Obrazowanie żywych komórek ROS podczas rozwoju neuronów

Summary

Ten protokół opisuje użycie genetycznie kodowanego biosensora nadtlenku wodoru (H₂O₂) w hodowanych neuronach i larwach zebry do oceny fizjologicznych ról sygnalizacyjnych H₂O₂ podczas rozwoju układu nerwowego. Może być stosowany do różnych typów komórek i modyfikowany za pomocą eksperymentalnych zabiegów w celu zbadania reaktywnych form tlenu (ROS) w ogólnym rozwoju.

Abstract

Reaktywne formy tlenu (ROS) są dobrze znanymi cząsteczkami sygnałowymi, które są ważne w prawidłowym rozwoju, homeostazie i fizjologii. Spośród różnych ROT nadtlenek wodoru (_H2O2) jest najlepiej scharakteryzowany pod względem ról w sygnalizacji komórkowej. H₂O₂ został zaangażowany podczas rozwoju u kilku gatunków. Na przykład przejściowy wzrost_H2O2 wykryto w zarodkach danio pręgowanego w pierwszych dniach po zapłodnieniu. Ponadto wyczerpanie ważnego komórkowego źródła_H2O2, oksydazy NADPH (NOX), upośledza rozwój układu nerwowego, taki jak różnicowanie, wzrost aksonów i kierowanie komórkami zwojowymi siatkówki (RGC) zarówno in vivo, jak i in vitro. W tym miejscu opisujemy metodę obrazowania wewnątrzkomórkowych poziomów_H2O2w hodowanych neuronach danio pręgowanego i całych larwach podczas rozwoju przy użyciu genetycznie kodowanego biosensora specyficznego dla_H2O2, roGFP2-Orp1. Sonda ta może być przejściowo lub stabilnie wyrażana w larwach danio pręgowanego. Co więcej, odczyt ratiometryczny zmniejsza prawdopodobieństwo wykrycia artefaktów z powodu różnicowej ekspresji genów lub efektów objętościowych. Po pierwsze, pokazujemy, jak izolować i hodować RGC pochodzące z zarodków zebry danio pręgowanego, które przejściowo eksprymują roGFP2-Orp1. Następnie używamy całych larw do monitorowania poziomu_H2O2na poziomie tkanki. Czujnik został zwalidowany przez dodanie_H2O2. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do pomiaru poziomów_H2O2w określonych typach komórek i tkankach poprzez generowanie zwierząt transgenicznych z ekspresją biosensorów specyficzną dla danej tkanki. Ponieważ danio pręgowany ułatwia manipulacje genetyczne i rozwojowe, zademonstrowane tutaj podejście może posłużyć jako narzędzie do testowania roli_H2O2podczas rozwoju neuronalnego i ogólnego rozwoju embrionalnego u kręgowców.

Introduction

Sygnalizacja reaktywnych form tlenu (ROS) reguluje rozwój i funkcjonowanie układu nerwowego¹. Ważnym źródłem komórkowym ROS są oksydazy NADPH (NOX), które są białkami transbłonowymi wytwarzającymi ponadtlenek i nadtlenek wodoru (_H2O2)<sup class="xref">2. Enzymy NOX znajdują się w całym ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), a ROS pochodzące z NOX przyczyniają się do rozwoju neuronów^3,4,5,6. Wykazano, że utrzymanie i różnicowanie nerwowych komórek macierzystych, ustalanie polaryzacji neuronów, wzrost....

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały etycznie sprawdzone i zatwierdzone przez Purdue Animal Care and Use Committee (PACUC), zgodnie z wytycznymi NIH, a protokół 2006002050 zatwierdzony 24.07.2020.

1. Przygotowanie roztworów

1. Nośniki E2 (1x)
   1. Przygotować roztwory 100 x E2A (500 ml), 500 x E2B (100 ml) i 500 x E2C (100 ml), łącząc wszystkie składniki pokazane w Tabeli 1. Autoklaw roztworów E2A, E2B i E2C. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Dla pożywek 1x E2: Połącz 5 ml 100x E2A, 1 ml 500x E2B i 1 ml 500x E2C. Doprowadzić objętość do 500 ml sterylną wodą. Dostosuj pH do 7,0-7,5.
   ....

Results

Hodowlane RGC danio pręgowanego rozszerzają aksony w obrębie 1d. Reprezentatywny obraz biosensora H₂O_{2 2} w proporcjach 405/480 pokazano na stronie Rysunek 4A. Ciało komórki, akson i stożki wzrostu są wyraźnie widoczne w poszczególnych neuronach. Neurony te mogą być poddawane różnym zabiegom w czasie w celu monitorowania zmian_H2O2. Wcześniej odkryliśmy, że dodanie 100 μM H₂O₂ do pożywki hodowlanej zwiększa wartości proporcji, co pokazuje.......

Discussion

W całym tym protokole istnieje kilka krytycznych kroków, które wymagają uwagi. Wierzymy, że uwzględnienie tych punktów poprawi przebieg eksperymentów. W przypadku pierwotnej hodowli RGC sterylność ZFCM(-) jest bardzo ważna, ponieważ pożywka ta nie zawiera antybiotyków i może dojść do zanieczyszczenia przed lub w trakcie obrazowania. Aby tego uniknąć, zalecamy przygotowanie i stosowanie ZFCM(-) wyłącznie w komorze bezpieczeństwa biologicznego i regularne przygotowywanie świeżych pożywek ZFCM(-) (Krok 1.5). Ponadto zapasy .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naczynie hodowlane 35 mm	Sarstedt	83-3900
Naczynie ze szklanym dnem 35 mm	MatTek	P35G-1.5-10-C
Agaroza	Fisher Scientific	BP160-500
Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego	Sutter/Fisher Scientific	NC9029378
Dwuwodny chlorek wapnia	Fisher Scientific	C79-500
Szkło osłonowe	Corning	2850-22
Jednorazowe szalki Petriego (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Surowica bydlęca	płodu ThermoFisher Scientific	26140087
Glukoza	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Adaptacyjne narzędzia naukowe	form wtryskowych	TU-1
Mikroskop odwrócony	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017-015
Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna	Zeiss	710
Leibovitz L-15 Medium z czerwienią fenolową	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium bez czerwieni fenolowej	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Niskotopliwa agaroza	Promega	V2111
mMessage Zestaw do transkrypcji mMachine SP6	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Penicylina/streptomycyna	ThermoFisher Scientific	15140122
Phenol Red	Sigma Aldich	P0290
Fenylotiomocznik (PTU)	Sigma Aldich	P7629
Pneumatyczna pompa PicoPump	World Precision Instruments	PV820
Poli-D-lizyna (PDL)	Sigma Aldich	P7280
Zestaw do oczyszczania QiaQUICK PCR	QIAGEN	28104
Rekombinowana mysz szczelina2	R& D Systems	5444-SL-050
Pirogronian sodu	Sigma Aldich	P5280
Steritop 0,22 i mikro; m filtr	Millipore	S2GPT05RE
TE Buffer	Ambion	AM9860
Metanosulfonian trikainy	Sigma Aldich	E10521
Pionowy ściągacz do pipet	David Kopf Instruments	700C