Artykuł metodologiczny

Wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie RNA u Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR/CasRx

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62154

⸱

5 lutego 2021

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół użycia enzymu Cas13D ukierunkowanego na RNA (RfxCas13D) u much.

Streszczenie

CasRx, członek rodziny Cas13 ukierunkowanej na RNA, jest obiecującym nowym dodatkiem technologii CRISPR/Cas do efektywnej redukcji transkryptów genów z atrakcyjnym profilem off-target zarówno na poziomie komórkowym, jak i organizmu. Niedawno pojawiły się doniesienia, że system CRISPR/CasRx może być wykorzystany do osiągnięcia wszechobecnej i specyficznej tkankowo redukcji transkryptów genów u Drosophila melanogaster. Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje metody z ostatnich prac, składające się z trzech części: 1) wszechobecne celowanie w endogenne RNA in vivo przy użyciu dwuskładnikowego systemu CasRx; 2) wszechobecne celowanie in vivo w egzogenne RNA z wykorzystaniem trójskładnikowego systemu CasRx; oraz 3) celowanie w tkankowo specyficzne RNA in vivo przy użyciu trójskładnikowego systemu CasRx. Zaobserwowane efekty celowania w RNA obejmują zmiany fenotypowe specyficzne dla docelowego genu, ukierunkowaną redukcję transkryptu RNA oraz sporadyczne fenotypy śmiertelności związane z wysoką ekspresją białka CasRx i aktywnością poboczną. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te pokazały, że system CasRx jest zdolny do celowej redukcji transkryptu RNA na poziomie organizmu w programowalny i skuteczny sposób, demonstrując, że celowanie i inżynieria transkryptomu in vivo są wykonalne i stanowią podstawę dla przyszłych technologii celowania RNA opartych na CRISPR in vivo.

Wprowadzenie

Od czasu pojawienia się technologii CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), większość uwagi w tej dziedzinie skupia się na edycji DNA, która oferuje przełomowe zastosowania w medycynie i biotechnologii1. Trwała zmiana sekwencji DNA nie zawsze jest jednak pożądana ze względów etycznych. W związku z tym w ostatnich badaniach rozpoczęto opracowywanie narzędzi opartych na CRISPR do celowania w RNA i wykazano, że technologie CRISPR mogą być rzeczywiście wykorzystywane do celowania w RNA w różnych systemach biologicznych2,3,4,5,6,7. W wielu z tych testowanych systemów obecnie szeroko stosowanym podejściem do ukierunkowania RNA i redukcji transkryptu jest interferencja RNA (RNAi), która jest daleka od doskonałości, często wykazując różną skuteczność i wysoką aktywność poza celem, gdy jest stosowana in vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. W związku z tym, biorąc pod uwagę status tych technologii, warto dalej badać potencjał narzędzi opartych na CRISPR do celowania w RNA.

Jedno z ostatnich godnych uwagi badań wykazało, że rybonukleaza CasRx, należąca do klasy Cas13d, może skutecznie obniżać poziom transkryptów genów w hodowli komórek ludzkich i posiada atrakcyjny profil poza celem4. Odkrycie to skłoniło do postawienia pytania, czy ta nowa rybonukleaza może utrzymać swoją skuteczność i niski wskaźnik niecelowania w RNA na poziomie organizmu. Niedawne badanie zajęło się tym pytaniem, pokazując, że system CasRx może być wykorzystany do osiągnięcia wszechobecnej i specyficznej tkankowo redukcji transkryptów genów u Drosophila melanogaster5.

Aby usprawnić użyteczność tego niedawno opublikowanego podejścia, ten protokół szczegółowo opisuje metody z tej ostatniej pracy, która składa się z trzech głównych części: 1) wszechobecne celowanie in vivo RNA przy użyciu dwuskładnikowego systemu CasRx; 2) wszechobecne celowanie in vivo w egzogenne RNA z wykorzystaniem trójskładnikowego systemu CasRx; oraz 3) celowanie w swoiste tkankowo RNA in vivo przy użyciu trójskładnikowego systemu CasRx.

Przewodnikowe RNA (gRNA) ukierunkowane na różne geny docelowe pod kontrolą wszędobylskiego promotora zostały zaprojektowane i wygenerowano linie muchowe wyrażające te konstrukty zawierające gRNA. Zaprojektowano również konstrukty CasRx pod kontrolą wszechobecnego promotora lub promotora warunkowej sekwencji aktywacji (UASt) aktywowanego przez czynnik transkrypcyjny GAL4, a linie muchowe zawierające te konstrukty zawierające CasRx zostały wygenerowane. Katalitycznie nieaktywne konstrukty CasRx, dCasRx, zostały zaprojektowane i wykorzystane jako kontrole ujemne. Wszechobecne celowanie w RNA u much osiąga się poprzez krzyżowanie linii muchowych wykazujących ekspresję gRNA z wszechobecnymi liniami muchowymi wykazującymi ekspresję CasRx. Potomstwo wykazujące ekspresję zarówno konstruktu gRNA ukierunkowanego na określony transkrypt genu, jak i białka CasRx, ma wszechobecną redukcję docelowych transkryptów genów. Celowanie w tkankowo swoiste RNA u muszek osiąga się poprzez pierwsze skrzyżowanie muszek wykazujących ekspresję gRNA z muszkami wykazującymi ekspresję UASt-CasRx, uzyskując transheterozygotyczne muchy przenoszące zarówno konstrukty gRNA, jak i UASt-CasRx. Takie muchy z kolei są krzyżowane z muszkami wykazującymi ekspresję GAL4 specyficzną dla tkanki, co skutkuje generowaniem specyficznej tkankowo ekspresji CasRx i celowania w RNA u much.

Programowalny charakter systemu CasRx oferuje możliwość dostosowania i optymalizacji, aby pomóc osiągnąć wysoką skuteczność i niską aktywność poza celem dla celowania in vivo RNA. Potencjalne zastosowania celowania w RNA oparte na CRISPR są liczne, w tym zastąpienie RNAi w laboratorium i przyczynienie się do zwalczania wektorów owadów w środowisku naturalnym. Spośród tych ostatnich jedną z globalnych niezaspokojonych potrzeb jest opracowanie skutecznych narzędzi do zwalczania zakażeń wirusami RNA przenoszonymi przez komary. Wiele wirusów RNA, takich jak denga, Zika i wirus chikungunya, jest przenoszonych przez komary, wpływając na zdrowie ludzi i przyczyniając się do śmiertelności. Przedstawiono wiele propozycji inżynierii populacji komarów z odpornością na wirusy w celu zapobiegania chorobom; jednak żadna obecna technologia nie jest w stanie sprawić, że komary będą jednocześnie odporne na wszystkie znaczące wirusy RNA18,19,20,21,22,23. Systemy CAS ukierunkowane na RNA mogą stanowić punkt wyjścia dla takiej technologii, umożliwiając programowalną platformę do celowania we wszystkie wirusy RNA przenoszone przez komary.

