Method Article

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

DOI:

10.3791/62177

⸱

March 14th, 2021

 ,  ,  , 
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnio odkryto, że kilku członków rodziny ewolucyjnie zachowanych białek wiążących oksysterol (OSBP) (ORP)/homologów OSBP (Osh) reprezentuje nową grupę białek przenoszących lipidy (LTP) w komórkach drożdży i ludzi. Przenoszą one fosfatydyloserynę (PS) z retikulum endoplazmatycznego (ER) do błony plazmatycznej (PM) poprzez cykle wymiany PS / fosfatydyloinozytolu 4-fosforanu (PI(4)P). Odkrycie to pozwala lepiej zrozumieć, w jaki sposób PS, który ma kluczowe znaczenie dla procesów sygnalizacyjnych, jest rozprowadzany w komórce oraz zbadać związek między tym procesem a metabolizmem fosfoinozytolu (). Opracowanie nowych protokołów opartych na fluorescencji odegrało zasadniczą rolę w odkryciu i scharakteryzowaniu tego nowego mechanizmu komórkowego in vitro na poziomie molekularnym. W artykule opisano produkcję i zastosowanie dwóch znakowanych fluorescencyjnie czujników lipidowych, NBD-C2Lact i NBD-PHFAPP, do pomiaru zdolności białka do ekstrakcji PS lub PI(4)P i przenoszenia tych lipidów między sztucznymi błonami. Po pierwsze, protokół opisuje, w jaki sposób produkować, znakować i uzyskiwać próbki tych dwóch konstruktów o wysokiej czystości. Po drugie, w artykule wyjaśniono, jak używać tych czujników z czytnikiem mikropłytek fluorescencyjnych w celu określenia, czy białko może wyekstrahować PS lub PI(4)P z liposomów, wykorzystując Osh6p jako studium przypadku. Wreszcie, protokół ten pokazuje, jak dokładnie zmierzyć kinetykę wymiany PS / PI (4) P między liposomami o określonym składzie lipidowym i określić szybkość transferu lipidów za pomocą transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) przy użyciu standardowego fluorometru.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precyzyjny rozkład lipidów pomiędzy różnymi błonami oraz w obrębie błon komórek eukariotycznych1,2 ma głębokie implikacje biologiczne. Odszyfrowanie sposobu działania LTP jest ważną kwestią w biologii komórki3,4,5,6, a podejścia in vitro mają wielką wartość w rozwiązywaniu tego problemu7,8,9,10,11. W tym miejscu p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oczyszczanielaktu NBD-C2

UWAGA: Chociaż ten protokół szczegółowo opisuje użycie zakłócacza komórkowego do rozbijania bakterii, może być zmodyfikowany tak, aby używał innych strategii lizy (np. prasy francuskiej). Na początku oczyszczania obowiązkowe jest użycie buforu, który jest świeżo odgazowany, przefiltrowany i uzupełniony 2 mM ditiotreitolem (DTT), aby zapobiec utlenianiu cysteiny. Jednak na etapie znakowania białka kluczowe jest całkowite usunięcie DTT. Wiele etapów należy wykonać na lodzie lub w chłodni, aby uniknąć degradacji białka. Próbki o objętości 30 μl muszą być pobierane na różnych etapach protokołu w cel....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1: Opis fluorescencyjnych czujników lipidowych i testów in vitro. (A) Trójwymiarowe modele NBD-C2Lact i NBD-PHFAPP oparte na strukturze krystalicznej domeny C2 laktadheryny bydlęcej (PDB ID: 3BN648) oraz strukturze NMR domeny PH ludzkiego białka FAPP1 (PDB ID: 2KCJ46

