Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Podsumowanie

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Streszczenie

Nabłonek jelitowy składa się z pojedynczej warstwy komórek, które działają jak bariera między światłem jelita a wnętrzem ciała. Przerwanie ciągłości tej bariery może skutkować zaburzeniami zapalnymi, takimi jak nieswoiste zapalenie jelit. Jednym z ograniczeń w badaniach nad biologią nabłonka jelitowego był brak pierwotnych modeli hodowli komórek, co zmusiło naukowców do wykorzystania modelowych linii komórkowych pochodzących z raków. Pojawienie się trójwymiarowych (3D) enteroidów dało biologom nabłonkowym potężne narzędzie do generowania pierwotnych kultur komórkowych, niemniej jednak struktury te są osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej i brakuje im dojrzałości charakterystycznej dla zróżnicowanych komórek nabłonka jelitowego. Opublikowano kilka technik generowania monowarstw nabłonka jelitowego, ale większość z nich pochodzi z ustalonych enteroidów 3D, co sprawia, że proces ten jest pracochłonny i kosztowny. Tutaj opisujemy protokół generowania pierwotnych monowarstw nabłonka jelita grubego bezpośrednio z mysich krypt jelitowych. Szczegółowo opisujemy również podejścia eksperymentalne, które można zastosować w tym modelu, takie jak generowanie zlewających się kultur na filtrach przepuszczalnych, monowarstwa konfluentna do badań gojenia ran zadrapań oraz rzadkie i zlewające się monowarstwy do analizy immunofluorescencyjnej.

Wprowadzenie

Komórki nabłonka jelitowego (IEC) otaczają jelita, tworząc selektywnie przepuszczalną barierę, która umożliwia wchłanianie składników odżywczych i wody, jednocześnie zapobiegając przedostawaniu się mikroorganizmów i toksyn do organizmu ¹. Błona śluzowa jelita składa się z projekcji świetlnych zwanych kosmkami (obecnych tylko w jelicie cienkim) i wgłębień zwanych kryptami. Kosmki i powierzchnia krypt jelita grubego pokryte są zróżnicowanymi komórkami nabłonkowymi, podczas gdy podstawa krypt składa się z komórek macierzystych, które dokonują szybkiej odnowy nabłonka jelitowego, który ma obrót od 3 do 7 dni. Jelitowe komórki macierzyste (ISC) są ważne nie tylko dla utrzymania homeostazy jelitowej, ale także dla odpowiedniej naprawy uszkodzonego nabłonka².

Badanie biologii nabłonka jelitowego było ograniczone przez brak pierwotnych hodowli komórkowych, a przekształcone linie komórkowe były jedynym dostępnym narzędziem. Linie komórkowe modelu nabłonka jelitowego nie są w stanie dokładnie odtworzyć fizjologii normalnego nabłonka jelitowego. Opracowanie kultur 3D pochodzących z ISC dostarczyło biologom błony śluzowej jelit modeli in vitro, które przypominają warunki błony śluzowej jelit in vivo³. Krypty można łatwo wyizolować z próbek mysich, osadzić w pożywce z matrycą błony podstawnej (np. Matrigel) i hodować w kondycjonowanych pożywkach zawierających Wnt3a, R-spondynę i Noggin, generując struktury 3D znane jako enteroidy (jelito cienkie) lub kolonoidy (jelito grube)⁴. Enteroidy i kolonoidy są spolaryzowanymi strukturami sferoidalnymi, w których domena wierzchołkowa jest skierowana w stronę wewnętrznego światła, a obszar podstawno-boczny jest w bezpośrednim kontakcie z macierzą zewnątrzkomórkową. Enteroidy i kolonoidy zawierają wszystkie główne zróżnicowane podtypy nabłonka jelitowego, takie jak enterocyty/kolonocyty, Paneth, komórki enteroendokrynne i kubkowe, i pojawiają się w stosunkowo takich samych proporcjach, jak w sekcji jelita, z której zostały wyizolowane⁵. Mimo że enteroidy i kolonoidy 3D stanowią duży postęp w badaniach nad rozwojem i fizjologią jelit, modele te mają pewne wady, takie jak ograniczony dostęp do wierzchołkowej powierzchni komórek nabłonka (światło) oraz możliwość skalowania kultur w górę lub w dół w celu uzyskania wysokoprzepustowych badań przesiewowych interesujących molekuł. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano protokoły uzyskiwania pierwotnych kultur 2D IEC pochodzących z enteroidów/kolonoidów 3D. Enteroidy / kolonoidy 2D rosną jako arkusze komórek, tak jak modelowe linie komórkowe i są idealne do badania naprawy ran jelitowych, interakcji gospodarz-patogen i medycyny regeneracyjnej. Kilka opublikowanych artykułów opisuje, jak generować monowarstwy 2D ze struktur 3D lub bezpośrednio z krypt jelitowych, (patrz^{6,7,8,9,10,11}), ale te metody są zwykle pracochłonne i trudne do odtworzenia. W niniejszym protokole przedstawiono szybką, prostą i powtarzalną metodę uzyskiwania monowarstw bezpośrednio ze świeżo wyizolowanych krypt jelit myszy.