Protokół

1. Wszechobecne celowanie w RNA in vivo za pomocą dwuskładnikowego systemu CasRx

  1. Generowanie wektora wyrażeń Ubiq-CasRx i Ubiq-dCasRx
    1. Amplifikuj sekwencję CasRx za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) ze starterem 1050E. C3 oraz 1050E. C4 i oryginalna konstrukcja CasRx pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx); i amplifikować sekwencję dCasRx za pomocą PCR ze starterem 1050E. C3 oraz 1050E. C4 i oryginalny dCasRx konstruują pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)4 (Tabela 1). Następnie należy oczyścić żelem amplifikowane fragmenty CasRx i dCasRx za pomocą zestawu do oczyszczania żelu.
    2. Trawisz wektor podstawowy (plazmid Addgene #112686) z enzymami restrykcyjnymi SwaI i PacI24. W otrzymanych produktach użyj zestawu do oczyszczenia żelem większego fragmentu, który nazywa się szkieletem wektora podstawowego.
    3. Złóż wektor Ubiq-CasRx ze szkieletem wektora bazowego i fragmentem CasRx za pomocą metody montażu Gibsona; złóż wektor Ubiq-dCasRx ze szkieletem wektora bazowego i fragmentem dCasRx za pomocą metody asemblera Gibsona25.
      UWAGA: Identyfikator Addgene wektora Ubiq-CasRx (OA-1050E) to #132416, a identyfikator Addgene wektora Ubiq-dCasRx (OA-1050R) to #132417.
  2. Generowanie wektora ekspresji gRNA
    1. Zaprojektuj każdy fragment gRNA w oparciu o następujące kryteria: sekwencja docelowa o długości 30 nukleotydów; maksymalna długość odcinków poli-U w sekwencji docelowej wynosi 4 pary zasad; zawartość GC sekwencji docelowej mieści się w zakresie 30% - 70%; przewiduje się, że sekwencja docelowa nie tworzy silnych struktur spinki do włosów RNA; oraz sekwencja docelowa zawierająca minimalną przewidywaną strukturę drugorzędową lub trzeciorzędową RNA5.
      UWAGA: W tym badaniu zaprojektowano każde gRNA jako 4 sekwencje tandemowe o długości 30 nukleotydów każda, oddalone od siebie o 36 długich bezpośrednich powtórzeń nukleotydów i z terminatorem 7-tyminowym na obu końcach5. Dla egzogennego genu docelowego, GFP, zastosowano te same kryteria, co powyżej, dodając fragment OpIE2-GFP class5.
    2. Amplifikuj sekwencję promotora U6:3 za pomocą PCR ze starterami 1043.C1 i 1043.C23 oraz plazmidem Addgene #112688 (Tabela 1)26. Żelem oczyść amplifikowane fragmenty U6:3 za pomocą zestawu do oczyszczania żelu.
    3. Digest Addgene plazmid #112688 z enzymem restrykcyjnym AscI i XbaI24. W otrzymanych produktach użyj zestawu do żelowego oczyszczania większych fragmentów, który nazywa się szkieletem wektora pre-base.
    4. Złóż wektor podstawowy ze szkieletem wektora pre-base i fragmentem U6:3 przy użyciu metody montażu Gibsona25. Wektor podstawowy nosi nazwę OA-1043.
      UWAGA: Identyfikator Addgene plazmidu OA-1043 to #164586.
    5. Zsyntetyzuj fragment gRNA genu docelowego za pomocą zewnętrznej usługi syntezy genów.
    6. Przetrawić wektor podstawowy OA-1043 za pomocą enzymu restrykcyjnego PstI i NotI24. Zachowaj cały produkt trawienny, który nazywa się strawionym OA-1043.
    7. Złóż wektor ekspresyjny gRNA z strawionym OA-1043 i docelowym fragmentem gRNA genu przy użyciu metody składania Gibsona25.
      UWAGA: Badano cztery geny docelowe: trzy były endogenne (biały, Notch, żółty), jeden był egzogenny (GFP). Ich identyfikatory Addgene to: #132420 (gRNAw), #132421(gRNAN), #132425 (gRNAy) i #133304 (gRNAGFP).
  3. Generowanie much transgenicznych
    1. Wstrzyknąć wektory ekspresyjne do zarodków much, korzystając z usługi zewnętrznej iniekcji zarodków much oraz zarodków z much zawierających miejsca integracji ØC31. Wyhodować wstrzyknięte zarodki w temperaturze 26 °C.
      UWAGA: Linia attp40w (z miejscami integracji na 2. chromosomie) została wykorzystana do wygenerowania linii CasRx, a linia 8622 (z miejscami integracji na 3. chromosomie) została wykorzystana do wygenerowania różnych linii gRNA.
    2. Utrzymuj muchy jako linie homozygotyczne lub jako zrównoważone linie heterozygotyczne.
      UWAGA: Muchy Ubiq-CasRx i Ubiq-dCasRx były utrzymywane jako heterozygotyczne zrównoważone linie z CyO jako równoważnikiem. Ponadto zarówno wektory Ubiq-CasRx, jak i Ubiq-dCasRx zawierają znacznik dsRed. W rezultacie muchy Ubiq-CasRx i Ubiq-dCasRx mają następujące trzy fenotypy: dsRed-dodatnie, kędzierzawe skrzydła i białe oczy. Muchy wykazujące ekspresję gRNA utrzymywano jako linie homozygotyczne. Ich numery muchowe Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) to: #84118 (Ubiq-CasRx), #84119 (Ubiq-dCasRx), #84124 (gRNAw), #84122 (gRNAN), #84123 (gRNAy), #84986 (gRNAGFP).
  4. Genetyka much (Rysunek 1A)
    1. Zbierz 10 dziewiczych dorosłych samic much z homozygotycznej linii gRNA i zbierz 5 dorosłych samców much ze zrównoważonej heterozygotycznej linii Ubiq-CasRx/CyO. Umieść zebrane samice i samce much, które nazywane są muchami rodzicielskimi, w fiolce uzupełnionej suchym proszkiem drożdżowym (Rysunek 1A).
    2. Powtórz poprzedni krok 3 razy, aby wygenerować 3 powtórzenia. Dla grupy kontrolnej użyj linii Ubiq-dCasRx/CyO, zachowując wszystko inne bez zmian.
      UWAGA: W przypadku zwykłej szklanej fiolki z żywnością wystarczy 0,1 g suchych drożdży w proszku. Stosowany jest przepis BDSC na pokarm na muchy.
    3. Przechowywać fiolki zawierające muchy rodzicielskie w temperaturze 26 °C przez 48 godzin. Następnie usuń wszystkie muchy rodzicielskie z każdej fiolki. Następnie przechowywać fiolki w temperaturze 26 °C przez co najmniej 20 dni.
    4. Obserwuj fiolki codziennie, aby zobaczyć, czy z poczwarek pokolenia F1 wyłoniło się jakieś nowe dorosłe potomstwo. Jeśli tak, znieczulij je dwutlenkiem węgla, wkładając rurkę podłączoną do zbiornika dwutlenku węgla do fiolek na muchy, a następnie włączając przełącznik przepływu na 10 sekund.
    5. Gdy muchy staną się nieruchome, opróżnij je z fiolki na muchówkę na muchę, która jest również podłączona do zbiornika dwutlenku węgla, a dwutlenek węgla w sposób ciągły przepływa przez muchownicę.
    6. Oceń fenotyp znieczulonych muszek i zobrazuj je za pomocą kolorowej kamery podłączonej do fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Policz liczbę potomstwa o różnych fenotypach. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu do przetwarzania końcowego i kompilacji obrazu (Rysunek 2A - 2D).
      UWAGA: Opierając się na genetyce mendlowskiej, wśród potomstwa dla każdej krzyżówki spodziewane są dwa rodzaje much (Ryc. 1A).
  5. Sekwencja RNA (Rysunek 2E – 2G)
    1. Pobieranie próbek
      UWAGA: Wybierz odpowiednią metodę pobierania próbek spośród 3 poniższych przykładów; Wymagane są 3 powtórzenia dla każdego odrębnego typu próbki.
