Celem tego protokołu jest wykorzystanie obrazowania na żywo do wizualizacji wpływu uszkodzeń oksydacyjnych na lokalizację i dynamikę struktur subkomórkowych w jajnikach Drosophila.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja wpływu uszkodzeń oksydacyjnych na komory jajowe Drosophila za pomocą obrazowania na żywo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie na żywo jajników Drosophila melanogaster odegrało kluczową rolę w zrozumieniu różnych podstawowych procesów komórkowych podczas rozwoju, w tym ruchu cząsteczek rybonukleoproteiny, lokalizacji mRNA, ruchu organelli i dynamiki cytoszkieletu. Istnieje kilka metod obrazowania na żywo, które zostały opracowane. Ze względu na fakt, że każda metoda polega na wypreparowaniu pojedynczych jajników umieszczonych w pożywce lub oleju halowęglowym, uszkodzenie komórek spowodowane niedotlenieniem i/lub manipulacją fizyczną nieuchronnie nastąpi z czasem. Jednym z dalszych skutków niedotlenienia jest zwiększenie uszkodzeń oksydacyjnych w komórkach. Celem tego protokołu jest wykorzystanie obrazowania na żywo do wizualizacji wpływu uszkodzenia oksydacyjnego na lokalizację i dynamikę struktur subkomórkowych w jajnikach Drosophila po indukcji kontrolowanego uszkodzenia komórek. Tutaj używamy nadtlenku wodoru do wywołania komórkowego uszkodzenia oksydacyjnego i podajemy przykłady wpływu takiego uszkodzenia na dwie struktury subkomórkowe, mitochondria i cząsteczki błogości Clu. Jednak ta metoda ma zastosowanie do każdej struktury subkomórkowej. Ograniczenia polegają na tym, że nadtlenek wodoru może być dodawany tylko do środowisk wodnych i nie będzie działał w przypadku obrazowania z użyciem oleju halowęglowego. Zaletą jest to, że nadtlenek wodoru jest łatwo dostępny i niedrogi, działa szybko, jego stężenie można modulować, a uszkodzenie oksydacyjne jest dobrym przybliżeniem uszkodzeń spowodowanych niedotlenieniem, a także ogólnego uszkodzenia tkanek w wyniku manipulacji.
Wprowadzenie
Podczas eksperymentalnej hodowli i manipulacji tkankami ex vivo może powstać wiele różnych stresorów komórkowych, w tym szok cieplny, stres oksydacyjny, stres osmotyczny, stres żywieniowy i warunki toksyczności. Obrazowanie na żywo to potężne narzędzie służące do wizualizacji zmian w tkankach ex vivo w czasie rzeczywistym po eksperymentalnym leczeniu i manipulacji. Drobne sekcje tkanek i manipulacje wymagają praktyki, a czas od sekcji do obrazowania może się różnić w zależności od doświadczenia. Uzasadnienie opracowania tej metody opiera się na obawie, że przygotowanie tkanki do obrazowania na żywo może powodować stres komórkowy podczas sekcji i przygotowania obrazowania. Może to być szczególnie problematyczne w przypadku procesów wrażliwych na zmiany w metabolizmie komórkowym i dostępnym poziomie tlenu, takich jak funkcja mitochondriów. Chociaż posiadanie równoległej próbki typu dzikiego jest ważną kontrolą, nadal istnieje możliwość, że niektóre lub wszystkie zaobserwowane zmiany w strukturach subkomórkowych mogą być spowodowane uszkodzeniem lub stresem komórkowym spowodowanym rozwarstwieniem i nie odzwierciedlają normalnej fizjologii lub badanego leczenia lub mutacji.
