Wizualizacja wpływu uszkodzeń oksydacyjnych na komory jajowe Drosophila za pomocą obrazowania na żywo

Summary

Celem tego protokołu jest wykorzystanie obrazowania na żywo do wizualizacji wpływu uszkodzeń oksydacyjnych na lokalizację i dynamikę struktur subkomórkowych w jajnikach Drosophila.

Abstract

Obrazowanie na żywo jajników Drosophila melanogaster odegrało kluczową rolę w zrozumieniu różnych podstawowych procesów komórkowych podczas rozwoju, w tym ruchu cząsteczek rybonukleoproteiny, lokalizacji mRNA, ruchu organelli i dynamiki cytoszkieletu. Istnieje kilka metod obrazowania na żywo, które zostały opracowane. Ze względu na fakt, że każda metoda polega na wypreparowaniu pojedynczych jajników umieszczonych w pożywce lub oleju halowęglowym, uszkodzenie komórek spowodowane niedotlenieniem i/lub manipulacją fizyczną nieuchronnie nastąpi z czasem. Jednym z dalszych skutków niedotlenienia jest zwiększenie uszkodzeń oksydacyjnych w komórkach. Celem tego protokołu jest wykorzystanie obrazowania na żywo do wizualizacji wpływu uszkodzenia oksydacyjnego na lokalizację i dynamikę struktur subkomórkowych w jajnikach Drosophila po indukcji kontrolowanego uszkodzenia komórek. Tutaj używamy nadtlenku wodoru do wywołania komórkowego uszkodzenia oksydacyjnego i podajemy przykłady wpływu takiego uszkodzenia na dwie struktury subkomórkowe, mitochondria i cząsteczki błogości Clu. Jednak ta metoda ma zastosowanie do każdej struktury subkomórkowej. Ograniczenia polegają na tym, że nadtlenek wodoru może być dodawany tylko do środowisk wodnych i nie będzie działał w przypadku obrazowania z użyciem oleju halowęglowego. Zaletą jest to, że nadtlenek wodoru jest łatwo dostępny i niedrogi, działa szybko, jego stężenie można modulować, a uszkodzenie oksydacyjne jest dobrym przybliżeniem uszkodzeń spowodowanych niedotlenieniem, a także ogólnego uszkodzenia tkanek w wyniku manipulacji.

Introduction

Podczas eksperymentalnej hodowli i manipulacji tkankami ex vivo może powstać wiele różnych stresorów komórkowych, w tym szok cieplny, stres oksydacyjny, stres osmotyczny, stres żywieniowy i warunki toksyczności. Obrazowanie na żywo to potężne narzędzie służące do wizualizacji zmian w tkankach ex vivo w czasie rzeczywistym po eksperymentalnym leczeniu i manipulacji. Drobne sekcje tkanek i manipulacje wymagają praktyki, a czas od sekcji do obrazowania może się różnić w zależności od doświadczenia. Uzasadnienie opracowania tej metody opiera się na obawie, że przygotowanie tkanki do obrazowania na żywo może powodować stres komórkowy podczas sekcji i przygotowania obrazowania. Może to być szczególnie problematyczne w przypadku procesów wrażliwych na zmiany w metabolizmie komórkowym i dostępnym poziomie tlenu, takich jak funkcja mitochondriów. Chociaż posiadanie równoległej próbki typu dzikiego jest ważną kontrolą, nadal istnieje możliwość, że niektóre lub wszystkie zaobserwowane zmiany w strukturach subkomórkowych mogą być spowodowane uszkodzeniem lub stresem komórkowym spowodowanym rozwarstwieniem i nie odzwierciedlają normalnej fizjologii lub badanego leczenia lub mutacji.

