Artykuł metodologiczny

Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

DOI:

10.3791/62165

⸱

9 lutego 2021

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanego biosensora nadtlenku wodoru (H2O2) w hodowanych neuronach i larwach zebry do oceny fizjologicznych ról sygnalizacyjnych H2O2 podczas rozwoju układu nerwowego. Może być stosowany do różnych typów komórek i modyfikowany za pomocą eksperymentalnych zabiegów w celu zbadania reaktywnych form tlenu (ROS) w ogólnym rozwoju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reaktywne formy tlenu (ROS) są dobrze znanymi cząsteczkami sygnałowymi, które są ważne w prawidłowym rozwoju, homeostazie i fizjologii. Spośród różnych ROT nadtlenek wodoru (H2O2) jest najlepiej scharakteryzowany pod względem ról w sygnalizacji komórkowej. H2O2 został zaangażowany podczas rozwoju u kilku gatunków. Na przykład przejściowy wzrostH2O2 wykryto w zarodkach danio pręgowanego w pierwszych dniach po zapłodnieniu. Ponadto wyczerpanie ważnego komórkowego źródłaH2O2, oksydazy NADPH (NOX), upośledza rozwój układu nerwowego, taki jak różnicowanie, wzrost aksonów i kierowanie komórkami zwojowymi siatkówki (RGC) zarówno in vivo, jak i in vitro. W tym miejscu opisujemy metodę obrazowania wewnątrzkomórkowych poziomówH2O2w hodowanych neuronach danio pręgowanego i całych larwach podczas rozwoju przy użyciu genetycznie kodowanego biosensora specyficznego dlaH2O2, roGFP2-Orp1. Sonda ta może być przejściowo lub stabilnie wyrażana w larwach danio pręgowanego. Co więcej, odczyt ratiometryczny zmniejsza prawdopodobieństwo wykrycia artefaktów z powodu różnicowej ekspresji genów lub efektów objętościowych. Po pierwsze, pokazujemy, jak izolować i hodować RGC pochodzące z zarodków zebry danio pręgowanego, które przejściowo eksprymują roGFP2-Orp1. Następnie używamy całych larw do monitorowania poziomuH2O2na poziomie tkanki. Czujnik został zwalidowany przez dodanieH2O2. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do pomiaru poziomówH2O2w określonych typach komórek i tkankach poprzez generowanie zwierząt transgenicznych z ekspresją biosensorów specyficzną dla danej tkanki. Ponieważ danio pręgowany ułatwia manipulacje genetyczne i rozwojowe, zademonstrowane tutaj podejście może posłużyć jako narzędzie do testowania roliH2O2podczas rozwoju neuronalnego i ogólnego rozwoju embrionalnego u kręgowców.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sygnalizacja reaktywnych form tlenu (ROS) reguluje rozwój i funkcjonowanie układu nerwowego1. Ważnym źródłem komórkowym ROS są oksydazy NADPH (NOX), które są białkami transbłonowymi wytwarzającymi ponadtlenek i nadtlenek wodoru (H2O2)<sup class="xref">2. Enzymy NOX znajdują się w całym ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), a ROS pochodzące z NOX przyczyniają się do rozwoju neuronów3,4,5,6. Wykazano, że utrzymanie i różnicowanie nerwowych komórek macierzystych, ustalanie polaryzacji neuronów, wzrost neurytów i plastyczność synaptyczna wymagają odpowiedniego poziomu ROS7,8,9,10,11. Z drugiej strony, niekontrolowana produkcja ROS przez NOX przyczynia się do zaburzeń neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera, stwardnienia rozsianego i urazowego uszkodzenia mózgu12,13,14. W związku z tym produkcja fizjologicznie istotnych ROS ma kluczowe znaczenie dla utrzymania zdrowych warunków.

Rozwój genetycznie kodowanych biosensorów znacznie ułatwił wykrywanie komórkowych ROS. Jedną z ważnych zalet genetycznie kodowanych biosensorów jest zwiększona rozdzielczość czasowa i przestrzenna sygnału ROS, ponieważ czujniki te mogą być specjalnie ukierunkowane na różne lokalizacje. Wrażliwy na redoks GFP (roGFP) jest jednym z rodzajów takich bioczujników ROS. Wariant roGFP2-Orp1 specyficznie wykrywaH2O2 poprzez swoją domenę Orp1, która jest białkiem z rodziny peroksyredoksyn glutationu z drożdży15,16. Utlenianie białka Orp1 jest przenoszone do roGFP2 w celu zmiany jego konformacji (Rysunek 1A). Sonda wykazuje dwa piki wzbudzenia w pobliżu 405 nm i 480 nm oraz pojedynczy pik emisji przy 515 nm. Po utlenieniu zmienia się intensywność fluorescencji wokół pików wzbudzenia: podczas gdy wzbudzenie 405 nm wzrasta, wzbudzenie 480 nm maleje. Tak więc roGFP2-Orp1 jest biosensorem ratiometrycznym, a poziomyH2O2 są wykrywane przez stosunek intensywności fluorescencji wzbudzonych na dwóch różnych długościach fal (Rysunek 1B). Ogólnie rzecz biorąc, roGFP2-Orp1 jest wszechstronnym narzędziem do obrazowania ROS, które może być efektywnie wykorzystywane in vivo.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie i widma wzbudzenia roGFP2-Orp1. (A) Transfer utleniacza zachodzi między Orp1 i roGFP2 w odpowiedzi na H2O2, prowadząc do zmian konformacyjnych w roGFP2. (B) Widma wzbudzenia roGFP2-Orp1 wykazują dwa piki wzbudzenia przy 405 nm i 480 nm oraz pojedynczy pik emisyjny przy 515 nm. Po utlenieniu przezH2O2 wzbudzenie 405 nm wzrasta, podczas gdy wzbudzenie 480 nm maleje. W ten sposób uzyskuje się ratiometryczny odczyt obecnościH2O2. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie Bilan and Belousov (2017)16 i Morgan et al. (2011)25. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

