Method Article

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

DOI:

10.3791/62177

⸱

March 14th, 2021

 ,  ,  , 
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnio odkryto, że kilku członków rodziny ewolucyjnie zachowanych białek wiążących oksysterol (OSBP) (ORP)/homologów OSBP (Osh) reprezentuje nową grupę białek przenoszących lipidy (LTP) w komórkach drożdży i ludzi. Przenoszą one fosfatydyloserynę (PS) z retikulum endoplazmatycznego (ER) do błony plazmatycznej (PM) poprzez cykle wymiany PS / fosfatydyloinozytolu 4-fosforanu (PI(4)P). Odkrycie to pozwala lepiej zrozumieć, w jaki sposób PS, który ma kluczowe znaczenie dla procesów sygnalizacyjnych, jest rozprowadzany w komórce oraz zbadać związek między tym procesem a metabolizmem fosfoinozytolu (). Opracowanie nowych protokołów opartych na fluorescencji odegrało zasadniczą rolę w odkryciu i scharakteryzowaniu tego nowego mechanizmu komórkowego in vitro na poziomie molekularnym. W artykule opisano produkcję i zastosowanie dwóch znakowanych fluorescencyjnie czujników lipidowych, NBD-C2Lact i NBD-PHFAPP, do pomiaru zdolności białka do ekstrakcji PS lub PI(4)P i przenoszenia tych lipidów między sztucznymi błonami. Po pierwsze, protokół opisuje, w jaki sposób produkować, znakować i uzyskiwać próbki tych dwóch konstruktów o wysokiej czystości. Po drugie, w artykule wyjaśniono, jak używać tych czujników z czytnikiem mikropłytek fluorescencyjnych w celu określenia, czy białko może wyekstrahować PS lub PI(4)P z liposomów, wykorzystując Osh6p jako studium przypadku. Wreszcie, protokół ten pokazuje, jak dokładnie zmierzyć kinetykę wymiany PS / PI (4) P między liposomami o określonym składzie lipidowym i określić szybkość transferu lipidów za pomocą transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) przy użyciu standardowego fluorometru.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precyzyjny rozkład lipidów pomiędzy różnymi błonami oraz w obrębie błon komórek eukariotycznych1,2 ma głębokie implikacje biologiczne. Odszyfrowanie sposobu działania LTP jest ważną kwestią w biologii komórki3,4,5,6, a podejścia in vitro mają wielką wartość w rozwiązywaniu tego problemu7,8,9,10,11. W tym miejscu przedstawiono strategię opartą na fluorescencji in vitro, która odegrała zasadniczą rolę w ustaleniu, że kilka białek ORP/Osh wpływa na wymianę PS/PI(4)P między błonami komórkowymi12, a tym samym stanowi nową klasę LTPs. PS jest anionowym glicerofosfolipidem, który stanowi 2-10% całkowitych lipidów błonowych w komórkach eukariotycznych13,14,16. Jest on rozprowadzany wzdłuż gradientu między ER a PM, gdzie stanowi odpowiednio 5-7% i do 30% glicerofosfolipidów17,18,19. Co więcej, PS jest zasadniczo skoncentrowany w cytozolowej ulotce PM. To nagromadzenie i nierównomierny podział PS w PM mają kluczowe znaczenie dla procesów sygnalizacji komórkowej19. Ze względu na ujemny ładunek cząsteczek PS, ulotka cytozolowa PM jest znacznie bardziej anionowa niż ulotka cytozolowa innych organelli1,2,19,20. Umożliwia to rekrutację, za pomocą sił elektrostatycznych, białek sygnałowych, takich jak mirystoylowany substrat kinazy C bogaty w alaninę (MARCKS)21, mięsak (Src)22, onkogen wirusa mięsaka szczura Kirsten (K-Ras)23 i substrat toksyny botulinowej C3 związany z Ras 1 (Rac1)24, które zawierają odcinek dodatnio naładowanych aminokwasów i ogon lipidowy.

PS jest również rozpoznawany przez konwencjonalną kinazę białkową C w sposób stereoselektywny za pośrednictwem domeny C225. Jednak PS jest syntetyzowany w klasie ER26, co oznacza, że musi zostać wyeksportowany do PM, zanim będzie mógł odegrać swoją rolę. Nie było wiadomo, w jaki sposób zostało to osiągnięte19 aż do stwierdzenia, że w drożdżach Osh6p i Osh7p przenoszą PS z ER do PM27. Te LTP należą do ewolucyjnie konserwatywnej rodziny eukariontów, której członkiem założycielem jest OSBP i która zawiera białka (ORP u ludzi, białka Osh u drożdży) integrujące domenę związaną z OSBP (ORD) z kieszenią do przechowywania cząsteczki lipidu. Osh6p i Osh7p składają się tylko z ORD, którego cechy strukturalne są przystosowane do specyficznego wiązania PS i przenoszenia go między membranami. Niemniej jednak nie było jasne, w jaki sposób białka te kierunkowo przenosiły PS z ER do PM. Osh6p i Osh7p mogą wychwytywać PI(4)P jako alternatywny ligand lipidowy12. W drożdżach PI(4)P jest syntetyzowany z fosfatydyloinozytolu (PI) w Golgiego i PM przez kinazy PI 4, odpowiednio Pik1p i Stt4p. W przeciwieństwie do tego, w błonie ER nie ma PI(4)P, ponieważ ten lipid jest hydrolizowany do PI przez fosfatazę Sac1p. W związku z tym gradient PI(4)P występuje zarówno na interfejsie ER/Golgiego, jak i ER/PM. Osh6p i Osh7p przenoszą PS z ER do PM poprzez cykle wymiany PS/PI(4)P przy użyciu gradientu PI(4)P, który istnieje między tymi dwiema membranami12.

W ciągu jednego cyklu, Osh6p ekstrahuje PS z ER, wymienia PS na PI(4)P w PM i przenosi PI(4)P z powrotem do ER, aby wyodrębnić inną cząsteczkę PS. Osh6p/Osh7p oddziałuje z Ist2p28, jednym z niewielu białek, które łączą i zbliżają błonę ER i PM do siebie, tworząc miejsca kontaktu ER-PM w drożdżach29,30,31. Ponadto związek Osh6p z ujemnie naładowanymi błonami staje się słaby, gdy tylko białko ekstrahuje jeden ze swoich ligandów lipidowych z powodu zmiany konformacyjnej, która modyfikuje jego cechy elektrostatyczne32. Wspomaga to Osh6p, skracając czas przebywania jego błony, utrzymując w ten sposób wydajność jego aktywności transferu lipidów. W połączeniu z wiązaniem z Ist2p, mechanizm ten może pozwolić Osh6p/7p zarówno na szybką, jak i dokładną wymianę lipidów na granicy ER / PM. W komórkach ludzkich białka ORP5 i ORP8 wykonują wymianę PS/PI(4)P w miejscach kontaktu ER-PM za pomocą różnych mechanizmów33. Mają centralny ORD, podobny do Osh6p, ale są bezpośrednio zakotwiczone w ER za pośrednictwem C-końcowego segmentu transbłonowego33 i dokują do PM za pośrednictwem N-końcowej domeny homologii Pleckstrin (PH), która rozpoznaje PI(4)P i PI(4,5)P233,34,35. ORP5/8 wykorzystuje PI(4)P do przenoszenia PS i wykazano, że ORP5/8 dodatkowo reguluje poziomy PM PI(4,5)P2 i przypuszczalnie moduluje szlaki sygnałowe. Z kolei spadek poziomów PI(4)P i PI(4,5)P2 obniża aktywność ORP5 / ORP8, ponieważ białka te wiążą się z PM w sposób zależny od. Nienormalnie wysoka synteza PS, która prowadzi do zespołu Lenza-Majewskiego, wpływa na poziomy PI(4)P poprzez ORP5/836. Gdy aktywność obu białek jest zablokowana, PS staje się mniej obfity w PM, obniżając onkogenną zdolność białek sygnałowych37.