Aby rozwiązać ten potencjalny problem, używamy dodatku nadtlenku wodoru podczas obrazowania na żywo w celu wywołania komórkowego uszkodzenia oksydacyjnego¹. Celem tej metody jest wywołanie uszkodzenia tkanek w celu monitorowania wpływu na struktury subkomórkowe. Protokół ten jest przydatny do dwóch celów: 1) określenia, czy zmiany w subkomórkowej lokalizacji struktury będącej przedmiotem zainteresowania są spowodowane stresem spowodowanym przez niedoświadczoną sekcję oraz 2) gdy badacz ma pewność co do opisanych technik preparacji w celu monitorowania wpływu kontrolowanego stresu na strukturę zainteresowania. Tutaj pokazujemy dwa przykłady tego, jak zwiększone uszkodzenia oksydacyjne powodują zmiany w dwóch strukturach subkomórkowych, mitochondriach i cząsteczkach błogości Clu. W tym celu używamy jajnika Drosophila, który jest powszechnym modelem do badań obrazowych na żywo. Pierwszy przykład bada lokalizację mitochondriów. Z naszego doświadczenia wynika, że normalna lokalizacja mitochondriów w żeńskich komórkach rozrodczych jest bardzo wrażliwa na zaburzenia i może działać jako zwiastun stresu komórkowego. Mitochondria żeńskich komórek rozrodczych Drosophila są zwykle równomiernie rozproszone w cytoplazmie². Dodatek nadtlenku wodoru powoduje szybką błędną lokalizację organelli i grupowanie się w podobny sposób jak w przypadku różnych mutacji^3,4,5. Drugim przykładem są cząstki błogości utworzone przez Clueless (Clu). Clu jest rybonukleoproteiną, która jest rozproszona w cytoplazmie; Jednak w optymalnych warunkach komórkowych tworzy również cząstki związane z mitochondriami⁵. Ponieważ obecność cząsteczek Clu zależy od zdrowych warunków komórkowych, nazwaliśmy je cząstkami "błogości"^3,5,6. Dodatek nadtlenku wodoru powoduje, że cząstki te szybko rozpraszają się i stają się jednorodne w cytoplasm⁵. W toku naszych badań zaobserwowaliśmy zmiany w lokalizacji obu tych struktur subkomórkowych, ale dopiero po wykonaniu badań obrazowych na żywo mogliśmy w pełni docenić wpływ stresu komórkowego i uszkodzeń oksydacyjnych na lokalizację i dynamikę mitochondriów i cząstek błogości.

Użyteczność tego protokołu jako dodatku do już istniejących lub alternatywnych metod zależy od kilku czynników. Po pierwsze, protokół obrazowania musi być podatny na dodawanie leków. Jeśli próbka jest zamontowana pod szkiełkiem nakrywkowym i w oleju halowęglowym, ta metoda nie byłaby możliwa⁷. Dodatek H₂O₂ powoduje szybki wzrost uszkodzeń oksydacyjnych, dlatego ta skala czasowa może nie być odpowiednia. Uszkodzenie oksydacyjne może być uważane za wskaźnik hipoksji; Jednak może być zbyt ostry lub zbyt uogólniony, aby działać jako odpowiednia kontrola uszkodzeń niektórych składników subkomórkowych. Wreszcie, w przypadku eksperymentów obrazowych, które trwają kilka godzin, takich jak te następujące po procesie rozwojowym, dodawanie H₂O₂ może być zbyt silne (na przykład⁸). Badanie krzywej stężeń może przezwyciężyć to ograniczenie.

Protocol

1. Przygotowanie mediów preparacyjnych i obrazowych

UWAGA: Pożywka najlepiej nadająca się do tego eksperymentu na żywo zawiera pożywkę Drosophila Schneidera zawierającą 15% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 0,6x Pen-Strep i 200 μg/ml insuliny bydlęcej, zwanej dalej pożywką Complete Schneidera.