System modelu danio pręgowanego ma kilka zalet w stosowaniu genetycznie kodowanych biosensorów. Przezroczystość optyczna zarodków i larw umożliwia nieinwazyjne obrazowanie in vivo. Opracowywane są nowe narzędzia do obrazowania, aby osiągnąć wyższą rozdzielczość i głębszą penetrację17. Ponadto istnieją uznane narzędzia do manipulacji genetycznej (ektopowa ekspresja mRNA, transgeneza Tol2 itp.) oraz edycji genomu (TALENs, CRISPR/Cas9 itp.), które promują tworzenie transgenicznych zwierząt18. Ponieważ zarodki danio pręgowanego rozwijają się poza matką, system ten umożliwia jeszcze łatwiejszy dostęp do zarodków i manipulację nimi. Na przykład można łatwo wykonać zastrzyki jednokomórkowe i leczenie farmakologiczne.

Tutaj użyliśmy danio pręgowanego do przejściowej ekspresji biosensora H2O2 roGFP2-Orp1 poprzez wstrzyknięcie mRNA transkrybowanego in vitro. Zarodki te mogą być wykorzystywane zarówno do obrazowania in vitro hodowanych neuronów, jak i do obrazowania in vivo (Ryc. 2). Opisujemy protokół preparowania i siatkowania komórek zwojowych siatkówki (RGC) z zarodków danio pręgowanego, a następnie oceny poziomówH2O2w hodowanych neuronach. Następnie przedstawiono metodę obrazowania in vivo zarodków i larw wykazujących ekspresję roGFP2-Orp1 za pomocą mikroskopii konfokalnej. Takie podejście pozwala nie tylko na określenie fizjologicznych poziomówH2O2, ale także potencjalnych zmian zachodzących w różnych etapach rozwoju lub warunkach. Ogólnie rzecz biorąc, system ten zapewnia niezawodną metodę wykrywaniaH2O2w żywych komórkach i zwierzętach w celu zbadania roliH2O2w rozwoju, zdrowiu i chorobie.

figure-introduction-2
Rysunek 2. Zarys podejścia eksperymentalnego. Krótko, po pobraniu zarodka, mRNA roGFP2-Orp1 jest wstrzykiwane do żółtka jednokomórkowych zarodków danio pręgowanego. Rozwijające się zarodki mogą być wykorzystywane zarówno do (A) obrazowania in vitro, jak i (B) in vivo. (A) Zarodki GFP-dodatnie wykorzystuje się do preparowania siatkówki w celu pobrania RGC w temperaturze 34 hpf. Zdysocjowane RGC są powlekane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PDL/lamininą w mediach ZFCM (+). Obrazowanie stożków wzrostu można przeprowadzić, ponieważ RGC wydłużają swoje aksony po 6-24 godzinach posiewu. Komórki można poddawać różnym zabiegom w celu zmierzenia potencjalnych zmian w poziomachH2O2. Tutaj zmierzyliśmy poziomyH2O2-poziomyw stożkach wzrostu RGC (czerwony). (B) Zarodki z dodatnim wynikiem GFP wykorzystuje się do obrazowania in vivo. W pożądanym wieku zarodki mogą być znieczulane i umieszczane na naczyniach ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w celu obrazowania konfokalnego. W tym przypadku zarodki są montowane brzusznie w celu obrazowania siatkówki. Schemat przedstawia rozwój siatkówki u danio pręgowanego. RGC tworzą warstwę komórek zwojowych (GCL), która jest najbardziej wewnętrzną warstwą siatkówki. Aksony RGC rozwijają się w nerw wzrokowy, który przekracza linię środkową, tworząc skrzyżowanie wzrokowe. Następnie aksony RGC rosną grzbietowo, tworząc synapsy w tektum wzrokowym w śródmózgowiu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały etycznie sprawdzone i zatwierdzone przez Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), zgodnie z wytycznymi NIH, a protokół 2006002050 zatwierdzony 24.07.2020.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Nośniki E2 (1x)
    1. Przygotować roztwory 100 x E2A (500 ml), 500 x E2B (100 ml) i 500 x E2C (100 ml), łącząc wszystkie składniki pokazane w Tabeli 1. Autoklaw roztworów E2A, E2B i E2C. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Dla pożywek 1x E2: Połącz 5 ml 100x E2A, 1 ml 500x E2B i 1 ml 500x E2C. Doprowadzić objętość do 500 ml sterylną wodą. Dostosuj pH do 7,0-7,5.
    3. Przygotować 50 ml porcji 1x E2 przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania. Jednak po rozmrożeniu mogą wystąpić opady. Upewnij się, że wytrącanie się całkowicie rozpuszczone przed użyciem roztworu podstawowego.
powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
rozwiązanieskładnikkwotakoncentracja
100X E2A (500 ml)
Zawartość NaCl43,8 gr1500 mM
Kcl1,88 gr50 mM
MgSO46 gramów100 mM
KH2PO41,03 gr15 mM
Na2HPO40,34 grama5 mM
500X E2B (100 ml)
CaCl25,5 gr500 mM
500X E2C (100 ml)
NaHCO33 gramów350 mM
1X E2 (500 ml)
100X E2A5 ml1X
500X E2B1 ml1X
500X E2C1 ml1X

