Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

4.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62165

⸱

9 lutego 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanego biosensora nadtlenku wodoru (H2O2) w hodowanych neuronach i larwach zebry do oceny fizjologicznych ról sygnalizacyjnych H2O2 podczas rozwoju układu nerwowego. Może być stosowany do różnych typów komórek i modyfikowany za pomocą eksperymentalnych zabiegów w celu zbadania reaktywnych form tlenu (ROS) w ogólnym rozwoju.

Streszczenie

Reaktywne formy tlenu (ROS) są dobrze znanymi cząsteczkami sygnałowymi, które są ważne w prawidłowym rozwoju, homeostazie i fizjologii. Spośród różnych ROT nadtlenek wodoru (H2O2) jest najlepiej scharakteryzowany pod względem ról w sygnalizacji komórkowej. H2O2 został zaangażowany podczas rozwoju u kilku gatunków. Na przykład przejściowy wzrostH2O2 wykryto w zarodkach danio pręgowanego w pierwszych dniach po zapłodnieniu. Ponadto wyczerpanie ważnego komórkowego źródłaH2O2, oksydazy NADPH (NOX), upośledza rozwój układu nerwowego, taki jak różnicowanie, wzrost aksonów i kierowanie komórkami zwojowymi siatkówki (RGC) zarówno in vivo, jak i in vitro. W tym miejscu opisujemy metodę obrazowania wewnątrzkomórkowych poziomówH2O2w hodowanych neuronach danio pręgowanego i całych larwach podczas rozwoju przy użyciu genetycznie kodowanego biosensora specyficznego dlaH2O2, roGFP2-Orp1. Sonda ta może być przejściowo lub stabilnie wyrażana w larwach danio pręgowanego. Co więcej, odczyt ratiometryczny zmniejsza prawdopodobieństwo wykrycia artefaktów z powodu różnicowej ekspresji genów lub efektów objętościowych. Po pierwsze, pokazujemy, jak izolować i hodować RGC pochodzące z zarodków zebry danio pręgowanego, które przejściowo eksprymują roGFP2-Orp1. Następnie używamy całych larw do monitorowania poziomuH2O2na poziomie tkanki. Czujnik został zwalidowany przez dodanieH2O2. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do pomiaru poziomówH2O2w określonych typach komórek i tkankach poprzez generowanie zwierząt transgenicznych z ekspresją biosensorów specyficzną dla danej tkanki. Ponieważ danio pręgowany ułatwia manipulacje genetyczne i rozwojowe, zademonstrowane tutaj podejście może posłużyć jako narzędzie do testowania roliH2O2podczas rozwoju neuronalnego i ogólnego rozwoju embrionalnego u kręgowców.

Wprowadzenie

Sygnalizacja za pomocą reaktywnych form tlenu (ROS) reguluje rozwój i funkcjonowanie układu nerwowego1. Ważnym komórkowym źródłem ROS są oksydazy NADPH (NOX), które są białkami transbłonowymi generującymi anion ponadtlenkowy oraz nadtlenek wodoru (H2O2)2. Enzymy NOX występują w całym ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), a ROS pochodzące z NOX przyczyniają się do rozwoju neuronów3,4,5,6. Wykazano, że utrzymanie i różnicowanie komórek macierzystych układu nerwowego, ustalanie polarności neuronów, wzrost neurytów oraz plastyczność synaptyczna wymagają odpowiednich poziomów ROS7,8,9,10,11. Z drugiej strony, niekontrolowana produkcja ROS przez NOX przyczynia się do rozwoju schorzeń neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera, stwardnienia rozsianego oraz urazowych obrażeń mózgu12,13,14. Zatem produkcja fizjologicznie istotnych ROS jest kluczowa dla utrzymania stanu zdrowia.

Opracowanie genetycznie kodowanych biosensorów znacznie ułatwiło detekcję komórkowych ROS. Istotną zaletą genetycznie kodowanych biosensorów jest zwiększona rozdzielczość czasowa i przestrzenna sygnału ROS, ponieważ sensory te mogą być specyficznie kierowane do konkretnych lokalizacji. Jednym z rodzajów takich biosensorów ROS jest białko GFP wrażliwe na utlenianie i redukcję (roGFP). Wariant roGFP2-Orp1 specyficznie wykrywa H2O2 za pomocą domeny Orp1, która jest białkiem z rodziny peroksiredoksyn glutationowych pochodzącym z drożdży15,16. Utlenienie białka Orp1 jest przenoszone na roGFP2, co zmienia jego konformację (Rycyna 1A). Sonda wykazuje dwa piki pobudzenia w pobliżu 405 nm i 480 nm oraz pojedynczy pik emisji przy 515 nm. Po utlenieniu zmienia się intensywność fluorescencji wokół pików pobudzenia: podczas gdy pobudzenie przy 405 nm wzrasta, pobudzenie przy 480 nm maleje. W związku z tym roGFP2-Orp1 jest biosensorem ratiometrycznym, a poziomy H2O2 są wykrywane na podstawie stosunku intensywności fluorescencji wzbudzanej przy dwóch różnych długościach fal (Rycina 1B). Ogólnie roGFP2-Orp1 jest wszechstronnym narzędziem do obrazowania ROS, które może być efektywnie wykorzystywane in vivo.