Aby rozwiązać ten potencjalny problem, używamy dodatku nadtlenku wodoru podczas obrazowania na żywo w celu wywołania komórkowego uszkodzenia oksydacyjnego1. Celem tej metody jest wywołanie uszkodzenia tkanek w celu monitorowania wpływu na struktury subkomórkowe. Protokół ten jest przydatny do dwóch celów: 1) określenia, czy zmiany w subkomórkowej lokalizacji struktury będącej przedmiotem zainteresowania są spowodowane stresem spowodowanym przez niedoświadczoną sekcję oraz 2) gdy badacz ma pewność co do opisanych technik preparacji w celu monitorowania wpływu kontrolowanego stresu na strukturę zainteresowania. Tutaj pokazujemy dwa przykłady tego, jak zwiększone uszkodzenia oksydacyjne powodują zmiany w dwóch strukturach subkomórkowych, mitochondriach i cząsteczkach błogości Clu. W tym celu używamy jajnika Drosophila, który jest powszechnym modelem do badań obrazowych na żywo. Pierwszy przykład bada lokalizację mitochondriów. Z naszego doświadczenia wynika, że normalna lokalizacja mitochondriów w żeńskich komórkach rozrodczych jest bardzo wrażliwa na zaburzenia i może działać jako zwiastun stresu komórkowego. Mitochondria żeńskich komórek rozrodczych Drosophila są zwykle równomiernie rozproszone w cytoplazmie2. Dodatek nadtlenku wodoru powoduje szybką błędną lokalizację organelli i grupowanie się w podobny sposób jak w przypadku różnych mutacji3,4,5. Drugim przykładem są cząstki błogości utworzone przez Clueless (Clu). Clu jest rybonukleoproteiną, która jest rozproszona w cytoplazmie; Jednak w optymalnych warunkach komórkowych tworzy również cząstki związane z mitochondriami5. Ponieważ obecność cząsteczek Clu zależy od zdrowych warunków komórkowych, nazwaliśmy je cząstkami "błogości"3,5,6. Dodatek nadtlenku wodoru powoduje, że cząstki te szybko rozpraszają się i stają się jednorodne w cytoplasm5. W toku naszych badań zaobserwowaliśmy zmiany w lokalizacji obu tych struktur subkomórkowych, ale dopiero po wykonaniu badań obrazowych na żywo mogliśmy w pełni docenić wpływ stresu komórkowego i uszkodzeń oksydacyjnych na lokalizację i dynamikę mitochondriów i cząstek błogości.
Użyteczność tego protokołu jako dodatku do już istniejących lub alternatywnych metod zależy od kilku czynników. Po pierwsze, protokół obrazowania musi być podatny na dodawanie leków. Jeśli próbka jest zamontowana pod szkiełkiem nakrywkowym i w oleju halowęglowym, ta metoda nie byłaby możliwa7. Dodatek H2O2 powoduje szybki wzrost uszkodzeń oksydacyjnych, dlatego ta skala czasowa może nie być odpowiednia. Uszkodzenie oksydacyjne może być uważane za wskaźnik hipoksji; Jednak może być zbyt ostry lub zbyt uogólniony, aby działać jako odpowiednia kontrola uszkodzeń niektórych składników subkomórkowych. Wreszcie, w przypadku eksperymentów obrazowych, które trwają kilka godzin, takich jak te następujące po procesie rozwojowym, dodawanie H2O2 może być zbyt silne (na przykład8). Badanie krzywej stężeń może przezwyciężyć to ograniczenie.
Protokół
1. Przygotowanie mediów preparacyjnych i obrazowych
UWAGA: Pożywka najlepiej nadająca się do tego eksperymentu na żywo zawiera pożywkę Drosophila Schneidera zawierającą 15% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 0,6x Pen-Strep i 200 μg/ml insuliny bydlęcej, zwanej dalej pożywką Complete Schneidera.
- Przygotowanie podłoża należy przeprowadzić w sterylnych warunkach, aby upewnić się, że nie zostanie ono zanieczyszczone. Pożywka została opracowana z myślą o wspieraniu Drosophila ovarioles przez dłuższy czas9.