1. Przygotowanie podłoża należy przeprowadzić w sterylnych warunkach, aby upewnić się, że nie zostanie ono zanieczyszczone. Pożywka została opracowana z myślą o wspieraniu Drosophila ovarioles przez dłuższy czas⁹.
2. Do pożywki Schneidera dodać 15% inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą, 0,6 x Pen-Strep i 200 μg/ml insuliny bydlęcej.
3. Dobrze wymieszać zawartość i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
   UWAGA: Insulina nie rozpuszcza się całkowicie w pożywce Complete Schneider i można zauważyć osad osadzający się na dnie probówki.
4. Zrób porcje pożywki, upewniając się, że pozostawiłeś osad, ponieważ będzie to przeszkadzać w obrazowaniu.
   UWAGA: Roztwór ten może być zużyty w ciągu jednego miesiąca, jeżeli jest przechowywany w porcjach w temperaturze 4 °C.

2. Kolekcja Drosophila do sekcji

UWAGA: Szczegółowe procedury zbierania i sekcji Drosophila można również znaleźć w Weil et al.¹⁰ i Parker et al.¹¹.

1. Aby uzyskać optymalne obrazowanie żeńskich komórek rozrodczych, najpierw przygotuj fiolkę zawierającą standardowy pokarm dla much z mąki kukurydzianej i odrobinę mokrej pasty drożdżowej o konsystencji masła orzechowego. Dzięki temu samice much są dobrze odżywione i wytwarzają wszystkie etapy rozwoju mieszków włosowych do obrazowania.
2. Aby uzyskać optymalnie zdrowe muchy, zbierz 0-1 jednodniowe samice i przenieś je z samcami do fiolki z pokarmem dla much zawierającej mokrą pastę drożdżową.
   UWAGA: Upewnij się, że śpiące muchy nie stykają się z pastą drożdżową, ponieważ mogą się do niej przykleić.
3. Karm muchy 3-7 dni, codziennie zmieniając fiolkę i pastę drożdżową.
   UWAGA: Upewnij się, że pasta drożdżowa styka się z pokarmem na muchy, aby nie wyschł
.

3. Rozwarstwienie jajników Drosophila

UWAGA: Ważne jest, aby przygotować roztwory pożywek na świeżo, ponieważ nadtlenek wodoru jest podatny na utlenianie, a TMRE ulega degradacji z czasem.

1. Bezpośrednio przed rozbieraniem, w pożywkach Complete Schneidera, przygotować świeżą podwielokrotność roztworu 2 μM H₂O₂, świeżą podwielokrotność 46 nM tetrametylorodaminy, ester etylowy (TMRE) i świeżą podwielokrotność 46 nM roztworu TMRE zawierającego 2 μM H₂O_2.
2. Do wypreparowania jajników użyj dwóch par cienkich kleszczyków i pary elektrolitycznie zaostrzonych igieł wolframowych¹². Aby wypreparować jajniki, napełnij 2-3 dołki naczynia preparacyjnego ze szklanym dnem (szkiełko zegarkowe) Complete Schneider's, który został podgrzany do temperatury pokojowej.
3. Znieczulić fiolkę utuczonych much dwutlenkiem węgla i posegregować pożądaną liczbę samic much do sekcji. Umieść pojedynczą muchę w podłożu za pomocą kleszczy.
4. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie chwyć muchę za klatkę piersiową za pomocą jednej pary cienkich kleszczy. Drugą parą kleszczy chwyć tył i delikatnie pociągnij, aby usunąć jajniki.
   UWAGA: jeśli jajniki nie wyjdą gładko tą metodą, cały brzuch może być również usunięty z muchy, a jajniki można delikatnie wycisnąć z obu końców brzucha za pomocą kleszczy.
5. Usuń wszelkie obce naskórki lub tkanki, a następnie przenieś jajniki do nowej studzienki zawierającej świeżą pożywkę. Jajniki powinny nadal poruszać się od otaczającej osłonki mięśniowej.

