Method Article

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

DOI:

10.3791/62175

⸱

August 21st, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki są stale narażone na działanie różnych czynników uszkadzających DNA, wywołując różne reakcje komórkowe. Zastosowanie podejść biochemicznych i genetycznych jest niezbędne do ujawnienia zdarzeń komórkowych związanych z rekrutacją i składaniem kompleksów naprawczych DNA w miejscu uszkodzenia DNA. W ciągu ostatnich kilku lat opracowano kilka potężnych narzędzi do indukowania uszkodzeń DNA specyficznych dla danego miejsca. Co więcej, nowatorskie techniki nasienne pozwalają nam badać te procesy na poziomie rozdzielczości pojedynczej komórki, zarówno przy użyciu komórek stałych, jak i żywych. Chociaż techniki te zostały wykorzystane do badania różnych procesów biologicznych, w niniejszym artykule przedstawiamy najczęściej stosowane protokoły w dziedzinie naprawy DNA, barwienie immunologiczne fluorescencji (IF) i immunoprecypitację chromatyny (ChIP), które w połączeniu z uszkodzeniami DNA specyficznymi dla miejsca na podstawie endonukleazy umożliwiają wizualizację i ilościowe określenie zajętości genomu czynników naprawy DNA w sposób ukierunkowany i regulowany, odpowiednio. Techniki te dostarczają naukowcom potężnych narzędzi do identyfikacji nowych białek związanych z uszkodzonym locus genomu, a także ich modyfikacji potranslacyjnych niezbędnych do ich precyzyjnej regulacji podczas naprawy DNA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz genom jest nieustannie kwestionowany przez różne czynniki uszkadzające DNA. Ataki te mogą pochodzić ze źródeł środowiskowych, takich jak światło UV lub napromieniowanie, a także ze źródeł endogennych, takich jak produkty uboczne przemiany materii spowodowane stresem oksydacyjnym lub błędami replikacji1,2. Zmiany te mogą wpływać na integralność jednej lub obu nici DNA, a jeśli wygenerowane błędy staną się trwałe, często prowadzi to do translokacji i niestabilności genomu, co może skutkować nowotworzeniem 3,4. Aby zachować integralność genomu, podczas ewolucji opracowano wiele systemów naprawczych. W zależności od właściwości chemicznych i fizycznych określonych rodzajów uszkodzeń DNA, można aktywować wiele mechanizmów naprawczych. Niedopasowania, miejsca podstawowe, pęknięcia pojedynczej nici i 8-oksoguanina (8-oxoG) mogą być usunięte przez naprawę niedopasowania lub ścieżkę naprawy przez wycinanie zasady5,6. Zmiany spowodowane przez fotoprodukty wywołane promieniowaniem UV i masywne addukty mogą być naprawione przez naprawę przez wycinanie nukleotydów (NER) lub proces naprawy podwójnej nici DNA (DSBR) 7,8. NER składa się z dwóch głównych podszlaków: NER SPRZĘŻONEGO Z TRANSKRYPCJĄ (TC-NER) i globalnego genomowego NER (GG-NER). Jeśli chodzi o fazę cyklu komórkowego, po indukcji pęknięcia podwójnej nici DNA mogą zostać aktywowane dwie podścieżki: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i rekombinacja homologiczna (HR)1,9. NHEJ, który jest dominującym szlakiem w komórkach w stanie spoczynku, może być aktywowany we wszystkich fazach cyklu komórkowego, reprezentując szybszą, ale podatną na błędy ścieżkę10. Z drugiej strony, HR jest ścieżką wolną od błędów, w której DSB są naprawiane w oparciu o wyszukiwanie homologii sekwencji chromatyd siostrzanych, dlatego występuje głównie w fazach cyklu komórkowego S i G211. Co więcej, łączenie końców za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ) jest kolejnym mechanizmem naprawy DSB, odrębnym od wyżej wymienionych, opartym na niezależnym od KU70/80 i RAD51 sposobie religacji wcześniej wyciętych sekwencji mikrohomologicznych flankujących uszkodzone końce DNA. W związku z tym MMEJ jest uważany za podatny na błędy i wysoce mutagenny12. Podczas naprawy DNA DSB mogą indukować odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR), co powoduje aktywację kinaz punktów kontrolnych, które zatrzymują cykl komórkowy podczas naprawy13,14,15. DDR jest aktywowany w odpowiedzi na rekrutację i rozległe rozprzestrzenianie się kluczowych czynników inicjujących proces naprawy wokół zmian, przyczyniając się do powstania ogniska naprawy. W tej wczesnej kaskadzie sygnalizacyjnej kinaza ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) odgrywa kluczową rolę, katalizując fosforylację wariantu histonu H2AX w Ser139 (określanym jako γH2AX) wokół lesion16. To wczesne zdarzenie jest odpowiedzialne za rekrutację dodatkowych czynników naprawczych i zainicjowanie dalszych procesów naprawczych. Chociaż dokładna funkcja rekrutowanych białek w ognisku naprawy nie została jeszcze w pełni scharakteryzowana, powstawanie i dynamika ognisk naprawy zostały zbadane przez kilka laboratoriów. Markery te są szeroko stosowane do śledzenia kinetyki naprawy, ale ich dokładna rola podczas procesu naprawy pozostaje nieuchwytna. Ze względu na ogromne znaczenie, ale słabe zrozumienie procesów komórkowych związanych z naprawą DNA, do tej pory opracowano kilka metod indukcji i wizualizacji DDR.