- Do pożywki Schneidera dodać 15% inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą, 0,6 x Pen-Strep i 200 μg/ml insuliny bydlęcej.
- Dobrze wymieszać zawartość i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
UWAGA: Insulina nie rozpuszcza się całkowicie w pożywce Complete Schneider i można zauważyć osad osadzający się na dnie probówki. - Zrób porcje pożywki, upewniając się, że pozostawiłeś osad, ponieważ będzie to przeszkadzać w obrazowaniu.
UWAGA: Roztwór ten może być zużyty w ciągu jednego miesiąca, jeżeli jest przechowywany w porcjach w temperaturze 4 °C.
2. Kolekcja Drosophila do sekcji
UWAGA: Szczegółowe procedury zbierania i sekcji Drosophila można również znaleźć w Weil et al.10 i Parker et al.11.
- Aby uzyskać optymalne obrazowanie żeńskich komórek rozrodczych, najpierw przygotuj fiolkę zawierającą standardowy pokarm dla much z mąki kukurydzianej i odrobinę mokrej pasty drożdżowej o konsystencji masła orzechowego. Dzięki temu samice much są dobrze odżywione i wytwarzają wszystkie etapy rozwoju mieszków włosowych do obrazowania.
- Aby uzyskać optymalnie zdrowe muchy, zbierz 0-1 jednodniowe samice i przenieś je z samcami do fiolki z pokarmem dla much zawierającej mokrą pastę drożdżową.
UWAGA: Upewnij się, że śpiące muchy nie stykają się z pastą drożdżową, ponieważ mogą się do niej przykleić. - Karm muchy 3-7 dni, codziennie zmieniając fiolkę i pastę drożdżową.
UWAGA: Upewnij się, że pasta drożdżowa styka się z pokarmem na muchy, aby nie wyschł .
3. Rozwarstwienie jajników Drosophila
UWAGA: Ważne jest, aby przygotować roztwory pożywek na świeżo, ponieważ nadtlenek wodoru jest podatny na utlenianie, a TMRE ulega degradacji z czasem.
- Bezpośrednio przed rozbieraniem, w pożywkach Complete Schneidera, przygotować świeżą podwielokrotność roztworu 2 μM H2O2, świeżą podwielokrotność 46 nM tetrametylorodaminy, ester etylowy (TMRE) i świeżą podwielokrotność 46 nM roztworu TMRE zawierającego 2 μM H2O2.
- Do wypreparowania jajników użyj dwóch par cienkich kleszczyków i pary elektrolitycznie zaostrzonych igieł wolframowych12. Aby wypreparować jajniki, napełnij 2-3 dołki naczynia preparacyjnego ze szklanym dnem (szkiełko zegarkowe) Complete Schneider's, który został podgrzany do temperatury pokojowej.
- Znieczulić fiolkę utuczonych much dwutlenkiem węgla i posegregować pożądaną liczbę samic much do sekcji. Umieść pojedynczą muchę w podłożu za pomocą kleszczy.
- Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie chwyć muchę za klatkę piersiową za pomocą jednej pary cienkich kleszczy. Drugą parą kleszczy chwyć tył i delikatnie pociągnij, aby usunąć jajniki.
UWAGA: jeśli jajniki nie wyjdą gładko tą metodą, cały brzuch może być również usunięty z muchy, a jajniki można delikatnie wycisnąć z obu końców brzucha za pomocą kleszczy. - Usuń wszelkie obce naskórki lub tkanki, a następnie przenieś jajniki do nowej studzienki zawierającej świeżą pożywkę. Jajniki powinny nadal poruszać się od otaczającej osłonki mięśniowej.
4. Przygotowanie jajników do obrazowania
- Używając zaostrzonych igieł wolframowych, delikatnie rozsuń jajniki, uważając, aby usunąć otaczającą je osłonkę mięśniową (Rysunek 1).