4. Przygotowanie jajników do obrazowania

1. Używając zaostrzonych igieł wolframowych, delikatnie rozsuń jajniki, uważając, aby usunąć otaczającą je osłonkę mięśniową (Rysunek 1).
2. Delikatnie usuń osłonkę mięśniową i włókna nerwowe przyczepione do izolowanych jajników (Rysunek 2).
   UWAGA: Jeśli osłonka mięśniowa nie zostanie usunięta, jajnik będzie drgał i poruszał się, powodując problemy z akwizycją obrazu (Wideo 1).
3. Jeśli interesujące struktury subkomórkowe są znakowane endogennie, przejdź do kroku 4.4. Jeśli interesujące nas struktury zostaną oznaczone barwnikiem fluorescencyjnym, przejdź do sekcji 5.
4. Po dokładnym wycięciu jajników za pomocą mikropipety przenieś je w kropli o objętości 100 μl pożywki do obrazowania Complete Schneider do szklanego wgłębienia naczynia ze szklanym dnem. Poszczególne jajniki opadną na dno kropli.
5. Przejdź do sekcji 6 dotyczącej obrazowania.
   UWAGA: W przypadku obrazowania mitochondriów i cząstek błogości Clu nie powinno upłynąć więcej niż pięć-dziesięć minut od rozpoczęcia sekcji do obrazowania.

5. Barwienie mitochondriów za pomocą TMRE

UWAGA: Dodatkowe szczegółowe procedury barwienia mitochondriów na żywo barwnikami fluorescencyjnymi można znaleźć w Parker et al. 2017.

1. Po kroku 4.3 przenieść wyizolowane jajniki w kropli 100 μl pożywki TMRE o stężeniu 46 nM do szklanego wgłębienia naczynia ze szklanym dnem. Poszczególne jajniki opadną na dno kropli.
2. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Umieść pokrywkę na naczyniu ze szklanym dnem i umieść naczynie w przykrytym pudełku na czas eksperymentu, aby chronić je przed światłem.
   UWAGA: Po inkubacji próbki można obrazować bezpośrednio, bez konieczności mycia.
3. Powtórzyć kroki 5.1-5.2, aby przygotować co najmniej dwie potrawy z jajników znakowanych TMRE, jedną służącą jako grupa doświadczalna, a drugą jako kontrolną.

6. Akwizycja obrazu na żywo

1. Po zamontowaniu jajników umieść jedną z naczyń ze szklanym dnem na mikroskopie i skonfiguruj parametry obrazowania zgodnie z potrzebami. Optymalne długości fal wzbudzenia/emisji dla zastosowanego tutaj TMRE wynoszą 549 nm/574 nm.
2. Po zlokalizowaniu żądanego pola widzenia uzyskaj nieruchome obrazy lub krótkie filmy przedstawiające jeden lub więcej jajników zgodnie z potrzebami, jako zapis warunków przed leczeniem.

