Artykuł metodologiczny

Dwa testy infekcji do badania nieśmiertelnych fenotypów wirulencji u C. albicans przy użyciu C. elegans

DOI:

10.3791/62170

⸱

17 maja 2021

 ,  , 
1Graduate Program in Genetics & Molecular Biology, Emory University, 2Department of Biology, Emory University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grzybowe patogeny oportunistyczne mogą powodować zagrażające życiu jak również drobne infekcje, ale nieśmiertelne fenotypy są często ignorowane podczas badania zjadliwości. W związku z tym opracowaliśmy model nicieni, który monitoruje zarówno aspekty przetrwania, jak i reprodukcji gospodarza, aby zbadać zjadliwość grzybów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż patogeny mogą być śmiertelne dla ludzi, wiele z nich powoduje szereg typów infekcji o nieśmiertelnych fenotypach. Candida albicans, oportunistyczny patogen grzybiczy ludzi, jest czwartą najczęstszą przyczyną zakażeń szpitalnych, co skutkuje ~40% śmiertelnością. Jednak inne infekcje C. albicans są mniej poważne i rzadko śmiertelne i obejmują kandydozę sromu i pochwy, dotykającą ~75% kobiet, a także kandydozę jamy ustnej i gardła, dotykającą głównie niemowlęta, pacjentów z AIDS i pacjentów z rakiem. Podczas gdy modele mysie są najczęściej używane do badania patogenezy C. albicans, modele te głównie oceniają przeżycie gospodarza i są kosztowne, czasochłonne i ograniczone w replikacji. W związku z tym opracowano kilka mini-modelowych systemów, w tym Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella i Caenorhabditis elegans, do badania C. albicans. Te mini-modele doskonale nadają się do badań przesiewowych bibliotek mutantów lub różnych środowisk genetycznych C. albicans. Tutaj opisujemy dwa podejścia do badania infekcji C. albicans przy użyciu C. elegans. Pierwszym z nich jest test płodności, który mierzy rozmnażanie gospodarza i monitoruje przeżycie poszczególnych gospodarzy. Drugi to test rozszerzania linii, który mierzy, w jaki sposób infekcja C. albicans wpływa na wzrost populacji gospodarza przez wiele pokoleń. Razem testy te zapewniają prosty i ekonomiczny sposób szybkiej oceny zjadliwości C. albicans.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans to oportunistyczny patogen grzybiczy ludzi zamieszkujący różne nisze, w tym jamę ustną, przewód pokarmowy i moczowo-płciowy1. Chociaż typowo komensalny, C. albicans powoduje zarówno infekcje błony śluzowej, jak i krwi, z których te ostatnie mogą być śmiertelne. Nasilenie zakażenia C. albicans zależy od funkcji immunologicznej gospodarza, przy czym osoby z obniżoną odpornością są bardziej podatne na zakażenie niż osoby zdrowe1. Oprócz czynników związanych z gospodarzem, C. albicans ma kilka cech wirulencji, które obejmują strzępki, tworzenie biofilmu i produkcję wydzielniczych proteinaz aspartylowych (SAP), które działają w celu promowania adhezji i inwazji C. albicans do komórek nabłonka gospodarza2, oraz kandydalyzyna, cytolityczna toksyna peptydowa 3,4. Razem sugeruje to, że zjadliwość C. albicans jest złożonym fenotypem wynikającym z interakcji między patogenem a środowiskiem gospodarza. Dlatego badanie zjadliwości najlepiej badać przy użyciu organizmów modelowych, które służą jako środowisko gospodarza, w przeciwieństwie do podejść in vitro.

