ekspozycją. Wszystkie zwierzęta użyte w tym badaniu to 8-12 tygodniowe samce myszy C57BL/6 (średnia waga: 20 g).
  2. Przygotuj odpowiedni bodziec węchowy. Różne bodźce mogą być wykorzystywane do aktywacji neuronów węchowych w MOE (główny nabłonek węchowy) lub VNO (narząd lemieszowo-nosowy). Pełną listę bodźców węchowych można znaleźć w innych publikacjach3, 16, 22,23,24. Bodźce płynne, takie jak roztwory chemiczne, mocz lub rekombinowany roztwór białka, mogą być osadzane na gazie medycznej lub waciku.
  3. Włóż bodziec węchowy do klatki i pozostaw zwierzę w spokoju przez 1 godzinę.
  4. Poddaj mysz eutanazji i szybko przeanalizuj MOE lub VNO za pomocą narzędzi preparacyjnych wolnych od RNaz.

4. Sekcja tkanek i zamrażanie

  1. Przeanalizuj MOE lub VNO pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą roztworu preparacyjnego.
    1. W przypadku VNO usuń grube kości przegrody, pozostawiając bardziej miękkie skorupy chrząstki otaczające narząd.
  2. Przygotować próbkę do kriosekcji.
    1. Osusz próbkę na kawałku bibuły i umieść ją w histologicznej plastikowej formie zawierającej podłoże do zatapiania.
    2. W przypadku VNO ułóż każdy narząd pionowo i pociągnij go na dno plastikowej formy za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (Rysunek 1A).
    3. W przypadku MOE umieść go na dnie plastikowej formy płytką cribriform skierowaną w dół.
    4. Usuń nadmiar pęcherzyków wokół próbki, ponieważ mogą one przeszkadzać w dzieleniu.
    5. Zamrozić próbki na suchym lodzie.
    6. Przechowywać blok próbki w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Zamrożone próbki mogą być przechowywane przez kilka miesięcy przed podziałem.
  3. Wykonaj kriosekcję.
    1. Włącz kriostat i ustaw temperaturę na -23 °C co najmniej 4 godziny przed użyciem.
    2. Wyjmij zamrożony blok z histologicznej plastikowej formy i przytnij go żyletką.
    3. Pozostaw 5 mm wokół próbki, ponieważ ułatwia to obsługę sekcji (Rysunek 1B).
    4. Użyj podłoża do zatapiania, aby przymocować blok do uchwytu próbki kriostatu.
    5. Zbierz skrawki 16 μm na dodatnio naładowane szkiełka mikroskopowe.
    6. Przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Szkiełka mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy przed hybrydyzacją in situ.

5. Protokół hybrydyzacji in situ krok po kroku

  1. Suszyć szkiełka przez 10 minut za pomocą suszarki do włosów. Użyj ciepłego strumienia do rozmrożenia szkiełek, a następnie przełącz się na strumień o temperaturze pokojowej, aż medium do zatapiania stanie się nieprzezroczyste.
  2. Dodać 500 μl na szkiełko 4% roztworu utrwalającego paraformaldehyd bez RNaz i inkubować w temperaturze 23-26 °C przez 15 minut w celu utrwalenia skrawków histologicznych.
  3. Umyj szkiełka dwukrotnie w 1× PBS bez RNaz przez 5 minut każde.
  4. Dodać 500 μl na szkiełko 0,2 M HCl bez RNaz i inkubować w temperaturze 23-26 °C przez 10 minut.
  5. Umyj szkiełka dwukrotnie w 1× PBS bez RNaz przez 5 minut każde.
  6. Dodać 500 μl na szkiełko 0,1% H2O2/1× PBS bez RNaz i inkubować przez 30 minut w temperaturze 23-26 °C. Wykonać ten krok w ciemności, aby zapobiec degradacji nadtlenku wodoru wywołanej światłem.