7. Dodawanie nadtlenku wodoru podczas obrazowania

1. Wstrzymaj obrazowanie na żywo, zdejmij pokrywkę z naczynia ze szklanym dnem i ostrożnie dodaj 100 μl roztworu 2 μM H_2O2 do naczynia za pomocą mikropipety, jeśli obrazujesz struktury znakowane endogennie. W przypadku obrazowania mitochondriów ostrożnie dodaj 100 μl 46 nM TMRE z 2 μM H₂O₂ roztworem do naczynia za pomocą mikropipety (Wideo 2).
   1. Należy unikać rozbijania powierzchni istniejącej kropli pożywki lub zbyt szybkiego dodawania roztworu, aby nie przemieścić jajników spoczywających na dnie naczynia (Wideo 2).
2. Załóż pokrywę naczynia (pokrywę naczynia), w razie potrzeby przenieś i ponownie ustaw ostrość żądanego pola widzenia, a następnie wznów obrazowanie (Wideo 3, Wideo 4, Rysunek 3, Rysunek 4).
   1. Należy zadbać o jak najszybsze wznowienie obrazowania po dodaniu_H2O2, ponieważ leczenie eksperymentalne jest wrażliwe na czas (Wideo 5).
3. Zdobądź nieruchome zdjęcia lub krótkie filmy przedstawiające jeden lub więcej jajników zgodnie z potrzebami. Będzie to służył jako zapis warunków pozabiegowych.
4. W celu kontroli umieść drugą szklaną dolną miskę na mikroskopie i powtórz sekcję 6.
5. Powtórz krok 7.1, tym razem dodając do naczynia 100 μl pożywki zawierającej tylko TMRE. W przypadku obrazowania struktur znakowanych endogennie należy dodać 100 μl kompletnego roztworu Schneidera zawierającego tylko podłoże.
6. Powtórz kroki 7.2 i 7.3, aby uzyskać dane dla grupy kontrolnej.
   UWAGA: W przypadku obrazowania mitochondriów i cząstek błogości Clu nie powinno upłynąć więcej niż trzy-pięć minut od dodania nadtlenku wodoru do obrazowania.

Results

Opisane protokoły mogą być używane do badania efektów działania nadtlenku wodoru podczas obrazowania na żywo jajników Drosophila. Jak pokazano na Rysunek 3, Rysunek 4, Wideo 3 i Wideo 4, ta procedura zapewnia skuteczny sposób wizualizacji zmian i dynamiki tkanek po eksperymentalnym leczeniu w czasie rzeczywistym. Co ważne, protokół ten jest specyficzny dla dodawania_H2O2do jajników podczas obrazowania; Może być jednak przystosowany do egzogennego dodawania innych leków lub odczynników będących przedmiotem zainteresowania. Ponadto mieszki włosowe mogą być znakowane dowolnymi barwnikami fluorescencyjnymi, które mogą być przedmiotem zainteresowania (np. tetrametylorodaminą (TMRE), LysoTracker) przed obrazowaniem (Wideo 3). Najbardziej krytycznymi krokami do uzyskania wyraźnych wyników obrazowania są: 1) właściwa sekcja i izolacja pojedynczych jajników z usuniętymi wszystkimi elementami kurczliwymi (Rysunek 1 i Rysunek 2) oraz 2) szybkość, z jaką obrazowanie jest wznawiane po dodaniu nadtlenku wodoru. Film 4 jest ilustracją prawidłowo wypreparowanego pęcherzyka, który pozostaje stabilny przez cały czas trwania obrazowania, w porównaniu z filmem 1, który ilustruje słabo wypreparowany pęcherzyk opuszczający pole widzenia podczas obrazowania. Film 5 jest ilustracją, w której wpływ_H2O2na mitochondria znakowane TMRE postępował już przed rozpoczęciem obrazowania w wyniku zbyt długiego czasu, który upłynął. W porównaniu z Filmem 3, w którym obrazowanie zostało wznowione natychmiast po dodaniu nadtlenku wodoru (czas 0) i nienaruszone, rozproszone mitochondria są nadal widoczne, mitochondria w Wideo 5 zaczęły już widocznie się zlepiać i tracić swój potencjał błonowy po wznowieniu obrazowania. Problem ten przypisuje się głównie zakłóceniu pozycji próbki podczas dodawania_H2O2i można go złagodzić, postępując zgodnie z techniką, aby utrzymać nośnik obrazowania i pozycję próbki w stanie nienaruszonym (Wideo 2). Warto zauważyć, że w eksperymentach kontrolnych przeprowadzonych bez H₂O₂ dodanego do pożywki, mitochondria w pęcherzykach pozostają prawidłowo rozproszone, a barwnik TMRE pozostaje sekwestrowany w mitochondriach.