Kilka modeli gospodarzy, obejmujących zarówno kręgowce, jak i organizmy bezkręgowe, zostało opracowanych do badania infekcji C. albicans. Model mysi, uważany za złoty standard, jest często używany ze względu na jego adaptacyjny i wrodzony układ odpornościowy oraz zdolność do monitorowania postępu choroby zarówno ogólnoustrojowo, jak i w określonych narządach5. Istnieją jednak znaczące ograniczenia tego modelu gospodarza, w tym koszty utrzymania, mała liczba potomstwa oraz zmniejszona moc i odtwarzalność związane z małymi rozmiarami próbek5. W związku z tym opracowano inne, prostsze organizmy modelowe, takie jak danio pręgowany (Danio rerio), muszka owocowa (Drosophila melanogaster), woskowa (Galleria mellonella) i nicienie (Caenorhabditis elegans). Te organizmy modelowe inne niż ssaki są mniejsze, wymagają mniej konserwacji laboratoryjnej, a większe rozmiary próbek pozwalają na większą moc i odtwarzalność w porównaniu z modelami mysimi. Każdy z tych modeli ma określone zalety i wady, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze modelu infekcji. G. mellonella oferuje najbardziej fizjologicznie podobne środowisko do ludzi, ponieważ może być uprawiana w temperaturze 37 °C i ma różne komórki fagocytarne7. Co więcej, model ten pozwala na bezpośrednie wstrzyknięcie określonego inokulum7. Nie ma jednak w pełni zsekwencjonowanego genomu ani ustalonej metody tworzenia zmutowanych szczepów. Podobnie jak w przypadku G. mellonella, model D. rerio pozwala na bezpośrednie wstrzyknięcie określonego inokulum 5,7. Ma również zarówno adaptacyjny, jak i wrodzony układ odpornościowy5, który jest unikalny dla tego modelu nienależącego do ssaków, ale wymaga wodnych zbiorników hodowlanych do utrzymania. D. melanogaster i C. elegans mają podobne zalety i wady, do których należą w pełni zsekwencjonowane genomy, które są łatwe do manipulowania i generowania zmutowanych szczepów7, ale nie mają odporności adaptacyjnej ani cytokin7. Spośród wszystkich tych modeli nienależących do ssaków, C. elegans ma najszybszy cykl życiowy, samozapładnianie w celu wygenerowania dużej liczby genetycznie identycznego potomstwa i jest najbardziej podatne na badania przesiewowe na dużą skalę6,7,8. C. elegans okazał się niezwykle skuteczny w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków przeciwgrzybiczych9,10, charakteryzując czynniki wirulencji7 i identyfikując sieci obrony gospodarzy specyficzne dla C. albicans11. Wrodzony układ odpornościowy u C. elegans składa się z wielu elementów, które są wysoce konserwatywne u ludzi12. Wrodzone mechanizmy obronne gospodarza obejmują produkcję peptydów przeciwdrobnoustrojowych13 (AMPs) i reaktywnych form tlenu14,15,16.

Dotkliwość infekcji C. albicans jest głównie mierzona przeżywalnością gospodarza, ale nie jest w stanie uchwycić nieśmiertelnych fenotypów wirulencji. Często pomijanym aspektem sprawności gospodarza jest reprodukcja, ale kilka badań sugeruje, że C. albicans wpływa na reprodukcję, zmniejszając żywotność plemników17,18, co sugeruje, że może to być ważny aspekt zdolności gospodarza do badania. Dlatego wpływ zakażenia C. albicans na płodność gospodarza jest użytecznym sposobem badania fenotypów zjadliwości nieletalnej. Opracowaliśmy dwa testy infekcji przy użyciu C. elegans do zbadania fenotypów zarówno przeżycia, jak i reprodukcji u zdrowych gospodarzy19,20. Tutaj opisujemy zarówno testy płodności, jak i rozszerzania linii. Płodność mierzy zarówno wyprodukowane potomstwo, jak i przeżywalność pojedynczych żywicieli, a ekspansja linii ocenia konsekwencje infekcji w ciągu trzech pokoleń gospodarza. Pokazujemy, w jaki sposób te testy można wykorzystać do badań przesiewowych mutantów delecji C. albicans w celu uchwycenia zarówno dramatycznych, jak i subtelnych różnic w letalnych i nieśmiertelnych fenotypach wirulencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Etapy przygotowawcze do eksperymentów