  7. Umyj szkiełka dwukrotnie w 1× PBS bez RNaz przez 5 minut każda.
  8. Przeprowadź acetylację, przenosząc szkiełka do słoika zawierającego 250 ml trietanoloaminy 0,1 M o pH 8,0 i magnetycznej mieszadła w dygestorium. Dodać 625 μl bezwodnika octowego pod ciągłym mieszaniem. Zmniejsz prędkość mieszania, dodaj kolejne 625 μl kropla po kropli na szkiełka, a następnie wyłącz mieszanie i inkubuj przez 10 minut.
  9. Umyj szkiełka dwukrotnie w 1× PBS bez RNaz przez 5 minut każda.
  10. Szkiełka należy myć raz w 1× PBS bez RNaz w temperaturze 60 °C przez 5 min.
  11. Wykonaj wstępną hybrydyzację, usuwając szkiełka z 1× PBS pojedynczo i osuszając każdą z nich za pomocą niestrzępiącej się bibułki laboratoryjnej. Odpipetować 400 μl roztworu do wstępnej hybrydyzacji na każde szkiełko i umieścić go w wilgotnej komorze podgrzanej do temperatury 60 °C w łaźni wodnej lub rozgrzanym piekarniku. Inkubować w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę.
  12. Podgrzać wystarczającą ilość roztworu do hybrydyzacji do 60 °C, porcję 200 μl na szkiełko w probówkach do mikrofuge i podgrzewać je do 85 °C przez 10 minut.
  13. Dodać odpowiednią sondę (sondy) cRNA do probówek z roztworem do hybrydyzacji (1 μg/ml każda sonda) i poddać denaturacji w temperaturze 85 °C przez 5 minut.
  14. W celu hybrydyzacji należy wyjmować po jednym szkiełku z nawilżonej komory, osuszać i umieszczać na płycie ogrzewanej w temperaturze 60 °C. Dodać 200 μl roztworu hybrydyzacyjnego zawierającego rybosondę i przykryć szkiełko szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować przez 12-16 godzin w wilgotnej komorze w temperaturze 60 °C.
    UWAGA: Nie pozwól, aby szkiełka ostygły po wstępnej hybrydyzacji. Temperatura hybrydyzacji musi być empirycznie określona dla każdej sondy. Jako punkt wyjścia sugeruje się sześćdziesiąt stopni Celsjusza, ponieważ generalnie działa dobrze w przypadku sond o rozmiarze 1 kb.
  15. Podgrzać roztwory do płukania SSC do 55 °C w oddzielnych słoikach i umieścić je w łaźni wodnej o odpowiedniej temperaturze.
  16. Po zakończeniu hybrydyzacji usunąć szkiełko nakrywkowe z każdego szkiełka za pomocą kąpieli zawierającej 5× roztworu SSC o temperaturze 55 °C. Trzymać każde szkiełko poziomo w ciepłym roztworze SSC. Gdy szkiełko nakrywkowe się odczepi, przechyl szkiełko i pozwól, aby szkiełko nakrywkowe opadło na dno.
  17. Myć 2× SSC w temperaturze 55 °C przez 30 minut w słoiku na szkiełku.
  18. Myć 0,2× SSC w temperaturze 55 °C przez 20 minut w szklanym słoiku.
  19. Myć 0,1× SSC w temperaturze 55 °C przez 20 minut w szklanym słoiku.
  20. Przenieść do 0,1× SSC w temperaturze 23-26 °C i inkubować przez 3 minuty w szkiełku.
  21. Prać w PTw przez 10 minut w słoiku na szkiełko.
  22. Umyj dwukrotnie w buforze TN, po 5 minut, w słoiku na szkiełko.
  23. Odmierzyć pipetą 600 μl buforu blokującego TNB na każde szkiełko i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 23-26 °C.