Utlenianie Orp1-roGFP2 przez H2O2; zmiana intensywności fluorescencji; schemat utleniania-redukcji.
Rysunek 1: Schematyczny opis i widma wzbudzenia roGFP2-Orp1. (A) Przeniesienie utleniacza zachodzi między Orp1 a roGFP2 w odpowiedzi na H2O2, co prowadzi do zmian konformacyjnych w roGFP2. (B) Widma wzbudzenia roGFP2-Orp1 wykazują dwa piki wzbudzenia przy 405 nm i 480 nm oraz pojedynczy pik emisji przy 515 nm. Po utlenieniu przez H2O2 wzbudzenie przy 405 nm wzrasta, podczas gdy wzbudzenie przy 480 nm spada. Skutkuje to ratiometrycznym odczytem obecności H2O2 . Rysunek został zmodyfikowany na podstawie prac Bilan i Belousov (2017)16 oraz Morgan i wsp. (2011)25. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Model system Danio rerio (danio pręgowany) posiada szereg zalet w kontekście zastosowania genetycznie kodowanych biosensorów. Przezroczystość optyczna embrionów i larw umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo. Opracowywane są nowe narzędzia obrazowania, aby osiągnąć wyższą rozdzielczość i głębszą penetrację17. Ponadto istnieją sprawdzone narzędzia do manipulacji genetycznych (ektopowa ekspresja mRNA, transgeneza Tol2 itp.) oraz edycji genomu (TALENs, CRISPR/Cas9 itp.), co sprzyja generowaniu zwierząt transgenicznych18. Ponieważ embriony danio pręgowanego rozwijają się poza organizmem matki, system ten zapewnia dodatkowo łatwiejszy dostęp do embrionów i możliwość ich manipulowania. Przykładowo, bez trudu można przeprowadzić iniekcje w stadium jednego komórki oraz podawać leki.

W niniejszej pracy wykorzystaliśmy rybki danio do przejściowej ekspresji specyficznego dla H2O2 biosensora roGFP2-Orp1 poprzez wstrzyknięcie mRNA transkrybowanego in vitro. Embriony te mogą być wykorzystywane zarówno do obrazowania in vitro hodowanych neuronów, jak i obrazowania in vivo (Rysunek 2). Opisujemy protokół preparatyki i wysiewania komórek zwojowych siatkówki (RGCs) z embrionów rybek danio, a następnie ocenę poziomu H2O2 w hodowanych neuronach. Następnie przedstawiamy metodę obrazowania in vivo embrionów i larw wykazujących ekspresję roGFP2-Orp1 przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Podejście to pozwala nie tylko na określenie fizjologicznych poziomów H2O2, ale także na badanie potencjalnych zmian zachodzących w różnych stadiach rozwojowych lub warunkach. Ogólnie rzecz biorąc, system ten stanowi niezawodną metodę detekcji H2O2 w żywych komórkach i zwierzętach, umożliwiając badanie roli H2O2 w rozwoju, zdrowiu i chorobach.

Schemat edycji genów mRNA roGFP2-orp1; eksperyment obrazowania in vitro/in vivo u rybek zebrafish.
Rysunek 2Schemat podejścia eksperymentalnego. Krótko mówiąc, po pobraniu zarodków, mRNA roGFP2-Orp1 wstrzykuje się do żółtka zarodków danio pręgowanego w stadium jednego komórki. Rozwijające się zarodki mogą być wykorzystane zarówno do (A) in vitro oraz (B) in vivo obrazowanie. (AZarodki wykazujące pozytywną ekspresję GFP są wykorzystywane do wycięcia siatkówek w celu pobrania komórek zwojowych siatkówki (RGC) w 34. godzinie po zapłodnieniu (hpf). Dysocjowane komórki RGC wysiewa się na szkiełka nakrywkowe pokryte PDL/lamininą w pożywce ZFCM (+). Obrazowanie stożków wzrostu można przeprowadzić w czasie, gdy komórki RGC wydłużają swoje aksony po 6–24 godzinach od wysiania. Komórki można poddać różnym zabiegom w celu pomiaru potencjalnych zmian w H2O2-poziomy. Tutaj zmierzyliśmy H2O2-poziomy w stożkach wzrostu komórek zwoju siatkówkowego (RGC) (czerwone). (B) embriony GFP-dodatnie są wykorzystywane do in vivo obrazowanie. Po osiągnięciu pożądanego wieku zarodki można znieczulić i umieścić na szalkach z szklanym dnem o średnicy 35 mm do obrazowania konfokalnego. W tym przypadku zarodki są montowane stroną brzuszną w celu obrazowania siatkówki. Schemat przedstawia rozwój siatkówki u ryb danio. Komórki zwojowe siatkówki (RGC) tworzą warstwę komórek zwojowych (GCL), która jest najbardziej wewnętrzną warstwą siatkówki. Aksony RGC przekształcają się w nerw wzrokowy, który przecina linię środkową, tworząc skrzyżowanie wzrokowe. Następnie aksony RGC rosną grzbietowo, tworząc synapsy w wzgórzu optycznym w śródmózgowiu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały poddane ocenie etycznej i zatwierdzone przez Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), zgodnie z wytycznymi NIH, na podstawie protokołu 2006002050 zatwierdzonego w dniu 07/24/2020.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Pożywka E2 (1x)
    1. Przygotować roztwory 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) oraz 500x E2C (100 mL), łącząc wszystkie składniki przedstawione w Tabeli 1. Roztwory E2A, E2B i E2C poddać autoklawowaniu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Dla pożywki 1x E2: Połączyć 5 mL 100x E2A, 1 mL 500x E2B oraz 1 mL 500x E2C. Dopełnić objętość do 500 mL sterylną wodą. Dostosować pH do wartości 7,0-7,5.
    3. Przygotować aliquoty pożywki 1x E2 o objętości 50 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego magazynowania. Należy jednak pamiętać, że po rozmrożeniu mogą wystąpić wytrącania. Przed użyciem roztworu stokowego należy upewnić się, że osad jest całkowicie rozpuszczony.
RoztwórKomponentIlośćStężenie
100X E2A (500 mL)
NaCl43,8 g1500 mM
KCl1,88 g50 mM
MgSO46 g100 mM
KH2PO41,03 g15 mM
Na2HPO40,34 g5 mM
500X E2B (100 ml)
CaCl25,5 g500 mM
500X E2C (100 mL)
NaHCO33 g350 mM
1X E2 (500 ml)
100X E2A5 ml1X
500X E2B1 ml1X
500X E2C1 mL1X