Na odwrót, nadekspresja ORP5 wydaje się sprzyjać inwazji komórek rakowych i procesom przerzutowym38. Tak więc zmiany w aktywności ORP5/8 mogą poważnie modyfikować zachowanie komórek poprzez zmiany w homeostazie lipidów. Co więcej, ORP5 i ORP8 zajmują miejsca kontaktu ER-mitochondriów i zachowują niektóre funkcje mitochondrialne, prawdopodobnie poprzez dostarczanie PS39. Dodatkowo, ORP5 lokalizuje się w miejscach kontaktu kropelek ER-lipidów, aby dostarczyć PS do kropelek lipidów przez PS/PI(4)P exchange40. Opisana w niniejszym dokumencie strategia pomiaru (i) ekstrakcji PS i PI(4)P z liposomów oraz (ii) transportu PS i PI(4)P między liposomami została opracowana w celu ustalenia i analizy aktywności wymiany PS/PI(4)P Osh6p/Osh7p12,32 i stosowana przez inne grupy do analizy aktywności ORP5/ORP835 i innych LTP10, 41. Opiera się na wykorzystaniu czytnika płytek fluorescencyjnych, standardowego spektrofluorometru w formacie L oraz dwóch czujników fluorescencyjnych, NBD-C2Lact i NBD-PHFAPP, które mogą wykrywać odpowiednio PS i PI(4)P.

NBD-C2Lact odpowiada domenie C2 glikoproteiny, laktadheryny, która została przeprojektowana tak, aby zawierała unikalną cysteinę wystawioną na działanie rozpuszczalnika w pobliżu przypuszczalnego miejsca wiązania PS; wrażliwy na polarność fluorofor NBD (7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol) jest kowalencyjnie połączony z tą resztą (Rysunek 1A)12. Mówiąc dokładniej, domena C2 laktadheryny (Bos taurus, UniProt: Q95114, reszty 270-427) została sklonowana do wektora pGEX-4T3, który ulega ekspresji w fuzji z S-transferazą glutationu (GST) w Escherichia coli. Sekwencja C2Lact została następnie zmutowana w celu zastąpienia dwóch dostępnych w rozpuszczalniku reszt cysteiny (C270, C427) resztami alaniny i wprowadzenia reszty cysteiny do regionu w pobliżu domniemanego miejsca wiązania PS (mutacja H352C), która może być następnie znakowana N,N'-dimetylo-N-(jodoacetylo)-N'-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo) etylenodiamina (IANBD) 12. Miejsce rozszczepienia trombiny znajduje się między białkiem GST a N-końcem domeny C2. Główną zaletą jest to, że ta domena selektywnie rozpoznaje PS w sposób niezależny od Ca2+, w przeciwieństwie do innych znanych domen C2 lub Annexin A542. NBD-PHFAPP pochodzi z domeny pH ludzkiego białka adaptora czterofosforanowego 1 (FAPP1), które zostało przeprojektowane tak, aby zawierało pojedynczą cysteinę wystawioną na działanie rozpuszczalnika, którą można znakować grupą NBD w pobliżu miejsca wiązania PI(4)P (Rysunek 1A)43. Sekwencja nukleotydowa domeny PH ludzkiego białka FAPP (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]) została sklonowana do wektora pGEX-4T3, który ulega ekspresji w połączeniu ze znacznikiem GST. SekwencjaPH FAPP została zmodyfikowana w celu wstawienia unikalnej reszty cysteiny do interfejsu wiążącego błonę białka43. Co więcej, między miejscem rozszczepienia trombiny a N-końcem domeny PH wprowadzono łącznik z dziewięcioma resztami, aby zapewnić dostęp do proteazy.

Aby zmierzyć ekstrakcję PS z liposomów, NBD-C2Lact jest mieszany z liposomami wykonanymi z fosfatydylocholiny (PC) zawierającymi śladowe ilości PS. Ze względu na swoje powinowactwo do PS, konstrukt ten wiąże się z liposomami, a fluorofor NBD doświadcza zmiany polarności, gdy wchodzi w kontakt z hydrofobowym środowiskiem błony, co wywołuje przesunięcie ku błękitowi i wzrost fluorescencji. Jeśli PS jest prawie całkowicie ekstrahowany przez stechiometryczną ilość LTP, sonda nie kojarzy się z liposomami, a sygnał NBD jest niższy ( Rysunek 1B) 32. Ta różnica w sygnale jest używana do określenia, czy LTP (np. Osh6p) wyodrębnia PS. Podobna strategia jest stosowana w przypadku NBD-PHFAPP do pomiaru ekstrakcji PI(4)P (Rysunek 1B), jak opisano wcześniej12,32. Zaprojektowano dwa testy oparte na FRET, aby (i) zmierzyć transport PS z liposomów LA do LB, które naśladują odpowiednio błonę ER i PM, oraz (ii) transport PI(4)P w odwrotnym kierunku. Testy te przeprowadza się w tych samych warunkach (tj. w tym samym buforze, temperaturze i stężeniu lipidów) w celu pomiaru wymiany PS/PI(4)P. Aby zmierzyć transport PS, NBD-C2Lact miesza się z liposomami LA złożonymi z PC i domieszkuje 5% mol PS i 2 mol% fluorescencyjnego gliposomów fosfatydyloetanoloaminy znakowanej rodaminą (Rhod-PE) i LB zawierających 5% mol PI (4) P.

O godzinie zero, FRET z Rhod-PE wygasza fluorescencję NBD. Jeśli PS jest transportowany z liposomów LA do LB (np. Po wstrzyknięciu Osh6p), następuje szybkie wygaszenie z powodu translokacji cząsteczekLact NBD-C2 z liposomów LA do LB (Rysunek 1C). Biorąc pod uwagę ilość dostępnego PS, NBD-C2Lact pozostaje zasadniczo w stanie związanym z błoną w trakcie eksperymentu12. Tak więc intensywność sygnału NBD bezpośrednio koreluje z dystrybucjąlaktu NBD-C2 między liposomami LA i LB i można ją łatwo znormalizować w celu określenia, ile PS jest przenoszone. Aby zmierzyć przenoszenie PI(4)P w przeciwnym kierunku, NBD-PHFAPP miesza się z liposomami LA i LB; biorąc pod uwagę, że wiąże się tylko z liposomami LB, które zawierają PI(4)P, ale nie Rhod-PE, jego fluorescencja jest wysoka. Jeśli PI(4)P zostanie przeniesiony do liposomówLA, przemieszcza się do tych liposomów, a sygnał zmniejsza się z powodu FRET z Rhod-PE (Rysunek 1C). Sygnał jest normalizowany w celu określenia, ile PI(4)P jest przesyłane43.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oczyszczanielaktu NBD-C2

UWAGA: Chociaż ten protokół szczegółowo opisuje użycie zakłócacza komórkowego do rozbijania bakterii, może być zmodyfikowany tak, aby używał innych strategii lizy (np. prasy francuskiej). Na początku oczyszczania obowiązkowe jest użycie buforu, który jest świeżo odgazowany, przefiltrowany i uzupełniony 2 mM ditiotreitolem (DTT), aby zapobiec utlenianiu cysteiny. Jednak na etapie znakowania białka kluczowe jest całkowite usunięcie DTT. Wiele etapów należy wykonać na lodzie lub w chłodni, aby uniknąć degradacji białka. Próbki o objętości 30 μl muszą być pobierane na różnych etapach protokołu w celu przeprowadzenia analizy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) przy użyciu 15% żelu akrylowego w celu sprawdzenia postępu oczyszczania. Wymieszać wystarczającą ilość denaturującego buforu próbki Laemmli z każdą podwielokrotnością i podgrzać mieszaninę w temperaturze 95 °C. Zamrażać i przechowywać probówki w temperaturze -20 °C do czasu analizy.