Tabela 1: Składniki pożywki 1x E2 do hodowli komórek danio pręgowanego.

  1. Nośniki E3 (1x)
    1. Rozpuść składniki w 1 l sterylnej wody, jak pokazano w tabeli 2, aby uzyskać 100-krotny bulion. Rozcieńczyć bulion w sterylnej wodzie, aby uzyskać 1x pożywkę E3.
    2. Dodaj 0,2% błękitu metylenowego. Na 20 ml pożywki 1x E3 dodaj 40 μl błękitu metylenowego.
    3. Wykonaj kolejną partię bez błękitu metylenowego do obrazowania fluorescencyjnego.
szt.
składnikIlość (g)Stężenie w zapasie 100X (mM)
Zawartość NaClGodzina 29,22500
KclPytanie 1,2617
CaCl2 2H2OGodzina 4,8533 Rozdział 33
MgSO4 7H2OKlasa 8.1333 Rozdział 33

Tabela 2: Składniki 100x pożywki E3 do hodowli zarodków danio pręgowanego.

  1. 80x roztwór podstawowy soli fizjologicznej
    1. Połącz wszystkie składniki pokazane w tabeli 3. Dodaj wodę, aby uzyskać 100 ml roztworu. Mieszaj, aż wszystkie składniki się rozpuszczą. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
pkt.
składnikIlość (g)Stężenie w magazynie (mM)
glukozaKlasa 1,44Rozdział 80
Pirogronian sodu0,44Rozdział 40
CaCl2 2H2O0,14810
HEPESY6.1Rozdział 256

Tabela 3: Składniki 80-krotnego roztworu soli do hodowli komórek danio pręgowanego.

  1. Pożywka do hodowli komórek danio pręgowanego (ZFCM+)
    1. Połączyć wszystkie składniki pokazane w tabeli 4, aby uzyskać 250 ml pożywki. Dostosuj pH do 7,5. Filtrować media za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
pkt. pkt.
składnikIlość (ml)Objętość %
Pożywka L-15 (z czerwienią fenolową)212,7585,1
Płodowa surowica bydlęca (FBS)5cyfra arabska
Penicylina/Streptomycyna10,4
80-krotny roztwór soli fizjologicznejPytanie 3,125Wydanie orzeczenia 1,25
WodaGodzina 28 125Godzina 11.25

Tabela 4: Składniki pożywki do hodowli komórek danio pręgowanego z surowicą i antybiotykami.

  1. Pożywka do hodowli komórek danio pręgowanego do obrazowania (ZFCM-)
    1. Połączyć wszystkie składniki pokazane w tabeli 5, aby uzyskać 250 ml pożywki. Dostosuj pH do 7,5. Media filtracyjne za pomocą filtra 0,22 μm.
    2. Przygotuj jednorazowe porcje (partie 50 ml), aby zapobiec zanieczyszczeniu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
pkt. pkt.
składnikIlość (ml)Objętość %
L-15 podłoże (bez czerwieni fenolowej)212,7585,1
80-krotny roztwór soli fizjologicznejPytanie 3,125Wydanie orzeczenia 1,25
WodaRozdział 34.125godz. 13.65

Tabela 5: Składniki pożywki do hodowli komórek danio pręgowanego bez surowicy i antybiotyków do obrazowania in vitro.