Tutaj szczegółowo wyjaśniamy proces ekstrakcji krypt przy minimalnym generowaniu zanieczyszczeń, wybór macierzy zewnątrzkomórkowej oraz różne powierzchnie i zastosowania dla tej techniki. To eksperymentalne podejście zostało zoptymalizowane pod kątem krypt jelita grubego, ale podobne wyniki uzyskuje się w przypadku zastosowania do jelita cienkiego.

Protokół

Wszystkie procedury opisane poniżej zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Przygotowanie odczynników do izolacji krypty i hodowli (przygotowanie w kapturze do hodowli tkankowej)

1. 50 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA): Dodaj 50 ml 0,5 M bulionu do 450 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, bez wapnia (Ca²⁺) i magnezu (Mg²⁺), aby przygotować 500 ml. W tym protokole PBS będzie odnosić się do PBS bez wapnia i magnezu, chyba że zaznaczono inaczej.
2. Bufor wstrząsający: Rozpuść 7,4 g sacharozy (43,3 mM) i 5 g sorbitolu (54,9 mM) w PBS, aby przygotować 500 ml.
3. Pożywki L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondin i Noggin): Uzupełnij Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium / Ham's F-12 (DMEM / F12) (780 ml) z 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (200 ml), 1x dostępnym w handlu suplementem glutaminy (10 ml), 100 U/ml penicyliny i 100 g / ml streptomycyny (10 ml) i sterylizuj filtrem z filtrem 0,22 μm.
   1. Pobierz komórki L-WRN przez ATCC, hoduj w kolbach T175 i wybierz przy użyciu Geneticin i Hygromycyny. Nośnik jest wymieniany i zbierany przez 12 dni.
      UWAGA: Każda partia nośnika jest testowana pod kątem aktywności Wnt za pomocą testu TOPflash Wnt Reporter. W tym przypadku zastosowano protokoły Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory (https://www.umichttml.org/protocols). Linia komórkowa TOPflash HEK 293 jest hodowana do zbiegu w kolbie T75, trypsynizowana i powlekana na 96-dołkowej płytce. Następnego dnia różne rozcieńczenia zebranej pożywki dodaje się do komórek i inkubuje w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia komórki są poddawane lizie, a test lucyferazy świetlika jest wykonywany zgodnie z instrukcjami producenta. Test normalizuje się przy użyciu rekombinowanego Wnt-3A. Pożywkę dzieli się na podwielokrotności o objętości 25 ml w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i przechowuje w temperaturze -80 °C.
4. Pożywka bazowa: Dla 500 ml uzupełnij Advanced DMEM/F12 (448 ml) z 2x dostępnym w handlu suplementem glutaminy (10 ml), 20 mM HEPES (10 ml), 100 U/ml penicyliny i 100 g/ml streptomycyny (10 ml), 2 mM N-acetylo-L-cysteiny (2 ml), suplementem N2 (10 ml) i suplementem B27 (20 ml), sterylizuj filtrem z filtrem 0,22 μm. Podzielić pożywkę na 25 ml porcji w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
5. Kompletna pożywka LWRN: Połącz 25 ml pożywki LWRN z 25 ml pożywki bazowej i uzupełnij 200 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) (20 μl) i 2x roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym (1 ml). Przechowuj cały nośnik w temperaturze 4 °C.
6. Kolagen i Laminina: Rozpuść 5 mg proszku w 5 ml wysterylizowanego przez filtr 100 mM kwasu octowego (dodaj 60 μl bulionu kwasu octowego do 9,94 ml wody o czystości cząsteczkowej), aby uzyskać stężenie podstawowe 1 mg / ml. Obracać w temperaturze 4 °C przez 4 godziny i przygotować 100 μl porcji w probówkach o pojemności 0,2 ml. Zamrażać w temperaturze -20 °C. Laminina jest kupowana w stężeniu podstawowym 100 μg/ml.
7. Kompletne pożywki bez czynników wzrostu (CMGF-): Suplement Advanced DMEM/F12 (500 ml) z 1x dostępnym w handlu suplementem glutaminy (5 ml), 10 mM HEPES (5 ml), 100 U/ml penicyliny i 100 g/ml streptomycyny (5 ml).
8. Pożywki różnicujące: Do 9,2 ml pożywki CMGF- dodaj 200 μl suplementu B27, 100 μl suplementu N2, 20 μl N-acetylo-L-cysteiny, 500 μl pożywki Noggin media¹² (wykonanej z komórek produkujących Noggin) i 2 μl EGF, aby uzyskać 10 ml pożywki różnicującej.