Tabela 1: Skład pożywki 1x E2 do hodowli komórek ryby danio pręgowanej.

  1. Pożywka E3 (1x)
    1. Rozpuścić składniki w 1 L sterylnej wody zgodnie z Tabelą 2, aby przygotować roztwór zapasowy 100x. Rozcieńczyć roztwór zapasowy w sterylnej wodzie do uzyskania pożywki E3 1x.
    2. Dodać 0,2% błękitu metylenowego. Do 20 mL pożywki E3 1x dodać 40 µL błękitu metylenowego.
    3. Przygotować osobną partię bez błękitu metylenowego do obrazowania fluorescencyjnego.
KomponentIlość (g)Stężenie w roztworze zapasowym 100X (mM)
NaCl29.22500
KCl1.2617
CaCl2 2H2O4.8533
MgSO4 7H2O8.1333

Tabela 2: Składniki 100-krotnego roztworu pożywki E3 do hodowli embrionów rybek danio pręgowanych.

  1. 80x roztwór zapasowy soli fizjologicznej
    1. Połączyć wszystkie składniki przedstawione w Tabeli 3. Dodać wodę do uzyskania 100 mL roztworu. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia wszystkich składników. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
KomponentIlość (g)Stężenie w roztworze stokowym (mM)
Glukoza1.4480
pirogronian sodu0.4440
CaCl2 2H2O0.14810
HEPES6.1256

Tabela 3: Składniki 80-krotnego roztworu soli do pożywek dla hodowli komórek ryby danio-pręgowanej.

  1. Pożywka do hodowli komórek ryby danio (ZFCM+)
    1. Połączyć wszystkie składniki wymienione w Tabeli 4, aby przygotować 250 mL pożywki. Dostosować pH do wartości 7,5. Przefiltrować pożywkę za pomocą filtra 0,22 µm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
KomponentIlość (ml)% obj.
pożywka L-15 (z czerwienią fenolową)212.7585.1
płodowa surowica bydlęca (FBS)52
Penicylina/Streptomycyna10.4
Roztwór soli 80X3.1251.25
Woda28.12511.25

Tabela 4: Składniki pożywki do hodowli komórek rybki zebrafish z surowicą i antybiotykami.

  1. Pożywka do hodowli komórek zebrafish do obrazowania (ZFCM-)
    1. Połączyć wszystkie składniki przedstawione w Tabeli 5, aby przygotować 250 mL pożywki. Dostosować pH do wartości 7.5. Przefiltrować pożywkę za pomocą filtra 0.22 µm.
    2. Przygotować alikwoty do jednorazowego użycia (partie po 50 mL), aby zapobiec kontaminacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
KomponentIlość (ml)% obj.
pożywka L-15 (bez czerwieni fenolowej)212.7585.1
Roztwór soli 80X3.1251.25
Woda34.12513.65

Tabela 5: Składniki pożywki do hodowli komórek ryby danio-ostrobramskiej bez surowicy i antybiotyków do obrazowania in vitro.

  1. Formy do wstrzykiwania
    1. Rozpuść 1,5% agarozy w pożywce E3. Wlej ~ 25 mL agarozy do szalki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm.
    2. Połóż formę na agarozy pod kątem 45° względem powierzchni i pozwól jej powoli opaść na agarozy. Pomoże to uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Pozostaw agarozę do ostygnięcia i stężenia na blacie laboratoryjnym.
    3. Po całkowitym stężeniu powoli usuń formę, aby zapobiec pękaniu agarozy. Dolej świeżą pożywkę E3, zabezpiecz brzegi szalki folią parafinową, aby zapobiec rozlaniu, i przechowuj w temperaturze 4 °C (Rycina 3).