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki tych testów opierają się bezpośrednio na sygnałach fluorescencyjnych czujników lipidowych. W związku z tym oczyszczenie tych sond znakowanych w stosunku 1:1 za pomocą NBD i bez zanieczyszczenia wolnym fluoroforem NBD jest krytycznym krokiem w tym protokole. Obowiązkowe jest również sprawdzenie, czy badany LTP jest prawidłowo złożony i nie jest zagregowany. Ilość LTP badana w testach ekstrakcji musi być równa lub wyższa niż ilość dostępnych cząsteczek PS lub PI(4)P, aby prawidłowo zmierzyć, czy LTP skutecznie ekstr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni dr A. Cuttriss za staranną korektę manuskryptu. Prace te są finansowane z grantu Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) oraz przez CNRS.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  L-cysteina ≥ 97 % (FG) SigmaW326305-100GPrzygotuj 10 mM roztwór podstawowy L-cysteiny w wodzie. Podwielokrotności są przechowywane w temperaturze -20 ° C
2 ml Bursztynowa fiolka, PTFE/Rub Lnr, do przechowywania lipidów w CHCL3WheatonW224681
kulki szklane o średnicy 4 mmSigmaZ265934-1EA
50 mL stożkowa probówka wirówkowaFalcon
Ä Oczyszczacz KTAGE healthcareFPLC
Folia
Amicon Ultra-15 o MWCO 3 i 10 kDaMerckUFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 o MWCO 3 i 10 kDaMerckUFC800324, UFC801024
AmpicylinaPrzygotuj roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml z przefiltrowaną i wysterylizowaną wodą i przechowuj go w temperaturze -20 & stopień C.
BestatinSigmaB8385-10mg
BL21 Złote kompetentne komórkiAgilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) w CHCl3 (1 mg/ml)Avanti Polar Lipids810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon LipidsP-4016-3Rozpuść 1 mg proszku C16:0/C16:0-PI(4)P w 250 &mikro; L MeOH i 250 &mikro; L z CHCl3. Następnie uzupełnij CHCl3 do 1 ml. Rozwiązanie musi stać się jasne.
C16:0/C18:1-PS (POPS) w CHCl3 (10 mg/ml)Avanti Polar Lipids840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) w CHCl3 (25 mg/mL)Avanti Polar Lipids850375C-500mg
CaCl2 SigmaPrzygotować 10 mM roztworu podstawowego CaCl2 w wodzie.
Chloroform
CHCl3) RPE-ISOCarlo Erba438601
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA5056489001
Dejonizowana (Milli-Q) woda
Dimetyloformamid (DMF), bezwodny, >99% czystości
DNAzya I Rekombinowana, wolna od RNAzy, w proszkuRoche10104159001
DTTEuromedexEU0006-BPrzygotować 1 M roztwór podstawowy DTT w wodzie Milli-Q.  Przygotować 1 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Kolumny chromatograficzne Econo-Pac (1,5 i razy 12 cm).Biorad7321010
Kuweta do elektroporacji 2 mmOzymeEP102
Elektroporator Eppendorf 2510Eppendorf
Rotor o stałym kącie nachylenia Rurki Ti45 i Ti45BeckmanWirowanie lizatów
Szklane strzykawki (10, 25 i 50 &mikro; L) do eksperymentu fluorescencyjnegoSzklane
(25 , 100, 250, 500 i 1000 &mikro; L) do obsługi podstawowych roztworów lipidowychHamilton1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutation Sepharose 4B BeadsGE Healthcare17-0756-05
Glicerol (99% czystości)SigmaG5516-500ML
Rurki do hemolizy z nakrętką
HEPES, >99% czystejSigmaH3375-500G
Illustra Kolumna odsalająca NAP 10GE healthcareGE17-0854-02
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) EuromedexEU0008-BPrzygotować 1 M roztwór podstawowy IPTG w Milli-Qwater. Przygotować 1 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