2. Przygotowanie płytek, szkiełek komorowych i wkładek do błon do hodowli komórkowych

1. Powlekanie 48-dołkowych płytek i szkiełek komorowych do powlekania monowarstwy 2D: Użyć roztworu powlekającego, który zawiera lamininę (rozcieńczenie 1:40, patrz tabela materiałów) i kolagen (rozcieńczenie 1:30) w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco, z Ca²⁺ i Mg²⁺ (DPBS). Dodać 200 μl roztworu powlekającego do każdej studzienki i wstępnie inkubować szkiełko płytkowo-komorowe w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny.
2. Powlekanie wkładek błony do hodowli komórkowej 0,4 μm: Rozcieńczyć kolagen w wodzie molekularnej w stosunku 1:30 i dodać 200 μl do każdej wkładki. Przechowywać płytkę zawierającą wkładkę membranową na lodzie w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Po 30 minutach inkubacji przechowywać płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 1,5-2 godziny. Wkładki membranowe z poliestru i poliwęglanu dają porównywalne rezultaty.
   UWAGA: Każdą płytkę do hodowli tkankowej można wysiać (można wykonać skalowanie w górę i w dół) przy użyciu tego protokołu, dostosowując objętość kolagenu/lamininy, aby uzyskać pełne pokrycie powierzchni posiewu.

3. Izolacja krypty

UWAGA: Przed rozpoczęciem sekcji, przygotuj płytkę/wkładki membranowe/szkiełko komorowe pokryte kolagenem i/lub lamininą i pozostaw je w inkubatorze o stężeniu 5%_CO2 w temperaturze 37 °C. Przygotuj czysty stół warsztatowy i sterylne narzędzia chirurgiczne odpowiednie do operacji, a także komorę bezpieczeństwa biologicznego do hodowli monowarstw 2D. Upewnij się, że wszystkie inne standardowe urządzenia do hodowli jednowarstwowej 2D, takie jak nawilżany inkubator CO_{2 ,} wirówki stołowe (utrzymywane w temperaturze 4 °C), mikroskop i pipety (w tym pipety serologiczne) są gotowe.