- Delikatnie usuń osłonkę mięśniową i włókna nerwowe przyczepione do izolowanych jajników (Rysunek 2).
UWAGA: Jeśli osłonka mięśniowa nie zostanie usunięta, jajnik będzie drgał i poruszał się, powodując problemy z akwizycją obrazu (Wideo 1). - Jeśli interesujące struktury subkomórkowe są znakowane endogennie, przejdź do kroku 4.4. Jeśli interesujące nas struktury zostaną oznaczone barwnikiem fluorescencyjnym, przejdź do sekcji 5.
- Po dokładnym wycięciu jajników za pomocą mikropipety przenieś je w kropli o objętości 100 μl pożywki do obrazowania Complete Schneider do szklanego wgłębienia naczynia ze szklanym dnem. Poszczególne jajniki opadną na dno kropli.
- Przejdź do sekcji 6 dotyczącej obrazowania.
UWAGA: W przypadku obrazowania mitochondriów i cząstek błogości Clu nie powinno upłynąć więcej niż pięć-dziesięć minut od rozpoczęcia sekcji do obrazowania.
5. Barwienie mitochondriów za pomocą TMRE
UWAGA: Dodatkowe szczegółowe procedury barwienia mitochondriów na żywo barwnikami fluorescencyjnymi można znaleźć w Parker et al. 2017.
- Po kroku 4.3 przenieść wyizolowane jajniki w kropli 100 μl pożywki TMRE o stężeniu 46 nM do szklanego wgłębienia naczynia ze szklanym dnem. Poszczególne jajniki opadną na dno kropli.
- Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Umieść pokrywkę na naczyniu ze szklanym dnem i umieść naczynie w przykrytym pudełku na czas eksperymentu, aby chronić je przed światłem.
UWAGA: Po inkubacji próbki można obrazować bezpośrednio, bez konieczności mycia. - Powtórzyć kroki 5.1-5.2, aby przygotować co najmniej dwie potrawy z jajników znakowanych TMRE, jedną służącą jako grupa doświadczalna, a drugą jako kontrolną.
6. Akwizycja obrazu na żywo
- Po zamontowaniu jajników umieść jedną z naczyń ze szklanym dnem na mikroskopie i skonfiguruj parametry obrazowania zgodnie z potrzebami. Optymalne długości fal wzbudzenia/emisji dla zastosowanego tutaj TMRE wynoszą 549 nm/574 nm.
- Po zlokalizowaniu żądanego pola widzenia uzyskaj nieruchome obrazy lub krótkie filmy przedstawiające jeden lub więcej jajników zgodnie z potrzebami, jako zapis warunków przed leczeniem.
7. Dodawanie nadtlenku wodoru podczas obrazowania
- Wstrzymaj obrazowanie na żywo, zdejmij pokrywkę z naczynia ze szklanym dnem i ostrożnie dodaj 100 μl roztworu 2 μM H2O2 do naczynia za pomocą mikropipety, jeśli obrazujesz struktury znakowane endogennie. W przypadku obrazowania mitochondriów ostrożnie dodaj 100 μl 46 nM TMRE z 2 μM H2O2 roztworem do naczynia za pomocą mikropipety (Wideo 2).
- Należy unikać rozbijania powierzchni istniejącej kropli pożywki lub zbyt szybkiego dodawania roztworu, aby nie przemieścić jajników spoczywających na dnie naczynia (Wideo 2).
- Załóż pokrywę naczynia (pokrywę naczynia), w razie potrzeby przenieś i ponownie ustaw ostrość żądanego pola widzenia, a następnie wznów obrazowanie (Wideo 3, Wideo 4, Rysunek 3, Rysunek 4).
- Należy zadbać o jak najszybsze wznowienie obrazowania po dodaniuH2O2, ponieważ leczenie eksperymentalne jest wrażliwe na czas (Wideo 5).