  24. Odmierzyć pipetą 500 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (przeciwciało anty-DIG sprzężone z peroksydazą rozcieńczone w stosunku 1:400 w roztworze TNB) na każde szkiełko. Ostrożnie nałożyć kawałek termoplastycznej folii laboratoryjnej na każde szkiełko i inkubować przez 12-16 godzin w temperaturze 4 °C.
  25. Umyj szkiełka 6 razy buforem TNT przez 5 minut każde, delikatnie mieszając w słoiku ze szkiełkiem.
  26. Odmierzyć pipetą 100 μl roztworu roboczego tyramidu i biotyny na każde szkiełko. Przykryć szkiełkami nakrywkowymi z termoplastycznej folii laboratoryjnej i inkubować przez 12 minut w temperaturze 23-26 °C.
    UWAGA: Wykonaj ten etap inkubacji w sposób rozłożony, z 2 lub 3 szkiełkami na partię, aby umożliwić dobrą kontrolę nad czasem inkubacji. Czas trwania inkubacji tyramidu może wymagać optymalizacji, w zależności od czułości i stężenia sondy cRNA.
  27. Umyj szkiełka 6 razy buforem TNT przez 5 minut każde, delikatnie mieszając w słoiku ze szkiełkiem.
  28. Odmierzyć pipetą 200 μl roztworu zawierającego streptawidynę sprzężoną z peroksydazą (SA-HRP, rozcieńczoną w stosunku 1:100 w buforze TNB) na każde szkiełko podstawowe i przykryć szkiełkiem nakrywkowym z termoplastycznej folii laboratoryjnej. Inkubować w temperaturze 23–26 °C przez 1 godzinę.
  29. Umyj szkiełka 6 razy buforem TNT przez 5 minut każde, delikatnie mieszając w słoiku ze szkiełkiem.
  30. Odmierzyć pipetę 100 μl roztworu roboczego tyramide-Alexa 488 na każde szkiełko, przykryć szkiełkiem nakrywkowym z termoplastycznej folii laboratoryjnej i inkubować w temperaturze 23-26 °C przez 12 minut w ciemności.
  31. Umyj szkiełka 6 razy buforem TNT przez 5 minut każde, delikatnie mieszając w słoiku ze szkiełkiem.
  32. Inkubować w 3% H2O2/1× PBS w szkiełku przez 1 godzinę, w celu dezaktywacji peroksydaz z poprzednich etapów.
  33. Umyj szkiełka 6 razy buforem TNT przez 5 minut każde, delikatnie mieszając w słoiku ze szkiełkiem.

6. barwienie immunologiczne pS6

  1. Odmierzyć pipetą 500 μl 4% roztworu paraformaldehydu/1× PBS na każde szkiełko i inkubować w temperaturze 23-26 °C przez 15 minut w celu utrwalenia skrawków.
  2. Odpipetować 500 μl 1× PBS/0,1% Triton X-100 na każde szkiełko i inkubować przez 5 minut, aby uzyskać przepuszczalność skrawków.
  3. Umyć dwukrotnie 1× PBS w słoiku na szkiełko.
  4. Odpipetować 2-3 krople na sekcję dostępnego w handlu roztworu blokującego wzmocnienie sygnału tyramidu B (tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 23-26 °C przez 1 godzinę.
  5. Odpipetować 400 μl immunohistochemicznego roztworu blokującego na każde szkiełko i inkubować w temperaturze 23-26 °C przez 30 minut w celu zablokowania sekcji.
  6. Odmierzyć pipetą 200 μl króliczego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego anty-pS6 (rozcieńczonego w stosunku 1:200 w roztworze blokującym immunohistochemię; końcowe stężenie: 1 μg/ml) na każde szkiełko, przykryć szkiełkiem nakrywkowym z termoplastycznej folii laboratoryjnej i inkubować w temperaturze 4 °C przez 12-16 godzin.