Chip mikrofluidyczny w szalce Petriego, stosowany w eksperymentach z hodowlą komórek, przedstawiający wzory kanałów.
Rycina 3: Obrazy formy wtryskowej. (A) Plastikowa forma używana do wytwarzania płytek do iniekcji. Forma posiada sześć ramp, jedną ściankę ściętą pod kątem 90° i jedną pod kątem 45° w celu unieruchomienia embrionów. (B) Płytka do iniekcji po zestaleniu agarozy i usunięciu formy. Paski skali = 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

2. Przygotowanie i wstrzyknięcie mRNA roGFP2-Orp1

UWAGA: Konstrukt roGFP2-Orp1 został otrzymany od dr. Tobiasa Dicka z DKFZ w Niemczech. Został on podklonowany do wektora pCS2+ w laboratorium dr. Qing Deng na Purdue University. Aby zapobiec degradacji przez RNazę, należy podjąć szereg środków ostrożności. Przez cały czas należy używać odczynników i probówek wolnych od RNazy, na wszystkich etapach należy nosić rękawiczki, a alternatywnie materiały i powierzchnie można przecierać środkiem czyszczącym do usuwania RNazy.

  1. Zlinearyzuj 3-10 µg wektora pCS2+/roGFP2-Orp1 za pomocą NotI.
  2. Oczyść zlinearyzowany plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR.
  3. Przeprowadź transkrypcję in vitro mRNA roGFP2-Orp1 za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Przygotowanie reakcji transkrypcji z nakładaniem czapeczki (capping)
      1. Umieść polimerazę RNA oraz zlinearyzowane/oczyszczone DNA na lodzie. Wirowzuj w vortexie 10x bufor reakcyjny oraz 2x NTP/CAP do całkowitego rozpuszczenia. Przechowuj NTP/CAP na lodzie, natomiast bufor pozostaw w temperaturze pokojowej (RT) podczas przygotowywania reakcji. Przed otwarciem probówek krótko wiruj wszystkie odczynniki (touch-spin), aby zapobiec kontaminacji.
      2. Przygotuj reakcję syntezy RNA w temperaturze RT w wolnej od RNaz probówce do wirówki o pojemności 0,5 mL w kolejności wskazanej poniżej. Końcowa objętość reakcji wynosi 20 µL. Skład reakcji przedstawiono w Tabeli 6.
      3. Do probówki dodaj 10 µL mieszaniny rybonukleotydów, 2x NTP/CAP oraz, w razie potrzeby, wodę wolną od nukleaz. Dodaj 2 µL 10X buforu reakcyjnego. Dodaj 1-1,5 µg liniowego DNA (do 6 µL). Jeśli jest to konieczne, uzupełnij objętość reakcji do 20 µL wodą wolną od nukleaz.
      4. Zamknij probówkę, krótko wymieszaj w vortexie i krótko wiruj w mikrowirówce. Dodaj 2 µL 10x mieszaniny enzymu SP6. Zamknij probówkę i krótko wiruj w mikrowirówce.
      5. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 2-2,5 h (można wydłużyć do 18 h).
        UWAGA: W przedstawionym eksperymencie, dla uzyskania najlepszych wyników, zastosowano inkubację nocną przez 16-18 h w 37 °C.
      6. Dodaj 1 µL DNazy w celu usunięcia matrycy DNA, zamknij probówkę, krótko wiruj i inkubuj w 37 °C przez 15 min.
OdczynnikObjętość (µL)Ilość w reakcji
2X NTP/CAP101X
Bufor reakcyjny 10X21X
DNA matrycoweDo 61-1.5 µg
Woda wolna od nukleazDodać w celu przygotowania 20 µL
10X mieszanka enzymu SP621X

Tabela 6: Skład mieszaniny reakcyjnej do transkrypcji in vitro mRNA roGFP2-Orp1.