- Zdobądź nieruchome zdjęcia lub krótkie filmy przedstawiające jeden lub więcej jajników zgodnie z potrzebami. Będzie to służył jako zapis warunków pozabiegowych.
- W celu kontroli umieść drugą szklaną dolną miskę na mikroskopie i powtórz sekcję 6.
- Powtórz krok 7.1, tym razem dodając do naczynia 100 μl pożywki zawierającej tylko TMRE. W przypadku obrazowania struktur znakowanych endogennie należy dodać 100 μl kompletnego roztworu Schneidera zawierającego tylko podłoże.
- Powtórz kroki 7.2 i 7.3, aby uzyskać dane dla grupy kontrolnej.
UWAGA: W przypadku obrazowania mitochondriów i cząstek błogości Clu nie powinno upłynąć więcej niż trzy-pięć minut od dodania nadtlenku wodoru do obrazowania.
Wyniki
Opisane protokoły mogą być wykorzystane do badania efektów działania nadtlenku wodoru podczas obrazowania na żywo jajników Drosophila. Jak pokazano na Rysunku 3, Rysunku 4, Wideo 3 i Wideo 4, procedura ta stanowi skuteczny sposób wizualizacji zmian i dynamiki tkankowej w czasie rzeczywistym po poddaniu próbki działaniu czynnika eksperymentalnego. Co istotne, protokół ten jest specyficzny dla dodawania H2O2 do owarioli podczas obrazowania; może on jednak zostać zaadaptowany do egzogennego dodawania innych interesujących leków lub odczynników. Ponadto, przed obrazowaniem (Wideo 3) mieszyki można znakować dowolnymi odpowiednimi barwnikami fluorescencyjnymi (np. tetrametylorodaminą (TMRE), LysoTrackerem). Najbardziej krytycznymi krokami w celu uzyskania wyraźnych wyników obrazowania są: 1) prawidłowa dysekcja i izolacja pojedynczych owarioli z usunięciem wszystkich elementów kurczliwych (Rysunek 1 i Rysunek 2) oraz 2) szybkość wznowienia obrazowania po dodaniu nadtlenku wodoru. Video 4 stanowi ilustrację prawidłowo zdyssekowanego mieszyka, który pozostaje stabilny przez cały czas trwania obrazowania, w przeciwieństwie do Video 1, które przedstawia niedokładnie zdyssekowany mieszyk opuszczający pole widzenia podczas obrazowania. Video 5 jest przykładem, w którym efekty działania H2O2 na mitochondria znakowane TMRE postąpiły już przed rozpoczęciem obrazowania w wyniku zbyt długiego czasu oczekiwania. W porównaniu do Video 3, w którym obrazowanie wznowiono natychmiast po dodaniu nadtlenku wodoru (czas 0) i wciąż widoczne są nienaruszone, rozproszone mitochondria, mitochondria w Video 5 zaczęły już widocznie skupiać się i tracić potencjał błonowy w momencie wznowienia obrazowania. Problem ten wynika głównie z zaburzenia pozycji próbki podczas dodawania H2O2 i można go zminimalizować, stosując technikę pozwalającą na zachowanie nienaruszonego medium obrazującego i pozycji próbki (Video 2). Warto zauważyć, że w eksperymentach kontrolnych przeprowadzonych bez dodawania H2O2 do medium, mitochondria w mieszykach pozostają prawidłowo rozproszone, a barwnik TMRE pozostaje zsekwestrowany w mitochondriach.