      1. Pobieranie próbek z dorosłej głowy muchy
        1. Zbierz 10 dziewiczych dorosłych samic much z homozygotycznej linii gRNA. Zbierz 5 dorosłych samców much ze zrównoważonej heterozygotycznej linii Ubiq-CasRx/CyO. Zebrane samice i samce much, które są muchami rodzicielskimi, umieścić w fiolce uzupełnionej suchym proszkiem drożdżowym.
        2. Powtórz poprzedni krok 3 razy dla 3 powtórzeń. Dla grupy kontrolnej użyj linii Ubiq-dCasRx/CyO, zachowując wszystko inne bez zmian.
        3. Przechowywać fiolki zawierające muchy rodzicielskie w temperaturze 26 °C przez 48 godzin. Następnie usuń wszystkie muchy rodzicielskie z każdej fiolki. Następnie należy przechowywać fiolki w temperaturze 26 °C do momentu, gdy z poczwarek wyłonią się potomstwo.
        4. Zbierz 10 1-dniowych dorosłych much o prawidłowym fenotypie. Znieczulij muchy dwutlenkiem węgla, a następnie odetnij głowę muchy i umieść głowy w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml na suchym lodzie. Przechowywać probówkę wirówkową w temperaturze -80 °C. Powtórzyć ten krok 3 razy dla 3 powtórzeń.
      2. 17 – 20-godzinne pobieranie próbek zarodków
        1. Zbierz 8-10 dziewiczych dorosłych samic much z homozygotycznej linii gRNA. Zbierz 4-5 dorosłych samców much ze zrównoważonej heterozygotycznej linii Ubiq-CasRx/CyO. Zebrane samice i samce much, które są muchami rodzicielskimi, umieścić w fiolce uzupełnionej suchym proszkiem drożdżowym.
        2. Powtórz poprzedni krok 3 razy dla 3 powtórzeń. Dla grupy kontrolnej użyj linii Ubiq-dCasRx/CyO, zachowując wszystko inne bez zmian.
        3. Przechowywać fiolki zawierające muchy rodzicielskie w temperaturze 26 °C przez 48 godzin.
        4. Przygotuj jedną komorę do pobierania zarodków z sokiem winogronowym dla każdej kontrpróby zgodnie z tym przepisem: 376 ml wody, 126 ml soku winogronowego, 15 g agaru i 6 g sacharozy. Umieść podłoże w zlewce o pojemności 1 l i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej na wysokich obrotach przez 5-6 minut, uważnie obserwując podłoże w zlewce, aby sprawdzić, czy nie pojawiają się bąbelki/piana. Jeśli tak, zatrzymaj kuchenkę mikrofalową i pozwól, aby bąbelek/piana opadła. Kontynuuj podgrzewanie w kuchence mikrofalowej w ten sposób, aż bąbelek stanie się przezroczysty. Nie obracaj, dopóki wszystkie bąbelki nie będą czyste. Na koniec dodaj 10 ml 100% alkoholu i 5 ml kwasu octowego. Dobrze wymieszać, a następnie odpipetować pożywkę na szalki Petriego o średnicy 35 mm za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml. Gdy pożywka zestala się na szalce Petriego, jest gotowa do użycia.
        5. Pod koniec 48-godzinnej inkubacji przenieść muszki rodzicielskie do komór pobierania zarodków soku winogronowego i inkubować je w temperaturze 26 °C przez 3 godziny. Następnie usunąć dorosłe muchy, trzymając świeżo złożone zarodki na talerzach z sokiem winogronowym przez kolejne 17 godzin w temperaturze 26 °C.
        6. Po inkubacji zbierz 50-100 zarodków z płytek z sokiem winogronowym, oczyść powierzchnię zarodka, zanurzając je w wodzie dejonizowanej, a następnie przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie. Przechowywać je w temperaturze -80 °C. Powtórzyć ten krok 3 razy dla 3 powtórzeń.
      3. Pobranie pierwszej próbki larw w stadium rozwojowym
        1. Zbierz 8-10 dziewiczych dorosłych samic much z homozygotycznej linii gRNA. Zbierz 4-5 dorosłych samców much ze zrównoważonej heterozygotycznej linii Ubiq-CasRx/CyO. Zebrane samice i samce much, które są muchami rodzicielskimi, umieścić w fiolce uzupełnionej suchym proszkiem drożdżowym. Powtórz ten krok 3 razy dla 3 powtórzeń. Dla grupy kontrolnej użyj linii Ubiq-dCasRx/CyO, zachowując wszystko inne bez zmian.
        2. Przechowywać fiolki zawierające muchy rodzicielskie w temperaturze 26 °C przez 48 godzin. Następnie przenieść dorosłe muchy do innej nowej fiolki z pokarmem do inkubacji przez noc (16 godzin) w temperaturze 26 °C. Następnie usuń dorosłe muchy.
        3. Przechowywać fiolkę zawierającą zarodki w temperaturze 26 °C przez 24 godziny, a następnie ocenić transheterozygotyczne larwy pierwszego stadium pod mikroskopem przy użyciu odrębnych markerów. Zebrać 15-30 larw o prawidłowych fenotypach i umieścić je w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Powtórz ten krok 3 razy dla 3 powtórzeń.
    2. Sekwencjonowanie
      1. Ekstrakcja RNA: użyj dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji RNA i postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu, aby przetworzyć wszystkie próbki. Następnie należy inkubować wyekstrahowane próbki RNA z dostępnym w handlu dezoksyrybonukleazą i postępować zgodnie z jego instrukcjami, aby usunąć wszelkie zanieczyszczające DNA z próbek.
      2. Zmierz stężenie RNA za pomocą dostępnego na rynku spektrofotometru UV-vis. Zmierz integralność RNA w próbkach przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do oznaczania integralności RNA.
      3. Skonstruuj biblioteki sekwencyjne RNA, korzystając z dostępnego na rynku zestawu do przygotowywania bibliotek RNA.
      4. Użyj zewnętrznej usługi sekwencjonowania do sekwencjonowania biblioteki z następującymi ustawieniami: tryb pojedynczego odczytu; długość odczytu: 50nt, głębokość: 20 milionów odczytów na bibliotekę. Wykonuj wywołania podstawowe za pomocą RTA 1.18.64, a następnie konwertuj dane na FASTQ za pomocą bcl2fastq 1.8.4.
        UWAGA: Surowe dane sekwencjonowania można znaleźć w National Center for Biotechnology Information Sequencing Read Archive (identyfikator zgłoszenia: SUB6818910 [BioProject: PRJNA600654]).
    3. Bioinformatyka
      1. Mapa odczytuje dane sekwencjonowania do genomu Drosophila melanogaster Release 6 z Berkeley Drosophila Genome Project (numer dostępu do GenBank: GCA_000001215.4) oraz egzogennych sekwencji CasRx i GFP przy użyciu domyślnego ustawienia parametrów STAR aligner28 z dodaniem opcji filtra "-outFilterType BySJout" i "-sjdbGTFfile Drosophila_melanogaster. BDGP6.22.97.gtf" w formacie transferu genów z ENSEMBL.
      2. Określ nieprzetworzoną liczbę transkrypcji dla każdego transkryptu z adnotacjami za pomocą funkcji Counts35 przy użyciu opcji "-t exon -g gene_id -M -O --fraction". Następnie znormalizuj liczbę nieprzetworzonych transkrypcji przy użyciu całkowitej liczby transkrypcji przy użyciu skryptu Perla "addTpmFpkmToFeatureCounts.pl".
      3. Użyj metody maximum posteriori z oryginalnym estymatorem skurczu w potoku DESeq2, aby oszacować logarytmiczną zmianę fałdowania (LFC) każdego genu w transkryptach.