  1. Odzyskiwanie RNA
    1. Dodać 25 µL chlorku litu (LiCl) dostarczonego w zestawie do transkrypcji in vitro. Przechowywać w temperaturze -20 °C w zamrażarce beznadmiarowej przez co najmniej 30 min.
    2. Wirować przez 25 min z maksymalną prędkością w wirówce stołowej w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć i odrzucić nadsącz, aby nie zaburzyć osadu. Dodać 25 µL zimnego 75% etanolu i wirować przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    3. Ostrożnie usunąć i odrzucić nadsącz. Pozostawić osad do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 5 min w RT. Nie doprowadzić do nadmiernego wysuszenia. Dodać 12 µL buforu Tris-EDTA (TE) wolnego od nukleaz (pH 7.0) i przechowywać próbkę na lodzie.
    4. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru. Zazwyczaj uzyskuje się 0,5- 1 µg/µL.
    5. Przygotować mRNA o stężeniu 100 ng/µL w roztworze czerwieni fenolowej (0,5% czerwieni fenolowej w soli fosforanowej Dulbecco - DPBS) i podzielić na aalikwoty do jednorazowego użycia (3-5 µL). Przechowywać alikwoty mRNA w temperaturze - 80 °C.
  1. Mikroiniekcja mRNA
    1. W dniu iniekcji należy wykorzystać jedną z alikwotów mRNA i postępować zgodnie z protokołem iniekcji zarodków ryby danio-zebry, aby wstrzyknąć 1 nL mRNA do zarodków w stadium jednego komórki poprzez żółtko19. Poniżej znajduje się krótki opis tej procedury.
    2. Przeprowadzić rozród dorosłych ryb i zebrać zarodki zgodnie z wcześniej opisaną metodą20.
    3. Wyciągnąć igły do mikroiniekcji za pomocą wyciągarki do pipet. Odciąć końcówkę igieł pęsetą, aby uzyskać otwór o średnicy 10 µm.
    4. Ułożyć zarodki w formie do iniekcji opisanej w kroku 1.6.
    5. Wstrzyknąć 1 nL mRNA w czerwieni fenolowej za pomocą szklanej pipety do mikroiniekcji.
    6. Zebrać zarodki i przechowywać je w medium E3.
    7. Przechowywać zarodki w inkubatorze w temperaturze 27 °C w medium E3 aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju. Iniekcyjne zarodki mogą być wykorzystywane zarówno do obrazowania in vitro (rozdział 3 i rozdział 4), jak i in vivo (rozdział 5). Zarodki wykazujące ekspresję roGFP2-Orp1 można wyselekcjonować przed eksperymentami za pomocą zwykłego mikroskopu sekcyjnego wyposażonego w światło fluorescencyjne i zestaw filtrów niebieski/zielony.

3. Podstawowa hodowla komórek zwoju siatkówki wyhodowana z embrionów danio pręgowanego

UWAGA: Niniejszy protokół został dostosowany z wcześniej opublikowanej metody 21. Kroki 3.1 i 3.2 należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
    1. W każdym doświadczeniu przygotować od 4 do 6 płytek hodowlanych. Należy użyć oczyszczonych kwasem szkiełek nakrywkowych (kwadratowych o wymiarach 22 x 22 mm; grubości 0,16-0,19 mm) przechowywanych w 100% etanolu.
    2. Za pomocą pincety wyjąć jedno szkiełko nakrywkowe z pojemnika do przechowywania i wystawić je na płomień, aby usunąć pozostałości etanolu.
    3. Całkowicie wysuszyć szkiełko nakrywkowe na powietrzu, umieszczając je pod kątem w 35-milimetrowej płytce hodowlanej.
    4. Przygotować roztwór roboczy (1x) poli-D-lizyny (PDL) poprzez rozcieńczenie stoku 10x (5 mg/mL) w wodzie sterylnej.
    5. Nanieść 100 µL PDL o stężeniu 0,5 mg/mL na środek każdego szkiełka nakrywkowego, unikając rozprzestrzeniania się roztworu do krawędzi.
    6. Inkubować PDL na szkiełkach nakrywkowych przez 20-30 min w temperaturze pokojowej (RT). Należy dopilnować, aby PDL nie wyschła.
    7. Trzykrotnie przemyć PDL za pomocą 0,5 mL wody sterylnej. Pozostawić płytki do całkowitego wyschnięcia.
    8. Przygotować roztwór roboczy (1x) lamininy poprzez rozcieńczenie stoku 50x (1 mg/mL) w 1x PBS.
    9. Nanieść 100 µL lamininy o stężeniu 20 µg/mL w PBS na środek każdego szkiełka nakrywkowego, unikając rozprzestrzeniania się roztworu do krawędzi.
    10. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem przez 2-6 h. Należy zapobiegać wysychaniu roztworu lamininy.
  2. Disekcja zarodków i wysiew RGC
    1. W dniu disekcji przygotować i opisać cztery 35-milimetrowe płytki do hodowli tkanek i napełnić je 4 mL odpowiednio: 70% etanolu, „E2 media 1”, „E2 media 2” oraz „E2 media 3”. Przechowywać płytki w lodówce do czasu przeprowadzenia disekcji.
    2. Gdy zarodki zebrafish osiągną wiek 34 godzin po zapłodnieniu (hpf), wyjąć z inkubatora płytki hodowlane pokryte lamininą i trzykrotnie przemyć szkiełka nakrywkowe 0,5 mL 1x PBS.
    3. Po ostatnim płukaniu dodać 4 mL pożywki ZFCM(+) do każdej płytki hodowlanej, unikając wyschnięcia płytki.
    4. Wyjąć przygotowane płytki hodowlane z kroku 3.2.1. Pozostawić je do wyrównania temperatury do RT.
    5. Napełnić 4-6 probówek PCR 15 µL pożywki ZFCM(+). Jedna probówka jest potrzebna do przygotowania RGC z 4 oczu, które zostaną wysiane na jedno szkiełko nakrywkowe.
    6. Wyjąć zarodki zebrafish z inkubatora i zanurzyć je na 5-10 s w 35-milimetrowej płytce do hodowli tkanek zawierającej 70% etanol w celu sterylizacji.
    7. Za pomocą pipety transferowej przenieść zarodki do płytki E2 Media 1 zawierającej sterylną pożywkę E2, aby wypłukać nadmiar etanolu.
    8. Przenieść zarodki do płytki E2 Media 2 i usunąć ich choriony za pomocą ostrej pincety.
    9. Przenieść zarodki do końcowej płytki E2 Media 3 w celu przeprowadzenia disekcji.
    10. Używając cienkiej pincety, wypreparować siatkówki zgodnie z wcześniejszym opisem 22.
    11. Ustabilizować i przytrzymać zarodki przednie do żółtka jedną z pincet i usunąć ogon za workiem żółtkowym drugą pincetą.
    12. Chwycić szyję pincetą i usunąć głowę, aby odsłonić mózg i oczy na pożywkę E2. Unikać przecięcia worka żółtkowego.
    13. Końcówką cienkiej pincety delikatnie wysunąć oczy z głowy, jednocześnie dociskając tkankę czaszkową drugą pincetą. Należy utrzymać oczy w izolacji od sąsiednich szczątków tkankowych.
    14. Przenieść cztery oczy do jednej z wcześniej przygotowanych probówek zawierających ZFCM(+).
    15. Delikatnie pipetować w górę i w dół za pomocą pipety P20 z żółtym końcem około 45 razy, aby zdysocjować komórki. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza.
    16. Przenieść ZFCM(+) z zdysocjowanymi komórkami na środek szkiełka nakrywkowego. Powtórzyć kroki 10-12 dla kolejnych szkiełek nakrywkowych.
    17. Utrzymywać hodowle na blacie w temperaturze 22 °C na statywie z pianki polistyrenowej w celu tłumienia wibracji.
    18. Przeprowadzić obrazowanie 6-24 h po wysiewaniu.
      UWAGA: Do przenoszenia zarodków między różnymi płytkami hodowlanymi należy używać pipety transferowej. Zmieniać pipetę dla każdego roztworu, aby zapobiec przenoszeniu etanolu (kroki 6-8).