Rycina 1: Izolacja pojedynczych owarioli z jajników Drosophila. (A) Schemat przedstawiający parę jajników, pojedynczy owariol (strzałka) z germarium na szczycie (grot strzałki) oraz dwie pochewki mięśniowe otaczające owariol (brązowa, nabłonkowa) i jajnik (brązowa, otrzewnowa). (B) Wypreparowany jajnik Drosophila. (C) Następna separacja rozdzielonego jajnika na poszczególne owariole (strzałka). Pasek skali = 100 um. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Usuwanie włókien nerwowych i elementów kurczliwych z pojedynczych owarioli. (A) Pojedynczy owariol z wciąż przytwierdzonymi pozostałościami tkanki nerwowej i pochewki mięśniowej (strzałka). (B) Delikatne usunięcie całej pozostałej tkanki przytwierdzonej do owariola z obrazu A (strzałka). Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: H2O2 powoduje błędną lokalizację mitochondriów. (A-A″) Klatki z obrazowania na żywo dobrze odżywionego pęcherzyka cluCA06604 (muchy Clu::GFP). Dodanie H2O2 powoduje agregację mitochondriów w czasie obrazowania. Barwienie mitochondriów TMRE wskazuje, że w czasie 0 mitochondria są początkowo rozproszone (A), a po dodaniu H2O2 zaczynają się agregować (A′). W późniejszym punkcie czasowym barwienie TMRE staje się punktowe z powodu utraty potencjału błonowego mitochondriów, a tym samym utraty zdolności do sekwestracji barwnika (A″). Biały = TMRE (A-A″). Paski skali: 10 µm w (A) dla A-A″5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4H2O2 rozprasza Clu. (A-A″) Klatki z obrazowania na żywo dobrze nakarmionego cluCA06604 mechatek. Dodanie H2O2 powoduje rozproszenie cząstek i ich homogenizację w cytoplazmie w czasie obrazowania. Biały = Clu::GFP (A-A″). Pasek skali: 40 µm w (A) dla A-A″5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Wideo 1: Mieszek z cluCA06604 samica. Jak opisano w Rycina 2, brak usunięcia elementów kurczliwych włókien nerwowych z pojedynczych owarioli spowoduje znaczny dryf i przemieszczanie się owarioli podczas obrazowania, a w konsekwencji uniemożliwi analizę danych obrazowych. Biały = Clu::GFP. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.
Wideo 2: Prawidłowe dodawanie H2O2 do naczynia z próbką. Nadtlenek wodoru należy dodać do naczynia z próbką, używając mikropipety o odpowiedniej pojemności. Dozowanie H2O2 bez naruszania powierzchni medium. Należy zadbać o to, aby nie przerwać powierzchni medium obrazującego, aby zminimalizować dryft próbki podczas dodawania nadtlenku wodoru. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.
Wideo 3: Dodanie H2O2 podczas obrazowania pęcherzyków znakowanych TMRE. Pęcherzyk z samicy cluCA06604 zabarwiony TMRE. H2O2 powoduje błędną lokalizację mitochondriów w pęcherzykach Drosophila. Kolor biały = barwnik TMRE. Obrazowanie przeprowadzono w tempie jednej klatki co 15 s przez 20 min, a wideo wyświetla 10 klatek na sekundę5. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.
Wideo 4: Dodatek H2O2 podczas obrazowania mieszyków Clu::GFP. Mieszyk od samicy cluCA06604 . H2O2 rozprasza cząsteczki Clu, zgodnie z opisem na Rysunku 4. Kolor biały = Clu::GFP. Obrazowanie odbywało się w tempie jednej klatki na 15 s przez 15 min, a wideo ma częstotliwość 10 klatek na sekundę.5 Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.
Wideo 5: Opóźnione obrazowanie po dodaniu H2O2. Mieszyczek od samicy cluCA06604 . Dodanie nadtlenku wodoru do mieszyczków jest zabiegiem wrażliwym na czas. W tym filmie wznowienie obrazowania zostało opóźnione w wyniku przemieszczenia próbki podczas dodawania H2O2. W momencie wznowienia obrazowania w czasie 0 (w porównaniu do czasu 0 w Wideo 3) mitochondria zaczęły już widocznie skupiać się i tracić potencjał błonowy. Brak szybkiego wznowienia obrazowania po zabiegu doprowadzi do uzyskania niedokładnych i bezużytecznych wyników, ponieważ wczesne efekty eksperymentalne zostaną pominięte przed rozpoczęciem obrazowania. Kolor biały = TMRE. Rejestrowano jedną klatkę co 15 s przez 20 min, a prędkość wideo wynosi 10 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.
Dyskusja
Protokół ten może być użytecznym dodatkiem jako kontrola artefaktów spowodowanych rozwarstwieniem jajników i inkubacją tkanek w każdym eksperymencie z obrazowaniem na żywo. Krytyczne kroki są podobne do tych, które można znaleźć w przypadku innych protokołów obrazowania na żywo. Nauczenie się, jak preparować całe jajniki Drosophila, wymaga praktyki; Jednak tej umiejętności można zwykle nauczyć się dość szybko za pomocą odpowiednich narzędzi preparacyjnych. Trudniejsze do opanowania jest usunięcie mięśnia otaczającego jajniki i każdą jajnik13. Należy to zrobić, aby skurcze mięśni nie przeszkadzały w pozyskiwaniu obrazu. Jeśli użycie do tego zaostrzonych igieł wolframowych nie okaże się skuteczne, germarium na końcu jajnika można chwycić kleszczami, a jajnik wyciągnąć z osłonki mięśniowej. Jednak ta technika jest problematyczna, jeśli ma być badane najwcześniejsze stadia rozwojowe, ponieważ mogą one ulec uszkodzeniu. Kolejnym kluczowym krokiem jest nieusuwanie jajników spoczywających na dnie naczynia podczas dodawaniaH2O2. Dodatkowym ważnym aspektem jest wspólne dla wszystkich obrazowań na żywo: badacz powinien upewnić się, że struktura będąca przedmiotem zainteresowania jest dobrze oznakowana fluorescencyjnie przed leczeniem. Użyte tu naczynia (Tabela Materiałów) są powszechnie używane do obrazowania na żywo; Jednak każde naczynie lub szkiełko ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym na dnie, a nawet dużym szklanym szkiełkiem nakrywkowym powinno działać tak długo, jak długo można zakryć kroplę nośnika, aby zapobiec parowaniu nośnika. Chociaż używamy konkretnego mikroskopu, każdy odwrócony mikroskop z obiektywem o wystarczającym powiększeniu, aby zobaczyć daną strukturę subkomórkową i dołączoną kamerą, która ma wystarczającą rozdzielczość i szybkość przechwytywania obrazu, powinien działać.
Chociaż nasze laboratorium jest przede wszystkim zainteresowane funkcją mitochondriów, ta metoda może być pomocna w badaniu dynamiki i lokalizacji dowolnej struktury subkomórkowej lub organelli, takiej jak jądro, cytoszkielet lub retikulum endoplazmatyczne. Ta metoda ma jednak ograniczenia. Aby dodać nadtlenek wodoru, tkanka musi znajdować się w środowisku wodnym. Alternatywną metodą obrazowania na żywo jest użycie oleju halowęglowego, który odegrał zasadniczą rolę w opisie wielu ważnych procesów zachodzących u jajników Drosophila, w tym pierwszego przykładu dynamicznego ruchu GFP w organizmie modelowym 7,14. Ponadto dodanie nadtlenku wodoru do pożywki powoduje rozległe uszkodzenia oksydacyjne, które mogą być zbyt ogólnym zniewagą dla tkanki, aby mogły być informacyjne dla interesującego procesu komórkowego, szczególnie w przypadku dłuższych eksperymentów badających rozwój. Chociaż przeprowadzenie eksperymentów, które wymagają wizualizacji komórki przez długi czas, może nie być wykonalne ze względu na to szybkie, rozległe i prawdopodobnie nieodwracalne uszkodzenie oksydacyjne, widzieliśmy, że ostre leczenie nadtlenkiem wodoru, które opisaliśmy, ma zastosowanie do większości etapów oogenezy, ponieważ jesteśmy w stanie zobaczyć te same efekty na większości etapów w okresie obrazowania. Biorąc pod uwagę niski koszt i łatwość protokołu, może on być przydatną kontrolą uszkodzeń i może być również stosowany jako leczenie przed utrwaleniem i znakowaniem przeciwciał.