K-AcetateProlabo26664.293
Lennox LB Pożywka bulionowa bez glukozyPrzygotowana z wodą mili-Q i autoklawowana.
Ciekły azotLinde
Metanol (MeOH) ≥ 99,8%VWR20847.24
MgCl2SigmaPrzygotować roztwór 2 M MgCl2. Przefiltrować roztwór za pomocą 0,45 &mikro; Filtr M. 
Microplate 96 Well PS F-Botom niewiążącyGreiner Bio-one655900
Mini-ekstruder z dwiema gazoszczelnymi strzykawkami Hamilton o pojemności 1 mlAvanti Polar Lipids610023
Monochromatorowy czytnik płytek fluorescencyjnychTECANM1000 Pro
N,N'-dimetylo-N-(jodoacetylo)-N'-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)etylenodiamina) (amid IANBD)Sondy molekularneRozpuścić 25 mg IANBD w 2,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i przygotować 25 podwielokrotności 100 &mikro; L w probówkach z nakrętką 1,5 ml. Nie zakręcaj całkowicie nakrętki. Następnie należy usunąć DMSO z liofilizatora, aby uzyskać 1 mg suchego IANBD na probówkę. Probówki są zamykane i przechowywane w temperaturze -20 ° C w ciemności.   
NaClSigmaS3014-1KG
PBS137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1,8 mM KH2PO4, autoklawowane i przechowywane w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Szklane kolby w kształcie gruszki (25 mL, 14/23, szkło Duran)Grupa
PepstatynaSigmap5318-25mg
pGEX-C2LACT  plazmidDostępne na życzenie w naszym laboratorium
pGEX-PHFAPPDostępne na życzenie w naszym laboratorium
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) ≥ 98,5% (GC)SigmaP7626-25gPrzygotować 200 mM roztwór podstawowy PMSF w izopropanolu
PhosphoramidonSigmaR7385-10mg
Filtry poliwęglanowe (o średnicy 19 mm) o wielkości porów 0,2 i mikro; mAvanti Polar Lipids610006
Kolumna chromatograficzna Poly-Prep (o objętości złoża 0-2 ml i zbiorniku 10 ml)Filtry wstępne Biorad7311550
(o średnicy 10 mm).Avanti Polar Lipids610014
PyMOLhttp://pymol.org/Budowa modeli 3D białek (Rysunek 1A)
Kuweta kwarcowa do fluorescencji UV/widzialnej (minimalna objętość 600 &mikro; L)Hellma
  Eppendorf 5427RParownik obrotowy Eppendorf
BuchiB-100
Probówki do mikrowirówek z nakrętką (1,5 ml)Sarsted
Małe magnetyczne mieszadło PFTE (5 i razy; 2 mm)
Probówki do mikrowirówek zatrzaskowe (0,5, 1 i 2 ml)Eppendorf
SYPRO pomarańczowybarwienie fluorescencyjne do wykrywania białka w żelu SDS-PAGE
ThermomixerStarlab
TROMBINA, Z LUDZKIEGO OSOCZASigma10602400001Rozpuść 20 jednostek w 1 ml wody mili-Q i przygotuj 25 &mikro; L porcji w probówkach Eppendorfa o pojemności 0,5 ml. Następnie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
Tris, ultra czystyMP819623
Ultrawirówka L90KBeckman
Spektrofotometr UV/absorpcji światła widzialnegoSAFAS
Spektrofluorometr UV/widzialny z uchwytem na kuwetę o kontrolowanej temperaturze i urządzeniem mieszającymJasco lub ShimadzuJasco FP-8300 lub Shimadzu RF-5301PC
Komorapróżniowa
Łaźnia wodnaJulabo
XK 16/70 kolumna wypełniona Sephacryl S200HRGE healthcare
aluminiowa ( Roche batcerialnych strzykawki Hamilton Duranplazmid Kuwety kwarcowe Wirówka z chłodzeniem Hellma

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellul....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phosphatidylserine ExchangePhosphatidylinositol 4 PhosphateLipid Transfer ProteinFluorescence MeasurementsLiposome AssayNBD C2 LactNBD PH FAPPLipid Transfer KineticsFluorescence Resonance Energy TransferOsh6p Protein

Related Articles