  1. Przygotowanie kultur C. albicans i Escherichia coli
    UWAGA: Szczepy użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli 1.
    1. Utrzymać szczepy C. albicans i E. coli jako zapasy glicerolu w temperaturze -80 °C.
    2. Używając sterylnej wykałaczki, C. albicans przecedzić na stałą dekstrozę peptonu drożdżowego (YPD) (1% ekstraktu drożdżowego, 2% baktopeptonu, 2% glukozy, 1,5% agaru, 0,004% adeniny, 0,008% urydyny) i rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C.
      UWAGA: Jeśli szczep C. albicans jest auksotroficzny, należy uzupełnić pożywkę w niezbędne aminokwasy.
    3. Za pomocą sterylnej pętli lub wykałaczki zaszczepij pojedynczą kolonię C. albicans w 2 ml płynnego YPD. Inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przez 24 godziny.
    4. Za pomocą sterylnej wykałaczki rozprowadź E. coli (OP50) na płytkach agarowych Luria (LB; 10 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 10 g/L NaCl, 15 g/L agar). Inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.
    5. Zaszczepić pojedynczą kolonię OP50 w 50 ml LB. Inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przez noc.
  2. Przygotowanie pożywki dla nicieni
    1. W kolbie o pojemności 2 litrów dodać 29 g sproszkowanej pożywki hodowlanej nicieni (NGM; 17,5 g/l agaru, 3,0 g/l chlorku sodu, 2,5 g/l peptonu, 0,005 g/l cholesterolu) do 1 l wody i wymieszać z mieszadłem.
    2. Aby zahamować przerost E. coli i umożliwić proliferację C. albicans, uzupełnij NGM 0,2 g/L siarczanem streptomycyny po autoklawowaniu.
      UWAGA: W przypadku stosowania NGM do utrzymania nicieni, streptomycyna nie jest wymagana.
  3. Utrzymanie populacji nicieni
    1. Rozprowadzić 300 μl nocnej kultury E. coli na przygotowanych płytkach agarowych NGM za pomocą metalowego rozsiewacza. Ta technika będzie określana jako wysiew.
    2. Pozostaw płytki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT). Talerze uprawiać przez noc w temperaturze 30 °C.
    3. Utrzymuj populację nicieni, krojąc co 3-4 dni na nowo wysianą płytkę NGM z E. coli. Przechowywać w temperaturze 20 °C. Chunking to technika stosowana do szybkiego przenoszenia losowej populacji nicieni na nowo zasianą płytkę, co pozwala na rozmnażanie się populacji. Aby to zrobić, użyj sterylnej szpatułki, aby wyciąć mały kwadrat (1 x 1 cal) z płytki agarowej NGM. Ostrożnie przenieś kwadrat na nową płytkę NGM z nasionami, stroną z nicieniami skierowanymi w dół na nowym agar8.
      UWAGA: C. elegans utrzymywany w temperaturze 20 °C wydaje potomstwo ~48 godzin później, co jest przydatne do rozważenia podczas synchronizacji populacji nicieni. C. elegans utrzymywany w temperaturze 25 °C będzie się rozwijał i rozmnażał szybciej, a populacje utrzymywane w temperaturze 15 °C będą miały wolniejszy wzrost.
  4. Synchronizacja populacji nicieni
    1. Zacznij od istniejącej populacji nicieni utrzymywanej na NGM/OP50.
    2. Odpipetować ~3 ml buforu M9 na płytkę NGM zawierającą nicienie. Zmyj jaja nicieni z talerza i delikatnie użyj końcówki pipety, aby zeskrobać jajka z agaru (mają tendencję do przywierania). Za pomocą pipety P1000 przenieś płyn zawierający zarówno jaja, jak i robaki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Aby ocenić liczbę jaj pozostających na talerzu, użyj mikroskopu preparacyjnego, aby przyjrzeć się agarowi.
    3. Wirówka stożkowa przez 2 minuty przy 279 x g i RT.
    4. Usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu nicieni.
    5. Dodaj 3 ml 25% roztworu wybielacza ("UWAGA" podczas obchodzenia się).
    6. Odwróć rurkę na 2 minuty. Sprawdź, czy nicienie są martwe za pomocą mikroskopu preparacyjnego - będą proste jak patyk i nieruchome.
      UWAGA: To zabije tylko istniejące nicienie. Nie wpłynie to na integralność jaj.
    7. Wirować przez 2 minuty przy 279 x g i RT.
    8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml M9.
    9. Wirować przez 2 minuty przy 279 x g i RT.
    10. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 μl M9.
    11. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego sprawdź stężenie jaj, pipetując 5 μl jaj na małą płytkę Petriego. Idealne stężenie powinno wynosić od 20 do 100 jaj. Jeśli kultura jest zbyt rozcieńczona, zagęścić roztwór, odwirowując i usuwając nadmiar płynu. Jeśli kultura jest zbyt skoncentrowana, dodaj więcej M9, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia.
  5. Przygotować kultury C. albicans i E. coli do zakażenia nicieniami (siew).
    1. Przygotuj ślepy roztwór. W kuwecie wymieszaj 900 μl ddH2O i 100 μl płynnego YPD.
    2. Włóż kuwetę do spektrofotometru. Ustaw długość fali na 600 nanometrów za pomocą strzałki w górę. Kliknij przycisk "0 ABS 100% T", aby ustawić ślepe rozwiązanie.
    3. W nowej kuwecie połącz 900 μl ddH2O i 100 μl nocnej kultury drożdży. Wyjąć roztwór próby ślepej ze spektrofotometru i dodać kuwetę zawierającą roztwór drożdży. Zapisz gęstość optyczną pokazaną na ekranie (nie naciskaj żadnych przycisków). Pomnóż odczyt przez 10 (zmierzony roztwór drożdży był rozcieńczony 1 do 10).
    4. Normalizować hodowlę do 3,0 OD600/ml za pomocą ddH2O w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. 1 OD600 to około 3 x 10-7 CFU/mL class="xref">21.
      UWAGA: Jeśli odczyt OD600 wynosi 6,7, 3 OD/6,7 OD = 0,447 ml, dodaj 447 μl kultury C. albicans do probówki mikrowirówkowej. Wirować z maksymalną prędkością (16 873 x g) przez 30 s. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml ddH2O.
    5. Przenieś nocną hodowlę E. coli do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    6. Odwirować kulturę przy 279 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    7. Odessać większość supernatantu, pozostawiając ~1 ml.
    8. Zawiesić osad w pozostałym supernatantze i przenieść do wstępnie zważonej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    9. Wiruj probówkę mikrowirówki z maksymalną prędkością przez 30 s.
    10. Za pomocą pipety p1000 usunąć supernatant i zważyć ostateczną osadkę.
    11. Rozcieńczyć E. coli do 200 mg/ml w ddH2O.
    12. Użyj obliczeń miksu głównego (tabela 2) i odpowiednio skaluj.