Różne metody i systemy zostały stworzone w celu wywołania pożądanego rodzaju uszkodzenia DNA. Na przykład niektóre czynniki [takie jak neokarzynostatyna (NCS), fleomycyna, bleomycyna, promieniowanie γ, UV] mogą indukować dużą liczbę losowych pęknięć DNA w niepredykcyjnych pozycjach genomowych, podczas gdy inne (endonukleazy, takie jak AsiSI, I-PpoI lub I-SceI, a także paski laserowe) mogą indukować pęknięcia DNA w znanych loci genomowych17,18,19,20,21. W tym miejscu skupiamy się na technikach opartych na endonukleazie stosowanych obecnie do badania DDR w komórkach ssaków i drożdży. Oprócz podkreślenia zasad tych technik, podkreślamy zarówno ich zalety, jak i wady.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Immunodetekcja specyficznych białek

  1. Przygotowanie hodowli komórkowej i konfiguracja doświadczalna
    1. Utrzymuj komórki U2OS w monowarstwach w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 2 mM glutaminą i 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym.
      UWAGA: Do indukcji uszkodzeń DNA na podstawie endonukleazy należy użyć pożywki poddanej działaniu węgla drzewnego lub bezsteroidowej, aby uniknąć nieszczelności systemu.
    2. Hoduj komórki w nawilżonym środowisku o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C aż do 80% konfluencji, odnawiając podłoże co 2-3 dni.
    3. Odessać pożywkę i przemyć komórki 1x PBS. Odłącz komórki roztworem Trypsyna-EDTA. Kiedy komórki odłączają się, zatrzymaj aktywność trypsyny, dodając pożywkę hodowlaną do komórek, uzyskując zawiesinę komórkową.
    4. Policz komórki za pomocą komory do liczenia komórek. Płytka 2 x 104 komórki/ml/basenik na 24-dołkowej płytce, ze sterylnymi okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 12 mm w każdym dołku.
    5. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w celu umożliwienia przyłączenia do szkiełek nakrywkowych.
    6. Potraktuj komórki 10 ng/ml neokarzynotatyny (NCS), bezpośrednio pipetując czynnik uszkadzający do hodowanej pożywki. Inkubować komórki z pożywką zawierającą NCS przez 15 minut, a następnie przemyć je 1x PBS i dodać do komórek świeżą, uzupełnioną pożywkę hodowlaną. W przeciwnym razie należy użyć odpowiedniego środka (tj. 4-OHT) do indukowania DSB za pośrednictwem systemów opartych na endonukleazie bez odświeżania medium22.
      UWAGA: Alternatywnie, użyj napromieniowania do wywołania uszkodzenia DNA, w zakresie od 30 minut do 8 godzin czasu rekonwalescencji, używając strumienia neutronów w zakresie 2-20 Gy23.
    7. Inkubować komórki przez 1-8 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 , aby śledzić kinetykę naprawy DNA.
  2. Utrwalanie komórek
    UWAGA: W poniższych krokach (kroki 1.2-1.5) należy użyć 300-500 μl roztworów/studzienkę, aby odpowiednio pokryć wszystkie komórki. Każdy etap inkubacji i przemywania (z wyjątkiem inkubacji przeciwciał) powinien być wykonywany na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym mieszaniem.
    1. Po indukcji DSB i inkubacji komórek, usuń pożywkę z dołączonych komórek i umyj komórki raz 1x PBS.
    2. Utrwalić komórki 4% roztworem formaldehydu-PBS przez 20 minut w temperaturze 25 °C.
  3. Przepuszczalność komórek
    1. Usuń roztwór utrwalający i umyj komórki trzy razy 1x PBS przez 5 minut każda.
    2. Usunąć PBS i dodać 0,2% Triton X-100 rozpuszczony w PBS. Inkubować próbki przez 20 minut.
  4. Blokowanie niespecyficznych stron wiążących
    1. Umyj komórki trzy razy 1x PBS.
    2. Zablokować niespecyficzne miejsca wiązania za pomocą 5% albuminy BSA (albumina frakcji V surowicy bydlęcej) rozcieńczonej w PBST (1x PBS uzupełniony 0,1% Tween-20) i inkubować permeabilizowane próbki przez co najmniej 20 minut.
  5. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Dodać odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego (tj. anty-γH2AX, anty-DNA-PKcs) rozcieńczonego w 1% roztworze BSA-PBST. Umieść każde szkiełko nakrywkowe do góry nogami na folii parafinowej na 10 μl kropli rozcieńczonego przeciwciała anty-γH2AX.
      UWAGA: W przypadku barwienia koimmunologicznego należy odpowiednio rozcieńczyć oba przeciwciała w tym samym 1% roztworze BSA-PBST.
    2. Próbki inkubować w komorze wilgotnościowej przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Inkubację można również przeprowadzić w temperaturze 4 °C przez noc.
    3. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem do góry na płytce 24-dołkowej i umyj trzy razy przez 5 minut 1x PBS.
    4. Dodać odpowiednią ilość przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w 1% BSA-PBST. Umieść każde szkiełko nakrywkowe do góry nogami na folii parafinowej na 10 μl kropli rozcieńczonego przeciwciała.
    5. Próbki należy inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    6. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem do góry na płytce 24-dołkowej i umyj trzy razy przez 5 minut 1x PBS.
    7. Przed usunięciem ostatniego roztworu myjącego PBS należy delikatnie wyjąć szkiełka nakrywkowe za pomocą pęsety i igły, a następnie umieścić je do góry nogami na szkiełkach podstawowych z kropelkami podłoża montażowego (uzupełnionego DAPI).
      UWAGA: Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza. Po wyschnięciu podłoża montażowego zaleca się uszczelnienie krawędzi szkiełek nakrywkowych lakierem do paznokci, aby zapobiec marszczeniu się próbek.