  1. Ekspresjalaktu GST-C2 w Escherichia coli
    1. Wymieszaj 20 μl kompetentnych komórek BL21 Gold z 18 μl wysterylizowanej wody. Następnie wymieszaj 2 μl plazmidu pGEX-C2Lact (o stężeniu ~65 ng/μL) z bakteriami i przekształc je za pomocą elektroporacji. Zawiesić bakterie w 150 μl autoklawizowanego podłoża Lennox Lysogeny-Broth (LB) (10 g/l tryptonu, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l NaCl w wodzie dejonizowanej, bez glukozy). Pozwól bakteriom rosnąć w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w probówce wirówkowej z zatrzaskową nasadką o pojemności 2 ml.
    2. Zaszczepić 25 ml pożywki LB, uzupełnionej 50 μg/ml ampicyliny, 150 μl zawiesiny bakteryjnej w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 ml. Umieścić kolbę w wytrząsarce orbitalnej o temperaturze 37 °C i pozostawić bakterie do wzrostu przez noc z mieszaniem przy 185 obr./min.
    3. Napełnij dwie sterylne 2 litry kolby Erlenmeyera 500 ml pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml ampicyliny i dodaj 5 ml zawiesiny preculture. Pozwól bakteriom rosnąć w temperaturze 37 °C z mieszaniem przy 220 obr./min.
    4. Okresowo mierzyć gęstość optyczną (OD) zawiesiny przy długości fali (λ) 600 nm. Gdy OD osiągnie wartość ~0,6-0,7, dodać 500 μl roztworu podstawowego 1 M izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do każdej kolby, aby zainicjować ekspresjęlaktu GST-C2. Wytrząsać kolby z prędkością 185 obr./min przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
    5. Przenieść zawartość każdej kolby do polipropylenowej butelki wirówkowej. Odwirować dwie butelki przez 30 minut w temperaturze 4600 × g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia bakterii. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w 50 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.
    6. Przenieść zawiesinę bakteryjną znajdującą się w każdej butelce do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Odwirować obie probówki przez 30 minut w temperaturze 2300 × g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i przechowywać probówki, z których każda zawiera osad bakteryjny, w temperaturze -20 °C.
  2. Oczyszczanielaktu C2
    1. Na lodzie napełnić dwie stożkowe rurki odśrodkowe o pojemności 50 ml 50 ml buforu zawierającego 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 i 150 mM NaCl (zwanego dalej buforem TN), uprzednio przefiltrowanych i odgazowanych przez membranową filtrację próżniową.
    2. Aby przygotować bufor do lizy w każdej probówce, należy rozpuścić tabletkę koktajlu inhibitorów proteazy bez kwasu etylenodiaminowego tetraoctowego w buforze TN przez łagodną sonikację lub wirowanie. Dodaj inne antyproteazy (10 μM bestatyny, 1 μg/ml pepstatyny A i 10 μM fosforamidonu). Co ważne, uzupełnij bufor o 2 mM DTT.
    3. Napełnić dwie probówki, które zawierają granulki bakteryjne przygotowane w kroku 1.1.6, buforem do lizy, aby uzyskać końcową objętość 30 ml w każdej probówce, i powoli rozmrażać granulki na lodzie przez 10 minut. Zmiażdżyć każdą granulkę szpatułką ze stali nierdzewnej i ponownie ją zawiesić, wirując probówki i/lub pipetując zawiesinę tam i z powrotem za pomocą kontrolera pipet i pipety o pojemności 25 ml, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny Uzyskane.
    4. Przeprowadzić lizę przy użyciu wstępnie schłodzonego rozdzielacza komórek (patrz tabela materiałów), ładując 30 ml próbki do zbiornika i uruchamiając cykl przerywania w trybie ciągłym pod ciśnieniem 1,6 bara. Zebrać lizat do tej samej probówki, trzymać probówkę na lodzie i natychmiast dodać 250 μl z roztworu podstawowego 200 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) przygotowanego w izopropanolu.
    5. Poddać próbce poddać lizę zgodnie z tą samą procedurą. Użyj pozostałej części buforu do lizy do przepłukania rozdzielnicy komórek i zbierz popłuczynę, aby dostosować objętość każdego lizatu (~ 30 ml) do końcowej objętości 50 ml.
    6. Uzupełnij każdy lizat 5 mM MgCl2 i dodaj 20 μg/ml DNAzy I, aby rozdrobnić DNA i w ten sposób zmniejszyć lepkość próbki. Inkubować na lodzie przez 30 minut. Pobrać próbkę do analizy żelu.
    7. Przenieść każde 50 ml lizatu do wstępnie schłodzonej probówki ultrawirówki z poliwęglanu (w sumie dwa, patrz tabela materiałów). Wirować przy 186 000 × g w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę przy użyciu ultrawirówki.
    8. Równolegle do etapu wirowania dozować 1,4 ml zawiesiny zawierającej glutation sprzężony z 4% kulkami agarozy do dwóch stożkowych probówek odśrodkowych o pojemności 50 ml, dodać 20 ml buforu TN uzupełnionego 1 mM DTT (bufor TND) do każdej probówki, odwirować przy 1200 × g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok prania dwa razy.
    9. Po odwirowaniu lizatu bakteryjnego należy pobrać próbkę o objętości 30 μl z supernatantu i przenieść supernatant z każdej probówki ultrawirówki do odpowiedniej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, która zawiera czyste kulki. W celu analizy żelu należy ponownie zawiesić osad zanieczyszczeń w jednej z probówek ultrawirówkowych z 50 ml buforu TND i pobrać próbkę o objętości 30 μl.
    10. Umieścić probówki na rotatorze na 3-4 godziny w temperaturze 4 °C, aby uzyskać jednorodną zawiesinę kulki. Zebrać zawiesiny kulek w pustej kolumnie chromatograficznej o pojemności 25 ml. Pozwól kulkom zdekantować i usuń bufor i niezwiązane białka przez przepływ grawitacyjny. Pobrać próbkę z eluatu do analizy.
    11. Ponownie zawiesić kulki za pomocą 20 ml buforu TND i zebrać eluat przez przepływ grawitacyjny. Powtórz ten krok dwukrotnie, aby całkowicie umyć koraliki. Zebrać zebrane eluaty i zachować próbkę o objętości 30 μl do dalszej analizy.
      UWAGA: Po krótkiej dekantacji, objętość ~2 ml zawiesiny perełek, do której dołączony jest GST-C2Lact, osadza się na dnie kolumny.
    12. Dodać 1 ml zawiesiny perełkowej do dwóch probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml z zatrzaskami. Napełnij każdą probówkę buforem TND do końcowej objętości 1.970 ml. Pobrać próbkę o objętości 30 μl z jednej probówki do dalszej analizy (próbka B1). Dodać 10 μl 10 mM roztworu CaCl2 i 25 μl z roztworu podstawowego ludzkiego roztworu proteazy trombinowej o stężeniu 0,02 j/μl.
    13. Umieścić dwie probówki na rotatorze w temperaturze 4 °C przez noc, aby trombina mogła odciąć znacznik GST od domeny C2Lact. Następnego dnia w każdej probówce wymieszać 10 μl 200 mM roztworu PMSF z zawiesiną kulek, aby zahamować działanie trombiny.
    14. Odwirować probówki o masie 700 × g przez 5 minut i zebrać supernatant, który zawiera rozpuszczalną domenęC2 Lact, z każdej probówki, bez pobierania kulek. Zebrać supernatanty w probówce do mikrowirówki typu snap-cap o pojemności 2 ml (eluat E1), która jest przechowywana na lodzie.
    15. Dodać 1 ml buforu TND do każdej probówki w celu ponownego zawieszenia kulek i umyć je; powtórzyć krok 1.2.14. Wykonaj ten krok trzy razy więcej, aby odzyskać maksymalną ilość białka. Za każdym razem zebrać zebrane supernatanty w nowej probówce o pojemności 2 ml (eluaty E2, E3, E4 i E5) i pobrać podwielokrotność do dalszej analizy. Na końcu etapów mycia pobrać podwielokrotność z zawiesiny ściegu (podwielokrotność B2).
    16. Przeanalizuj 30 μl próbek, które zostały pobrane na różnych etapach protokołu oczyszczania przez separację SDS-PAGE na 15% żelu akrylowym.
    17. Usunąć potencjalne kulki zanieczyszczające poprzez zebranie wszystkich supernatantów (tj. ~10 ml) zebranych podczas etapów 1.2.14 i 1.2.15 w kolumnie chromatograficznej o pojemności 10 ml. Zebrać eluat przez przepływ grawitacyjny i zatrzymać kulki na dnie kolumny.
    18. Zagęścić próbkęC2 Lact za pomocą odśrodkowego zespołu filtrującego o wartości odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącej 3 kDa i prędkości wirowania 2300 × g. Procedurę zatężania należy przerwać, gdy objętość próbki białka wynosi ~1 ml.
  3. Przygotowanie i oczyszczanielaktu NBD-C2
    1. Zrównoważyć kolumnę odsalającą (patrz tabela materiałów) z buforem TN. Załadować kolumnę 1 ml stężonej próbkiC2 Lact. Pozwól, aby próbka całkowicie weszła do złoża żelowego, dodaj 1,5 ml świeżo odgazowanego buforu TN wolnego od DTT do kolumny i zbierz eluat przez przepływ grawitacyjny do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml typu snap-cap.
    2. Rozcieńczyć 50 μl eluatu w końcowej objętości 300 μl buforu TN i zapisać widmo absorbancji od 230 do 450 nm, używając czystego buforu TN jako próby ślepej. Określić stężenieC2 Lact na podstawie absorbancji zmierzonej przy 280 nm, biorąc pod uwagę współczynnik ekstynkcji ε równy 44 920 M-1.cm-1.
    3. Aby oznaczyć konstruktC2 Lact fluoroforem NBD, należy wymieszać białko z dziesięciokrotnym nadmiarem molowym N,N'-dimetylo-N-(jodoacetylo)-N'-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)etylenodiamina (amid IANBD).
      1. Rozpuścić 1 mg IANBD w bezwodnym dimetyloformamidzie (DMF), pamiętając, że końcowa objętość DMF użyta do znakowania konstruktuC2 Lact nie może przekraczać 5% (v/v) objętości próbki białka.
      2. Aby określić objętość DMF (VDMF) do rozpuszczenia IANBD, najpierw oblicz wymaganą ilość IANBD (m, wyrażoną w mg) do znakowania białka za pomocą wzoru 1.
        m = 10 000 × C × V × MWIANBD (1)
        gdzie C jest stężeniem C2Lact mierzonym w kroku 1.3.2, V jest objętością próbkiC2 Lact, a MWIANBD jest masą cząsteczkową fluoroforu (420 g/mol).
      3. Oblicz VDMF za pomocą wzorów 2 (gdzie m0 = 1) i 3,
        VDMF= (m0/m) × VIANBD (2)
        VIANBD=0,05 × V (3)
        Gdzie m0 jest ilością proszku IANBD w mg, a VIANBD jest objętością roztworu IANBD, który należy dodać do próbki C2Lact.
      4. Dodać objętość VIANBD świeżo przygotowanego roztworu IANBD do próbkiC2 Lact i wstrząsać mieszaniną reakcyjną z prędkością 800-900 obr./min przez 30 minut w temperaturze 25 °C przy użyciu termomiksera chronionego przed światłem. Pozwól reakcji postępować przez 90 minut na lodzie. W międzyczasie wyczyść odśrodkową jednostkę filtrującą (MWCO = 3 kDa) za pomocą 10 ml buforu TN.
    4. Dodaj L-cysteinę (w 10-krotnym nadmiarze molowym do IANBD) do mieszaniny reakcyjnej, aby dezaktywować wolny IANBD.
    5. Dodać 15 ml buforu TN do roztworuLact NBD-C2 i przenieść roztwórLact NBD-C2 do odśrodkowej jednostki filtracyjnej. Zagęścić próbkę do 2 ml w celu oddzielenia większości wolnego NBD od białka przez odwirowanie w temperaturze 2300 × g. Powtórz ten krok prania dwa razy. Odwirować próbkę w probówce wirówkowej typu snap-cap o pojemności 2 ml przez 10 minut w temperaturze 19 000 × g w temperaturze 4 °C w celu uzyskania granulowanych potencjalnych agregatów i zebrać supernatant.
    6. Rozcieńczyć 50 μl eluatu w końcowej objętości 300 μl buforu TN. Zapisać widmo absorbancji od 230 do 650 nm, używając eluatu zebranego podczas procedury zatężania jako ślepej próby. Oznaczyć stężenielaktu NBD-C2 przy użyciu maksymalnej absorbancji przy λ=280 i 495 nm oraz współczynnikach ekstynkcji ε= 44,920 M-1.cm-1 (białko) i 25,000 M-1.cm-1 (fluorofor NBD).
      UWAGA: Jeśli dwie wartości stężenia są podobne, oznacza to, że konstruktC2 Lact jest oznaczony w stosunku 1:1 z grupą NBD.
    7. Jeżeli stężenielaktu NBD-C2 oszacowane na podstawie pomiaru absorbancji NBD przekracza stężenie oszacowane na podstawie absorbancji pozostałości tryptofanu (Trp), należy powtórzyć krok 1.3.5 w celu dalszego usunięcia wolnego NBD.
    8. Dodać glicerol do próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 10% (v/v) w celu krioochrony konstruktoru NBD-C2Lact podczas błyskawicznego zamrażania. Zmierz końcowe stężenie białka.
    9. Przygotować 50 μl porcji białka w probówkach do mikrowirówek typu snap-cap o pojemności 0,5 ml. Błyskawicznie zamrozić probówki w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C.