  7. Umyj 3 razy 1× PBS/0,1% Triton X-100, po 5 minut w słoiku na szkiełko.
  8. Odmierzyć pipetę po 2-3 krople na szkiełko dostępnego w handlu roztworu przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi sprzężonemu z peroksydazą (tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 23-26 °C przez 1,5 godziny.
  9. Umyj 3 razy 1× PBS/0,1% Triton X-100, po 5 minut w słoiku na szkiełko.
  10. Osusz szkiełka podstawowe i odpipetuj od 100 do 200 μl roztworu roboczego tyramide-Alexa 555 na każde szkiełko, pokryj kawałkiem termoplastycznej folii nakrywkowej z folii laboratoryjnej i inkubuj przez 7 minut w ciemności.
  11. Umyć dwukrotnie 1× PBS przez 5 minut każdy w słoiku na szkiełko.
  12. Odpipetować 500 μl rozcieńczonego barwnika jądrowego (w 1× PBS) na każde szkiełko i inkubować w temperaturze 23-26 °C przez 30 minut.
  13. Umyć dwukrotnie 1× PBS w temperaturze 23-26 °C przez 5 minut każdy w słoiku na szkiełko.
  14. Zamontuj szkiełka z medium montażowym zapobiegającym blaknięciu i pozwól medium montażowemu utwardzić się przez 24 godziny w ciemności.
  15. Przechowuj szkiełka w odpowiedniej temperaturze do czasu obrazowania, aby uniknąć blaknięcia fluorescencji.

7. Obrazowanie mikroskopowe

  1. Preparaty obrazowe wykonuje się za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego wyposażonego w filtry odpowiednie dla zastosowanych fluoroforów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół ma na celu uzyskanie obrazów mikroskopowych, na których badanym genem oraz markerem aktywności neuronalnej pS6 są znakowane fluorescencyjnie. Opisana metoda wykorzystuje wzmocnienie sygnału tyramidowego, co pozwala na uzyskanie wyraźnego i silnego znakowania przy minimalnym lub całkowitym braku tła. Immunobarwienie pS6 przejawia się jako fluorescencyjny sygnał cytoplazmatyczny, który zazwyczaj wypełnia całe ciało neuronu, natomiast sygnał hybrydyzacji in situ dla neuronów receptorowych węchu w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół niezawodnie identyfikuje neurony czuciowe aktywowane przez sygnały chemiczne w układzie węchowym poprzez połączenie wykrywania in situ receptorów OR lub VR z immunodetekcją pS6, pośredniego markera aktywności neuronalnej. Eksperymentator musi zachować szczególną ostrożność, aby zachować integralność histologiczną i wykonać wszystkie kroki przed hybrydyzacją w warunkach wolnych od RNaz. Niezastosowanie się do tego może spowodować degradację mRNA i pogorszenie znakowania rybosondą. Należy za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy GAG Pereira i JA Yunes za zasoby, APF Ferreira i WO Bragança za pomoc administracyjną i techniczną, a także personelowi Life Sciences Core Facility (LaCTAD-UNICAMP) za pomoc w mikroskopii konfokalnej. Praca ta była wspierana przez Fundację Badawczą Sao Paulo (FAPESP; granty nr 2009/00473-0 i 2015/50371-0 dla F.P.), przez PRP/UNICAMP (granty o numerach 2969/16, 725/15, 348/14 i 315/12 dla F.P.), przez stypendia FAPESP dla V.M.A.C. (2014/25594-3, 2012/21786-0, 2012/01689-0), T.S.N. (2012/04026-1) oraz przez stypendium Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) dla T.S.N.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20x rozcieńczalnik do amplifikacji (bufor reakcyjny z  Zestaw Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40923 lub  B40922określany jako bufor wzmacniający A w roztworach roboczych dla tyramidu-Alexa 488 lub tyramide-Alexa 555 wzmocnienie sygnału
20x SSCMerck (Calbiochem)8310-OPn/a
30% albumina surowicy bydlęcej (BSA)Merck (Sigma-Aldrich)A9576n/a
30% nadtlenowodoru (H2O2)Merck (Sigma-Aldrich)H1009n/a
Bezwodnik octowyMerck (Sigma-Aldrich)320102n/a
AgarozaMerck (Sigma-Aldrich)A9539brak
Amplifikacyjny rozcieńczalnik (z zestawu TSA Biotyna)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAokreślany jako bufor wzmacniający B w roztworze roboczym do wzmacniania sygnału tyramidu-biotyny
Anti-pS6 (Ser 244/247) królicze przeciwciało poliklonalneThermo Fisher ScientificCat# 44-923G, RRID:AB_2533798nie dotyczy