2. Test płodności

UWAGA: Dane reprezentatywne są pokazane w Tabeli Uzupełniającej 1, a schemat w pokazany w Rysunek 1A.

  1. Otrzymać lub przygotować: płytki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm, NGM uzupełnione 0,2 g/L siarczanu streptomycyny, kulturę E. coli OP50, LB, kulturę C. albicans, YPD, Wire Pick, bufor M9 (3,0 g/L KH2PO4, 6,0 g/L Na2HPO4, 0,5 g/L NaCl, 1,0 g/L NH4Cl), Probówki stożkowe 15 ml.
    Dwa dni przed eksperymentem
  2. Szczepy C. albicans należy zaszczepić w 2 ml YPD i E. coli (OP50) w 50 ml LB i rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C.
  3. Przygotować płytki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm z NGM uzupełnione siarczanem streptomycyny o stężeniu 0,2 g/l. Liczba przygotowanych płytek powinna wystarczyć na cały eksperyment. Zalecana liczba powtórzeń wynosi 10 na zabieg. Na 10 powtórzeń zostanie użytych 70 płytek. 1 L NGM pozwoli na wyprodukowanie ~250 talerzy.
    Dzień przed eksperymentem
  4. Nasiona 35 mm x 10 mm płytki agarowe NGM uzupełnione streptomycyną na Dzień 0, Dzień 2 i Dzień 3 zgodnie z opisanym powyżej protokołem wysiewu ze stężeniem mastermix (Tabela 2). Odpipetować odpowiednią ilość mastermixu na środek płytki. Rozsiewanie kultury nie jest konieczne, ponieważ pojedynczy punkt wzrostu drobnoustrojów jest wystarczający do odżywiania żywiciela i pozwala nam łatwo zidentyfikować żywicieli poza nasionami. Inkubować płytki przez noc w temperaturze RT.
    UWAGA: Mastermix dnia 0 zawiera 50 μl "nasion" na kontrpróbę dla każdego zabiegu eksperymentalnego. Dni 2-7 obejmują 10 μl "nasiona" na powtórzenie dla każdego eksperymentalnego zabiegu. Nie ma tabliczki dnia 1, ponieważ nicienie osiągną stadium L4 48 godzin po zsynchronizowaniu z płytką dnia 0. Gdy osiągną L4, poszczególne nicienie zostaną przeniesione na płytki dnia 2.
. . . . . . . . .
Dla 1 replikiE. coli (OP50) warunek kontrolnyC. albicans & E. coli (OP50) warunki leczenia
Zobacz materiał OP50H2OłącznyZobacz materiał OP50C. albicans (C. albicans)H2Ołączny
Dzień 06,25 ul43.75 ul50 ul6,25 ul1,25 ul42,5 ul50 ul
Dni 2-71,25 ul8.75 ul10 ul1,25 ul.25 ul8,5 ul10 ul

Tabela 2: Objętości Mastermix kultur E. coli i C. albicans potrzebne do zakażenia nicieni do testu płodności.