2. Immunoprecypitacja chromatyny

  1. Zbieranie komórek, sieciowanie, liza komórkowa i jądrowa oraz fragmentacja DNA
    1. Hodowla około 5 x 106 komórek/ml w naczyniu o średnicy 150 mm dla każdej próbki.
    2. Usuń pożywkę hodowlaną i umyj komórki dwukrotnie lodowatym 1x PBS.
    3. Utrwalić komórki 1% roztworem formaldehydu-PBS, umieścić płytki na wytrząsarce orbitalnej i delikatnie mieszać przez 20 min.
      UWAGA: Formaldehyd jest lotny; Zawsze przygotowuj świeże roztwór roboczy. W niektórych przypadkach roztwór formaldehydu zawiera metanol w celu jego stabilizacji, ale lepiej jest użyć roztworu bez metanolu, aby uniknąć zakłóceń w dalszych reakcjach.
    4. Przerwać utrwalanie glicyną o stężeniu 125 mM i inkubować na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym mieszaniem przez 5 minut w temperaturze 25 °C.
    5. Umieść talerze na lodzie i umyj dwukrotnie lodowatym 1x PBS.
    6. Zeskrob komórki w lodowato zimnym 1x PBS i przenieś je do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
    7. Odwirować komórki przy 2 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml buforu do lizy komórek [5 mM RURY pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 1x (koktajl inhibitorów proteazy)] i inkubować na lodzie przez 10 min.
    9. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 2 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500-1 500 μl buforu do lizy jądrowej (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,8% SDS, 1x) i inkubować na lodzie przez 30-60 min. Przenieść lizat do polistyrenowej stożkowej rurki odpowiedniej do sonikacji.
      UWAGA: Ponieważ bufor do lizy jądrowej zawiera SDS, wytrąci się na lodzie, a roztwór zmieni kolor na biały. Roztwór powinien stać się przezroczysty po sonikacji.
    11. Sonikacja lizatu w celu ścinania DNA do średniej wielkości fragmentu 300-1,000 p.
      UWAGA: Odpowiednie cykle i warunki sonikacji powinny być ustawione w zależności od typu komórki i sprzętu do sonikacji. Fragmenty mniejsze niż 200 pz nie są odpowiednie dla ChIP, ponieważ interakcje nukleosom-DNA mogą zostać zakłócone.
  2. Odwrócenie sieciowania, wyznaczanie wielkości fragmentów poddanych sonikacji
    1. Pobrać 100 μl próbki poddanej sonikacji, aby sprawdzić wielkość fragmentu chromatyny poddanej sonikacji. Pozostałą chromatynę należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
    2. Dodać 0,5 mg/ml RNazy A do każdych 100 μl próbki i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu aktywacji RNazy.
    3. Próbki należy inkubować w temperaturze 65 °C przez noc.
    4. Następnego dnia dodać 500 μg/ml proteinazy K i 0,5% SDS i inkubować próbki w temperaturze 50 °C przez 3 godziny.
    5. Do każdej próbki dodać 0,5 objętości fenolu i 0,5 objętości mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1).
    6. Wirować przez 1 min.
    7. Wirować przy 13 000 x g przez 10 min.
    8. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.
    9. Dodać 1 objętość mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1) do każdej próbki.
    10. Wirować przez 1 min.
    11. Wirować przy 13 000 x g przez 10 min.
    12. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.
    13. Dodać 2,5 objętości 96% etanolu i 0,1 objętości 3 M Na-octanu pH 5,2.
    14. Inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze -80 °C.