2. Oczyszczanie NBD-PHFAPP

UWAGA: Procedura produkcji i etykietowania PHFAPP jest identyczna jak w przypadku NBD-C2Lact, aż do przeniesienia roztworu NBD-C2Lact do filtra odśrodkowego w kroku 1.3.4. Począwszy od tego kroku, postępuj zgodnie z protokołem opisanym poniżej.

  1. Po etapie zatężania należy przechowywać 2 ml NBD-PHFAPP w temperaturze 4 °C w ciemności nie dłużej niż 1 dzień przed wykonaniem chromatografii wykluczającej rozmiar. Przed chromatografią wykluczania wielkości należy sprawdzić, czy na dnie probówki nie ma pomarańczowych osadów (agregacji podczas zatężania). W takim przypadku należy odwirować próbkę o masie 540 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i oczyścić supernatant metodą chromatografii wykluczającej wielkość produktu.
    UWAGA: Chromatografię wykluczania wielkości produktu przeprowadza się na kolumnie wypełnionej usieciowanym kopolimerem dekstrona-akryloamidu (patrz Tabela Materiałów), uprzednio zrównoważonym buforem TND, przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (patrz Tabela Materiałów). Kolumna musi być chroniona przed światłem. Zastosowano natężenie przepływu 1 ml/min, a po elucji konstruktu NBD-PHFAPP zapisano absorbancję przy λ=280 (białko) i 480 nm (NBD) na wyjściu z kolumny.
    1. Pobrać próbkę NBD-PHFAPP załadowaną do pętli iniekcyjnej o pojemności 2 ml na kolumnę i natychmiast zebrać 2,5 ml frakcji eluatu.
  2. Przeanalizuj wszystkie frakcje, które odpowiadają głównemu pikowi wykrytemu przy 280 i 480 nm na 15% żelu SDS-PAGE. Wymieszać 25 μl próbki każdej frakcji z 15 μl buforu do próbek Laemmli przed podgrzaniem i załadowaniem do żelu.
    UWAGA: Główny pik, który jest jednocześnie wykrywany przy λ = 280 i 480 nm, pojawia się po przepuszczeniu przez kolumnę objętości buforu ~150 ml.
  3. Połącz frakcje, które zawierają wyłącznie białko NBD-PHFAPP (~12,2 kDa) i dodaj glicerol w końcowym stężeniu 10% (v/v). Zagęścić próbkę za pomocą filtra odśrodkowego o MWCO 3 kDa do końcowej objętości 1 ml przy użyciu prędkości wirowania 2300 × g.
  4. Przygotować podwielokrotności i zapisać widmo absorbancji zgodnie z opisem dlalaktu NBD-C2. Użyć współczynnika ekstynkcji ε= 29,450 M-1.cm-1, aby określić stężenie białka na podstawie absorbancji zmierzonej przy λ=280 nm.