Dzień eksperymentu (Dzień 0)

  1. Zsynchronizuj nicienie i płytkę ~ 50 jaj na każdym powtórzeniu Dnia 0 płytek kontrolnych (tylko OP50) i płytek zabiegowych (C. albicans + OP50). Inkubować w temperaturze 20 °C przez 48 h.
    Dzień 2
  2. Przenieś pojedynczego nicienia L4, zbierając8 z płytki dnia 0 na każdą z powtórzonych płytek wysiewanych dnia 2. Gospodarzy L4 można rozpoznać po małej kieszeni pośrodku grzbietowej strony ich ciała22. Nicienie, które się wykluły i osiągnęły dojrzałość, przenieść z tego samego rodzaju płytki wysiewanej (tj. nicienie L4 z płytek kontrolnych D0 muszą zostać przeniesione na płytki kontrolne dnia 2).
  3. Zaszczepić potrzebne kultury C. albicans w 2 ml YPD i E. coli (szczep OP50) w 50 ml LB.
    Dzień 3
  4. Przenieś nicienie z płytek dnia 2 na płytki wysiewane dnia 3, śledząc każdą kontrpróbę (tj. replikat A z dnia 2 musi zostać przeniesiony na półkę powtórzoną dnia 3).
  5. Inkubować płytki dnia 2 (zawierające wyłącznie jaja) i dnia 3 (zawierające pojedyncze osobniki dorosłe) w temperaturze 20 °C przez 24 godziny.
  6. Nasiona 35 mm x 10 mm NGM uzupełnione płytkami streptomycyny na dni 4 i 5 przy użyciu 10 μl mastermix na płytkę (Tabela 2) i płytki inkubacyjne w temperaturze pokojowej przez 24 godziny
    Dzień 4
  7. Przenieś nicienie z talerzy dnia 3 na talerze z nasionami dnia 4.
  8. Inkubować płytki dnia 3. i dnia 4 w temperaturze 20 °C przez 24 godziny.
  9. Korzystając z lunety preparatorskiej, policz zdolne do życia potomstwo na każdej płytce dnia 2. Zwróć uwagę na wszystkie repliki, które umarły lub nie znajdują się już na płycie (ocenzurowane). Po zarejestrowaniu liczby potomstwa wyrzuć tabliczki dnia 2.
    UWAGA: Cenzurowane odnosi się do nicieni, które znikają na talerzu. Może się to zdarzyć, gdy nicienie pełzają po talerzu. Chociaż rzadziej w ciągu 24 godzin, tusze martwych nicieni rozpadają się w agarze również powodując cenzurę. Ocenzurowane dane nie są uwzględniane w końcowej analizie danych dotyczących potomstwa i przeżycia.
  10. Zaszczepić nowe kultury szczepów C. albicans w 2 ml YPD i E. coli (OP50) w 50 ml LB.
    Dzień 5
  11. Przenieś nicienie z talerzy dnia 4 na talerze z nasionami dnia 5.
  12. Inkubować płytki dnia 4. i 5. w temperaturze 20 °C przez 24 godziny.
  13. Policz zdolne do życia potomstwo na każdej tablicy dnia 3. Zwróć uwagę na wszystkie repliki, które umarły lub nie znajdują się już na płycie (ocenzurowane). Po zarejestrowaniu liczby potomstwa wyrzuć płytki z dnia 3.
  14. Nasiona 35 mm x 10 mm NGM uzupełnione płytkami streptomycyny na dni 6 i 7 przy użyciu 10 μl mastermix na płytkę (Tabela 2) i inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 24 godziny
    Dzień 6
  15. Przenieś nicienie z talerzy dnia 5 na talerze z nasionami dnia 6.
  16. Inkubować płytki dnia 5 i dnia 6 w temperaturze 20 °C przez 24 godziny.
  17. Policz zdolne do życia potomstwo na każdej tablicy dnia 4. Zwróć uwagę na wszystkie repliki, które umarły lub nie znajdują się już na płycie (ocenzurowane). Po zarejestrowaniu liczby potomstwa wyrzuć płytki dnia 4.
    Dzień 7
  18. Przenieś nicienie z talerzy dnia 6 na talerze z nasionami dnia 7.
  19. Inkubować płytki dnia 6 i dnia 7 w temperaturze 20 °C przez 24 godziny.
  20. Policz zdolne do życia potomstwo na każdej tabliczce dnia 5. Zwróć uwagę na wszystkie repliki, które umarły lub nie znajdują się już na płycie (ocenzurowane). Po zarejestrowaniu liczby potomstwa wyrzuć tabliczki z dnia 5.
    Dzień 8
  21. Policz zdolne do życia potomstwo na każdej tabliczce dnia 6. Zwróć uwagę na wszystkie repliki, które umarły lub nie znajdują się już na płycie (ocenzurowane). Po zarejestrowaniu liczby potomstwa wyrzuć tabliczki z dnia 6.
    Dzień 9
  22. Policz zdolne do życia potomstwo na każdej tablicy dnia 7. Nie licz największego nicienia (rodzica). Zwróć uwagę na wszystkie repliki, które umarły lub nie znajdują się już na płycie (ocenzurowane). Po zarejestrowaniu liczby potomstwa wyrzuć tabliczki z dnia 7.
    UWAGA: Ten test może być również stosowany do oceny przeżycia. Zapisz, kiedy każdy nicień zdechł. Pod koniec eksperymentu można porównać odsetek nicieni, które przeżyły w ciągu siedmiodniowego eksperymentu. Nicienie czasami odpełzają od źródła pożywienia/patogenu i próbują wspiąć się na zjeżdżalnie płytki Petriego. Sprawdź wszystkie obszary płyty przed przejściem dalej. Martwe nicienie na ogół pozostawiają tuszę. Ocenzuruj wszelkie nicienie, których nie można zlokalizować i nie licz ich jako martwych. Nie uwzględniaj ocenzurowanych danych w końcowej analizie potomstwa i przeżywalności.
  23. Analizuj dane dotyczące wielkości lęgu i późnej reprodukcji za pomocą jednoczynnikowej ANOVA lub Kruskala-Wallisa, w zależności od normalności zestawów danych, a także wielokrotnych testów Tukeya/Dunna post hoc w celu zidentyfikowania istotnych różnic między grupami leczonymi za pomocą oprogramowania GraphPad Prism. Wykrywanie różnic między krzywymi przeżycia za pomocą testu logarytmicznego rangi Wilcoxona.