2. Wszechobecne celowanie w egzogenne RNA in vivo przy użyciu trójskładnikowego systemu CasRx

  1. Generowanie egzogenicznego docelowego wektora ekspresji wszechobecnej
    1. PCR amplifikuje fragment promotora Ubiq za pomocą starterów 1052B. C1 oraz 1052B. C2 i plazmid Addgene #11268626. Następnie PCR amplifikuje fragment T2A-eGFP amplifikowany z plazmidu Addgene #112686 za pomocą starterów 908A.1 i 908A.2 (Tabela 1)26. Następnie PCR amplifikuje fragment promotora Ubiq jako odwróconą sekwencję za pomocą plazmidu Addgene #112686 ze starterami 908A.3 i 908A.4 (Tabela 1)26. Oczyść żelem fragment promotora Ubiq, fragment T2A-eGFP i odwrócony fragment promotora Ubiq za pomocą zestawu do oczyszczania żelu.
    2. Zamów niestandardową sekwencję kodującą lucyferazy świetlika i niestandardowy fragment zawierający fragment p10 3'UTR, odwróconą lucyferazy renilla, a następnie fragment SV40 3'UTR.
    3. Trawić plazmid Addgene #112688 z enzymem restrykcyjnym AscI i XbaI24. W powstałych produktach należy oczyścić żelem większe fragmenty za pomocą zestawu do oczyszczania żelu, który nazywa się szkieletem wektora podstawowego.
    4. Użyj metody montażu Gibsona, aby złożyć wektor podstawowy ze szkieletem wektora bazowego i następującymi fragmentami: fragment promotora Ubiq, fragment T2A-eGFP, odwrócony fragment promotora Ubiq, sekwencja kodująca lucyferazy świetlika i odwrócona lucyferazy renilla, po której następuje fragment SV40 3'UTR25.
      UWAGA: Identyfikator Addgene wynikowego wektora ekspresji podwójnej lucyferazy (OA-1052B) to #132426.
  2. Generowanie wektora ekspresji gRNA
    1. PCR amplifikuje sekwencję promotora U6:3 za pomocą starterów 1043.C1 i 1043.C23 oraz plazmidu Addgene #112688 (Tabela 1)26. Żelem oczyść amplifikowane fragmenty U6:3 za pomocą zestawu do oczyszczania żelu.
    2. Digest Addgene plazmid #112688 z enzymem restrykcyjnym AscI i XbaI24. W otrzymanych produktach należy oczyścić żelem większe fragmenty, które nazywa się szkieletem wektora pre-base, za pomocą zestawu do oczyszczania żelu.
    3. Złóż wektor bazowy ze szkieletem wektora pre-base i fragmentem U6:3 przy użyciu metody montażu Gibsona25. Wektor podstawowy nosi nazwę OA-1043.
    4. Zsyntetyzuj fragment gRNA genu docelowego za pomocą zewnętrznej usługi syntezy genów.
    5. Przetrawić wektor podstawowy OA-1043 za pomocą enzymu restrykcyjnego PstI i NotI24. Zachowaj cały produkt trawienny, który nazywa się strawionym OA-1043.
    6. Złóż wektor ekspresyjny gRNA z strawionym OA-1043 i docelowym fragmentem gRNA genu przy użyciu metody składania Gibsona25.
      UWAGA: Identyfikator Addgene wynikowego plazmidu (OA-1052K) to #132422.
  3. Generowanie much transgenicznych
    1. Wstrzyknąć wektor OA-1052B do zarodków much, używając zarodków z much zawierających miejsce integracji ØC31 na 3. chromosomie, BDSC o numerze muchowym 9744, za pośrednictwem zewnętrznej usługi iniekcji zarodków much. Podobnie, wstrzyknąć wektor OA-1052K do zarodków much, używając zarodków z much zawierających miejsce integracji ØC31 na 3. chromosomie, BDSC o numerze muchowym 8622. Wyhodować wstrzyknięte zarodki w temperaturze 26 °C.
    2. Utrzymuj muchy z podwójną ekspresją lucyferazy i muchy gRNA jako linie homozygotyczne; utrzymuj linie Ubiq-CasRx jako podwójnie zrównoważone linie heterozygotyczne, krzyżując pojedynczą zrównoważoną heterozygotyczną linię Ubiq-CasRx wygenerowaną w sekcji 1 do linii równoważących zawierających chromosom równoważący TM6 ze znacznikiem ścierniska (Stb) i zachowaj jednocześnie tylko podwójnie zrównoważone potomstwo z białookimi, kędzierzawymi skrzydłami i fenotypami dCzerwonej fluorescencji.
      UWAGA: Numery zapasów muchowych BDSC to: #84127 (Ubiq-Fluc-Rluc), #84125 (gRNAFluc).
  4. Genetyka muchy (Rysunek 1B i Rysunek 3A)
    1. Zbierz 8-10 dziewiczych dorosłych samic much z linii podwójnej ekspresji lucyferazy. Zbierz 4-5 dorosłych samców much ze zrównoważonych heterozygotycznych Ubiq-CasRx/CyO; +/TM6, linia Stb, która pokazuje jednocześnie białookie, kędzierzawe skrzydła i dCzerwona fluorescencja. Zebrane samice i samce much, które są muchami rodzicielskimi, umieścić w fiolce uzupełnionej suchym proszkiem drożdżowym (zwanym dalej Krzyżówką Kroku 1).
    2. Powtórz poprzedni krok 3 razy dla 3 powtórzeń. Dla grupy kontrolnej użyj Ubiq-dCasRx/CyO; +/TM6, Stb line, zachowując wszystko inne bez zmian.
    3. Fiolki Kroku 1 z muszkami rodzicielskimi należy przechowywać w temperaturze 26 °C przez 48 godzin. Następnie usuń wszystkie muchy rodzicielskie z każdej fiolki. Następnie przechowywać fiolki w temperaturze 26 °C przez co najmniej 14 dni. W tym czasie zbierz 8-10 dziewic z homozygotycznej linii gRNA lucyferazy świetlika. Powtórz ten krok 3 razy dla 3 powtórzeń.
    4. Obserwuj fiolki Kroku 1 Krzyż każdego dnia, aby zobaczyć, czy z poczwarek wyłania się jakaś nowa dorosła mucha. Jeśli tak, znieczul je dwutlenkiem węgla, zbierz 5 samców much wyrażających zarówno Ubiq-CasRx (lub Ubiq-dCasRx), jak i reporter podwójnej lucyferazy z potomstwa i umieść je w nowej fiolce wraz z 10 dziewiczymi samicami z linii gRNA lucyferazy świetlika (zwanej dalej Krzyżówką Kroku 2). Powtórz ten krok 3 razy dla 3 powtórzeń.
    5. Zebrać kolejne 5 jednodniowych samców wykazujących ekspresję zarówno Ubiq-CasRx (lub Ubiq-dCasRx), jak i reportera podwójnej lucyferazy z fiolek krzyżówek Kroku 1 i inkubować je przez 2-4 dni w temperaturze 26 °C. Następnie przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Powtórzyć ten krok 3 razy dla trzech powtórzeń.
    6. Fiolki Kroku 2 z muszkami krzyżowymi należy przechowywać w temperaturze 26 °C przez 48 godzin. Następnie usuń wszystkie muchy rodzicielskie z każdej fiolki. Następnie przechowywać fiolki w temperaturze 26 °C przez co najmniej 20 dni.
    7. Codziennie obserwuj fiolki Kroku 2 Krzyż, aby sprawdzić, czy z poczwarek wyłoniło się jakieś nowe dorosłe potomstwo. Jeśli tak, znieczul je dwutlenkiem węgla, oceń fenotypy znieczulonych much i zobrazuj je za pomocą kolorowej kamery wyposażonej w fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy. Policz liczbę potomstwa o różnych fenotypach. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu do przetwarzania końcowego i kompilacji obrazu (Rysunek 3B – 3C).
      UWAGA: Genetyka mendlowska sugeruje, że jeśli wszystkie muchy są zdolne do życia, wśród potomstwa z krzyżówki Kroku 2 spodziewane są 4 rodzaje much, z których każdy stanowi 25% populacji (Ryc. 1B i Ryc. 3A).
  5. Test lucyferazy (ryc. 3D)
    1. Wygeneruj potrójne muchy transheterozygotyczne, jak również muchy kontrolne, powtarzając kroki 2.4.1-2.4.5. Zbieraj samce much po urodzeniu i starzej je do 3 dni życia.
    2. Przenieś 3-dniowe muchy do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i poddaj je lizie za pomocą tłuczka i buforu do lizy lucyferazy z dostępnego na rynku zestawu do oznaczania lucyferazy.
    3. Użyj 5 μl zlizowanej tkanki z każdej próbki, aby zmierzyć aktywność lucyferazy świetlika i renilli za pomocą dostępnego na rynku zestawu do oznaczania lucyferazy i luminometru.

3. Specyficzne tkankowo celowanie w RNA in vivo przy użyciu trójskładnikowego systemu CasRx

  1. Generowanie wektora wyrażeń UASt-CasRx i UASt-dCasRx
    1. PCR amplifikuje sekwencję promotora UASt za pomocą plazmidu pJFRC81 i starterów 1041.C9 i 1041.C11; następnie PCR amplifikuje fragment CasRx za pomocą plazmidu OA-1050E (Addgene ID #132416) i starterów 1050L. C1 oraz 1050E. Klasa C4; a następnie PCR amplifikuje fragmenty dCasRx za pomocą plazmidu OA-1050R (Addgene ID #132417) i starterów 1050L. C1 oraz 1050E. C4 (Tabela 1)26. Oczyść żelem amplifikowaną sekwencję promotora UASt, fragmenty CasRx i dCasRx za pomocą zestawu do oczyszczania żelu.
    2. Trawisz wektor podstawowy (plazmid Addgene #112686) z enzymami restrykcyjnymi NotI i PacI24. W powstałych produktach należy oczyścić żelem większy fragment, który nazywa się szkieletem wektora podstawowego, za pomocą zestawu do oczyszczania żelu.
    3. Złóż wektor UASt-CasRx ze szkieletem wektora podstawowego, sekwencją promotora UASt i fragmentem CasRx za pomocą zestawu Gibsona; następnie złóż wektor UASt-dCasRx ze szkieletem wektora podstawowego, sekwencją promotora UASt i fragmentem dCasRx za pomocą metody montażu Gibsona25.
      UWAGA: Wektor UASt-CasRx to plazmid Addgene #132418, a wektor UASt-dCasRx to plazmid Addgene #132419
  2. Generowanie much transgenicznych
    1. Wstrzyknąć wektor UASt-CasRx do zarodków much za pomocą usługi iniekcji zarodków much i zarodków z miejsca integracji ØC31 8621 muchy na ich 2chromosomach; następnie wstrzyknąć wektor UASt-dCasRx do zarodków much za pomocą usługi iniekcji zarodków much i zarodków z miejsca integracji ØC31 much 8621 na ich 2. chromosomach. Wyhodować wstrzyknięte zarodki w temperaturze 26 °C.
    2. Utrzymuj muchy jako podwójnie zrównoważone linie heterozygotyczne ze znacznikami CyO i Sb. UWAGA: Identyfikatory linii muchowych w BDSC to 84121 (UASt-CasRx) i 84120 (UASt-dCasRx).
  3. Genetyka much (Rysunek 1C)
    1. Zamów żądane linie GAL4 w BDSC; Uzyskaj odpowiednie linie gRNA z kroku 3.2.2 (lub z BDSC).
      UWAGA: Użyto następujących 2 much GAL4 z BDSC: GAL4-GMR (IDENTYFIKATOR BDSC: #29967), GAL4-y (identyfikator BDSC: #44373). Wykorzystano te same 3 linie gRNA wygenerowane w pierwszej sekcji: gRNAw (BDSC ID: #84124), gRNAN (BDSC ID #84122), gRNAy (BDSC ID: #84123).
    2. Zbierz 5-10 dziewiczych dorosłych samic much z linii gRNA. Zbierz 2-4 dorosłe samce much z podwójnie zrównoważonego heterozygotycznego UASt-CasRx/CyO; +/TM6, linia Sb, która pokazuje jednocześnie białookie, kędzierzawe skrzydła i dCzerwona fluorescencja. Umieść zebrane samice i samce much, które są muchami rodzicielskimi, w zwykłej fiolce z pokarmem (zwanej dalej Krzyżówką Kroku 1). Powtórz ten krok 3 razy dla 3 powtórzeń. Dla grupy kontrolnej należy użyć UASt-dCasRx/CyO; +/TM6, Sb, zachowując wszystko inne bez zmian.
    3. Fiolki Kroku 1 z muszkami rodzicielskimi należy przechowywać w temperaturze 26 °C przez 48 godzin. Następnie usuń wszystkie muchy rodzicielskie z każdej fiolki. Następnie przechowywać fiolki w temperaturze 26 °C przez co najmniej 14 dni. W tym czasie zbierz 5-10 dziewic żeńskich z linii GAL4. Powtórz ten krok 3 razy dla 3 powtórzeń.
    4. Obserwuj fiolki Kroku 1 Krzyż każdego dnia, aby zobaczyć, czy z poczwarek wyłania się jakaś nowa dorosła mucha. Jeśli tak, znieczul je dwutlenkiem węgla, zbierz 2-4 samce much wyrażające zarówno UASt-CasRx (lub UASt-dCasRx), jak i wektor gRNA z potomstwa, które jednocześnie ma fenotypy dsRed-fluorescencji i zarostu. Umieść zebrane samce z Kroku 1 Krzyża do nowej fiolki wraz z 5-10 zebranymi dziewiczymi samicami z linii GAL4 (zwanej dalej Krzyżówką Kroku 2). Powtórz ten krok 3 razy dla 3 powtórzeń.
    5. Fiolki Kroku 2 z muszkami krzyżowymi należy przechowywać w temperaturze 26 °C przez 48 godzin. Następnie usuń wszystkie muchy rodzicielskie z każdej fiolki. Następnie przechowywać fiolki w temperaturze 26 °C przez co najmniej 20 dni.
    6. Codziennie obserwuj fiolki Kroku 2 Krzyż, aby sprawdzić, czy z poczwarek wydostaje się jakaś nowa dorosła mucha. Jeśli tak, znieczul je dwutlenkiem węgla, oceń fenotypy znieczulonych much i zobrazuj je za pomocą kolorowej kamery wyposażonej w fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy. Policz liczbę potomstwa o różnych fenotypach. Użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu do przetwarzania końcowego i kompilacji obrazu (Rysunek 4).
      UWAGA: Genetyka mendlowska sugeruje, że jeśli wszystkie muchy są zdolne do życia, wśród potomstwa z krzyżówki Kroku 2 spodziewane są 4 rodzaje much, z których każdy stanowi 25% populacji (Ryc. 1C).

Wyniki

Szeroko zakresłe celowanie w RNA in vivo przy użyciu dwuskładnikowego systemu CasRx
Muchy transheterozygotyczne F1 wykazujące ekspresję zarówno konstruktów Ubiq-CasRx, jak i gRNA (celujących w geny endogenne i egzogenne) wykazały wyraźne fenotypy w porównaniu z muchami kontrolnymi wykazującymi ekspresję konstruktów Ubiq-dCasRx i gRNA (Ryc. 2 oraz Ryc. 4). W szczególności muchy transheterozygotyczne CasRx charakteryzowały się znacznie niższym wskaźnikiem przeżywalności w porównaniu z muchami transheterozygotycznymi dCasRx, co wskazuje na toksyczność systemu Ubiq-CasRx (Ryc. 2A i Ryc. 4A). Warto zauważyć, że zarówno muchy transheterozygotyczne CasRx, jak i dCasRx wykazują wskaźnik dziedziczenia poniżej 50%, co jest spodziewanym stosunkiem opartym na genetyce mendlowskiej. Z trzech genów docelowych, muchy Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ oraz Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAy/+ są nieżywotne (0% dziedziczenia) i nie przekroczyły stadium drugiego poczwalnego larwy (Ryc. 2A-2B). Przeżywające muchy Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAw/+, których wskaźnik dziedziczenia wyniósł 12,9%, wykazały wyraźny, w pełni penetrujący fenotyp białych oczu (Ryc. 2B). Oprócz obserwowalnych cech związanych z CasRx, udało nam się potwierdzić znaczną redukcję transkrypty genów docelowych dla 3 genów: Notch, yellow oraz GFP (Ryc. 2E-2G). Redukcję transkryptów genu white zaobserwowano u much Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAw/+ w porównaniu z kontrolnymi muchami Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAw/+, choć redukcja ta nie była statystycznie istotna (Ryc. 2E - 2F). Dowody na aktywność poza celową (off-target) indukowaną przez CasRx znaleziono podczas porównywania transkryptów o zróżnicowanej ekspresji między próbkami z much wykazujących ekspresję CasRx a próbkami z much wykazujących ekspresję dCasRx (Ryc. 2E, 2G). Liczba transkryptów pozacelowych o istotnie zróżnicowanej ekspresji przedstawia się następująco: white, 253 (1,4% wszystkich transkryptów); Notch, 30 (1,7%); yellow, 41 (0,23%); GFP, 5 80 (3%) (Ryc.2G). Spośród łącznie 17 79 różnych transkryptów, 6 transkryptów pozacelowych wykazywało istotnie zróżnicowaną ekspresję we wszystkich 4 grupach próbek. Jednym z 6 zidentyfikowanych transkryptów był Gadd45, gen zaangażowany w apoptozę i zatrzymanie cyklu komórkowego u much, co sugeruje możliwość, że enzymatyczne działanie CasRx może bezpośrednio wywoływać apoptozę komórkową lub pośrednio wywoływać błędną ekspresję innych genów, co z kolei prowadzi do apoptozy. Na koniec warto zaznaczyć, że muchy Ubiq-CasRx i Ubiq-dCasRx nie zostały ustanowione jako linie homozygotyczne, prawdopodobnie z powodu toksyczności wynikającej z wysokiej powszechnej ekspresji. W konsekwencji do krzyżowania z homozygotycznymi liniami much gRNA wykorzystano muchy heterozygotyczne Ubiq-CasRx/CyO i Ubiq-dCasRx/CyO. Podsumowując, dwuskładnikowy system Ubiq-CasRx pozwala na powszechne celowanie w RNA zarówno w przypadku celów endogennych, jak i egzogennych, co skutkuje obserwowalnymi fenotypami i redukcją transkrypty. Wyniki te wykazały również, że celowanie w RNA za pośrednictwem CasRx może wprowadzać toksyczność in vivo.

Wszechobecne celowanie w egzogenne RNA in vivo z wykorzystaniem trójskładnikowego systemu CasRx
Wyniki dwuetapowego krzyżowania wykazały, że pomimo egzogennego charakteru genu docelowego (tj. Fluc), ekspresja wszystkich trzech transgenów u potrójnych transheterozygot F2 (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) doprowadziła do 10% letalności w porównaniu z krzyżowaniami kontrolnymi z użyciem Ubiq-dCasRx, gdzie u potrójnych transheterozygot F2 (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) nie zaobserwowano letalności (Rycina 3B-C). Bardziej szczegółowo, tylko kombinacja wszystkich trzech transgenów (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) spowodowała 10% letalność (Rycina 3B oraz D), podczas gdy genotypy (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) oraz (Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) były żywotne i nie wykazywały fenotypów, a ich wskaźniki dziedziczenia były zgodne z oczekiwanymi prawami Mendla. Sugeruje to, że dostępność sekwencji docelowej (tj. lucyferazy świetlikowej) w połączeniu z Ubiq-CasRx/+ i gRNAFluc przyczynił się do zaobserwowanych fenotypów letalności, co prawdopodobnie wynika z aktywności kolateralnej enzymów Cas132,8. Ponadto, u transheterozygot F1 (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ lub Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) nie zaobserwowano wyraźnych fenotypów ani gwałtownego wpływu na dziedziczenie w porównaniu z kontrolami Ubiq-dCasRx (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ lub Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (Rycina 3B), co wskazuje, że do uzyskania obserwowanych fenotypów letalności niezbędny jest katalitycznie aktywny enzym. Co więcej, poziomy ekspresji Fluc i Rluc u much wszystkich żywotnych genotypów nie wykazały znaczącej redukcji ekspresji Fluc u potrójnych transheterozygot Ubiq-dCasRx (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) w porównaniu z kontrolami z podwójnym reporterem lucyferazy. Sugeruje to, że poziomy ekspresji białka Fluc nie zostały obniżone przez celowanie dCasRx (Rycina 3D). Podsumowując, wspólny fenotyp letalności w dwóch różnych eksperymentach wszechobecnego celowania w RNA za pomocą CasRx wskazuje, że przy zastosowaniu w tkankach w sposób wszechobecny, celowanie w RNA za pośrednictwem CasRx może być toksyczne dla organizmu.