    15. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    16. Usuń etanol i umyj granulat 400 μl 70% etanolu.
    17. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    18. Usuń etanol i wysusz granulki na powietrzu.
    19. Zawiesić osad w 10 μl TE.
    20. Próbki należy umieścić w 0,8% żelu agarozowym. Wielkość chromatyny po sonikacji powinna wynosić około 500 pz.
      UWAGA: Należy stosować bufor ładujący wolny od błękitu bromofenolowego, ponieważ wielkość tego barwnika wynosi około 500 pz, co może zakłócić prawidłowe wykrywanie fragmentów chromatyny. Zamiast tego zaleca się stosowanie buforu załadowczego uzupełnionego cyjanolem ksylenowym, który wynosi około 3 000 pz.
    21. Jeżeli wielkość chromatyny jest dopuszczalna, rozcieńczyć zamrożone próbki chromatyny z kroku 2.1. w 3 objętościach buforu rozcieńczającego (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x) i mieszać próbki przez obracanie przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ten krok jest konieczny do rozcieńczenia SDS obecnego w buforze do lizy jądrowej, aby uniknąć zakłóceń w dalszych reakcjach, w tym pomiarze stężenia chromatyny.
    22. Zmierzyć stężenie DNA w próbkach chromatyny przy 260/280 nm za pomocą spektrofotometru.
  3. Przygotowanie kulek, wstępne oczyszczanie i immunoprecypitacja
    1. Przygotuj kulki (owcze, anty-królicze lub mysie IgG) do etapów wstępnego oczyszczania i immunoprecypitacji. Umyć kulki dwukrotnie przez 10 minut w temperaturze 4 °C z buforem RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% Na-DOC, 0,1% SDS, 150 mM NaCl i 1X).
    2. Ponownie zawieś koraliki w tej samej objętości bufora RIPA, co w kroku 2.3.1.
    3. Wstępnie oczyścić 25-30 μg chromatyny z każdej próbki za pomocą 4 μl kulek poprzez obracanie przez 1-2 godziny w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Dodaj bufor RIPA do każdej próbki chromatyny do 500 μl końcowej objętości, aby umożliwić prawidłowe wymieszanie próbek podczas rotacji. Nie zapomnij wyjąć chromatyny dla NAC (No Antibody Control) i TIC (Total Input Control) w przypadku każdego zestawu próbek. TIC wymagają tylko końcowej objętości do 200 μl.
    4. Wytrącić kulki za pomocą magnesu i przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.
    5. Dodać odpowiednią ilość przeciwciała do każdej próbki chromatyny (z wyjątkiem NAC i TIC) i obracać przez noc w temperaturze 4 °C.
    6. Następnego dnia dodać 40 μl umytych kulek do każdej próbki (z wyjątkiem TIC) i inkubować je przez noc, obracając w temperaturze 4 °C.
  4. mycie
    1. Przemyć raz 300 μl buforu o niskiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x) przez 10 minut obracając w temperaturze 4 °C.
    2. Przemyć raz 300 μl buforu o wysokiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x) przez 10 minut obracając się w temperaturze 4 °C.
    3. Przemyć raz 300 μl buforu LiCl (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1x) przez 10 minut obracając w temperaturze 4 °C.
    4. Umyć dwukrotnie 300 μl TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) przez 10 minut na zmianę, do pierwszego prania w temperaturze 4 °C, a drugiego prania w temperaturze 25 °C.
  5. Elucji
    1. Dodać 200 μl buforu elucyjnego (1% SDS i 100 mM NaHCO3) do kulek i inkubować w temperaturze 65 °C w termowytrząsarce przez 15 minut z ciągłym wytrząsaniem (ok. 400 obr./min). Przenieść supernatant do nowej probówki i ponownie wymyć kulki w 200 μl buforu elucyjnego. Połączyć eluaty (400 μl końcowej objętości).