3. Przygotowanie liposomów do testów ekstrakcji lub transferu PS i PI(4)P

UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki w temperaturze pokojowej, chyba że określono inaczej. Z rozpuszczalnikami organicznymi, parownikami obrotowymi i ciekłym azotem należy obchodzić się ostrożnie.

  1. Przygotować świeży, przefiltrowany i odgazowany 50 mM bufor wodorotlenku 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES)-wodorotlenku potasu (KOH) o pH 7,4, 120 mM octanu potasu (HK).
  2. Dla każdego rodzaju liposomu należy pobrać dokładne ilości różnych lipidów z roztworów podstawowych i wymieszać je w szklanej kolbie o pojemności 25 ml w kształcie gruszki (Tabela 1). Dodaj czysty chloroform, aby dostosować objętość każdej mieszaniny do 1 ml. Oznacz każdą kolbę nazwą liposomu. Owinąć kolby zawierające mieszaninę lipidów domieszkowaną Rhod-PE folią aluminiową.
  3. Umieścić kolbę na wyparce obrotowej. Suszyć lipidy w próżni i w temperaturze 25 °C przez co najmniej 30 minut przy prędkości obrotowej 500 obr./min. W przypadku warstw lipidowych zawierających PI(4)P, należy wstępnie ogrzać kolbę w temperaturze 32-34 °C przez 5 minut, przy delikatnych obrotach, aby odpowiednio wymieszać PI(4)P z innymi lipidami przed wytworzeniem próżni w kolbie w celu usunięcia rozpuszczalnika, który pozostawi warstwę suchych lipidów na ściance kolby.
  4. Odłączyć kolbę od parownika i umieścić ją w komorze próżniowej na 45 minut w celu usunięcia wszelkich pozostałych śladów rozpuszczalnika. Napełnić kolbę 2 ml buforu HK i dodać do roztworu kilka szklanych kulek o średnicy 4 mm. Delikatnie wirować kolbę przez 2 minuty w celu ponownego zawieszenia lipidów i przygotowania wielopłytkowych pęcherzyków lipidowych (MLV) o stężeniu lipidów 4 mM. Przygotować 0,5 ml porcji MLV w 1,5 ml zakręcanych probówkach wirówek.
  5. Zamrażać i rozmrażać probówki 5x (odpowiednio przy użyciu ciekłego azotu i łaźni wodnej o temperaturze 37 °C). Wytłaczać liposomy lub przechowywać je w temperaturze -20 °C.
  6. Użyj mini ekstrudera, aby przygotować liposomy (tj. duże pęcherzyki jednowarstwowe) z MLV zgodnie z wytycznymi producenta. Stosować filtr poliwęglanowy z jednolitymi cylindrycznymi porami o średnicy 200 nm.
  7. Aby przygotować każdy rodzaj liposomu, należy wytłoczyć co najmniej 250 μl odpowiedniej zawiesiny MLV. Przechowywać wytłaczane liposomy w temperaturze 4 °C i w ciemności, jeśli zawierają Rhod-PE. Użyj liposomów w ciągu 2 dni.
Skład lipidowy (mol/mol)Lipidy
Nazwa liposomuDOPC
(25 mg/ml)		POCZPY
(10 mg/ml)		16:0 Liss Rhod-PE
(1 mg/ml)		C16:0/C16:0-PI(4)P
(1 mg/ml)
Testy ekstrakcjiLiposom 2 mol% PSKomputer PC/PS 98/2247 μL12,5 μl
Liposom 2 mol% PI(4)PPC/PI(4)P 98/2247 μL153 μL
Liposom PCKomputer 100252 μL
Testy transportoweL A PC/PS/Rhod-PE 93/5/2234 μL31,4 μL200 μL
LA bez PSPC/Rhod-PE 98/2247 μL200 μL
LB PC/PI(4)P 95/5237 μL383 μL
LB bez PI(4)PKomputer 100252 μL
LA-EqPC/PS/PI(4)P/Rhod-PE 93/2,5/2,5/2234 μL15,7 μL200 μL191 μL
LB-KorektorPC/PS/PI(4)P 95/2,5/2,5239 μL15,7 μL191 μL

Tabela 1: Objętości roztworów podstawowych lipidów, które należy wymieszać do przygotowania liposomów. Skróty: PS = fosfatydyloseryna; PC = fosfatydylocholina; PI(4)P = 4-fosforan fosfatydyloinozytolu; Rhod-PE = fosfatydyloetanoloamina znakowana rodaminą; DOPC = dioleoilofosfatydylocholina; TZO = 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryna; 16:0 Liss Rhod-PE = 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(lisamina rodamina B sulfonyl).

4. Pomiar ekstrakcji PS lub PI(4)P

UWAGA: Pomiary muszą być przeprowadzane przy użyciu czarnej płytki 96-dołkowej i czytnika płytek fluorescencyjnych wyposażonego w monochromatory: jeden do wzbudzenia fluorescencji i jeden do emisji, o zmiennej szerokości pasma.

  1. Przygotować świeży, przefiltrowany i odgazowany bufor HK uzupełniony 1 mM MgCl2 (bufor HKM). Przygotować czyste liposomy PC i liposomy PC domieszkowane 2 mol% PS lub 2 mol% PI(4)P (końcowe stężenie lipidów 4 mM, patrz Tabela 1).
    UWAGA: Utrzymuj probówki wypełnione zawiesiną wytłaczanych liposomów w temperaturze pokojowej przez cały czas trwania eksperymentu i utrzymuj białka na lodzie. Dodatkowo chroń czujniki lipidowe przed światłem.
  2. Do testu ekstrakcji PS, w jednym dołku, wymieszaj liposomy zawierające 2 mol% PS (80 μM końcowe stężenie lipidów, 0,8 μM dostępne stężenie PS) z NBD-C2Lact (stężenie końcowe 250 nM) w końcowej objętości 100 μL. Wypełnij drugą studzienkę taką samą ilością liposomu (80 μM, 2 mol% PS) i NBD-C2Lact (250 nM) zmieszanym z 3 μM LTP (Osh6p jako kontrola pozytywna lub Białko będące przedmiotem zainteresowania).
    UWAGA: Czas inkubacji wynoszący 5 minut jest wystarczający, aby Osh6p osiągnął ekstrakcję lipidów.
  3. Napełnij trzecią studzienkęlaktem NBD-C2 (250 nM) zmieszanym z czystymi liposomami PC (80 μM). Czwartą studzienkę należy napełnić tylko czystymi liposomami PC (80 μM). Powtórz kroki 4.2-4.3, aby przygotować trzy dodatkowe serie po cztery studzienki.
  4. Dla każdej studzienki zarejestrować widmo NBD od 505 do 650 nm (szerokość pasma 5 nm) po wzbudzeniu przy 490 nm (szerokość pasma 5 nm) w temperaturze 25 °C. Dla każdej serii odejmij widmo zarejestrowane tylko za pomocą liposomów od drugiego widma.
    UWAGA: F i Fmax odpowiadają intensywności przy 536 nm mierzonej liposomami zawierającymi PS odpowiednio w obecności lub braku LTP, podczas gdy F0 to intensywność na tej samej długości fali z czystymi liposomami PC. Dla każdej serii procent dostępnego PS, który jest ekstrahowany przez białko, jest podawany przy użyciu następującego wzoru.
    100 × (1-((F-F0)/(Fmax-F 0))) (4)
  5. Do testu ekstrakcji PI(4)P należy przygotować liposomy domieszkowane 2% mol% PI(4)P i przeprowadzić pomiary za pomocą sondy NBD-PHFAPP. Wykonaj eksperymenty kontrolne i określ procent ekstrakcji w taki sam sposób, jak opisano powyżej.
    UWAGA: Stężenie liposomów i białek jest identyczne z tymi stosowanymi w teście ekstrakcji PS.