1. Użyj myszy C57Bl/6 w wieku 8-12 tygodni. Eutanazja myszy przy użyciu zatwierdzonej metody eutanazji.
2. Spryskaj tusze myszy 70% roztworem etanolu (EtOH), aby oczyścić obszar sekcji i usunąć nadmiar EtOH za pomocą chusteczki papierowej.
   UWAGA: Upewnij się, że odczynniki izolujące krypty (takie jak PBS, 50 mM EDTA, bufor wstrząsowy) są utrzymywane w niskiej temperaturze. Odczynniki te można przygotować dzień wcześniej i można ich używać przez co najmniej 3 miesiące, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C. Należy również upewnić się, że kompletne media LWRN są przechowywane w kąpieli perełkowej/wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C do czasu użycia.
3. Za pomocą czystych nożyczek preparacyjnych i kleszczy wypreparuj okrężnicę od odbytnicy do jelita ślepego. Przytrzymaj koniec jelita grubego za pomocą kleszczy i bardzo delikatnie spłucz kał za pomocą lodowatego PBS w strzykawce o pojemności 10 ml, wyposażonej w rurkę do karmienia 20 G (Rysunek 1A). Uważaj, aby nie pęknąć okrężnicy.
   1. Usuń proksymalną okrężnicę. Będzie to część jelita grubego najbliżej połączenia krętniczo-kątniczego.
4. Za pomocą kleszczyków delikatnie wsuń dystalną okrężnicę na rurkę do karmienia 20 G, wiążąc okrężnicę na końcu rurki za końcówkę jedwabną nicią do szwów 4-0 (Rysunek 1B).
5. Odwróć okrężnicę na lewą stronę, używając palców nad zawiązanym końcem i zawiąż drugi koniec jedwabną nicią do szwów 4-0. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij okrężnicę poniżej końcówki rurki do karmienia (Rysunek 1C,D,E).
6. Używając tłoka strzykawki powtórzonej o pojemności 1,25 ml, delikatnie otwórz odwiązany koniec wklęsłej okrężnicy na końcówkę strzykawki powtórzonej o pojemności 1,25 ml. Wsuń odwróconą okrężnicę na koniec strzykawki i mocno zawiąż jedwabną nicią 4-0 (Rysunek 1F, G).
7. Włożyć tłok do strzykawki i napompować okrężnicę, aby uformować kiełbasę. Napompuj, aż kiełbasa z jelita grubego będzie wyglądać na surową bez widocznych zmarszczek (Rysunek 1H).
8. Umieść strzykawkę/okrężnicę w probówce o pojemności 15 ml z 5 ml roztworu do odzyskiwania komórek na lodzie na 20 minut, napompuj i opróżnij okrężnicę raz na 5 minut (Rysunek 1I). Kiełbasa musi pozostać napompowana podczas inkubacji.
9. Zwiąż za pomocą jedwabnej nici do szwów 4-0 poniżej końcówki strzykawki z napompowaną okrężnicą. Odetnij kiełbasę z kolejnej strzykawki i umieść w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 50 mM (2 mM dla jelita cienkiego) EDTA na 40 minut i obracaj w temperaturze 4 °C (Rysunek 1J,K).
10. Zdekantować roztwór EDTA i zastąpić go 5 ml buforu do wstrząsania. Potrząsaj kiełbasą ręcznie w pozycji pionowej (energicznie) przez 2 minuty.
11. Przelać roztwór do wytrząsania do nowej probówki o pojemności 15 ml i powtórzyć etap wytrząsania, aby uzyskać łącznie 10 ml krypt w buforze do wytrząsania.
12. Pobrać 20 μl zawiesiny krypty na szalkę Petriego i policzyć liczbę krypt pod mikroskopem. Obliczyć stężenie krypty w kryptach/μl. W zależności od stężenia, próbki rozcieńczyć tak, aby uzyskać 5 krypt/μl w momencie powlekania (1000 krypt/cm²).
13. Wirować probówkę z izolowanymi kryptami za pomocą wirówki stołowej o sile 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
14. W międzyczasie wyjmij z inkubatora 48-dołkową płytkę/wkładkę/szkiełko komorowe i umieść je w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zassać roztwór powlekający za pomocą P200 i pozostawić płytkę z lekko przesuniętą pokrywką, aż komórki będą gotowe do powlekania.