Rysunek 1: Izolacja pojedynczych jajników od jajników Drosophila. (A) Rysunek przedstawiający parę jajników, pojedynczy jajnik (strzałka) z germarium na końcu (grot strzałki) i dwie osłonki mięśniowe otaczające jajnik (brązowy, nabłonkowy) i jajnik (brązowy, otrzewnowy). (B) Wypreparowany jajnik Drosophila. (C) Późniejsze rozdzielenie drażnionego jajnika na poszczególne jajniki (strzałka). Podziałka liniowa = 100 um. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Usuwanie włókien nerwowych i elementów kurczliwych z pojedynczych jajników. (A) Pojedynczy jajnik z pozostałościami tkanki nerwowej i nadal przyczepioną osłonką mięśniową (strzałka). (B) Delikatne usunięcie całej pozostałej tkanki przyczepionej do jajnika w A (strzałka). Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: H₂O₂ powoduje błędną lokalizację mitochondriów. (A-A") Zdjęcia na żywo dobrze odżywionego pęcherzyka^CA06604 clu (Clu::GFP muchy). Dodanie_H2O2powoduje zbijanie się mitochondriów w czasie obrazowania. Znakowanie mitochondriów TMRE wskazuje, że mitochondria są początkowo rozproszone w czasie 0 (A) i że mitochondria zaczynają się zlepiać po dodaniu H₂O₂ (A′) W późniejszym czasie znakowanie TMRE staje się nierówne z powodu utraty przez mitochondria potencjału błonowego, a tym samym zdolności do sekwestracji barwnika (A). Biały = TMRE (A-A"). Podziałka skali: 10 μm w (A) dla A-A"⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: H₂O₂ rozprasza Clu. (A-A") Zdjęcia na żywo dobrze odżywionego pęcherzyka^CA06604 pęcherzyka. Dodanie_H2O2powoduje dyspersję cząstek i stanie się jednorodne w cytoplazmie w czasie obrazowania. Biały = Clu::GFP (A-A"). Podziałka: 40 μm w (A) dla A-A"⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Pęcherzyk z clu^CA06604 samicy. Jak opisano w Rysunek 2, niepowodzenie w usunięciu elementów kurczliwych włókien nerwowych z pojedynczych jajników spowoduje wyraźne dryfowanie i ruch jajników podczas obrazowania, a następnie niemożność analizy danych obrazowych. White = Clu::GFP. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Prawidłowe dodanie H₂O₂ do naczynia z próbką. Nadtlenek wodoru należy dodać do naczynia na próbkę za pomocą mikropipety o odpowiedniej wielkości. Dozowanie_H2O2bez naruszania powierzchni nośnika. Zwraca się uwagę, aby nie dopuścić do uszkodzenia powierzchni nośnika obrazowania, aby zminimalizować dryft próbki podczas dodawania nadtlenku wodoru. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 3: Dodawanie H₂O₂ podczas obrazowania mieszków włosowych znakowanych TMRE. Pęcherzyk z clu^CA06604 samicy barwionej TMRE. _H2O2powoduje nieprawidłową lokalizację mitochondriów w pęcherzykach Drosophila. Biały = barwnik TMRE. Obrazowanie jednej klatki na 15 s przez 20 minut, a wideo ma 10 klatek na sekundę⁵. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 4: Dodawanie H₂O₂ podczas obrazowania pęcherzyków Clu::GFP. Pęcherzyk z clu^CA06604 samicy. H₂O₂ rozprasza cząstki Clu zgodnie z opisem w Rysunek 4. Biały = Clu::GFP. Obrazowana jest jedna klatka na 15 s przez 15 minut, a wideo ma 10 klatek na sekundę. ⁵ Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 5: Opóźnione obrazowanie po dodaniu H ₂O₂.Pęcherzyk z clu^CA06604 samicy. Dodanie nadtlenku wodoru do mieszków włosowych jest leczeniem wrażliwym na czas. Wznowienie obrazowania zostało opóźnione w tym filmie w wyniku przemieszczenia próbki podczas dodawania_H2O2. Mitochondria zaczęły już widocznie zbijać się i tracić swój potencjał błonowy po ponownym uruchomieniu obrazowania w czasie 0 (w porównaniu do czasu 0 w filmie 3). Niewznowienie obrazowania szybko po leczeniu spowoduje niedokładne i bezużyteczne wyniki, ponieważ wczesne efekty eksperymentalne zostaną utracone przed obrazowaniem. Biały = TMRE. Obrazowano jedną klatkę na 15 s przez 20 minut, a wideo ma 10 klatek na sekundę. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Discussion