  1. Formy wtryskowe
    1. Rozpuść 1,5% agarozy w pożywce E3. Wlej ~ 25 ml agarozy na szalkę Petriego o wymiarach 100 x 15 mm.
    2. Połóż formę na agarozie pod kątem 45° w stosunku do powierzchni i pozwól jej unosić się na agarozie w zwolnionym tempie. Pomoże to uniknąć pęcherzyków. Pozwól agarozie ostygnąć i zestalić się na blacie.
    3. Po całkowitym zestaleniu powoli usuwaj pleśń, aby zapobiec pękaniu agarozy. Dodaj świeże podłoże E3, dodaj folię parafinową wokół naczynia, aby zapobiec rozlaniu, i przechowuj w temperaturze 4 °C ( Rysunek 3).

figure-protocol-1
Rysunek 3: Obrazy form wtryskowych. (A) Plastikowa forma, która jest używana do produkcji płytek wtryskowych. Forma ma sześć ramp, jedną pod kątem 90° i jedną pod kątem 45° do utrzymywania zarodków na miejscu. (B) Płytka wtryskowa po zestaleniu się agarozy i usunięciu pleśni. Podziałka = 1 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie i wstrzyknięcie mRNA roGFP2-Orp1

UWAGA: konstrukt roGFP2-Orp1 został uzyskany od Dr. Tobiasa Dicka, DKFZ, Niemcy. Został on sklonowany do wektora pCS2+ w laboratorium dr Qing Denga na Uniwersytecie Purdue. Aby zapobiec degradacji przez RNazę, należy podjąć kilka środków ostrożności. Odczynniki i probówki wolne od RNaz muszą być używane przez cały czas, rękawice muszą być noszone na wszystkich etapach, a materiały i powierzchnie można przecierać środkiem czyszczącym w celu usunięcia RNazy.

  1. Linearyzuj 3-10 μg wektora pCS2+/roGFP2-Orp1 za pomocą NotI.
  2. Oczyść zlinearyzowany plazmid za pomocą zestawu do czyszczenia PCR.
  3. In vitro należy dokonać transkrypcji mRNA roGFP2-Orp1 za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta.
    1. Zamknięty zestaw reakcji transkrypcyjnej
      1. Umieść polimerazę RNA i zlinearyzowane/oczyszczone DNA na lodzie. Wirować 10x bufor reakcyjny i 2x NTP / CAP, aż znajdą się całkowicie w roztworze. Przechowywać NTP/CAP na lodzie, ale utrzymywać bufor w temperaturze pokojowej (RT) podczas montażu reakcji. Odkręć wszystkie odczynniki dotykowo przed otwarciem probówek, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
      2. Ustawić reakcję syntezy RNA w kolejności wskazanej poniżej w RT w probówce wirówkowej 0,5 ml wolnej od RNaz. Końcowa objętość reakcji wynosi 20 μl. Układ reakcji przedstawiono w tabeli 6.
      3. Dodaj 10 μl mieszanki rybonukleotydów, 2x NTP/CAP i w razie potrzeby wodę wolną od nukleaz do probówki. Dodać 2 μl 10-krotnego buforu reakcyjnego. Dodać 1-1,5 μg liniowego DNA (do 6 μL). W razie potrzeby dodać wodę wolną od nukleaz, aby uzupełnić 20 μl objętości reakcyjnej.
      4. Zamknij rurkę, krótko odwiruj i odwiruj mikrofugę dotykową. Dodać 2 μl 10x mieszanki enzymów SP6. Zamknij jednym kliknięciem palca i obracaj dotykiem w mikrofuge.
      5. Umieść w temperaturze 37 °C na 2-2,5 godziny (może trwać do 18 godzin).
        UWAGA: W prezentowanym eksperymencie w celu uzyskania najlepszych wyników przeprowadzono nocną 16-18 godzinną inkubację w temperaturze 37 °C.
      6. Dodać 1 μl DNazy w celu usunięcia matrycy DNA, kliknąć palcem, odwirować dotykowo i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
OdczynnikObjętość (μL)Ilość w reakcji
2X NTP/CAP101X
10X bufor reakcyjnycyfra arabska1X
Matrycowy DNAMaksymalnie 61-1,5 μg
Woda wolna od nukleazDodaj do uzyskania 20 μL
10X mieszanka enzymatyczna SP6cyfra arabska1X

Tabela 6: Konfiguracja reakcji dla transkrypcji mRNA roGFP2-Orp1 in vitro.

  1. Odzyskiwanie RNA
    1. Dodać 25 μl chlorku litu (LiCl) dostarczonego w zestawie do transkrypcji in vitro. Umieścić w temperaturze -20 °C w zamrażarce bez szronu na co najmniej 30 minut.
    2. Wirować przez 25 minut z maksymalną prędkością w wirówce stołowej w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant, aby nie naruszyć osadu. Dodać 25 μl zimnego 75% etanolu i wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Pozostaw granulat do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej. Nie pozwól, aby wyschło. Dodać 12 μl wolnego od nukleaz buforu Tris-EDTA (TE) (pH 7,0) i utrzymać próbkę na lodzie.
    4. Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru. Zwykle uzyskuje się 0,5-1 μg/μL.
    5. Przygotować 100 ng/μl mRNA w roztworze czerwieni fenolowej (0,5% czerwieni fenolowej w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej Dulbecco -DPBS) i podwielokrotność do jednorazowego użytku (3-5 μl). Przechowywać porcje mRNA w temperaturze -80 °C.
  1. Mikroiniekcja mRNA
    1. W dniu wstrzyknięcia użyj jednej z podwielokrotności mRNA i postępuj zgodnie z protokołem wstrzykiwania zarodków danio pręgowanego, aby wstrzyknąć 1 nL mRNA do zarodków w stadium jednokomórkowym przez ich żółtko19. Krótki opis znajduje się poniżej.
    2. Hoduj dorosłe ryby i zbieraj zarodki zgodnie z wcześniejszym opisem20.
    3. Wyciągnij igły do mikroiniekcji za pomocą ściągacza do pipet. Przetnij końcówkę igieł kleszczami, aby utworzyć otwór na końcówkę o wielkości 10 μm.
    4. Wyrównaj zarodki w formie wtryskowej, która została opisana w kroku 1.6.
    5. Wstrzyknąć 1 nl mRNA w czerwieni fenolowej za pomocą szklanej pipety do mikroiniekcji.
    6. Zbierz zarodki i przechowuj je na pożywce E3.
    7. Przechowywać zarodki w inkubatorze w temperaturze 27 °C na pożywce E3 do czasu osiągnięcia pożądanego stadium rozwojowego. Zarodki, którym wstrzyknięto zarodki, mogą być wykorzystywane zarówno do obrazowania in vitro (sekcja 3 i sekcja 4), jak i do obrazowania in vivo (sekcja 5). Zarodki wykazujące ekspresję roGFP2-Orp1 mogą być wstępnie wybrane przed eksperymentami za pomocą zwykłego mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w światło fluorescencyjne i zestaw filtrów niebiesko-zielonych.