4. Obrazowanie ROS in vitro w hodowlach neuronów RGC

  1. W dniu obrazowania (zazwyczaj od 6 do 24 h po wysianiu komórek) sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić wzrost aksonów RGC.
  2. W przypadku obrazowania żywych komórek przenieść szkiełka podstawowe z naczynia hodowlanego do komory do obrazowania żywych komórek. W tym przypadku zastosowano opisaną wcześniej specjalnie wykonaną komorę otwartą23.
  3. Przygotować mikroskop do obrazowania. Użyć mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC), czerwony filtr długoprzepustowy OG590 oraz kamerę EM-CCD.
  4. Przed rozpoczęciem obrazowania zastąpić pożywkę ZFCM(+) pożywką ZFCM(-).
  5. Po ustawieniu komórek za pomocą obiektywu 10x, wykonać zdjęcia z powiększeniem 60x, używając obiektywu immersyjnego olejowego o wysokiej aperturze numerycznej (NA). Zastosować dodatkowe powiększenie 1.5x.
  6. Najpierw zarejestrować obrazy DIC. Następnie obrazować roGFP2-Orp1 przy użyciu odpowiedniego zestawu filtrów. Wzbudać roGFP2-Orp1 kolejno filtrami wzbudzenia 405/20 i 480/30 nm, a obrazy zarejestrować filtrem emisyjnym 535/30 nm po przejściu światła emisji przez lustro dichroiczne 505DCXR.
  7. Po wykonaniu pierwszej serii obrazów wymienić pożywkę na taką, która zawiera różne roztwory traktujące. Pożywkę należy wymieniać co 30 min obrazowania, aby uniknąć zmian pH i osmolarności.

5. Obrazowanie ROS in vivo w rozwijających się embrionach

  1. W przypadku obrazowania in vivo, od 22-24 hpf utrzymuj zarodki w medium E3 zawierającym 0,003% fenylotiomocznika (PTU) bez błękitu metylenowego. Codziennie wymieniaj medium i usuwaj martwe zarodki.
  2. W wybranym wieku znieczul zarodki w 0,016% trikainie. Osadź znieczulone zarodki w 1% agarozie niskotopliwej na szklanych szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm. Zarodki można zorientować grzbietowo, brzusznie lub bocznie, w zależności od regionu zainteresowania podczas obrazowania.
  3. Po zastygnięciu agarozy wypełnij szalki medium E3 bez błękitu metylenowego z dodatkiem 0,016% trikainy.
  4. Przygotuj mikroskop do obrazowania. Użyj odwróconego konfokalnego mikroskopu skaningowego. Alternatywnie można użyć prostego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw imersyjny wodny do obrazowania zarodków osadzonych na kropli agarozy.
  5. Wzbudzaj roGFP2-Orp1 kolejno filtrami wzbudzenia 405 nm i 488 nm i rejestruj odpowiadające im obrazy z filtrami emisyjnymi w zakresie 515-535 nm.
  6. Wykonaj serie obrazów z-stack z grubością przekroju 5 µm przez wybrany fragment zarodków. Zarodki można zachować do obrazowania w późniejszych stadiach rozwoju.
  7. Po obrazowaniu usuń zarodki z agarozy za pomocą precyzyjnej pincety i przechowuj w inkubatorze do osiągnięcia pożądanego wieku w medium z PTU bez błękitu metylenowego.