Tkankowo specyficzne celowanie w RNA in vivo z wykorzystaniem trójskładnikowego systemu CasRx
Wysoki poziom toksyczności zaobserwowany w eksperymentach powszechnego celowania w RNA skłonił nas do zbadania tkankowo specyficznego celowania w RNA z wykorzystaniem trójskładnikowego systemu CasRx, którego projekt szczegółowo opisano w sekcji metod. Rzeczywiście, poziom zaobserwowanej toksyczności uległ zmniejszeniu, gdy ogólna ekspresja CasRx została obniżona przy użyciu promotora UASt w porównaniu z promotorem Ubiq; egzemplifikuje to trzy aspekty: 1) linie UASt-CasRx i UASt-dCasRx utrzymywano jako linie homozygotyczne, choć w oparciu o dwuetapowy schemat krzyżowania do przeprowadzania krzyżówek użyto podwójnie zrównoważonych linii UASt-CasRx i UASt-dCasRx, 2) wszystkie wskaźniki dziedziczenia potrójnych transheterozygot dCasRx w pokoleniu F2 odpowiadały oczekiwanemu 25% wskaźnikowi dziedziczenia mendlowskiego oraz 3) fenotyp letalności potrójnych transheterozygot CasRx w pokoleniu F2 był umiarkowanie zredukowany. W eksperymencie celowania w white, z 25% oczekiwanych wskaźników dziedziczenia mendlowskiego w potrójnych transheterozygotach F2, zaobserwowano jedynie 0,57% żywych dorosłych much (UASt-CasRx/+; gRNAw/GMR-Gal4), z których wszystkie wykazywały ciężkie fenotypy pigmentacji i morfologii specyficzne dla oka (Rycina 4A i 4B). W przypadku krzyżowania celowanego w white, wskaźnik dziedziczenia potrójnych transheterozygot F2 wykazujących ekspresję CasRx był znacząco niższy niż w grupie kontrolnej potrójnych transheterozygot wykazujących ekspresję dCasRx (27,6%) (Rycina 4A). W eksperymencie celowania w Notch, potrójne transheterozygoty wykazujące ekspresję CasRx i posiadające wszystkie trzy transgeny były w 10% letalne, podczas gdy wskaźnik dziedziczenia kontroli dCasRx wynosił 29,3% (Rycina 4A). W eksperymencie celowania w yellow, potrójne transheterozygoty F2 wykazujące ekspresję CasRx, gRNAy oraz y-GAL4 wykazywały marginalną redukcję pigmentu chitynowego w postaci małych żółtych plamek kutykuli na klatce piersiowej i odwłoku, przy wskaźniku dziedziczenia wynoszącym 2,67%, co było znacznie niższe niż w grupie kontrolnej dCasRx (25,2%) (Rycina 4A). Wszystkie kontrolne potrójne transheterozygoty dCasRx nie wykazywały oczywistych fenotypów takich jak muchy wykazujące ekspresję CasRx, co wskazuje, że aktywność katalityczna CasRx przyczyniła się do zaobserwowanych fenotypów. Niski wskaźnik dziedziczenia w grupie potrójnych transheterozygot CasRx zasugerował, że w celowaniu w RNA za pomocą CasRx istnieją dwa źródła toksyczności: jedno wiąże się z wysoką ekspresją CasRx, której toksyczność została zredukowana przez ograniczoną ekspresję CasRx, a drugie wiąże się z aktywnością poboczną. Podsumowując, wyniki te wykazały, że system CasRx może umożliwiać tkankowo specyficzne celowanie w RNA in vivo poprzez wykorzystanie klasycznego systemu Gal4/UASt, a jednocześnie redukować toksyczność. Niemniej jednak, toksyczność i sporadyczne fenotypy letalności były nadal obserwowane, choć na niższym poziomie nasilenia w porównaniu z podejściami powszechnymi, co wskazuje, że aktywność cięcia pobocznego wiąże się z toksycznością.

figure-results-1
Rysunek 1: Ogólny przegląd targetowania RNA z wykorzystaniem systemu Cas13D. (A) Schematy jednokrokowego krzyżowania genetycznego w powszechnym targetowaniu RNA in vivo z użyciem dwuskładnikowego systemu CasRx. (B) Schematy dwukrokowego krzyżowania genetycznego w powszechnym targetowaniu egzogennego RNA in vivo z użyciem trójskładnikowego systemu CasRx. (C) Schematy dwukrokowego krzyżowania genetycznego w tkankowo specyficznym targetowaniu RNA in vivo z użyciem trójskładnikowego systemu CasRx. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Powszechne celowanie w RNA in vivo przy użyciu dwuskładnikowego systemu CasRx (reprodukowano5). (A) Całkowite procenty dziedziczenia much transheterozygotycznych dziedziczących Ubiq-CasRx (lub Ubiq-dCasRx) oraz gRNA. Niebieskie zacieniowanie na wykresie pudełkowym wskazuje penetrację fenotypową. (B) Fenotypy much transheterozygotycznych. Strzałki wskazują nekrozę tkanek w oku. Czarno-biała mucha oznaczona znakiem „X” reprezentuje letalność. (C) Całkowite procenty dziedziczenia much transheterozygotycznych w krzyżowaniach dwukierunkowych między muchami Ubiq-CasRx (lub Ubiq-dCasRx) a gRNAGFP-OpIE2-GFP. M – dziedziczenie CasRx po linii matczynej; P – dziedziczenie CasRx po linii ojcowskiej. (D) Potomstwo larwalne F1 w krzyżowaniu ojcowskim. (E) Oceny maximum a posteriori transkryptów dla logarytmicznej zmiany krotności (logarithmic fold change). Wykorzystano potok analizy DESeq2. (F) Liczba transkryptów na milion (TPM) celowanych za pomocą CasRx lub dCasRx. (G) Procent transkryptów o różnicowej ekspresji zależnej od CasRx. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rycina 3: Powszechne celowanie w egzogenne RNA in vivo przy użyciu trójskładnikowego systemu CasRx. (A) Schematy dwuetapowego krzyżowania genetycznego. (B) Całkowite procenty dziedziczenia dla wszystkich genotypów pojawiających się w pokoleniu F2. Dziedziczenie wszystkich trzech transgenów (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc oraz gRNAFLuc) w potomstwie F2 skutkowało 10% letalnością i było znacząco niższe w porównaniu z kontrolną grupą potrójnych transheterozygot Ubiq-dCasRx (p = 0.01, test t). (C) Obecność samego Ubiq-CasRx/gRNAFluc lub samego Ubiq-CasRx i Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc nie prowadziła do silnej letalności, a stosunki dziedziczenia między transheterozygotami Ubiq-CasRx i Ubiq-dCasRx nie różniły się znacząco (odpowiednio p = 0.41 i p = 0.51, test t). (D) Stosunki lucyferazy normalizujące odczyty Fluc do odczytów Rluc. Muchy potrójnie transheterozygotyczne wykazujące ekspresję Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc i gRNAFLuc wykazywały letalność zarodkową, co oznaczono muchą z symbolem „X”, w związku z czym nie zmierzono ekspresji lucyferazy. Stosunek Fluc/Rluc transheterozygot Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb był znacząco niższy niż w pozostałych grupach wykazujących ekspresję Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc (p = 1.2e-06 lub mniej, test t). Wyniki z grupy z samym gRNAFLuc były znacząco niższe niż we wszystkich pozostałych grupach (p = 1.2e-06 lub mniej, test t). Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-4
Rysunek 4: Tkankowo specyficzne celowanie w RNA in vivo z wykorzystaniem trójskładnikowego systemu CasRx (reprodukowano5). (A) Całkowity procent dziedziczenia u potrójnie transheterozygotycznych much niosących trzy transgeny (UASt-CasRx lub UASt-dCasRx, gRNA oraz driver Gal4). (B) Fenotypy potrójnie transheterozygotycznych much. Biała strzałka wskazuje redukcję pigmentu chitynowego w klatce piersiowej. Czarno-biała mucha oznaczona symbolem „X” oznacza letalność. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