3. Pierwotna hodowla komórek zwojowych siatkówki pochodzących z zarodków danio pręgowanego

UWAGA: Ten protokół jest adaptacją wcześniej opublikowanej metody 21. Wykonaj kroki 3.1 i 3.2 w okapie z przepływem laminarnym.

  1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
    1. Przygotuj 4-6 płytek hodowlanych w każdym eksperymencie. Używaj szkiełek nakrywkowych oczyszczonych kwasem (22 x 22 mm kwadrat; grubość 0,16-0,19 mm), które są przechowywane w 100% etanolu.
    2. Usuń jedno szkiełko nakrywkowe z pojemnika do przechowywania za pomocą kleszczy i podpal je, aby usunąć resztki etanolu.
    3. Całkowicie wysuszyć szkiełko nakrywkowe, umieszczając je pod kątem w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm.
    4. Przygotuj roztwór roboczy poli-D-lizyny (PDL) (1x), rozcieńczając 10x zapas (5 mg/ml) w sterylnej wodzie.
    5. Nanieść 100 μl 0,5 mg/ml PDL na środek każdego szkiełka nakrywkowego i unikać rozprowadzania roztworu na krawędziach.
    6. Inkubować PDL na szkiełkach nakrywkowych przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej (RT). Upewnij się, że PDL nie wysycha.
    7. Umyj PDL trzykrotnie 0.5 ml sterylnej wody. Pozostaw talerze do całkowitego wyschnięcia.
    8. Przygotuj roztwór roboczy z lamininą (1x), rozcieńczając 50x bulion (1 mg / ml) w 1x PBS.
    9. Nałóż 100 μl 20 μg/ml lamininy w PBS na środek każdego szkiełka nakrywkowego i unikaj rozprowadzania roztworu na krawędziach.
    10. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze przez 2-6 godzin. Unikać wysuszenia roztworu lamininy.
  2. Sekcja zarodków i posiewanie RGC
    1. Przygotować i oznaczyć cztery 35-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych i napełnić 4 ml 70% etanolu, "pożywki E2 1", "pożywki E2 2", "pożywki E2 3" w dniu sekcji. Trzymaj naczynia w lodówce do momentu rozwarstwienia.
    2. Gdy zarodki danio pręgowanego są 34 godziny po zapłodnieniu (hpf), wyjmij szalki hodowlane pokryte lamininą z inkubatora i umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie 0,5 ml 1x PBS.
    3. Po ostatnim umyciu dodaj 4 ml pożywki ZFCM(+) do każdego naczynia hodowlanego i unikaj wysuszania płytki.
    4. Pobierz przygotowane szalki z kultur z kroku 3.2.1. Niech zrównoważą się z RT.
    5. Napełnij 4-6 probówek PCR 15 μl pożywki ZFCM(+). Jedna tubka jest potrzebna do przygotowania RGC z 4 oczek, które mają być posiane na jednym szkiełku nakrywkowym.
    6. Pobrać zarodki danio pręgowanego z inkubatora i zanurzyć je w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 70% etanolu na 5-10 sekund w celu sterylizacji.
    7. Za pomocą pipety transferowej przenieś zarodki do naczynia E2 Media 1 zawierającego sterylne podłoże E2, aby zmyć nadmiar etanolu.
    8. Przenieś zarodki do szalki E2 Media 2 i usuń ich kosmówkę ostrymi kleszczami.
    9. Przenieś zarodki do końcowej szalki E2 Media 3 w celu przeprowadzenia sekcji.
    10. Za pomocą cienkich kleszczyków wypreparuj siatkówki zgodnie z wcześniejszym opisem 22.
    11. Umieść i przytrzymaj zarodki przed ich żółtkiem za pomocą jednego z kleszczy, a drugim kleszczami usuń ogon za woreczkiem żółtkowym.
    12. Chwyć szyję kleszczami i zdejmij głowę, aby wystawić mózg i oczy na działanie mediów E2. Unikaj krojenia woreczka żółtkowego.
    13. Czubkiem cienkich kleszczy delikatnie odsuń oczy od głowy, jednocześnie przytrzymując tkankę czaszki drugimi kleszczami. Trzymaj oczy odizolowane od sąsiednich resztek tkanek.
    14. Przenieść cztery oczka do jednej z wcześniej przygotowanych probówek zawierających ZFCM(+).
    15. Delikatnie miareczkować w górę i w dół za pomocą pipety P20 i żółtej końcówki około 45 razy, aby zdysocjować komórki. Unikaj pęcherzyków powietrza.
    16. Przenieść ZFCM(+) ze zdysocjowanymi komórkami do środka szkiełka nakrywkowego. Powtórz kroki 10-12, aby uzyskać dodatkowe szkiełka nakrywkowe.
    17. Utrzymuj kultury na stole w temperaturze 22 °C na stojaku z pianki polistyrenowej, aby pochłaniać wibracje.
    18. Wykonaj obrazowanie 6-24 h po poszyciu.
      UWAGA: Użyj pipety transferowej, aby przemieścić zarodki do różnych szalek hodowlanych. Zmień pipetę dla każdego roztworu, aby zapobiec przenoszeniu etanolu (kroki 6-8).