4. Monowarstwa 2D

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowy protokół generowania monowarstw nabłonka jelitowego z kolonoidów 3D, sprawdź protokoły laboratoriów Estes i Kovbasnjuk (^7,11).

1. Usunąć bufor do wytrząsania za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Upewnij się, że pelety są nienaruszone i mogą użyć P1000 do usunięcia resztek płynu. Ponownie zawiesić osad w 3 ml kompletnego podłoża LWRN i pipetować w górę iw dół za pomocą P1000. Dodać 200 μl krypt do każdej studzienki wstępnie pokrytej 48-dołkowej płytki/szkiełka komorowego i inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
2. Następnego dnia zassaj pożywkę za pomocą P200 i dodaj nową pożywkę. Komórki zlewają się w ciągu 24-48 godzin.
3. W przypadku wstawek błonowych do hodowli komórkowych dodać 200 μl krypt (5 krypt/μl) do górnej części wkładek i 600 μl kompletnej pożywki L-WRN do dolnej części. Następnego dnia odessać pożywkę za pomocą P200 i dodawać świeżą pożywkę tylko do górnej komory. Inkubować płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C. Przeznabłonkowy opór elektryczny (TEER) mierzy się codziennie za pomocą nabłonkowego miernika napięcia / oma (EVOM).
   UWAGA: Jeśli kultura ma odczyt TEER większy niż 300 Ω.cm², uważa się, że są one zlewane. Konfluencję osiąga się w ciągu 3-4 dni. Zmieniaj nośniki co 2 dni.

Wyniki

Aby zilustrować wiarygodność jednowarstwowych kultur pierwotnego nabłonka jelita grubego, pokazano podsumowanie izolacji krypty i reprezentatywne obrazy pochodzące z protokołu. Użytkownik musi mieć na uwadze, że izolowane krypty są hodowane w sterylnych warunkach, dlatego prawidłowe wypreparowanie i oczyszczenie jelita grubego jest priorytetem. Rysunek 1 przedstawia kluczowe kroki podczas izolacji krypty. Izolowane krypty (Rysunek 2A) są teraz zliczane i skoncentrowane (Rysunek 2B) w celu uzyskania stężenia 5 krypt/μL. Po skoncentrowanym przygotowaniu krypt, komórki zostaną posiane w pożądanym formacie (naczynie hodowlane, wkładki membranowe lub szkiełka komorowe) i inkubowane z odpowiednimi pożywkami w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Rysunek 3 pokazuje postęp kultur po 24 i 48 godzinach hodowli na płytkach 48-dołkowych. Komórki są inkubowane aż do osiągnięcia pożądanego zbiegu. Aby zilustrować możliwe zastosowania tej metody, pozwoliliśmy 48-dołkowym studzienkom płytkowym osiągnąć konfluencję i przystąpiliśmy do przeprowadzenia testu ran drapanych. Rysunek 4 przedstawia świeżo utworzoną rysę (Rysunek 4A) w monowarstwie kolonoidu 2D i tę samą ranę 24 godziny po (Rysunek 4B). Oczywiste jest, że kultura jest nadal zdrowa i żywotna, a rany się goją. Aby wygenerować zróżnicowane monowarstwy, media są zmieniane z LWRN na media różnicujące. Różnicowanie uzyskuje się poprzez wykazanie wysokich wartości TEER (Figura 5A), spadek markerów ISC ((bogaty w leucynę receptor 5 sprzężony z białkiem G zawierającym powtórzenia 5 (Lgr5) i Achaete-scute like 2 (Ascl2)) oraz wzrost markerów różnicowania ((aminopeptydaza alanylowa (Anpep), mucyna 2 (Muc2), lizozym 1 (Lyz1), izomaltaza sacharozy (Sis) i chrmogranina A (Chga)) (Rysunek 5B,C) metodą PCR. Inne znaczniki, takie jak CDX2 i KRT20, mogą być również zawarte w tym panelu. Oprócz poziomów ekspresji mRNA, pojawienie się podtypów zróżnicowanych komórek nabłonkowych w kolonoidach 2D hodowanych w warunkach różnicowania wykazuje również immunofluorescencja (Muc2 i Chga; Rysunek 5D).