Bufor blokujący 1x (z zestawu Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40923 lub  B40922określany jako roztwór blokujący B na etapie rozwoju sygnału tyramidu
Odczynnik blokujący (z zestawu TSA Biotyna)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAokreślany jako odczynnik blokujący A w preparacie do buforu TNB
Barwnik jądrowy DAPIThermo Fisher ScientificD1306n/a
Roztwór Denhardta (50x)Merck (Sigma-Aldrich)D9905n/a
Deoinizowany formamidMerck (Sigma-Aldrich)F9037n/a
roztwór siarczanu dekstranu (50%)Merck (Chemicon)S4030n/a
Kwas etyleno-diamino-tetraoctowy (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884n/a
Hoechst 33342 plama jądrowaThermo Fisher ScientificH1399n/d
Kwas solny (HCl)Merck ( Sigma-Aldrich)320331n/a
bodźce węchowen/aPapes i in. (2010), Carvalho i in. (2015), Nakahara er wsp. (2016), Carvalho i in. (2020)n/a
ParaformaldehydMerck (Sigma-Aldrich)P6148n/a
przeciwciało anty-digoksygeniny sprzężone z peroksydazą (fragmenty Fab)Merck (Roche)11207733910;   RRID:AB_514500określany jako przeciwciało anty-DIG sprzężone z peroksydazą
Przeciwciało anty-królicze sprzężone z peroksydazą (odczynnik anty-króliczy sprzężony z poliHRP z  Zestaw Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Streptawidyna sprzężona z peroksydazą (z zestawu biotyny TSA)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAbez
ProLong Gold ThermoFisher ScientificP36934określany jako środek montażowy zapobiegający blaknięciu
Ultraczysta woda bez RNazThermo Fisher Scientific10977015n/a
Chlorek sodu (NaCl)Merck (Sigma-Aldrich)S9888n/a
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)436143n/d
Wodorotlenek sodu (NaOH)Merck (Sigma-Aldrich)S8045n/a
sacharozaMerck (Sigma-Aldrich)S0389n/a
TrietanoloaminaMerck (Sigma-Aldrich)T58300n/a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n/a
Chlorowodorek Trizma (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n/a
Tween-20Merck (Sigma-Aldrich)822184n/a
koniugat Tyramide-Alexa 488 (z zestawu Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Konjugat Tyramidu-Alexa 555 (z zestawu Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40923bez
koniugatu tyramid-biotyna (z zestawu TSA Biotyna)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Drożdże tRNAMerck (Roche)10109495001n/a
Critical Commercial Assays and Animals
Zestaw Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoostThermo Fisher ScientificB40922n/a
Zestaw Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoostThermo Fisher ScientificB40923n/a
Zestaw do znakowania DIG RNA (SP6/T7)Merck (Roche)11175025910n/a
Odczynniki do analizy taśmy RNA o wysokiej czułości (bufor, drabinka i taśma)Agilent5067-5580, 5067-5581 i 5067-5579określany jako automatyczny system elektroforezy
Mysz: szczep wsobny C57BL / 6JJacksonLaboratories Nr magazynowy:  000664;   RRID:IMSR_JAX:000664)n/a
Mikrokolumny ProbeQuant G-50Cytiva Biosciences28903408określany jako zestaw do oczyszczania oparty na filtracji żelowej
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquickQiagen28506określany jako mini zestaw do oczyszczania żelu na bazie
Zestaw do czyszczenia RNeasy MinEluteQiagen74204określany jako zestaw do oczyszczania RNA oparty na mini kolumnach
TSA Zestaw biotynyAkoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
oligonukleotydy
' – AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aOlfr692
5' – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3'Zintegrowane technologie DNAn/a
5'- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aOlfr124
5' – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA
GAG – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aOlfr1509
5' – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC
G – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aOlfr1512
5' – GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aOlfr78
5' – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aOlfr691
5' – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
OWH – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aOlfr638
5' – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3'Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aOlfr569
5' – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
KTG – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r1
5' – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r2
5' – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3'Zintegrowane		technologie DNAnie dotyczy
5' – TAGGAAGCTATTTGCCTTTTTTC
CAC – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r13
5' – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r89
5' – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC
A – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r118
5' – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – ATCGGATCCGCTGATTTTTCTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r116
5' – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA
GA – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r28
5' – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA
CTGT – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r41
5' – CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r46
5' – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG
TG – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r69
5' – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3'Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r90
5' – CATATTCCACAGAAGAGAAGT
TGGAC – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r107
5' – CCCTTGTTGCACAAAATGAT
GATGTGA – 3'		Zintegrowane technologie DNAnie dotyczy
5' – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3'		Zintegrowane technologie DNAn/aVmn2r83
5' – ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/a
Recombinant DNA
pGEM-T-Easy wektorPromegaA1360zalecany wektor klonowania PCR
Inne materiały
1mL StrzykawkiFisher Scientific14-829-10Fn/a
Probówki stożkowe (15 ml i 50 ml)Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49Bn/a
Słoiki z koplinyFisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
CryostatLeica BiosystemsCMS 1850n/a
Narzędzia preparacyjne i kleszczeRobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111nie dotyczy
Sucha kąpielnie/a
Elektroforeza sprzętFisher Scientific09-528-110Bn/a
Pędzle cienkieWinsor & Newton10269097n/a
Mikroskop fluorescencyjny lub konfokalnyLeica MicrosystemsTCS SP5IIn/a
Podgrzewana płytaFisher ScientificHP88850200n/a
Nawilżana komora (jeśli jest używana w wyższych temperaturach, musi być zamknięta w plastikowym pojemniku Tupperware)Thermo Fisher Scientific22-045-034n/a
Niestrzępiące się laboratoryjne chusteczki nawilżaneKimberly-Clark34120określany jako niestrzępiąca się bibułka laboratoryjna
MikrowirówkaEppendorf5401000013nie dotyczy
Klatki dla myszyInnoViveM-BTM, MVX1bez
daty PCR TermocyklerThermo Fisher Scientific4375786nie dotyczy
Pipeta jednorazowe końcówki p1000, p200 i p20Fisher Scientific02-707-408, 02-707-411, 02-707-438n/a
Plastikowa histologia do zatapianiaThermo Fisher Scientific22-19n/a
Fluorometr Qubit 4Thermo Fisher ScientificQ33238określany jako bardzo czuła metoda fluorometryczna
Żyletki lub skalpeleFisher Scientific12-640n/a
Tapestation lub BioAnalyzerAgilent4200 TapeStation System lub 2100 BioanalizatorInstrument n/a
Szklane lub plastikowe cylindry i zlewki bez RNazFisher Scientific10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
Mikroskop stereoskopowyLeica MicrosystemsM80n/a
Szkiełka mikroskopowe SuperFrost PlusThermo Fisher Scientific12-550-15określane jako dodatnio naładowane szkiełka
mikroskopowe ParafilmFirma BemisPM999określana jako termoplastyczna folia laboratoryjna
Kąpiel wodnaThermo Fisher ScientificTSCIR19nie dotyczy
kolumny 5 dotyczy n

Bibliografia

  1. Stowers, L., Holy, T. E., Meister, M., Dulac, C., Koentges, G. Loss of sex discrimination and male-male aggression in mice deficient for TRP2. Science. 295 (5559), 1493-1500 (2002).
