Method Article

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

DOI:

10.3791/62175

⸱

August 21st, 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki są stale narażone na działanie różnych czynników uszkadzających DNA, wywołując różne reakcje komórkowe. Zastosowanie podejść biochemicznych i genetycznych jest niezbędne do ujawnienia zdarzeń komórkowych związanych z rekrutacją i składaniem kompleksów naprawczych DNA w miejscu uszkodzenia DNA. W ciągu ostatnich kilku lat opracowano kilka potężnych narzędzi do indukowania uszkodzeń DNA specyficznych dla danego miejsca. Co więcej, nowatorskie techniki nasienne pozwalają nam badać te procesy na poziomie rozdzielczości pojedynczej komórki, zarówno przy użyciu komórek stałych, jak i żywych. Chociaż techniki te zostały wykorzystane do badania różnych procesów biologicznych, w niniejszym artykule przedstawiamy najczęściej stosowane protokoły w dziedzinie naprawy DNA, barwienie immunologiczne fluorescencji (IF) i immunoprecypitację chromatyny (ChIP), które w połączeniu z uszkodzeniami DNA specyficznymi dla miejsca na podstawie endonukleazy umożliwiają wizualizację i ilościowe określenie zajętości genomu czynników naprawy DNA w sposób ukierunkowany i regulowany, odpowiednio. Techniki te dostarczają naukowcom potężnych narzędzi do identyfikacji nowych białek związanych z uszkodzonym locus genomu, a także ich modyfikacji potranslacyjnych niezbędnych do ich precyzyjnej regulacji podczas naprawy DNA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz genom jest nieustannie kwestionowany przez różne czynniki uszkadzające DNA. Ataki te mogą pochodzić ze źródeł środowiskowych, takich jak światło UV lub napromieniowanie, a także ze źródeł endogennych, takich jak produkty uboczne przemiany materii spowodowane stresem oksydacyjnym lub błędami replikacji1,2. Zmiany te mogą wpływać na integralność jednej lub obu nici DNA, a jeśli wygenerowane błędy staną się trwałe, często prowadzi to do translokacji i niestabilności genomu, co może skutkować nowotworzeniem 3,4. Aby zachować integralność genomu, podcz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Immunodetekcja specyficznych białek

  1. Przygotowanie hodowli komórkowej i konfiguracja doświadczalna
    1. Utrzymuj komórki U2OS w monowarstwach w pożywce hodowlanej DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 2 mM glutaminą i 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym.
      UWAGA: Do indukcji uszkodzeń DNA na podstawie endonukleazy należy użyć pożywki poddanej działaniu węgla drzewnego lub bezsteroidowej, aby uniknąć nieszczelności systemu.
    2. Hoduj komórki w nawilżonym środowisku o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C aż do 80% konfluencji, odnawiając podłoże co 2-3 dni.
    3. Odessać pożywkę i przem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie procesów naprawczych w komórkach wywołanych przez DSB może być osiągnięte poprzez stabilną lub przejściową transfekcję. Należy jednak zauważyć, że stabilna transfekcja zapewnia jednorodną populację komórek, co daje ujednoliconą, a tym samym bardziej niezawodną odpowiedź komórkową. W przypadku transfekcji przejściowej tylko niewielka część populacji komórek pobiera i utrzymuje plazmid, co wprowadza różnorodność do eksperymentu. Ustanowienie systemów komórkowych opartych na endonukleazie ER-I-PpoI lub ER-AsiSI wyma.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż naprawa DNA jest stosunkowo nową dziedziną badań, nasza wiedza szybko się poszerza za pomocą różnych metod biochemicznych i mikroskopowych. Zachowanie informacji genetycznej ma kluczowe znaczenie dla komórek, ponieważ mutacje zachodzące w genach biorących udział w procesach naprawczych są jedną z głównych przyczyn nowotworzenia, a zatem niezbędne jest wyjaśnienie kluczowych etapów szlaków naprawy DNA.

Techniki biochemiczne (tj. western blot, immunoprecypitacja, spektrometria mas itp.) .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez grant Narodowego Biura Badań, Rozwoju i Innowacji GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, stypendium badawcze Jánosa Bolyai Węgierskiej Akademii Nauk BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, krótkoterminowe stypendium EMBO 8513, oraz Fundację Tempus.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-OHTSigma AldrichH7904
AgaroseLonza50004
Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100& razy;), StabilizowanySigma AldrichA5955
Anty-gamma H2A. Przeciwciało X (fosfo S139)Abcamab26350
Frakcja V surowicy bydlęcejAlbumina BiosurowicaPM-T1725
TrackIt™ Cyjan/Żółty Bufor ZaładowczyThermo Fisher Scientific10482035
DMEM z 1,0 g/L glukozy, bez L-GlutaminyLonza12-707F
DoksycyklinaSigma AldrichD9891
Dynabeads™ M-280 Owca Przeciw myszom IgGInvitrogen11202D
Dynabeads&handel; M-280 Owca IgG przeciw królikomInvitrogen11204D
EDTASigma AldrichE6758
EGTASigmaAldrich E3889
Etanolmolowy Chemikalia02910-101-340
Płodowa surowica bydlęca (pochodzenie z Ameryki Południowej), zatwierdzona przez UEGibcoECS0180L
formaldehyd 37% roztwór wolny od kwasuSigma Aldrich1.03999
GlutaMAX&handel; SuplementThermo Fisher Scientific35050038
GlycineSigma Aldrich50046
IPure kit v2DiagenodeC03010015
Alkohol izoamylowySigma AldrichW205702
LiClSigma AldrichL9650
NaClSigma AldrichS5886
Na-DOCSigma AldrichD6750
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Neokarzynostatyna ze Streptomyces carzinostaticusSigma AldrichN9162
NP-40Sigma AldrichI8896
PBS Proszek bez Ca2+, Mg2+Sigma AldrichL182-50-BC
FenolSigma AldrichP4557
RURYSigma AldrichP1851
Polysorbate 20 (Tween 20)Molar Chemicals09400-203-190
KClSigma AldrichP5405
ProLong™ Złoty uchwyt zapobiegający blaknięciu z DAPIThermo FisherScientific P36935
Zestaw koktajli inhibitorów proteazy IRoche11873580001
Proteinaza KSigma AldrichP2308
P-S2056 Przeciwciało DNAPKcsAbcamab18192
RNaza ARoche10109169001
CH3COONaSigma AldrichS2889
SDSSigma AldrichL3771
Tris Bufor octanowo-EDTASigma AldrichT6025
Tris-HClSigma Aldrich91228
TRITON X-100Molar Chemicals09370-006-340
Trypsyna z trzustki świniSigma AldrichT4799
Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowejGibco15400054

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Site Specific DNA DamageDNA RepairChromatin ImmunoprecipitationFluorescence ImmunostainingDouble Strand BreaksProtein RecruitmentPost Translational ModificationsSingle Cell ResolutionWestern BlotSuper Resolution Microscopy

Related Articles