4. Obrazowanie in vitro ROS hodowanych neuronów RGC

  1. W dniu obrazowania (zwykle 6-24 godziny po posiewie komórek) sprawdź komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić wzrost aksonów RGC.
  2. W przypadku obrazowania żywych komórek przenieś szkiełka nakrywkowe z naczynia hodowlanego do komory obrazowania żywych komórek. W tym przypadku użyto specjalnie zaprojektowanej otwartej komory, która została wcześniej opisana23.
  3. Skonfiguruj mikroskop do obrazowania. Użyj odwróconego mikroskopu wyposażonego w obiektyw z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC), długoprzepustowy filtr czerwony OG590 i kamerę EM-CCD.
  4. Przed obrazowaniem należy wymienić pożywkę ZFCM(+) na ZFCM(-).
  5. Po ustawieniu komórek z 10-krotnym obiektywem uzyskuj obrazy w 60-krotnym powiększeniu za pomocą obiektywu immersyjnego z olejkiem o wysokiej NA. Użyj dodatkowego powiększenia 1,5x.
  6. Najpierw uzyskaj obrazy DIC. Następnie należy zobrazować roGFP2-Orp1 za pomocą odpowiedniego zestawu filtrów. Wzbudz roGFP2-Orp1 z filtrami wzbudzenia 405/20 i 480/30 nm sekwencyjnie i uzyskaj obrazy za pomocą filtra emisyjnego 535/30 nm po przejściu światła emisyjnego przez zwierciadło dichroiczne 505DCXR.
  7. Po wykonaniu pierwszego zestawu obrazów należy wymienić pożywkę na pożywkę zawierającą różne roztwory do obróbki. Pożywki należy wymieniać co 30 minut obrazowania, aby uniknąć zmian pH i osmolarności.

5. Obrazowanie in vivo ROS rozwijających się zarodków

  1. W przypadku obrazowania in vivo należy przechowywać zarodki w pożywce E3 zawierającej 0,003% fenylotiomocznika (PTU) bez błękitu metylenowego od 22-24 hpf. Codziennie wymieniaj się pożywkami i usuwaj martwe zarodki.
  2. W pożądanym wieku znieczulić zarodki w 0,016% tricaine. Zamontuj znieczulone zarodki w 1% niskotopliwej agarozie na 35-milimetrowych szklanych szalkach hodowlanych. Zarodki mogą być zorientowane grzbietowo, brzusznie lub bocznie, w zależności od obszaru zainteresowania do obrazowania.
  3. Po zestaleniu się agarozy napełnij naczynia pożywką E3 bez błękitu metylenowego/0,016% trikainy.
  4. Ustaw mikroskop do obrazowania. Użyj odwróconego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Alternatywnie, użyj pionowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w soczewkę zanurzeniową w wodzie, aby zobrazować zarodki zamontowane na kropli agarozy.
  5. Wzbudz sekwencyjnie roGFP2-Orp1 z filtrami wzbudzenia 405 nm i 488 nm i uzyskaj odpowiednie obrazy za pomocą filtrów emisyjnych w zakresie 515-535 nm.
  6. Pobrać stosy z o grubości przekroju 5 μm przez żądaną część zarodków. Zarodki mogą być przechowywane do obrazowania na późniejszych etapach rozwoju.
  7. Po obrazowaniu usuń zarodki z agarozy za pomocą drobnych kleszczyków i trzymaj w inkubatorze do pożądanego wieku w pożywce wolnej od błękitu metylenowego z PTU.