5. Pomiar transportu PS w czasie rzeczywistym

UWAGA: Standardowy fluorymetr (format 90°) wyposażony w uchwyt na kuwetę o kontrolowanej temperaturze i mieszadło magnetyczne służy do rejestrowania kinetyki transferu lipidów. Aby uzyskać dokładne dane, kluczowe jest stałe utrzymywanie próbki w tej samej temperaturze (ustawionej w zakresie od 25 do 37 °C w zależności od pochodzenia białka (np. drożdży lub człowieka)) i ciągłe mieszanie. Opisany poniżej protokół służy do pomiaru transportu lipidów w próbce o objętości 600 μl zawartej w cylindrycznej komórce kwarcowej.

  1. Przygotować świeżo odgazowany i przefiltrowany bufor HKM. Probówki zawierające wytłaczane liposomy należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Owiń probówki zawierające liposomy z Rhod-PE w folię aluminiową i/lub przechowuj je w nieprzezroczystym pudełku, aby zapobiec fotowybielaniu.
  2. Wyregulować monochromatory wzbudzenia i emisji odpowiednio przy λ = 460 nm (przy krótkim paśmie (1-3 nm)) i przy λ = 530 nm (przy dużej szerokości pasma (≥ 10 nm)). Ustaw czas akwizycji na 25 minut z rozdzielczością czasową ≤ 1 s.
  3. W kuwecie kwarcowej rozcieńczyć 30 μl zawiesiny liposomów LA i objętość roztworu podstawowegoLact NBD-C2 we wstępnie podgrzanym buforze HKM, aby przygotować próbkę o objętości 570 μl, która zawiera 200 μM lipidów całkowitych i 250 nMlaktu NBD-C2. Dodaj mały magnetyczny pręt mieszający i umieść kuwetę w uchwycie fluorometru.
  4. Gdy próbka zostanie zrównoważona termicznie (po 3-5 minutach), uruchom pomiar. Po upływie 1 minuty dodać do próbki 30 μl zawiesiny liposomów LB (końcowe stężenie 200 μM lipidów całkowitych). Po 3 minutach wstrzyknąć LTP do próbki tak, aby końcowe stężenie LTP wynosiło 200 nM, i uzyskać sygnał przez pozostałe 21 minut.
  5. Przeprowadź równoległy eksperyment w celu normalizacji sygnału NBD. Zmieszać 30 μl zawiesiny liposomów LA-Eq z 250 nM NBD-C2Lact w buforze HKM (końcowa objętość 570 μL). Po 1 minucie wstrzyknąć 30 μl zawiesiny liposomowej LB-Eq.
    UWAGA: Skład lipidowy liposomów LA-Eq i LB-Eq jest podobny do liposomów LA i LB stosowanych w teście transferu, z wyjątkiem tego, że każdy z nich zawiera 2,5 mol% PS i 2,5 mol% PI(4)P. W rezultacie mierzony sygnał NBD, określany jakoF Eq, odpowiada sygnałowi, który powinien być mierzony, jeśli PS był w pełni zrównoważony między liposomami LA i LB w procesie przenoszenia.
  6. Przelicz krzywe kinetyczne zmierzone za pomocą interesującego Cię LTP, aby określić ilość PS (w μM) przenoszoną z liposomów LA do LB w czasie. Znormalizuj każdy punkt danych (F) krzywej przy użyciu następującej formuły.
    Norma F = (F-F0)/(FEq-F 0) (5)
    w którym F0 odpowiada sygnałowi NBD tuż przed dodaniem LTP, aF Eq jest sygnałem zmierzonym w kroku 5.5.
    UWAGA: Ilość PS (w μM) przeniesiona z liposomów LA do LB odpowiadanormie 2,5 × F, biorąc pod uwagę, że równowaga odpowiada sytuacji, w której połowa dostępnych cząsteczek PS, zawartych w zewnętrznej wlotce liposomów LA (tj. odpowiadająca 5 mol% z 0,5 × 200 μM lipidów całkowitych) została przeniesiona do liposomów LB.

6. Pomiar transportu PI(4)P w czasie rzeczywistym

  1. Ustaw fluorymetr (długość fali wzbudzenia i emisji, szerokość pasma, czas akwizycji, rozdzielczość czasowa) tak, jak wykonano dla testu transferu PS. Podobnie, użyj tego samego bufora, kuwety i liposomów do przeprowadzenia eksperymentów pod ciągłym mieszaniem w tej samej temperaturze.
  2. W kuwecie wymieszaj 30 μl zawiesiny liposomów LB i NBD-PHFAPP ze wstępnie podgrzanym buforem HKM, aby uzyskać końcową objętość 570 μL (200 μM lipidów całkowitych, 250 nM NBD-PHFAPP). Po osiągnięciu równowagi termicznej próbki należy rozpocząć pomiar, a po 1 minucie wstrzyknąć 30 μl zawiesiny liposomów LA. Po 3 minutach wstrzyknij interesujący Cię LTP (końcowe stężenie 200 nM) i nagraj sygnał.
  3. Wykonaj drugi eksperyment, aby znormalizować sygnał NBD. Wymieszać 30 μl zawiesiny liposomów LB-Eq z 250 nMNBD-PH FAPP w 570 μl buforu HKM. Po 1 min wstrzyknąć 30 μl zawiesiny liposomowej LA-Eq.
    UWAGA: W tym przypadku sygnał NBD, określany jako FEq, odpowiada temu, który powinien być mierzony, jeśli PI(4)P był w pełni zrównoważony między liposomami LA i LB.
  4. Przelicz krzywe kinetyczne, aby określić ilość PI(4)P (w μM) przenoszonej z liposomów LB do LA w czasie. Każdy punkt danych (F) jest normalizowany przy użyciu wzoru 5, w którym F0 odpowiada sygnałowi NBD przed dodaniem LTP, aF Eq jest sygnałem zmierzonym w kroku 6.3.
    UWAGA: Ilość PI(4)P (w μM) przeniesiona z liposomówL B do LA odpowiadanormie 2,5 × F, biorąc pod uwagę, że równowaga odpowiada sytuacji, w której połowa PI(4)P zawarta w zewnętrznej wlotce liposomów LB (tj. 0,5 × 5 μM) została przeniesiona w liposomachLA.

7. Analiza krzywych kinetyki

  1. Określ ilościowo stopień, w jakim LTP jest wydajny, określając prędkość, z jaką LTP przenosi lipidy z jednej populacji liposomów do drugiej w ciągu pierwszych kilku sekund po wstrzyknięciu do kuwety.
    1. Wykonaj regresję liniową pierwszych punktów danych kinetyki transferu, aby uzyskać nachylenie. Podzielić wartość nachylenia przez stężenie LTP w mieszaninie reakcyjnej, aby określić liczbę cząsteczek lipidów przenoszonych na białko w jednostce czasu (min lub s).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1: Opis fluorescencyjnych czujników lipidowych i testów in vitro. (A) Trójwymiarowe modele NBD-C2Lact i NBD-PHFAPP oparte na strukturze krystalicznej domeny C2 laktadheryny bydlęcej (PDB ID: 3BN648) oraz strukturze NMR domeny PH ludzkiego białka FAPP1 (PDB ID: 2KCJ46