6. Analiza i przetwarzanie obrazu

  1. Pomiar poziomu H2O2 na podstawie wartości stosunku 405/480
    1. Należy użyć odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu. W tym przypadku do analizy i przetwarzania obrazów wykorzystano program ImageJ.
    2. Otwórz obrazy DIC, 405/535 i 480/535 w programie ImageJ, przeciągając pliki lub klikając File | Open. Jeśli nie zostało to jeszcze zrobione, przekonwertuj obrazy na 32 bity, klikając Image | Type | 32-bit.
    3. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia free hand z paska sterowania (np. ciało komórki, stożek wzrostu, siatkówka). Otwórz menedżera ROI, klikając Analyze | Tools | ROI Manager. Kliknij Add w karcie ROI Manager, aby dodać zdefiniowany obszar ROI.
    4. Narysuj obszar w pobliżu ROI i dodaj go jako ROI tła. Zmierz średnie wartości tła, wybierając ROI i klikając Measure w karcie menedżera ROI.
    5. Zanotuj średnie wartości intensywności z pomiaru. Odejmij wartość średniego tła od obrazów fluorescencyjnych, klikając Process | Math | Subtract. Wykonaj ten krok dla obrazów 405/535 i 480/535.
    6. Przed obliczeniem stosunku, dodaj wartość „1” do fluorescencyjnego obrazu 480/535, aby wyeliminować wartości „0”, klikając funkcję Process | Math | Add.
    7. Kliknij funkcję Process | Image Calculator | Divide w ImageJ, aby podzielić obraz 405/535 przez obraz 480/535 piksel po pikselu. Wybierz obraz 405/535 jako dzielenie przez obraz 480/535. Wybierz 32-bitowy obraz wyjściowy.
    8. Zastosuj ROI do obrazu stosunku, klikając najpierw obraz stosunku, a następnie ROI w karcie menedżera ROI.
    9. Zmierz średnie wartości stosunku obrazu 405/535 do obrazu 480/535, klikając Measure w karcie menedżera ROI.
    10. Powtórz kroki od 6.1.2 do 6.1.9 dla jak największej liczby próbek, aby przeprowadzić odpowiednią analizę statystyczną.
  2. Wyświetlanie obrazu stosunku
    UWAGA: Ta procedura służy do odjęcia tła poza preparatem i zastosowania kolorowej tablicy wyszukiwania (look-up table) do obrazu.
    1. Po utworzeniu obrazu stosunku w ImageJ w kroku 6.1.7., utwórz czarny obraz 32-bitowy, klikając File | New | Image.
    2. Zastosuj ROI, dla którego chcesz wyświetlić poziomy H2O2, do nowego obrazu, klikając najpierw nowy obraz, a następnie ROI z karty menedżera ROI.
    3. Utwórz maskę, klikając Edit | Selection | Create Mask.
    4. Podziel obraz maski przez 255, aby dostosować wartość ROI do „1” (wartości tła będą wynosić „0”). Kliknij Process | Math | Divide i wpisz 255.
    5. Pomnóż maskę przez obraz stosunku, klikając funkcję Process | Image Calculator | Multiply. Wynikiem będzie obraz stosunku w skali szarości, pokazujący tylko ROI.
    6. Zmień tablicę wyszukiwania na „Fire”, klikając Image | Look up Tables | Fire.
      UWAGA: Dla lepszej wizualizacji stosunku do wszystkich obrazów można zastosować mnożnik, klikając Process | Image | Multiply.
    7. Konwertuj obraz stosunku na 8 bitów, klikając Image | Type | 8-bit.
    8. Dodaj pasek kalibracyjny, klikając Analyze | Tools | Calibration Bar.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hodowlane komórki zwoju siatkówkowego (RGCs) rybki zebrafish wydłużają aksony w ciągu 1d. Reprezentatywny obraz stosunku 405/480 biosensora H2O2 przedstawiono na Rysunku 4A. W poszczególnych neuronach wyraźnie widoczne są ciało komórki, akson oraz stożki wzrostu. Neurony te mogą być poddawane różnym zabiegom w czasie w celu monitorowania zmian stężenia H2O2. Wcześniej wykazaliśmy, że dodanie 100 µM H2O2 do pożywki zwiększa war...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W całym tym protokole istnieje kilka krytycznych kroków, które wymagają uwagi. Wierzymy, że uwzględnienie tych punktów poprawi przebieg eksperymentów. W przypadku pierwotnej hodowli RGC sterylność ZFCM(-) jest bardzo ważna, ponieważ pożywka ta nie zawiera antybiotyków i może dojść do zanieczyszczenia przed lub w trakcie obrazowania. Aby tego uniknąć, zalecamy przygotowanie i stosowanie ZFCM(-) wyłącznie w komorze bezpieczeństwa biologicznego i regularne przygotowywanie świeżych pożywek ZFCM(-) (Krok 1.5). Ponadto zapasy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), Purdue Research Foundation (Grant 209911), oraz Biuro Wiceprezesa Wykonawczego ds. Badań i Partnerstw na Uniwersytecie Purdue (Grant 210362). Dziękujemy dr Cory'emu J. Weaverowi i Haley Roeder za ustanowienie protokołu hodowli RGC danio pręgowanego. Dziękujemy również Haley Roeder za udostępnienie danych z rysunku 4. Dziękujemy Leah Biasi i Kenny'emu Nguyenowi za pomoc w kulturze RGC. Dziękujemy Gentry Lee za redakcję tekstu. Dziękujemy dr Tobiasowi Dickowi za dostarczenie roGFP2-Orp1 i dr Qing Deng za wektor pCS2+ zawierający roGFP2-Orp1. Rysunek 2 jest tworzony za pomocą Biorender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie hodowlane 35 mmSarstedt83-3900
Naczynie ze szklanym dnem 35 mmMatTekP35G-1.5-10-C
AgarozaFisher ScientificBP160-500
Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowegoSutter/Fisher ScientificNC9029378
Dwuwodny chlorek wapniaFisher ScientificC79-500
Szkło osłonoweCorning2850-22
Jednorazowe szalki Petriego (100 x 15 mm)VWR25384-094
Surowica bydlęcapłodu ThermoFisher Scientific26140087
GlukozaSigma AldichG7528
HEPESSigma AldichH4034
Adaptacyjne narzędzia naukoweform wtryskowychTU-1
Mikroskop odwróconyNikonTE2000
LamininThermoFisher Scientific23017-015
Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalnaZeiss710
Leibovitz L-15 Medium z czerwienią fenolowąGibco/Fisher Scientific11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium bez czerwieni fenolowejGibco/Fisher Scientific21-083-027
Niskotopliwa agarozaPromegaV2111
mMessage Zestaw do transkrypcji mMachine SP6InvitrogenAM1340
NotINew England BiolabsR0189S
PBSHyclone/Fisher ScientificSH3025601
Penicylina/streptomycynaThermoFisher Scientific15140122
Phenol RedSigma AldichP0290
Fenylotiomocznik (PTU)Sigma AldichP7629
Pneumatyczna pompa PicoPumpWorld Precision InstrumentsPV820
Poli-D-lizyna (PDL)Sigma AldichP7280
Zestaw do oczyszczania QiaQUICK PCRQIAGEN28104
Rekombinowana mysz szczelina2R& D Systems5444-SL-050
Pirogronian soduSigma AldichP5280
Steritop 0,22 i mikro; m filtrMilliporeS2GPT05RE
TE BufferAmbionAM9860
Metanosulfonian trikainySigma AldichE10521
Pionowy ściągacz do pipetDavid Kopf Instruments700C
do