6. Analiza i przetwarzanie obrazu

  1. Pomiar poziomówH2O2w oparciu o wartości współczynnika 405/480
    1. Użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu. Do analizy i przetwarzania obrazu wykorzystano tu oprogramowanie ImageJ.
    2. Otwórz obrazy DIC, 405/535 i 480/535 w oprogramowaniu ImageJ, przeciągając pliki lub klikając Plik | Otwarty. Jeśli jeszcze tego nie zrobiono, przekonwertuj obrazy na 32-bitowe, klikając Obraz | Rodzaj | Wersja 32-bitowa.
    3. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia odręcznego z paska sterowania (korpus komórki, stożek wzrostu, siatkówka itp.). Otwórz menedżera ROI, klikając pozycję Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji. Kliknij przycisk Dodaj na karcie Menedżer ROI, aby dodać zdefiniowany ROI.
    4. Narysuj region blisko ROI i dodaj jako tło ROI. Zmierz średnie wartości tła, wybierając ROI i klikając opcję Zmierz na karcie Menedżer ROI.
    5. Zanotuj średnie wartości intensywności z pomiaru. Odejmij wartość średniego tła od obrazów fluorescencyjnych, klikając przycisk Proces | Matematyka | Odejmować. Wykonaj ten krok zarówno dla obrazów 405/535, jak i 480/535.
    6. Dodaj wartość "1" do obrazu fluorescencyjnego 480/535, aby wyeliminować wartości "0", klikając Proces. | Matematyka | Dodaj funkcję przed obliczeniem współczynnika.
    7. Kliknij opcję Process (Proces) | Kalkulator obrazów | Funkcja dzielenia w ImageJ, aby podzielić obraz 405/535 przez 480/535 piksel po pikselu. Wybierz obraz 405/535, który ma zostać podzielony przez obraz 480/535. Wybierz 32-bitowy obraz wyjściowy.
    8. Zastosuj ROI do obrazu proporcji, klikając najpierw obraz proporcji, a następnie ROI na karcie Menedżer ROI.
    9. Zmierz średnie wartości proporcji obrazu 405/535 do obrazu 480/535, klikając opcję Zmierz na karcie Menedżer zwrotu z inwestycji.
    10. Wykonaj kroki 6.1.2-6.1.9 dla jak największej liczby próbek, aby przeprowadzić odpowiednią analizę statystyczną.
  2. Współczynnik wyświetlania image
    UWAGA: Ta procedura polega na odjęciu tła poza próbką i zastosowaniu tabeli wyszukiwania kolorów do obrazu.
    1. Po utworzeniu obrazu o proporcjach w programie ImageJ w kroku 6.1.7 utwórz 32-bitowy obraz, klikając Plik | Nowość | Obraz.
    2. Zastosuj ROI, dla którego chcesz wyświetlić poziomyH2O2, do nowego obrazu, klikając najpierw nowy obraz, a następnie ROI na karcie Menedżer ROI.
    3. Utwórz maskę, klikając Edytuj | Selekcja | Utwórz maskę.
    4. Podziel obraz maski przez 255, aby dostosować wartość ROI do "1", a wartości tła będą wynosić "0". Kliknij opcję Process (Proces) | Matematyka | Podziel i wpisz 255.
    5. Pomnóż maskę z obrazem proporcji, klikając przycisk Proces | Kalkulator obrazów | Funkcja mnożenia. Spowoduje to powstanie obrazu w skali szarości pokazującego tylko zwrot z inwestycji.
    6. Zmień tabelę wyszukiwania na "Odpal", klikając Obraz | Tabele przeglądowe | Fire.
      UWAGA: Współczynnik mnożenia można zastosować do wszystkich obrazów w celu lepszej wizualizacji stosunku, klikając opcję Procesuj | Obraz | Pomnóż się.
    7. Przekonwertuj obraz o proporcjach na 8-bitowy, klikając Obraz | Rodzaj | 8-bitowy.
    8. Dodaj pasek kalibracji, klikając przycisk Analizuj | Narzędzia | Pasek kalibracji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowlane RGC danio pręgowanego rozszerzają aksony w obrębie 1d. Reprezentatywny obraz biosensora H2O2 2 w proporcjach 405/480 pokazano na stronie Rysunek 4A. Ciało komórki, akson i stożki wzrostu są wyraźnie widoczne w poszczególnych neuronach. Neurony te mogą być poddawane różnym zabiegom w czasie w celu monitorowania zmianH2O2. Wcześniej odkryliśmy, że dodanie 100 μM H2O2 do pożywki hodowlanej zwiększa wartości proporcji, co pokazuje...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W całym tym protokole istnieje kilka krytycznych kroków, które wymagają uwagi. Wierzymy, że uwzględnienie tych punktów poprawi przebieg eksperymentów. W przypadku pierwotnej hodowli RGC sterylność ZFCM(-) jest bardzo ważna, ponieważ pożywka ta nie zawiera antybiotyków i może dojść do zanieczyszczenia przed lub w trakcie obrazowania. Aby tego uniknąć, zalecamy przygotowanie i stosowanie ZFCM(-) wyłącznie w komorze bezpieczeństwa biologicznego i regularne przygotowywanie świeżych pożywek ZFCM(-) (Krok 1.5). Ponadto zapasy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (Grant R01NS117701), National Science Foundation (Grant 1146944-IOS), Indiana Traumatic Spinal Cord and Brain Injury Research Fund (Grant 20000289), Purdue Research Foundation (Grant 209911), oraz Biuro Wiceprezesa Wykonawczego ds. Badań i Partnerstw na Uniwersytecie Purdue (Grant 210362). Dziękujemy dr Cory'emu J. Weaverowi i Haley Roeder za ustanowienie protokołu hodowli RGC danio pręgowanego. Dziękujemy również Haley Roeder za udostępnienie danych z rysunku 4. Dziękujemy Leah Biasi i Kenny'emu Nguyenowi za pomoc w kulturze RGC. Dziękujemy Gentry Lee za redakcję tekstu. Dziękujemy dr Tobiasowi Dickowi za dostarczenie roGFP2-Orp1 i dr Qing Deng za wektor pCS2+ zawierający roGFP2-Orp1. Rysunek 2 jest tworzony za pomocą Biorender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie hodowlane 35 mmSarstedt83-3900
Naczynie ze szklanym dnem 35 mmMatTekP35G-1.5-10-C
AgarozaFisher ScientificBP160-500
Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowegoSutter/Fisher ScientificNC9029378
Dwuwodny chlorek wapniaFisher ScientificC79-500
Szkło osłonoweCorning2850-22
Jednorazowe szalki Petriego (100 x 15 mm)VWR25384-094
Surowica bydlęcapłodu ThermoFisher Scientific26140087
GlukozaSigma AldichG7528
HEPESSigma AldichH4034
Adaptacyjne narzędzia naukoweform wtryskowychTU-1
Mikroskop odwróconyNikonTE2000
LamininThermoFisher Scientific23017-015
Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalnaZeiss710
Leibovitz L-15 Medium z czerwienią fenolowąGibco/Fisher Scientific11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium bez czerwieni fenolowejGibco/Fisher Scientific21-083-027
Niskotopliwa agarozaPromegaV2111
mMessage Zestaw do transkrypcji mMachine SP6InvitrogenAM1340
NotINew England BiolabsR0189S
PBSHyclone/Fisher ScientificSH3025601
Penicylina/streptomycynaThermoFisher Scientific15140122
Phenol RedSigma AldichP0290
Fenylotiomocznik (PTU)Sigma AldichP7629
Pneumatyczna pompa PicoPumpWorld Precision InstrumentsPV820
Poli-D-lizyna (PDL)Sigma AldichP7280
Zestaw do oczyszczania QiaQUICK PCRQIAGEN28104
Rekombinowana mysz szczelina2R& D Systems5444-SL-050
Pirogronian soduSigma AldichP5280
Steritop 0,22 i mikro; m filtrMilliporeS2GPT05RE
TE BufferAmbionAM9860
Metanosulfonian trikainySigma AldichE10521
Pionowy ściągacz do pipetDavid Kopf Instruments700C
do