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki tych testów opierają się bezpośrednio na sygnałach fluorescencyjnych czujników lipidowych. W związku z tym oczyszczenie tych sond znakowanych w stosunku 1:1 za pomocą NBD i bez zanieczyszczenia wolnym fluoroforem NBD jest krytycznym krokiem w tym protokole. Obowiązkowe jest również sprawdzenie, czy badany LTP jest prawidłowo złożony i nie jest zagregowany. Ilość LTP badana w testach ekstrakcji musi być równa lub wyższa niż ilość dostępnych cząsteczek PS lub PI(4)P, aby prawidłowo zmierzyć, czy LTP skutecznie ekstr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni dr A. Cuttriss za staranną korektę manuskryptu. Prace te są finansowane z grantu Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) oraz przez CNRS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  L-cysteina ≥ 97 % (FG) SigmaW326305-100GPrzygotuj 10 mM roztwór podstawowy L-cysteiny w wodzie. Podwielokrotności są przechowywane w temperaturze -20 ° C
2 ml Bursztynowa fiolka, PTFE/Rub Lnr, do przechowywania lipidów w CHCL3WheatonW224681
kulki szklane o średnicy 4 mmSigmaZ265934-1EA
50 mL stożkowa probówka wirówkowaFalcon
Ä Oczyszczacz KTAGE healthcareFPLC
Folia
Amicon Ultra-15 o MWCO 3 i 10 kDaMerckUFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 o MWCO 3 i 10 kDaMerckUFC800324, UFC801024
AmpicylinaPrzygotuj roztwór podstawowy o stężeniu 50 mg/ml z przefiltrowaną i wysterylizowaną wodą i przechowuj go w temperaturze -20 & stopień C.
BestatinSigmaB8385-10mg
BL21 Złote kompetentne komórkiAgilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) w CHCl3 (1 mg/ml)Avanti Polar Lipids810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon LipidsP-4016-3Rozpuść 1 mg proszku C16:0/C16:0-PI(4)P w 250 &mikro; L MeOH i 250 &mikro; L z CHCl3. Następnie uzupełnij CHCl3 do 1 ml. Rozwiązanie musi stać się jasne.
C16:0/C18:1-PS (POPS) w CHCl3 (10 mg/ml)Avanti Polar Lipids840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) w CHCl3 (25 mg/mL)Avanti Polar Lipids850375C-500mg
CaCl2 SigmaPrzygotować 10 mM roztworu podstawowego CaCl2 w wodzie.
Chloroform
CHCl3) RPE-ISOCarlo Erba438601
Kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA5056489001
Dejonizowana (Milli-Q) woda
Dimetyloformamid (DMF), bezwodny, >99% czystości
DNAzya I Rekombinowana, wolna od RNAzy, w proszkuRoche10104159001
DTTEuromedexEU0006-BPrzygotować 1 M roztwór podstawowy DTT w wodzie Milli-Q.  Przygotować 1 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Kolumny chromatograficzne Econo-Pac (1,5 i razy 12 cm).Biorad7321010
Kuweta do elektroporacji 2 mmOzymeEP102
Elektroporator Eppendorf 2510Eppendorf
Rotor o stałym kącie nachylenia Rurki Ti45 i Ti45BeckmanWirowanie lizatów
Szklane strzykawki (10, 25 i 50 &mikro; L) do eksperymentu fluorescencyjnegoSzklane
(25 , 100, 250, 500 i 1000 &mikro; L) do obsługi podstawowych roztworów lipidowychHamilton1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutation Sepharose 4B BeadsGE Healthcare17-0756-05
Glicerol (99% czystości)SigmaG5516-500ML
Rurki do hemolizy z nakrętką
HEPES, >99% czystejSigmaH3375-500G
Illustra Kolumna odsalająca NAP 10GE healthcareGE17-0854-02
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) EuromedexEU0008-BPrzygotować 1 M roztwór podstawowy IPTG w Milli-Qwater. Przygotować 1 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
K-AcetateProlabo26664.293
Lennox LB Pożywka bulionowa bez glukozyPrzygotowana z wodą mili-Q i autoklawowana.
Ciekły azotLinde
Metanol (MeOH) ≥ 99,8%VWR20847.24
MgCl2SigmaPrzygotować roztwór 2 M MgCl2. Przefiltrować roztwór za pomocą 0,45 &mikro; Filtr M. 
Microplate 96 Well PS F-Botom niewiążącyGreiner Bio-one655900
Mini-ekstruder z dwiema gazoszczelnymi strzykawkami Hamilton o pojemności 1 mlAvanti Polar Lipids610023
Monochromatorowy czytnik płytek fluorescencyjnychTECANM1000 Pro
N,N'-dimetylo-N-(jodoacetylo)-N'-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)etylenodiamina) (amid IANBD)Sondy molekularneRozpuścić 25 mg IANBD w 2,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i przygotować 25 podwielokrotności 100 &mikro; L w probówkach z nakrętką 1,5 ml. Nie zakręcaj całkowicie nakrętki. Następnie należy usunąć DMSO z liofilizatora, aby uzyskać 1 mg suchego IANBD na probówkę. Probówki są zamykane i przechowywane w temperaturze -20 ° C w ciemności.   
NaClSigmaS3014-1KG
PBS137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1,8 mM KH2PO4, autoklawowane i przechowywane w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Szklane kolby w kształcie gruszki (25 mL, 14/23, szkło Duran)Grupa
PepstatynaSigmap5318-25mg
pGEX-C2LACT  plazmidDostępne na życzenie w naszym laboratorium
pGEX-PHFAPPDostępne na życzenie w naszym laboratorium
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) ≥ 98,5% (GC)SigmaP7626-25gPrzygotować 200 mM roztwór podstawowy PMSF w izopropanolu
PhosphoramidonSigmaR7385-10mg
Filtry poliwęglanowe (o średnicy 19 mm) o wielkości porów 0,2 i mikro; mAvanti Polar Lipids610006
Kolumna chromatograficzna Poly-Prep (o objętości złoża 0-2 ml i zbiorniku 10 ml)Filtry wstępne Biorad7311550
(o średnicy 10 mm).Avanti Polar Lipids610014
PyMOLhttp://pymol.org/Budowa modeli 3D białek (Rysunek 1A)
Kuweta kwarcowa do fluorescencji UV/widzialnej (minimalna objętość 600 &mikro; L)Hellma
  Eppendorf 5427RParownik obrotowy Eppendorf
BuchiB-100
Probówki do mikrowirówek z nakrętką (1,5 ml)Sarsted
Małe magnetyczne mieszadło PFTE (5 i razy; 2 mm)
Probówki do mikrowirówek zatrzaskowe (0,5, 1 i 2 ml)Eppendorf
SYPRO pomarańczowybarwienie fluorescencyjne do wykrywania białka w żelu SDS-PAGE
ThermomixerStarlab
TROMBINA, Z LUDZKIEGO OSOCZASigma10602400001Rozpuść 20 jednostek w 1 ml wody mili-Q i przygotuj 25 &mikro; L porcji w probówkach Eppendorfa o pojemności 0,5 ml. Następnie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
Tris, ultra czystyMP819623
Ultrawirówka L90KBeckman
Spektrofotometr UV/absorpcji światła widzialnegoSAFAS
Spektrofluorometr UV/widzialny z uchwytem na kuwetę o kontrolowanej temperaturze i urządzeniem mieszającymJasco lub ShimadzuJasco FP-8300 lub Shimadzu RF-5301PC
Komorapróżniowa
Łaźnia wodnaJulabo
XK 16/70 kolumna wypełniona Sephacryl S200HRGE healthcare
aluminiowa ( Roche batcerialnych strzykawki Hamilton Duranplazmid Kuwety kwarcowe Wirówka z chłodzeniem Hellma