3. Test rozszerzania linii

UWAGA: Reprezentatywne dane pokazano w Tabeli Uzupełniającej 2, a schemat jest pokazany w Rysunek 2A.

  1. Otrzymać lub przygotować: płytki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm zawierające agar NGM uzupełniony siarczanem streptomycyny o stężeniu 0,2 g/l, kultury E. coli OP50, LB, kultury C. albicans, YPD, bufor M9, Wire Pick, probówki stożkowe 15 ml.
    Dzień -2
  2. Zaszczepić szczepy C. albicans w 2 ml YPD i E. coli (OP50) w 50 ml LB i rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C.
    Dzień -1
  3. Nasiona płytek agarowych NGM 100 mm x 15 mm uzupełnione streptomycyną po 300 μl mastermixu na płytkę (tabela 3). Rozprowadź mastermix na talerzu za pomocą sterylnego metalowego rozsiewacza. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 30 °C. Zaleca się sześć powtórzeń na zabieg. W ten sposób należy przygotować siedem płytek (jedna płytka dla nicieni zsynchronizowanych, sześć płytek dla każdego dorosłego nicienia) na zabieg.
.
E. coli (OP50) warunek kontrolnyC. albicans i E. coli (OP50). Warunki leczenia
Dla 1 replikiZobacz materiał OP50H2OłącznyZobacz materiał OP50C. albicans (C. albicans)H2Ołączny
1,25 ul8.75 ul10 ul37.5 ul7.5 ul255 ul300 ul

Tabela 3: Objętości Mastermix kultur E. coli i C. albicans potrzebne do zakażenia nicieni do testu ekspansji linii.

Wzrost populacji nicieni: Dzień 0

  1. Zsynchronizować nicienie i umieścić na jednej płytce 10-25 jaj dla każdej kontroli (tylko OP50) i poddawania działaniu środka (C. albicans + OP50) i inkubować w temperaturze 20 °C przez 48 godzin
    Dzień 2:
  2. Przenieść pojedynczego robaka L4 z każdej płytki kontrolnej i zabiegowej dnia 0 na płytki z nasionami tego samego zabiegu. Gospodarzy L4 można rozpoznać po małej kieszeni pośrodku grzbietowej strony ich ciała22.
  3. Inkubować w temperaturze 20 °C przez 5 dni (łącznie jeden tydzień po synchronizacji).
    Dzień 7:
  4. Za pomocą pipety p1000 przepłukać całą populację nicieni z każdej płytki za pomocą 5 ml buforu M9 i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  5. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, aby nicienie mogły się uspokoić i ułatwić ich policzenie.
  6. Rozcieńczyć każdy stożek do końcowej objętości 10 ml buforem M9.
  7. Dla każdej kontrpróby biologicznej należy policzyć liczbę nicieni w podwielokrotności 20 μl. Czynność tę czynność należy powtórzyć, aby uzyskać 6 kontrprób technicznych dla każdej kontrpróby biologicznej. Oblicz wstecz, aby określić łączną wielkość populacji. Jeśli próbki są zbyt rozcieńczone (tj. mniej niż 10 nicieni na próbkę), należy skoncentrować populację w mniejszej objętości buforu M9.
    UWAGA: Odwirowanie żywych nicieni nie zaszkodzi nicieniom.
    Przykładowe obliczenia:
    70 hostów = X (łączna liczba hostów)
    20 μL (podwielokrotność) 10 000 μL (Objętość całkowita)
  8. Analizuj dane pod kątem ekspansji linii przy użyciu jednokierunkowej ANOVA lub Kruskala-Wallisa, w zależności od normalności zestawów danych, a także wielokrotnych testów Tukeya/Dunna post hoc w celu zidentyfikowania istotnych różnic między grupami leczonymi za pomocą oprogramowania GraphPad Prism.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy dwa testy, które mierzą zjadliwość C. albicans jako fenotyp nieśmiertelny, używając C. elegans jako modelu infekcji. Pierwszy test, płodność, monitoruje, w jaki sposób zakażenie C. albicans wpływa na pojedynczych żywicieli w celu produkcji i przeżycia potomstwa. Drugi test, ekspansja linii, mierzy, w jaki sposób infekcja C. albicans wpływa na wzrost populacji w ciągu wielu pokoleń.