Bibliografia

  1. Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
  2. Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
  3. Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development. Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).
  4. Terzi, A., Suter, D. M. The role of NADPH oxidases in neuronal development. Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).
  5. Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).
  6. Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum. Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).
  7. Le Belle, J. E., et al. Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
  8. Nayernia, Z., et al. Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC. Redox Biology. 13, 82-93 (2017).
  9. Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture. Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).
  10. Munnamalai, V., et al. Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones. Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).
  11. Kishida, K. T., et al. Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease. Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).
  12. Ravelli, K. G., et al. Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis. Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).
  13. Park, L., et al. Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).
  14. Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence. Scientific Reports. 7 (1), 8752(2017).
  15. Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
  16. Bilan, D. S., Belousov, V. V. New tools for redox biology: from imaging to manipulation. Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).
  17. Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology. Laboratory Animal Research. 36 (1), 12(2020).
  18. Sassen, W. A., Koster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).
  19. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  20. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).
  21. Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 8 (3), 57539(2013).
  22. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments. (40), e2028(2010).
  23. Suter, D. M. Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro. Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).
  24. Weaver, C. J., et al. nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity. Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).
  25. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).
  26. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PLoS One. 7 (6), 40132(2012).
  27. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222(2014).
  28. Oparka, M., et al. Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer. Methods. 109, 3-11 (2016).
  29. Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain. Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).
  30. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).
  31. Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
  32. Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues. Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).
  33. Breus, O., Dickmeis, T. Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration. Biological Chemistry. , (2020).
  34. Morgan, B., et al. Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes. Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).
  35. Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Bilan, D. S., Belousov, V. V. HyPer family probes: State of the art. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).
  37. Ermankova, Y. G., et al. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range. Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).
  38. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  39. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Reaktywne formy tlenubiosensor nadtlenku wodoruzarodki danio pręgowanegokomórki zwojowe siatkówkisensor roGFP2-Orp1mikroskopia konfokalnawzrost aksonówobrazowanie in vivo
Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.