KonstruktOpisStarterSekwencja startera (5’ do 3’)Matryca PCR
OA-1050ECasRx1050E.C3TACTAATTTTCCAC
ATCTATTTTGAC
CCGCAGATTAATTA
ATGAGCCCCAAGA
AGAA		pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)
1050E.C4CAATTGATTTGTTA
TTTTAAAAACGATT
CATTCTAGCTAGCT
TAAGCGTAATCTGG
AACA
OA-1050RdCasRx1050E.C3TACTAATTTTCCAC
ATCTATTTTGAC
CCGCAGATTA
ATGAGCCCCAAGA
AGAA		pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)
1050E.C4CAATTGATTTGTTA
TTTTAAAAACGATT
CATTCTAGCTAGCT
TAAGCGTAATCTG
GAACA
OA-1050Lpromotor UASt1041.C9GCGGGTTCTCGA
CGGTCACGGCGG
GCATGTCGACGC
GGCCGCAACCAA
CAACACTAGTAG		pJFRC81
1041.C1CTGGCCTCCACC
TTTCTCTTCTTCT
TGGCTCATGT
TTAAACCCAATT
CCCTATTCAGA
CasRx1050L.C1AATACAAGAAGA
GAACTGAATA
GGGAATTGGGT
TTAAACATGAGC
CCCAAGAAGAA		pCasRx
1050E.C4CAATTGATTTGT
TATTTTAAAAAC
GATTCATTCTA
GCTAGCTTAAG
CGTAATCTGGA
ACA
OA-1050Spromotor UASt1041.C9GCGGGTTCTC
GACGGTCACG
GCGGGCATGT
CGACGCGGCC
GCAACCAACAA
CACTAGTAG		pJFRC81
1041.C1CTGGCCTCCA
CCTTTCTCTTC
TTCTTGGCT
CATGTTTAAAC
CCAATTCCCTA
TTCAGA
dCasRx1050L.C1AATACAAGAAG
AGAACTGAAT
AGGGAATTGGG
TTTAAACATGAG
CCCCAAGAAGAA		pdCasRx
1050E.C4CAATTGATTTGT
TATTTTAAAAAC
GATTCATTCTAG
CTAGCTTAAGCG
TAATCTGGAACA
OA-1043promotor U6:31043.C1GGGAATTGGGA
ATTGGGCAATAT
TTAAATGGCGGC
GCGCCGAATTCT
TTTGCTCACCT		plazmid Addgene nr 164586
1043.C23ACACTAGTGGAT
CTAGGTAC
CGTTGCGGCCG
CAAAAAAGTTGT
AATAGCCCCTCA
AAACTGGACCTT
CCACAACTGCAG
CCGACGTTAAAT
TGAAA
OA-1052Bpromotor Ubiq1052B.C1GGGAATTGGGCA
ATATTTAAATGGC
GGCTGCAGCGC
GCAGATCGCCGAT		Plazmid Addgene nr 12686
1052B.C2TTTCTTTATGTTT
TTGGCGTCTTCC
ATCCTAGGTCTG
CGGGTCAAAATA
GAGATG
T2A-eGFP908A1ATAAAGGCCAAG
AAGGGCGGAAA
GATCGCCGTGG
AGGGCAGGA
AGTCTTCTAACAT
GC		plazmid Addgene nr 12686
908A2TTGTTATTTTAAAA
ACGATTCATTCTA
GGCGATCGCTTA
CTTGTACAGCTC
GTCCATGCC
Odwrócony promotor Ubiq908A3ACCGTGACCTAC
ATCGTCGACACTA
GTGGATCTCTAGA
CGCAGATCGC
CGATG		Plazmid Addgene nr 12686
908A4GGATCATAAACTT
TCGAAGTCATGC
GGCCGCTCTGCG
GGTCAAAATAG
ATGT

Tabela 1: Lista konstruktów molekularnych i starterów użytych w niniejszym badaniu. Lista ta obejmuje wszystkie konstrukty (zarówno identyfikator, jak i opis) oraz powiązane z każdym konstruktem startery (zarówno identyfikator, jak i sekwencje (5' do 3')) oraz użyte matryce.

Dyskusja

Dzięki trzem różnym projektom zastosowań systemu CasRx, prace te zademonstrowały celowanie w wiwoprogramowalne RNA u muszek. Różne strategie zaspokajają różne potrzeby projektu, takie jak endogenne i egzogenne celowanie w geny oraz wszechobecne w porównaniu z tkankowo specyficznym RNA. Efekty celowania w RNA obejmowały zmiany fenotypowe specyficzne dla genu docelowego, redukcję docelowego transkryptu RNA oraz sporadyczne fenotypy śmiertelności związane z wysoką ekspresją białka CasRx i aktywnością poboczną. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te wykazały, że system CasRx jest zdolny do docelowej redukcji transkryptu RNA na poziomie organizmu w programowalny i skuteczny sposób.

Jednym z kluczowych czynników udanej personalizacji systemu CasRx jest konstrukcja gRNA. W szczególności należy przestrzegać następujących zaleceń: sekwencja docelowa ma długość około 30 nukleotydów, długość odcinków poli-U w sekwencji docelowej wynosi 4 pary zasad lub mniej, zawartość GC sekwencji docelowej mieści się w zakresie 30% - 70%, nie przewiduje się, aby sekwencja docelowa tworzyła silne struktury spinki do włosów RNA, a sekwencja docelowa zawiera minimalną przewidywaną strukturę drugorzędową lub trzeciorzędowąRNA 5.

Oprócz projektów gRNA, etap genetyki muchy w każdym protokole ma również kluczowe znaczenie dla udanego wdrożenia. Obecność lub brak zdefiniowanych fenotypów przekazywanych przez rodziców w potomstwie jest ważna dla identyfikacji i ilościowego określenia fenotypów indukowanych przez system CasRx w transheterozygotycznych progeniach. Również ustawienie krzyżówek kontrolnych przy użyciu much dCasRx równolegle jest również pomocne w wykluczaniu niespecyficznych fenotypów w transheterozygotycznych progenies.

Warto zauważyć, że wyniki te ujawniły problem toksyczności spowodowany wszechobecną ekspresją białka CasRx i dCasRx w locie, co jest ograniczeniem systemu CasRx. Wszechobecna ekspresja CasRx lub dCasRx pod samym promotorem Ubiq, bez gRNA, wiązała się z nietrywialnymi kosztami przystosowania, ponieważ ani muchy Ubiq-CasRx, ani Ubiq-dCasRx nie mogły zostać uznane za linie homozygotyczne. Wręcz przeciwnie, muchy UASt-CasRx i UASt-dCasRx można uznać za zdrowe stada homozygotyczne, chociaż ze względu na konstrukcję schematu krzyżowego były one utrzymywane jako stada podwójnie zrównoważone, co potwierdza istnienie toksyczności wywołanej wszechobecną ekspresją białka CasRx. Innym dowodem potwierdzającym jest to, że w eksperymentach kontrolnych z udziałem dCasRx, który jest katalitycznie nieaktywny, odsetek much przenoszących zarówno konstrukty dCasRx, jak i gRNA w całkowitej liczbie much w pokoleniu F1 był konsekwentnie niższy niż 50%, stosunek oczekiwany na podstawie genetyki mendlowskiej, jeśli nie występowała toksyczność związana z dCasRx. Wskazywało to, że wszechobecna ekspresja dCasRx, wraz z gRNA, indukuje toksyczność u muchy, powodując mniejszy niż oczekiwano współczynnik dziedziczenia. Współczynniki dziedziczenia transheterozygotycznych muszek UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 były zgodne z genetyką mendlowską, co ponownie sugeruje toksyczność wywołaną specyficznie przez wszechobecną ekspresję białek CasRx i dCasRx. Toksyczność w systemie CRISPR/Cas nie jest niczym nowym. Wykazano, że duże ilości białka Cas9 są toksyczne dla kilku organizmów, w tym much 29,30,31,32. W niedawnym badaniu opracowano dostosowany system GAL4/UAS, który może dostroić ilość białka Cas9 wyrażanego u muszek poprzez dodanie otwartej ramki odczytu o różnej długości między sekwencją UAS a sekwencją Cas9 w konstrukcji UAS-Cas933. Dlatego warto zbadać sposoby zmniejszenia toksyczności indukowanej przez CasRx poprzez dostrojenie poziomu ekspresji białka CasRx.

Oprócz toksyczności wywołanej wszechobecną ekspresją białek CasRx i dCasRx, wyniki wykazały również śmiertelność związaną z niespecyficznymi efektami pobocznymi systemu CasRx poza celem, co jest cechą wielu systemów CRISPR1, 2, 7, 34. U niektórych podwójnych lub potrójnych muszek transheterozygotycznych z ekspresją CasRx i nieistotnym genem gRNA, na przykład podczas celowania w Notch, transheterozygotyczne muchy CasRx mają znacznie niższy poziom przeżywalności w porównaniu z transheterozgyous dCasRx. W analizie sekwencyjnej RNA tych transheterozygotycznych muszek z ekspresją CasRx i gRNA zaobserwowano zarówno zmniejszenie poziomów transkryptów genu docelowego, jak i zmniejszenie transkryptów genów niedocelowych. Te efekty uboczne były zależne od CasRx i celu, ponieważ obserwowano je tylko u muszek transheterozygotycznych wykazujących ekspresję zarówno białka CasRx, jak i gRNA. Warto zwrócić uwagę, że jeden z docelowych genów, biały, wykazywał jedynie ograniczoną, nieistotną statystycznie redukcję transkryptów, gdy biały gen był celem CasRx, co kontrastowało z fenotypem wyraźnej redukcji pigmentu. Przypuszcza się, że może to wynikać z faktu, że 1) czas pobierania próbek sekwencyjnych RNA nie był dobrze dostosowany do czasu, w którym biały gen osiąga szczytową ekspresję we wczesnym okresie rozwoju, oraz 2) zlokalizowana ekspresja białego genu w oczach utrudnia pobranie odpowiednich tkanek we wczesnej fazie rozwoju, gdy możliwe jest tylko pobranie próbki z całego ciała. Aby zmniejszyć aktywność uboczną w systemie CasRx, potrzebne są dalsze badania, aby w pełni zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw systemu zjawisk poza celem na poziomie organizmu.