Test płodności m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy dwa proste testy, które mierzą zjadliwość grzybów. Oba testy wykorzystują C. elegans jako system gospodarza, który obejmuje monitorowanie zarówno letalnych, jak i nieśmiertelnych fenotypów gospodarza. Na przykład testy płodności badają sukces reprodukcyjny poszczególnych zakażonych gospodarzy, jednocześnie mierząc przeżywalność poszczególnych osób. Codzienny monitoring zapewnia nie tylko całkowitą wielkość lęgu, ale także czas reprodukcji i czas śmierci. Test rozszerzania linii został opracow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dorianowi Feistelowi, Remie Elmostafie i McKennie Penleyowi za pomoc w rozwijaniu naszych testów i zbieraniu danych. Badania te są wspierane przez NSF DEB-1943415 (MAH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml mikroprobówki eppendorf 3810XMillipore SigmaZ606340
100 mm x 15 mm płytki PetriegoSigma-AldrichP5856-500EA
15 ml Falcon ConicalsFisher Scientific14-959-70C
50 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-432-22
AdeninaMilipore SigmaA8626
Agar (granulowany, klasy bakteriologicznej)Apex BioResearch produkuje20-248
(95% Pt, 32 gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Chlorek amonuMillipore Sigma254134
Bakteryjny rozsiewacz komórekScienceware21TP50
BactopeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
Jednorazowe probówki hodowlane (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
Mikroskop preparacyjny (iluminator NI-150 o wysokiej intensywności)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
Glikol glukozySigma50-99-7
Średnie szalki Petriego (35 x 10 mm)Falcon353001
Metalowa szpatułkaSP Scienceware8TL24
Pożywka do wzrostu nicieni (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
Potas Fosforan jednozasadowySigmaP0662-500G
Chlorek soduFisher ScientificBP358-1
Fosforan soduFisher ScientificBP332-500
Siarczan streptomycynyThermo-Fisher Scientific11860038
TryptoneMillipore Sigma91079-40-2
UridineMillipore SigmaU3750
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Genetics CenterN2
Ekstrakt z drożdżyMillipore Sigma8013-01-2
drut aluminiowy SP