W naszych rękach leczenieH2O2 naśladuje zmiany w błędnej lokalizacji mitochondriów i dyspersji cząstek błogości Clu, które widzimy u różnych mutantów Drosophila. Naśladuje również wyniki, które obserwujemy u nowych badaczy w laboratorium, którzy uczą się technik preparacji. W związku z tym metoda ta wyraźnie ujawniła, że przygotowanie próbki i ogólny stres komórkowy mogą prowadzić do nieoczekiwanych i wcześniej niewyjaśnionych zmian w błędnej lokalizacji mitochondriów i obecności cząstek błogości. Rozwijając tę technikę, stężenia nadtlenku wodoru można modulować za pomocą wyższego lub niższego stężenia. Jeśli efekt komórkowy jest obserwowany przy użyciu niższego stężenia, możliwe jest, że fenotyp stresu może być odwracalny poprzez zastąpienie pożywki Complete Schneider's. Różne stresory komórkowe, takie jak cyjanek karbonylu, m-chlorofenylohydrazon (CCCP), arsenit lub zwykły szok cieplny, mogą okazać się przydatne w ogólnym stresie komórkowym dla innych struktur subkomórkowych. Ponieważ obrazowanie na żywo tkanek ex vivo wymaga ręcznej manipulacji i inkubacji w różnych pożywkach, ta kontrola powinna być użytecznym dodatkiem, aby zapewnić, że wszelkie obserwacje są jak najbardziej zbliżone do normalnej fizjologii.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować dr Jeremy'emu Smythowi za wsparcie w zakresie obrazowania oraz Ann C. Shenk za ilustracje, produkcję i filmowanie. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (1R01GM127938 do R.T.C.).
Materiały
2
CO preparacyjne Nikon NC9344527 Probówki do mikrowirówek
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Aktywne suche drożdże | Red Star® | ||
| CO2 gaz | 99,9% czystości | ||
| Podkładka | |||
| Mikroskop preparacyjny, model Nikon SMZ645 | Igły | ||
| - Igły PrecisionGlide | BD | 305165 | rozmiar B-D 21G1 |
| Igły do preparowania - Strzykawki PrecisionGlide | BD | 309657 | Końcówka Luer-Lok, rozmiar 3 ml |
| Igły preparacyjne - drut wolframowy | Mikroskopia elektronowa Nauki | 73800 | |
| Kleszcze Dumont #5 (2 pary) | Fine Science Tools | 11251-10 NI-150 | |
| Oświetlacz o wysokiej intensywności | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Roztwór nadtlenku wodoru, 30% (w/w) w H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulina z trzustki bydlęcej | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Wirujący dysk mikroskop | Nikon | Równoważne lunety mogą być również używane | |
| Lonza BioWhittaker Antybiotyki: mieszaniny penicyliny i streptomycyny | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Naczynia ze szklanym dnem, 35 mm | Fisher Scientific | ||
| Mikropipety i końcówki o odpowiedniej wielkości | Eppendorf | ||
| , 1,7 ml | VWR | 87003-294 | |
| Tetrametylorodamina, ester etylowy, nadchloran (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Muchy dzikie |
| y w; clu[CA06604] | Dostępne na życzenie. | Clu::Pułapka GFP leci |
Bibliografia
- Winterbourn, C. C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction. Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin. Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).
- Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).
- Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress. Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).
- Sen, A., Cox, R. T. Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane. Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).
- Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. Isolation of Drosophila egg chambers for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402(2010).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679(2012).
- Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. Journal of Visualized Experiments. (119), e54989(2017).
- Brady, J. A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).
- Wang, S., Hazelrigg, T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).
Przedruki i uprawnienia