Protokół ten może być użytecznym dodatkiem jako kontrola artefaktów spowodowanych rozwarstwieniem jajników i inkubacją tkanek w każdym eksperymencie z obrazowaniem na żywo. Krytyczne kroki są podobne do tych, które można znaleźć w przypadku innych protokołów obrazowania na żywo. Nauczenie się, jak preparować całe jajniki Drosophila, wymaga praktyki; Jednak tej umiejętności można zwykle nauczyć się dość szybko za pomocą odpowiednich narzędzi preparacyjnych. Trudniejsze do opanowania jest usunięcie mięśnia otaczającego jajniki i każdą jajnik¹³. Należy to zrobić, aby skurcze mięśni nie przeszkadzały w pozyskiwaniu obrazu. Jeśli użycie do tego zaostrzonych igieł wolframowych nie okaże się skuteczne, germarium na końcu jajnika można chwycić kleszczami, a jajnik wyciągnąć z osłonki mięśniowej. Jednak ta technika jest problematyczna, jeśli ma być badane najwcześniejsze stadia rozwojowe, ponieważ mogą one ulec uszkodzeniu. Kolejnym kluczowym krokiem jest nieusuwanie jajników spoczywających na dnie naczynia podczas dodawania_H2O2. Dodatkowym ważnym aspektem jest wspólne dla wszystkich obrazowań na żywo: badacz powinien upewnić się, że struktura będąca przedmiotem zainteresowania jest dobrze oznakowana fluorescencyjnie przed leczeniem. Użyte tu naczynia (Tabela Materiałów) są powszechnie używane do obrazowania na żywo; Jednak każde naczynie lub szkiełko ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym na dnie, a nawet dużym szklanym szkiełkiem nakrywkowym powinno działać tak długo, jak długo można zakryć kroplę nośnika, aby zapobiec parowaniu nośnika. Chociaż używamy konkretnego mikroskopu, każdy odwrócony mikroskop z obiektywem o wystarczającym powiększeniu, aby zobaczyć daną strukturę subkomórkową i dołączoną kamerą, która ma wystarczającą rozdzielczość i szybkość przechwytywania obrazu, powinien działać.

Chociaż nasze laboratorium jest przede wszystkim zainteresowane funkcją mitochondriów, ta metoda może być pomocna w badaniu dynamiki i lokalizacji dowolnej struktury subkomórkowej lub organelli, takiej jak jądro, cytoszkielet lub retikulum endoplazmatyczne. Ta metoda ma jednak ograniczenia. Aby dodać nadtlenek wodoru, tkanka musi znajdować się w środowisku wodnym. Alternatywną metodą obrazowania na żywo jest użycie oleju halowęglowego, który odegrał zasadniczą rolę w opisie wielu ważnych procesów zachodzących u jajników Drosophila, w tym pierwszego przykładu dynamicznego ruchu GFP w organizmie modelowym ^7,14. Ponadto dodanie nadtlenku wodoru do pożywki powoduje rozległe uszkodzenia oksydacyjne, które mogą być zbyt ogólnym zniewagą dla tkanki, aby mogły być informacyjne dla interesującego procesu komórkowego, szczególnie w przypadku dłuższych eksperymentów badających rozwój. Chociaż przeprowadzenie eksperymentów, które wymagają wizualizacji komórki przez długi czas, może nie być wykonalne ze względu na to szybkie, rozległe i prawdopodobnie nieodwracalne uszkodzenie oksydacyjne, widzieliśmy, że ostre leczenie nadtlenkiem wodoru, które opisaliśmy, ma zastosowanie do większości etapów oogenezy, ponieważ jesteśmy w stanie zobaczyć te same efekty na większości etapów w okresie obrazowania. Biorąc pod uwagę niski koszt i łatwość protokołu, może on być przydatną kontrolą uszkodzeń i może być również stosowany jako leczenie przed utrwaleniem i znakowaniem przeciwciał.