  2. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  3. Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141 (4), 692-703 (2010).
  4. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annual review of physiology. 71, 115-140 (2009).
  5. Chess, A., et al. Allelic inactivation regulates olfactory receptor gene expression. Cell. 78, 823-834 (1994).
  6. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature Reviews Neuroscience. 5, 263-278 (2004).
  7. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  8. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83 (2), 195-206 (1995).
  9. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90 (4), 763-773 (1997).
  10. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-Expression of Putative Pheromone Receptors in the Sensory Neurons of the Vomeronasal Organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  11. Silvotti, L., Moiani, A., Gatti, R., Tirindelli, R. Combinatorial co-expression of pheromone receptors, V2Rs. Journal of Neurochemistry. 103 (5), 1753-1763 (2007).
  12. Ishii, T., Mombaerts, P. Expression of nonclassical class I major histocompatibility genes defines a tripartite organization of the mouse vomeronasal system. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2332-2341 (2008).
  13. Saraiva, L. R., et al. Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: From whole mucosa to single-cell RNA-seq. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. Hanchate, N. K., et al. Single-cell transcriptomics reveals receptor transformations during olfactory neurogenesis. Science. 350, 1251-1255 (2015).
  15. Matsunami, H. Functional expression of mammalian odorant receptors. Chemical Senses. 30, Suppl 1 95-96 (2005).
  16. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  17. Xu, L., Li, W., Voleti, V., Zou, D. J., Hillman, E. M. C., Firestein, S. Widespread receptor-driven modulation in peripheral olfactory coding. Science. 368 (6487), (2020).
  18. Pfister, P., et al. Article Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding. Current Biology. , 1-14 (2020).
  19. de March, C. A., Titlow, W. B., Sengoku, T., Breheny, P., Matsunami, H., McClintock, T. S. Modulation of the combinatorial code of odorant receptor response patterns in odorant mixtures. Molecular and Cellular Neuroscience. 104, 103469(2020).
  20. Nakahara, T. S., Carvalho, V. M. A., Souza, M. A. A., Trintinalia, G. Z., Papes, F. Detection of Activated Mouse Neurons with Temporal Resolution via Dual c-Fos Staining. STAR Protocols. 1 (3), 100153(2020).
  21. Nakahara, T. S., et al. Detection of pup odors by non-canonical adult vomeronasal neurons expressing an odorant receptor gene is influenced by sex and parenting status. BMC biology. 14 (1), 12(2016).
  22. Carvalho, V. M. A., et al. Lack of spatial segregation in the representation of pheromones and kairomones in the mouse medial amygdala. Frontiers in Neuroscience. 9, 1-19 (2015).
  23. Carvalho, V. M. A., et al. Representation of Olfactory Information in Organized Active Neural Ensembles in the Hypothalamus. Cell Reports. 32 (8), 108061(2020).
  24. Papes, F., Nakahara, T. S., Camargo, A. P. Behavioral assays in the study of olfaction: a practical guide. Methods in Molecular Biology, v1820: Olfactory receptors. , 289-388 (2018).
  25. Jiang, Y., Gong, N. N., Hu, X. S., Ni, M. J., Pasi, R., Matsunami, H. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors responding to odors in vivo. Nature Neuroscience. 18, 1446-1454 (2015).
  26. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Neuroscience. 18 (10), (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Aktywacja neuronalnamysi system węchowyfosforylowane S6detekcja bodźców chemicznychreceptory sprzężone z białkiem Gzachowania węchowereceptory vomeronasalne

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.