Rysunek 1: Przygotowanie próbki do generowania zdrowych monowarstw. Przygotowanie próbki ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia zdrowych monowarstw. Kluczowe etapy procesu izolacji są przedstawione na tym rysunku, aby ułatwić czytelnikowi. Okrężnica jest wycinana z myszy, upewniając się, że nie ma resztek sierści. Ostrożnie usuń kał, upewniając się, że nie przebijesz okrężnicy; Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ okrężnica musi być w stanie zatrzymać powietrze i być napompowana i opróżniona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Liczba i stężenie izolacji krypty. (A) Krypty okrężnicy po potrząśnięciu kiełbasami z jelita grubego. Obraz przedstawia pole kropli o wielkości 20 μl. (B) Koncentracja krypt w celu uzyskania 5 krypt/μL. Podziałka: 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Pierwotny wzrost monowarstwy IEC. (A) Monowarstwy 2D IEC po 24 godzinach powlekania i usuwania resztek komórek. (B) Zlewające się monowarstwy 2D IEC 48 godzin po posiewaniu. Podziałka skali: 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Testy ran na zadrapaniach przy użyciu mysiego pierwotnego IEC. Obrazy przedstawiające gojenie się ran po zadrapaniu wykonano w monowarstwie nabłonka jelita grubego. Podziałka skali: 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Różnicowanie monowarstw nabłonka jelita grubego. (A) Podłoże różnicujące tworzy szczelne bariery nabłonkowe, jak wykazano za pomocą TEER. Pożywki różnicujące powodują spadek ekspresji mRNA markerów komórek macierzystych (B) i regulację w górę markerów różnicowania (C). (D) Markery wyspecjalizowanych zróżnicowanych komórek nabłonkowych, takich jak Muc2 i Chromogranina-A, można również wykryć za pomocą immunofluorescencji bezpośrednich kolonoidów 2D. Podziałka skali: 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Nasz protokół zapewnia szybką, powtarzalną i niezawodną metodę generowania bezpośrednich pierwotnych monowarstw 2D IEC. Jedną z głównych różnic w naszym protokole w porównaniu z wcześniej opublikowanymi protokołami generowania monowarstw nabłonka jelita grubego jest to, że nie tniemy okrężnicy na małe kawałki, aby uwolnić krypty. Zamiast tego dostosowaliśmy protokół oddzielania nabłonka jelitowego od mezenchymy¹³ poprzez połączenie sił chemicznych i mechanicznych, aby uwolnić krypty w wyjątkowo czystym preparacie (ryc. 2), zapewniając badaczowi idealny materiał do wytworzenia kultur pierwotnych. Nasza metoda izolacji może być również wykorzystana do generowania enteroidów 3D i okrężnic. Ważne jest, aby zliczać krypty za każdym razem, gdy przeprowadzany jest eksperyment, aby znormalizować liczbę krypt, które są platerowane. Zmienne takie jak turgor kiełbasy jelita grubego, szybkość izolacji, wiedza użytkownika mogą wpływać na liczbę izolowanych krypt. Sugerowana koncentracja krypty poszycia wymieniona w protokole jest punktem wyjścia, ale każdy użytkownik, który ma uwzględnić zmienne sterowane przez użytkownika, musi ją zoptymalizować. Zastosowaliśmy tę technikę z samcami i samicami myszy WT w okresie od 8 do 20 tygodni i nie zaobserwowaliśmy większych różnic w przeżywalności komórek, teoretycznie krypty odizolowane od młodszych myszy mają większe szanse na przeżycie. Krypty są pokryte w nadmiarze, ponieważ tylko niewielki procent z nich przyczepia się do powierzchni i przetrwa. Celem jest równowaga, w której jest wystarczająco dużo krypt, aby mieć 50% konfluencji jednego dnia po poszyciu, ale nie za dużo krypt, w których umierające krypty będą miały efekt cytotoksyczny. Pożywki LWRN należy ostrożnie usunąć 24 godziny po poszyciu, aby wyeliminować martwe krypty i zanieczyszczenia, należy to zrobić ostrożnie, aby uniknąć oderwania komórek, które już rosną jako monowarstwa.