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellular territories in determining specificity. Developmental Cell. 23 (5), 886-895 (2012).
  3. Prinz, W. A. Lipid trafficking sans vesicles: where, why, how. Cell. 143 (6), 870-874 (2010).
  4. Holthuis, J. C., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Wong, L. H., Copic, A., Levine, T. P. Advances on the transfer of lipids by lipid transfer proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 516-530 (2017).
  6. Wong, L. H., Gatta, A. T., Levine, T. P. Lipid transfer proteins: the lipid commute via shuttles, bridges and tubes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (2), 85-101 (2019).
  7. Iaea, D. B., Dikiy, I., Kiburu, I., Eliezer, D., Maxfield, F. R. STARD4 membrane interactions and sterol binding. Biochemistry. 54 (30), 4623-4636 (2015).
  8. Wilhelm, L. P., et al. STARD3 mediates endoplasmic reticulum-to-endosome cholesterol transport at membrane contact sites. The EMBO Journal. 36 (10), 1412-1433 (2017).
  9. Bian, X., Saheki, Y., De Camilli, P. Ca(2+) releases E-Syt1 autoinhibition to couple ER-plasma membrane tethering with lipid transport. The EMBO Journal. 37 (2), 219-234 (2018).
  10. Horenkamp, F. A., Valverde, D. P., Nunnari, J., Reinisch, K. M. Molecular basis for sterol transport by StART-like lipid transfer domains. The EMBO Journal. 37 (6), 98002(2018).
  11. Jentsch, J. A., et al. Structural basis of sterol binding and transport by a yeast StARkin domain. The Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5522-5531 (2018).
  12. Moser von Filseck, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. Phosphatidylserine transport by ORP/Osh proteins is driven by phosphatidylinositol 4-phosphate. Science. 349 (6246), 432-436 (2015).
  13. Daum, G., et al. Systematic analysis of yeast strains with possible defects in lipid metabolism. Yeast. 15 (7), 601-614 (1999).
  14. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  15. Leidl, K., Liebisch, G., Richter, D., Schmitz, G. Mass spectrometric analysis of lipid species of human circulating blood cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (10), 655-664 (2008).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Vance, J. E., Steenbergen, R. Metabolism and functions of phosphatidylserine. Progress in Lipid Research. 44 (4), 207-234 (2005).
  18. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  19. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annual Review of Biophysics. 39, 407-427 (2010).
  20. Yeung, T., et al. Membrane phosphatidylserine regulates surface charge and protein localization. Science. 319 (5860), 210-213 (2008).
  21. Kim, J., Shishido, T., Jiang, X., Aderem, A., McLaughlin, S. Phosphorylation, high ionic strength, and calmodulin reverse the binding of MARCKS to phospholipid vesicles. Journal of Biological Chemistry. 269 (45), 28214-28219 (1994).
  22. Sigal, C. T., Zhou, W., Buser, C. A., McLaughlin, S., Resh, M. D. Amino-terminal basic residues of Src mediate membrane binding through electrostatic interaction with acidic phospholipids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (25), 12253-12257 (1994).
  23. Gal Bivona, T., et al. PKC regulates a farnesyl-electrostatic switch on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondria and induces apoptosis. Molecular Cell. 21 (4), 481-493 (2006).
  24. Finkielstein, C. V., Overduin, M., Capelluto, D. G. Cell migration and signaling specificity is determined by the phosphatidylserine recognition motif of Rac1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27317-27326 (2006).
  25. Bolsover, S. R., Gomez-Fernandez, J. C., Corbalan-Garcia, S. Role of the Ca2+/Phosphatidylserine Binding Region of the C2 Domain in the Translocation of Protein Kinase Cα to the Plasma Membrane. Journal of Biological Chemistry. 278 (12), 10282-10290 (2003).
  26. Vance, J. E., Tasseva, G. Formation and function of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 543-554 (2013).
  27. Maeda, K., et al. Interactome map uncovers phosphatidylserine transport by oxysterol-binding proteins. Nature. 501 (7466), 257-261 (2013).
  28. D'Ambrosio, J. M., et al. Osh6 requires Ist2 for localization to ER-PM contacts and efficient phosphatidylserine transport in budding yeast. Journal of Cell Science. 133 (11), 243733(2020).
  29. Manford, A. G., Stefan, C. J., Yuan, H. L., Macgurn, J. A., Emr, S. D. ER-to-plasma membrane tethering proteins regulate cell signaling and ER morphology. Developmental Cell. 23 (6), 1129-1140 (2012).
  30. Collado, J., et al. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  31. Hoffmann, P. C., et al. Tricalbins contribute to cellular lipid flux and form curved ER-PM contacts that are bridged by rod-shaped structures. Developmental Cell. 51 (4), 488-502 (2019).
  32. Lipp, N. F., et al. An electrostatic switching mechanism to control the lipid transfer activity of Osh6p. Nature Communications. 10 (1), 3926(2019).
  33. Chung, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  34. Sohn, M., et al. PI(4,5)P2 controls plasma membrane PI4P and PS levels via ORP5/8 recruitment to ER-PM contact sites. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1797-1813 (2018).
  35. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8 (1), 757(2017).
  36. Sohn, M., et al. Lenz-Majewski mutations in PTDSS1 affect phosphatidylinositol 4-phosphate metabolism at ER-PM and ER-Golgi junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4314-4319 (2016).
  37. Kattan, W. E., et al. Targeting plasma membrane phosphatidylserine content to inhibit oncogenic KRAS function. Life Science Alliance. 2 (5), 00431(2019).
  38. Du, X., Turner, N., Yang, H. The role of oxysterol-binding protein and its related proteins in cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 81, 149-153 (2018).
  39. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  40. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. The Journal of Cell Biology. 219 (1), 201905162(2020).
  41. Wang, H., et al. ORP2 delivers cholesterol to the plasma membrane in exchange for phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PI(4,5)P2). Molecular Cell. 73 (3), 458-473 (2019).
  42. Kay, J. G., Grinstein, S. Sensing phosphatidylserine in cellular membranes. Sensors (Basel). 11 (2), 1744-1755 (2011).
  43. Moser von Filseck, J., Vanni, S., Mesmin, B., Antonny, B., Drin, G. A phosphatidylinositol-4-phosphate powered exchange mechanism to create a lipid gradient between membranes. Nature Communications. 6, 6671(2015).
  44. Wills, R. C., Goulden, B. D., Hammond, G. R. V. Genetically encoded lipid biosensors. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1526-1532 (2018).
  45. Raychaudhuri, S., Im, Y. J., Hurley, J. H., Prinz, W. A. Nonvesicular sterol movement from plasma membrane to ER requires oxysterol-binding protein-related proteins and phosphoinositides. The Journal of Cell Biology. 173 (1), 107-119 (2006).
  46. Lenoir, M., et al. Structural basis of wedging the Golgi membrane by FAPP pleckstrin homology domains. EMBO reports. 11 (4), 279-284 (2010).
  47. Liu, Y., Kahn, R. A., Prestegard, J. H. Interaction of Fapp1 with Arf1 and PI4P at a membrane surface: an example of coincidence detection. Structure. 22 (3), 421-430 (2014).
  48. Shao, C., Novakovic, V. A., Head, J. F., Seaton, B. A., Gilbert, G. E. Crystal structure of lactadherin C2 domain at 1.7A resolution with mutational and computational analyses of its membrane-binding motif. The Journal of Biological Chemistry. 283 (11), 7230-7241 (2008).
  49. Lipp, N. F., Ikhlef, S., Milanini, J., Drin, G. Lipid exchangers: cellular functions and mechanistic links with phosphoinositide metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 663(2020).
  50. Venditti, R., et al. Molecular determinants of ER-Golgi contacts identified through a new FRET-FLIM system. The Journal of Cell Biology. 218 (3), 1055-1065 (2019).
  51. Pemberton, J. G., et al. Defining the subcellular distribution and metabolic channeling of phosphatidylinositol. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  52. Nakanishi, H., de los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Molecular Biology of the Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  53. Maekawa, M., Yang, Y., Fairn, G. D. Perfringolysin O theta toxin as a tool to monitor the distribution and inhomogeneity of cholesterol in cellular membranes. Toxins. 8 (3), 67(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phosphatidylserine ExchangePhosphatidylinositol 4 PhosphateLipid Transfer ProteinFluorescence MeasurementsLiposome AssayNBD C2 LactNBD PH FAPPLipid Transfer KineticsFluorescence Resonance Energy TransferOsh6p Protein

Related Articles