    2. Dodać NaCl do końcowego stężenia 200 mM w każdej próbce. Uzupełnij próbki TIC 200 μl buforu elucyjnego i dodaj również NaCl.
      UWAGA: Na tym etapie z TIC należy obchodzić się w takich samych warunkach, jak z innymi próbkami.
    3. Próbki należy inkubować w temperaturze 65 °C (bez wstrząsania) przez co najmniej 6 godzin.
    4. Dodać 1 ml zimnego 100% etanolu do każdej próbki, obrócić probówki dwukrotnie, aby wymieszać, i wytrącić DNA przez noc w temperaturze -80 °C.
    5. Następnego dnia wirować przez 30 minut w temperaturze 13 000 x g w temperaturze 4 °C.
    6. Wyrzucić supernatant i przemyć osad 70% EtOH.
    7. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Wyrzucić supernatant i wysuszyć granulki na powietrzu.
    9. Zawiesić granulki w 100 μl TE i dodać 0,5 mg/ml RNazy A do każdej próbki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu aktywacji RNazy.
  6. Odwrócenie sieciowania
    1. Dodać 500 μg/ml proteinazy K i 0,5% SDS, a następnie inkubować próbki w temperaturze 50 °C przez 2 godziny
      UWAGA: W przypadku przechodzenia do sekwencji ChIP-należy unikać ekstrakcji fenolowo-chloroformowej, ponieważ hamuje ona dalszy proces NGS. Zamiast tego zaleca się użycie dostępnego w handlu zestawu (patrz tabela materiałów).
    2. Do każdej próbki dodać 0,5 objętości fenolu i 0,5 objętości mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1).
    3. Wirować przez 1 min.
    4. Wirować przy 13 000 x g przez 10 min.
    5. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.
    6. Dodać 1 objętość mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1) do każdej próbki.
    7. Wirować przez 1 min.
    8. Wirować przy 13 000 x g przez 10 min.
    9. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki do mikrowirówki.
  7. Ekstrakcja DNA
    1. Dodać 2,5 objętości 96% etanolu i 0,1 objętości 3 M Na-octanu pH 5,2.
    2. Inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze -80 °C.
    3. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Usuń etanol i umyj granulat 400 μl 70% etanolu.
    5. Odwirować próbki o masie 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Usuń etanol i wysusz granulki na powietrzu.
    7. Zawiesić osad w 50 μl TE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie procesów naprawczych w komórkach wywołanych przez DSB może być osiągnięte poprzez stabilną lub przejściową transfekcję. Należy jednak zauważyć, że stabilna transfekcja zapewnia jednorodną populację komórek, co daje ujednoliconą, a tym samym bardziej niezawodną odpowiedź komórkową. W przypadku transfekcji przejściowej tylko niewielka część populacji komórek pobiera i utrzymuje plazmid, co wprowadza różnorodność do eksperymentu. Ustanowienie systemów komórkowych opartych na endonukleazie ER-I-PpoI lub ER-AsiSI wyma...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż naprawa DNA jest stosunkowo nową dziedziną badań, nasza wiedza szybko się poszerza za pomocą różnych metod biochemicznych i mikroskopowych. Zachowanie informacji genetycznej ma kluczowe znaczenie dla komórek, ponieważ mutacje zachodzące w genach biorących udział w procesach naprawczych są jedną z głównych przyczyn nowotworzenia, a zatem niezbędne jest wyjaśnienie kluczowych etapów szlaków naprawy DNA.