Po wstępnym usunięciu pożywki LWRN użytkownik musi zdecydować, czy warunki eksperymentalne wymagają pierwotnych monowarstw IEC, które pozostają bliżej komórek macierzystych i dodania świeżych pożywek LWRN, czy też pożądane jest różnicowanie monowarstwy, zastąpienia pożywką różnicującą. Najważniejszym czynnikiem w tym protokole jest zapewnienie integralności jelita grubego podczas procesu izolacji. Jeśli dojdzie do pęknięcia, kiełbasę można skrócić, aby wyeliminować uszkodzony obszar. Przed włożeniem kiełbasy do EDTA upewnij się, że węzły są tak ciasne, jak to możliwe. Jeśli kiełbasa zostanie opróżniona po inkubacji EDTA, protokół może być kontynuowany z niewielkim lub żadnym wpływem na ogólną wydajność krypty. Jeśli powtórzenie strzykawki nie jest dostępne, do procesu napełniania i opróżniania można również użyć zwykłej końcówki do mikropipety dołączonej do zwykłej strzykawki. Ponadto, jeśli nie jest dostępny żaden roztwór do odzyskiwania komórek, etapy inflacji i deflacji można przeprowadzić w EDTA (2 mM jelito cienkie, 50 mM okrężnicy), ale ta substytucja nie jest zalecana. Jeśli zbieg nie jest wymagany, krypty mogą rosnąć na płytkach pokrytych tylko kolagenem, a nawet na płytkach niepowlekanych. Używaj tylko niepowlekanych pojemników na płytki, nie ma innej opcji, ale komórki nie będą rosły zdrowo, tak jak w płytkach pokrytych kolagenem. Jeśli chodzi o zdrowie i stabilność hodowli, monowarstwy platerowane tworzywem sztucznym są zdrowe przez 4 do 5 dni, podczas gdy monowarstwy platerowane w transwellach mogą być noszone do 8 dni.

Jednym z głównych ograniczeń tej metody jest pożywka komórkowa wymagana do wzrostu monowarstw nabłonka jelita grubego. Ogniwa LWRN są dostępne w ATCC, ale generowanie pożywek kondycjonowanych LWRN jest pracochłonne i wymaga dostępu do spektrometru fluorescencyjnego w celu określenia aktywności Wnt. Podłoża różnicujące wymagają pewnej liczby odczynników, które są dodawane na świeżo przed użyciem, co sprawia, że jest to żmudny proces. Wreszcie, większość z tych odczynników jest kosztowna i łatwo jest je spalić w szybkim tempie. Jeśli laboratorium chce ustalić tę technikę bez wcześniejszej hodowli pierwotnych komórek jelitowych, zdecydowanie zaleca się znalezienie współpracownika/uczelni z doświadczeniem i przeszkolenie jednego z ich członków.