W naszych rękach leczenie_H2O2 naśladuje zmiany w błędnej lokalizacji mitochondriów i dyspersji cząstek błogości Clu, które widzimy u różnych mutantów Drosophila. Naśladuje również wyniki, które obserwujemy u nowych badaczy w laboratorium, którzy uczą się technik preparacji. W związku z tym metoda ta wyraźnie ujawniła, że przygotowanie próbki i ogólny stres komórkowy mogą prowadzić do nieoczekiwanych i wcześniej niewyjaśnionych zmian w błędnej lokalizacji mitochondriów i obecności cząstek błogości. Rozwijając tę technikę, stężenia nadtlenku wodoru można modulować za pomocą wyższego lub niższego stężenia. Jeśli efekt komórkowy jest obserwowany przy użyciu niższego stężenia, możliwe jest, że fenotyp stresu może być odwracalny poprzez zastąpienie pożywki Complete Schneider's. Różne stresory komórkowe, takie jak cyjanek karbonylu, m-chlorofenylohydrazon (CCCP), arsenit lub zwykły szok cieplny, mogą okazać się przydatne w ogólnym stresie komórkowym dla innych struktur subkomórkowych. Ponieważ obrazowanie na żywo tkanek ex vivo wymaga ręcznej manipulacji i inkubacji w różnych pożywkach, ta kontrola powinna być użytecznym dodatkiem, aby zapewnić, że wszelkie obserwacje są jak najbardziej zbliżone do normalnej fizjologii.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aktywne suche drożdże	Red Star®
CO2 gaz			99,9% czystości
Podkładka
Mikroskop preparacyjny, model Nikon SMZ645	Igły
- Igły PrecisionGlide	BD	305165	rozmiar B-D 21G1
Igły do preparowania - Strzykawki PrecisionGlide	BD	309657	Końcówka Luer-Lok, rozmiar 3 ml
Igły preparacyjne - drut wolframowy	Mikroskopia elektronowa Nauki	73800
Kleszcze Dumont #5 (2 pary)	Fine Science Tools	11251-10 NI-150
Oświetlacz o wysokiej intensywności	Nikon Instruments Inc.
Gibco Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termicznie	Fisher Scientific	10082-147
Gibco Schneider's Drosophila Media	Sigma-Aldrich	21720-024
Roztwór nadtlenku wodoru, 30% (w/w) w H2O	Sigma-Aldrich	H1009
Insulina z trzustki bydlęcej	Sigma-Aldrich	I6634
Wirujący dysk mikroskop	Nikon		Równoważne lunety mogą być również używane
Lonza BioWhittaker Antybiotyki: mieszaniny penicyliny i streptomycyny	Fisher Scientific	17-602E
MatTek Corporation Naczynia ze szklanym dnem, 35 mm	Fisher Scientific
Mikropipety i końcówki o odpowiedniej wielkości	Eppendorf
, 1,7 ml	VWR	87003-294
Tetrametylorodamina, ester etylowy, nadchloran (TMRE)	AnaSpec	AS-88061
w[1118]	Bloomington Drosophila Stock Center	5905	Muchy dzikie
y w; clu[CA06604]		Dostępne na życzenie.	Clu::Pułapka GFP leci