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bórquez, D. A., et al. Dissecting the role of redox signaling in neuronal development. Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).
  2. Bedard, K., Krause, K. -H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
  3. Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development. Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).
  4. Terzi, A., Suter, D. M. The role of NADPH oxidases in neuronal development. Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).
  5. Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function. Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).
  6. Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum. Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).
  7. Le Belle, J. E., et al. Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
  8. Nayernia, Z., et al. Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC. Redox Biology. 13, 82-93 (2017).
  9. Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture. Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).
  10. Munnamalai, V., et al. Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones. Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).
  11. Kishida, K. T., et al. Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease. Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).
  12. Ravelli, K. G., et al. Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis. Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).
  13. Park, L., et al. Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).
  14. Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence. Scientific Reports. 7 (1), 8752(2017).
  15. Gutscher, M., et al. Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).
  16. Bilan, D. S., Belousov, V. V. New tools for redox biology: from imaging to manipulation. Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).
  17. Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology. Laboratory Animal Research. 36 (1), 12(2020).
  18. Sassen, W. A., Koster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).
  19. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  20. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).
  21. Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio). PLoS One. 8 (3), 57539(2013).
  22. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments. (40), e2028(2010).
  23. Suter, D. M. Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro. Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).
  24. Weaver, C. J., et al. nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity. Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).
  25. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).
  26. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PLoS One. 7 (6), 40132(2012).
  27. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222(2014).
  28. Oparka, M., et al. Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer. Methods. 109, 3-11 (2016).
  29. Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain. Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).
  30. Cannon, M. B., Remington, S. J. Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review. Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).
  31. Meyer, A. J., Dick, T. P. Fluorescent protein-based redox probes. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).
  32. Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues. Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).
  33. Breus, O., Dickmeis, T. Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration. Biological Chemistry. , (2020).
  34. Morgan, B., et al. Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes. Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).
  35. Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Bilan, D. S., Belousov, V. V. HyPer family probes: State of the art. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).
  37. Ermankova, Y. G., et al. SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range. Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).
  38. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  39. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Reaktywne formy tlenubiosensor nadtlenku wodoruzarodki danio pr gowanegokom rki zwojowe siatk wkisensor roGFP2 Orp1mikroskopia konfokalnawzrost akson wobrazowanie in vivo

Powiązane artykuły