Utrzymanie hodowli 3D może być kosztowne ze względu na koszt podłoża z matrycą błony podstawnej i dużych ilości kondycjonowanych pożywek potrzebnych do hodowli organoidów, ale ma tę zaletę, że wykorzystuje się zmniejszoną liczbę myszy, a wygenerowane struktury mogą być wielokrotnie pasażowane. Enteroidy (pochodzące z jelita cienkiego) są stosunkowo łatwe do wyizolowania i utrzymania, podczas gdy kolonoidy są delikatniejsze, rosną w wolniejszym tempie i mają bardziej ograniczoną zdolność przejścia. Generowanie monowarstw z kolonoidów 3D wymaga nieproporcjonalnie dużej ilości struktur 3D, co sprawia, że tego rodzaju eksperymenty są czasochłonne i kosztowne. Wręcz przeciwnie, bezpośrednie przygotowanie monowarstwy nabłonka jelita grubego jest szybkie i jest szybkim sposobem na uzyskanie wyników. Jedno przygotowanie jelita grubego może wygenerować zlewający się obszar o długości 75 cm² (10 do 15 ml kondycjonowanej pożywki, wymienia się raz) 2 do 3 dni po posiewie (obszar ten wymagałby 144 dołków koloidów 3D, co oznacza prawie 6 ml Matrigel i ponad 250 ml kondycjonowanej pożywki). Mniejsze zużycie pożywki, niskie koszty utrzymania hodowli komórkowej oraz możliwość wykonywania testów funkcjonalnych i szybkie przetwarzanie to duże zalety monowarstw nabłonka jelita grubego.

Protokół ten jest cennym narzędziem w badaniach biologii komórek nabłonka jelitowego w obszarach takich jak adhezja komórek, polaryzacja i różnicowanie. Daje to przewagę w generowaniu pierwotnych kultur komórkowych z genetycznie zmodyfikowanych myszy (nokaut, nadekspresja, reportery). Pierwotne monowarstwy nabłonka jelitowego umożliwiają łatwy dostęp do powierzchni wierzchołkowej i podstawno-bocznej (po pokryciu na transwellach), umożliwiając badanie przepuszczalności, bariery i migracji przeznabłonkowej różnych typów komórek. Wreszcie, model ten może być przydatny w różnych dziedzinach, takich jak interakcje gospodarz-patogeny, uszkodzenia i naprawa nabłonka oraz odkrywanie leków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zaawansowany DMEM/F12	Gibco	12634-010
Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy	Suplement Corning	30-004CI
B27 (50X)	Gibco	12587-010
Roztwór do odzyskiwania komórek	Corning	354253
Kolagen z ludzkiego łożyska (typ IV)	Sigma-Aldrich	C5533
D-Sorbitol	Sigma	85529-250G
D-Sacharoza	Fisher Scientific	BP220-1
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami, z Ca2+ i Mg2+ (DPBS)	Corning	21-030-CV
Nabłonkowy woltomierz/omomierz	World Precision Instruments	0-10KΩ z STX2 (EVOM2)
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Lonza	51201
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Corning	35-016-CV
Test lucyferazy świetlika	Biotium	30085-2
Geneticin	Gibco	10131-035
GlutaMAX (100X)	Gibco	35050-061
HEPES (1M)	Corning	25060CI
Ludzki rekombinowany EGF	R& Systemy D	236-EG	Stężenie zapasów: 500&mikro; g / mL
Ludzki rekombinowany Wnt-3A	R& Systemy D	W3a-H-005
Hygromycyna B	Invitrogen	10687010
ogniwa LWRN	ATCC	CRL-3276
Woda klasy molekularnej	Suplement Corning	46-000-CV
N2 (100X)	Gibco	17502-048
N-acetylo-L-cysteina	Sigma-Aldrich	A9165-5G	Stężenie zapasów: 500mM
Noggin	Kondycjonowane	media-Nunc
Lab-Tek System prowadnic komorowych	Sigma-Aldrich	C7182-1PAK
Pencillin-Streptomycyna (10 000U / ml)	Corning	30002CI
Buforowana sól fizjologiczna Phospahte, Ca2+ i Mg2+ free (PBS)	Corning	21-040-CV
Plastikowa rurka zasilająca 20G	Fisher Scientific	50-810-46
rh-laminin-521	Gibco	A29248	Stężenie zapasów: 100&mikro; g / mL
Roboz Surgical 4-0 Jedwabny pleciony 100YD	Fisher Scientific	NC9452680
TOPflash HEK293 ogniwa	ATCC	CRL-3249
Transwell Przepuszczalne podpory (0,4 i mikro; m)	Corning	3470