Co ciekawe, niedawne badanie35 opisujące narzędzia Cas13 ukierunkowane na RNA u muszek wydaje się łagodzić ogólną toksyczność związaną z ekspresją CasRx, z kilku możliwych powodów. Po pierwsze, autorzy przekodowali transgeny Cas13 w celu optymalizacji ekspresji u Drosophila i wykorzystali promotor o słabszej ekspresji (aktynę 5C) w porównaniu z promotorem ubikwityny zastosowanym w niniejszym badaniu, co prawdopodobnie prowadzi do niższych poziomów ekspresji Cas13, a tym samym mniejszej toksyczności. Rzeczywiście, jest to poparte obserwacjami, że ekspresja CasRx i dCasRx sterowana przez UASt nie była sama w sobie toksyczna, ponieważ to badanie (i autorzy w 35) nie zaobserwowali żadnej oczywistej śmiertelności u much UASt-CasRx. Co więcej, autorzy ci kodowali swoje gRNA inaczej w porównaniu z tym badaniem, co mogło wpłynąć na ich ekspresję i zmniejszyć toksyczność systemu u transheterozygotycznych muszek Cas13 / gRNA. Na przykład w ich badaniu dwa gRNA uległy ekspresji przy użyciu promotora U6:3 i zostały otoczone tRNA, aby umożliwić przetwarzanie gRNA po dojrzewaniu tRNA bez konieczności CasRx35. I odwrotnie, w tym badaniu gRNA zostały zakodowane jako macierze ukierunkowane na maksymalnie 4 lokalizacje na gen i naśladujące endogenną strukturę macierzy Cas13 występującą u bakterii, która wymaga enzymu Cas13 do przetworzenia każdego gRNA. Te różne podejścia mogły prowadzić do różnic w poziomach ekspresji gRNA i innych czynnikach, które mogą mieć nieodłączny wpływ na toksyczność całego systemu. Wreszcie, Huynh i in. celowali w inne geny niż te, które są celem niniejszego badania, co skutkuje różnicami w interakcji cel-Cas / gRNA i aktywności pobocznej oraz może mieć wpływ na obserwowane poziomy śmiertelności. Te różnice w obserwowanej toksyczności uzasadniają dalsze badania w celu określenia sposobów ulepszenia całych systemów.

Ogólnie rzecz biorąc, badanie to jest pierwszą demonstracją funkcjonalnego, genetycznie kodowanego, programowalnego systemu Cas ukierunkowanego na RNA u D. melanogaster, chociaż konieczna będzie dalsza optymalizacja systemu CasRx (zgodnie z tym, co zgłoszono35) w celu dalszego zmniejszenia śmiertelności związanej z niecelowością i zwiększenia skuteczności rozszczepienia CasRx na celu. Celowanie w RNA za pomocą enzymów Cas to szybko rozwijająca się dziedzina z wieloma potencjalnymi zastosowaniami, od kontroli wektorów owadów po zastosowania terapeutyczne 1,2,3,4,5,6,7, a protokół ten oferuje pakiet startowy dla każdego, kto jest zainteresowany zaprojektowaniem swojego pierwszego systemu CasRx u much, będąc jednocześnie kompatybilnym z dostosowywaniem i dalszą optymalizacją systemu. Przedstawione tu przykłady pokazują szereg wyników, z jakimi można się spotkać podczas wdrażania tego systemu in vivo i mogą służyć jako punkt odniesienia dla innych użytkowników w ocenie wydajności systemu CasRx w ich aplikacjach.

Oświadczenia

O.S.A. jest założycielem Agragene, Inc., posiada udziały w kapitale zakładowym i zasiada w Naukowej Radzie Doradczej firmy. Warunki tej umowy zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w San Diego zgodnie z jego zasadami dotyczącymi konfliktu interesów. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez finansowanie z grantu DARPA Safe Genes Program (HR0011-17-2-0047) oraz nagród NIH (R21RAI149161A, DP2AI152071) przyznanych O.S.A.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100% sok winogronowyWelch Foods Inc.Nie dotyczy
suchych drożdży (908g)Red Star Yeast Company, LLCNie dotyczy
DMC4500 kolorowego aparatuLeica MicrosystemsDMC4500
System testowy reporterowy z podwójną lucyferazyąPromegaE1910
GAL4-GMR leciCentrum Magazynowe Bloomington Drosophila29967
GAL4-y muchyCentrum Magazynowe Bloomington Drosophila44373
Luminometr Glomax 20/20PromegaE5331
Sekwencer Illumina HiSeq2500Illumina, Inc.Stereoskopowy fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy HiSeq2500
M165FCLeica MicrosystemsM165FC
Nanodrop OneC Spektrofotometr UV-visThermoFisherNDONEC-W
NEBNext Ultra II Zestaw do przygotowania biblioteki RNANew England Biolabs, Inc.E7770
plazmid # 112686Addgene112686
plazmid # 112688Addgene112688
plazmid # 132416Addgene132416
plazmid # 132417Addgene132417
plazmid # 132419Addgene132419
plazmid # 132420Addgene132420
plazmid # 132421Addgene132421
plazmid # 132422Addgene132422
plazmid # 132425Addgene132425
plazmid # 132426Addgene132426
plazmid # 133304Addgene133304
plazmid # 164586Addgene164586
plazmid #132418Addgene132418
plazmid pJFRC81Addgene36432
Qiagen RNeasy Mini KitQiagen74104
Endonukleazy restrykcyjne AscINew England Biolabs Inc.R0558L
Endonukleazy restrykcyjne NotINew England Biolabs Inc.R0189L
Endonukleazy restrykcyjne PacINew England Biolabs Inc.R0547L
Endonukleazy restrykcyjne PstINew England Biolabs Inc.R0140L
Endonukleazy restrykcyjne SwaINew England Biolabs Inc.R0604L
Endonukleazy restrykcyjne XbaINew England Biolabs Inc.R0145L
RNA 6000 Zestaw Pico do bioanalizatoraAgilent Technologies5067-1513
Turbo DNaseInvitrogenAM2238
U6-3:4-gRNA-Fluc muchyBloomington Drosophila Stock Center84125
U6-3:4-gRNA-GFP; Muchy OpIE2-GFPBloomington Drosophila Stock Center84986
Muchy U6-3:4-gRNA-NBloomington Drosophila Stock Center84122
Muchy U6-3:4-gRNA-wBloomington Drosophila Stock Center84124
Muchy U6-3:4-gRNA-yBloomington Drosophila Stock Center84123
Muchy UASt-CasRxBloomington Drosophila Stock Centrum84121
UASt-dCasRx leciBloomington Drosophila Stock Center84120
Ubiq-CasRx leciBloomington Drosophila Stock Center84118
Ubiq-dCasRx leciBloomington Drosophila Stock Center84119
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla leciBloomington Drosophila Stock Center84127
Zestawy do odzyskiwania DNA Zymoclean GelZymo Research CorporationD4007
aktywnych

Bibliografia

  1. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat Communications. 9, 1911(2018).
  2. Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), 5573(2016).
  3. East-Seletsky, A., O'Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes. Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).
  4. Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell. 173 (3), 665-676 (2018).
  5. Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies. The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).
  6. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  7. Abudayyeh, O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550, 280-284 (2017).
  8. Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. In vivo RNAi: today and tomorrow. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640(2010).
  9. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
  10. Ni, J., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  11. Ni, J., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature Methods. 8, 405-407 (2011).
  12. Ni, J., et al. Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster. Nature Methods. 5, 49-51 (2008).
  13. Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).
  14. Kulkarni, M., et al. Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays. Nature Methods. 3, 833-838 (2006).
  15. Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens. Nature. 443, 359-363 (2006).
  16. Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila. Fly. 1 (1), 1-5 (2007).
  17. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).
  18. Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations. Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).
  19. Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103(2020).
  20. Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).
  21. Franz, A., et al. Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).
  22. Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti. Communications Biology. 1, 11(2018).
  23. Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
  24. Addgene. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/ (2020).
  25. Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  26. Addgene. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr/ (2020).
  27. Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL (2020).
  28. Dobin, A., et al. STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  29. Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).
  30. Poe, A., et al. Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila. Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).
  31. Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).
  32. Yang, S., Li, S., Li, X. Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).
  33. Port, F., et al. A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila. eLife. 9, 53865(2020).
  34. Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4 (17), 264(2015).
  35. Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila. Genome Biology. 21, 279(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Redukcja transkrypcji genucelowanie tkankowo swoistepowszechne celowanie w RNAsystem Cas13test lucyferazowyaktywno poza celemprzesiew fenotypowy
Wszechobecne i specyficzne tkankowo celowanie RNA u Drosophila melanogaster przy użyciu CRISPR/CasRx
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.