Techniki biochemiczne (tj. western blot, immunoprecypitacja, spektrometria mas itp.) ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez grant Narodowego Biura Badań, Rozwoju i Innowacji GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, stypendium badawcze Jánosa Bolyai Węgierskiej Akademii Nauk BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, krótkoterminowe stypendium EMBO 8513, oraz Fundację Tempus.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHTSigma AldrichH7904
AgaroseLonza50004
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100& razy;), StabilizowanySigma AldrichA5955
Anty-gamma H2A. Przeciwciało X (fosfo S139)Abcamab26350
Frakcja V surowicy bydlęcejAlbumina BiosurowicaPM-T1725
TrackIt™ Cyjan/Żółty Bufor ZaładowczyThermo Fisher Scientific10482035
DMEM z 1,0 g/L glukozy, bez L-GlutaminyLonza12-707F
DoksycyklinaSigma AldrichD9891
Dynabeads™ M-280 Owca Przeciw myszom IgGInvitrogen11202D
Dynabeads&handel; M-280 Owca IgG przeciw królikomInvitrogen11204D
EDTASigma AldrichE6758
EGTASigmaAldrich E3889
Etanolmolowy Chemikalia02910-101-340
Płodowa surowica bydlęca (pochodzenie z Ameryki Południowej), zatwierdzona przez UEGibcoECS0180L
formaldehyd 37% roztwór wolny od kwasuSigma Aldrich1.03999
GlutaMAX&handel; SuplementThermo Fisher Scientific35050038
GlycineSigma Aldrich50046
IPure kit v2DiagenodeC03010015
Alkohol izoamylowySigma AldrichW205702
LiClSigma AldrichL9650
NaClSigma AldrichS5886
Na-DOCSigma AldrichD6750
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Neokarzynostatyna ze Streptomyces carzinostaticusSigma AldrichN9162
NP-40Sigma AldrichI8896
PBS Proszek bez Ca2+, Mg2+Sigma AldrichL182-50-BC
FenolSigma AldrichP4557
RURYSigma AldrichP1851
Polysorbate 20 (Tween 20)Molar Chemicals09400-203-190
KClSigma AldrichP5405
ProLong™ Złoty uchwyt zapobiegający blaknięciu z DAPIThermo FisherScientific P36935
Zestaw koktajli inhibitorów proteazy IRoche11873580001
Proteinaza KSigma AldrichP2308
P-S2056 Przeciwciało DNAPKcsAbcamab18192
RNaza ARoche10109169001
CH3COONaSigma AldrichS2889
SDSSigma AldrichL3771
Tris Bufor octanowo-EDTASigma AldrichT6025
Tris-HClSigma Aldrich91228
TRITON X-100Molar Chemicals09370-006-340
Trypsyna z trzustki świniSigma AldrichT4799
Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowejGibco15400054

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
  4. Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
  6. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
  7. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
  8. Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
  9. Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
  10. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  11. Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
  12. Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
  13. Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
  14. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  15. Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
  18. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460(2012).
  19. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
  20. Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  21. Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
  22. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
  23. Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
  24. Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
  25. Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
  26. Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Site Specific DNA DamageDNA RepairChromatin ImmunoprecipitationFluorescence ImmunostainingDouble Strand BreaksProtein RecruitmentPost Translational ModificationsSingle Cell ResolutionWestern BlotSuper Resolution Microscopy

Related Articles