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Underhill, D. M., Iliev, I. D. The mycobiota: interactions between commensal fungi and the host immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (6), (2014).
  2. Ibrahim, A. S., Filler, S. G., Sanglard, D., Edwards, J. E., Hube, B. Secreted Aspartyl Proteinases and Interactions of Candida albicans with Human Endothelial Cells. Infection and Immunity. 66 (6), 3003-3005 (1998).
  3. Calderone, R. A., Fonzi, W. A. Virulence factors of Candida albicans. Trends in Microbiology. 9 (7), 327-335 (2001).
  4. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  5. Chin, V., Lee, T., Rusliza, B., Chong, P. Dissecting Candida albicans Infection from the Perspective of C. albicans Virulence and Omics Approaches on Host-Pathogen Interaction: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (10), 1643(2016).
  6. Elkabti, A., Issi, L., Rao, R. Caenorhabditis elegans as a Model Host to Monitor the Candida Infection Processes. Journal of Fungi. 4 (4), 123(2018).
  7. Arvanitis, M., Glavis-Bloom, J., Mylonakis, E. Invertebrate models of fungal infection. Biochimica et biophysica acta. 1832 (9), 1378-1383 (2013).
  8. Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. Journal of Visualized Experiments. (128), e56487(2017).
  9. Breger, J., et al. Antifungal Chemical Compounds Identified Using a C. elegans Pathogenicity Assay. PLoS Pathogens. 3 (2), 18(2007).
  10. Okoli, I., et al. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PloS one. 4 (9), 7025(2009).
  11. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans Infection of Caenorhabditis elegans Induces Antifungal Immune Defenses. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002074(2011).
  12. Kim, D. H., Ausubel, F. M. Evolutionary perspectives on innate immunity from the study of Caenorhabditis elegans. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 4-10 (2005).
  13. Kim, D. H., et al. A Conserved p38 MAP Kinase Pathway in Caenorhabditis elegans Innate Immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  14. van der Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generated Reactive Oxygen Species Trigger Protective SKN-1 Activity via p38 MAPK Signaling during Infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 7 (12), 1002453(2011).
  15. van der Hoeven, R., Cruz, M. R., Chávez, V., Garsin, D. A. Localization of the Dual Oxidase BLI-3 and Characterization of Its NADPH Oxidase Domain during Infection of Caenorhabditis elegans. PLOS ONE. 10 (4), 0124091(2015).
  16. Chávez, V., Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generates Reactive Oxygen Species as a Protective Innate Immune Mechanism in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 77 (11), 4983-4989 (2009).
  17. Vander, H., Prabha, V. Evaluation of fertility outcome as a consequence of intravaginal inoculation with sperm-impairing micro-organisms in a mouse model. Journal of Medical Microbiology. 64, Pt_4 344-347 (2015).
  18. Castrillón-Duque, E. X., Suárez, J. P., Maya, W. D. C. Yeast and Fertility: Effects of In Vitro Activity of Candida spp. on Sperm Quality. Journal of Reproduction & Infertility. 19 (1), 49-55 (2018).
  19. Feistel, D. J., et al. A Novel Virulence Phenotype Rapidly Assesses Candida Fungal Pathogenesis in Healthy and Immunocompromised Caenorhabditis elegans Hosts. mSphere. 4 (2), (2019).
  20. Feistel, D. J., Elmostafa, R., Hickman, M. A. Virulence phenotypes result from interactions between pathogen ploidy and genetic background. Ecology and Evolution. 10 (17), 9326-9338 (2020).
  21. Mitchell, B. M., Wu, T. G., Jackson, B. E., Wilhelmus, K. R. Candida albicans Strain-Dependent Virulence and Rim13p-Mediated Filamentation in Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (2), 774-780 (2007).
  22. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook - Introduction. WormAtlas. , (2006).
  23. Yuan, X., Mitchell, B. M., Hua, X., Davis, D. A., Wilhelmus, K. R. The RIM101 Signal Transduction Pathway Regulates Candida albicans Virulence during Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (9), 4668-4676 (2010).
  24. Davis, D., Edwards, J. E., Mitchell, A. P., Ibrahim, A. S. Candida albicans RIM101 pH Response Pathway Is Required for Host-Pathogen Interactions. Infection and Immunity. 68 (10), 5953-5959 (2000).
  25. Chamilos, G., et al. Candida albicans Cas5, a Regulator of Cell Wall Integrity, Is Required for Virulence in Murine and Toll Mutant Fly Models. The Journal of Infectious Diseases. 200 (1), 152-157 (2009).
  26. Bruno, V. M., et al. Control of the C. albicans Cell Wall Damage Response by Transcriptional Regulator Cas5. PLoS Pathogens. 2 (3), 21(2006).
  27. Davis, D. Adaptation to environmental pH in Candida albicans and its relation to pathogenesis. Current Genetics. 44 (1), 58(2003).
  28. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A Pathogenesis Assay Using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans Reveals Novel Roles for Yeast AP-1, Yap1, and Host Dual Oxidase BLI-3 in Fungal Pathogenesis. Eukaryotic Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  29. De, A., Sahu, A. K., Singh, V. Bite size of Caenorhabditis elegans regulates feeding, satiety and development on yeast diet. bioRxiv. , 473256(2018).
  30. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  31. Smith, A. C., Hickman, M. A. Host-Induced Genome Instability Rapidly Generates Phenotypic Variation across Candida albicans Strains and Ploidy States. mSphere. 5 (3), 00433(2020).
  32. Palominos, M. F., Calixto, A. Quantification of Bacteria Residing in Caenorhabditis elegans Intestine. BIO-PROTOCOL. 10 (9), (2020).
  33. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a Model Organism for Investigating Immunity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  34. Liberati, N. T., et al. Requirement for a conserved Toll/interleukin-1 resistance domain protein in the Caenorhabditis elegans immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6593-6598 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Candida albicanstest p odno ciekspansja liniireprodukcja gospodarzawzrost populacjimini modele systemowe
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły