Tutaj prezentujemy protokół adaptacji metody CLARITY tkanek mózgowych do całych siatkówek, aby poprawić jakość standardowego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metoda delipidacji hydrożelowej (CLARITY), pierwotnie opracowana przez laboratorium Deisseroth, została zmodyfikowana i szeroko stosowana do barwienia immunologicznego i obrazowania grubych próbek mózgu. Jednak ta zaawansowana technologia nie została jeszcze zastosowana w przypadku całych siatek siatkówki. Chociaż siatkówka jest częściowo przezroczysta, jej grubość około 200 μm (u myszy) nadal ogranicza przenikanie przeciwciał do głębokich tkanek, a także zmniejsza penetrację światła w przypadku obrazowania w wysokiej rozdzielczości. W tym przypadku dostosowaliśmy metodę CLARITY do całych siatkówek myszy, polimeryzując je monomerem akrylamidu w celu utworzenia nanoporowatego hydrożelu, a następnie oczyszczając je w dodecylosiarczanie sodu, aby zminimalizować utratę białka i uniknąć uszkodzenia tkanek. Siatkówki przetworzone w ramach projektu CLARITY poddano barwieniu immunologicznemu przeciwciałami przeciwko neuronom siatkówki, komórkom glejowym i białkom synaptycznym, zamontowano w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła i zobrazowano. Nasze dane pokazują, że projekt CLARITY może poprawić jakość standardowego barwienia i obrazowania immunohistochemicznego neuronów siatkówki i komórek glejowych w preparacji typu full-mount. Na przykład w ramach projektu CLARITY znacznie poprawiono rozdzielczość 3D drobnych aksonów i dendrytycznych struktur dopaminergicznych komórek amakrynowych. W porównaniu z nieprzetworzonymi siatkówkami typu full-mount, projekt CLARITY może ujawnić barwienie immunologiczne białek synaptycznych, takich jak białko o gęstości postsynaptycznej 95. Nasze wyniki pokazują, że CLARITY sprawia, że siatkówka staje się bardziej optycznie przezroczysta po usunięciu lipidów i zachowuje drobne struktury neuronów siatkówki i ich białek, które mogą być rutynowo wykorzystywane do uzyskiwania obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych w preparacji do montażu całościowego.
Wprowadzenie
Siatkówka kręgowców jest prawdopodobnie najbardziej dostępną częścią ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i służy jako doskonały model do badania rozwoju, struktury i funkcji mózgu. Pięć klas neuronów w siatkówce jest rozmieszczonych w trzech warstwach jądrowych oddzielonych dwiema warstwami splotowatymi. Zewnętrzna warstwa jądrowa (ONL) składa się z klasycznych fotoreceptorów (pręcików i czopków), które przekształcają światło w sygnały elektryczne. Sygnały elektryczne są przetwarzane przez neurony w wewnętrznej warstwie jądrowej (INL), w tym w komórkach dwubiegunowych, poziomych i amakrynowych, a następnie przekazywane do komórek zwojowych siatkówki (RGC) w warstwie ko....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opieka nad myszami i wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dla zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie w Oakland (protokół nr 18071).
UWAGA: Nazwy roztworów i ich składy są wymienione w Tabeli 1.
1. Przygotowanie tkanek
- Poddaj mysz eutanazji z przedawkowaniem CO2, a następnie zwichnięciem szyjki macicy.
- Wyłuszczyć oczy zakrzywionymi kleszczami i przenieść je na małą szalkę Petriego z 0,1 M PBS (Ta....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Siatkówki przetworzone zmodyfikowaną metodą CLARITY są tkankami optycznie przezroczystymi.
Aby opracować metodę utrudniania (klarowania) tkanki, która byłaby kompatybilna z zastosowaniami immunohistochemicznymi w siatkówce, zapewniając jednocześnie odpowiednią delipidację i zachowanie integralności strukturalnej białek komórkowych, dostosowaliśmy metodę klarowania tkanki CLARITY do całych preparatów siatkówek mysich. Udało nam się uprościć protokół i zmodyfikować go dla całych preparatów siatkówek .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Modyfikacja protokołu CLARITY dla całych siatek siatkówki.
Uprościliśmy protokół CLARITY, aby osiągnąć odpowiednią polimeryzację bez konieczności stosowania próżniowej komory opróżniającej lub osuszającej, jak to jest stosowane w większości poprzednich badań 7,9,11. Proces polimeryzacji jest hamowany przez tlen, co wymaga odizolowania próbki od powietrza na etapie polimeryzacji protokołu. Jednak zamiast odg.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Bing Ye, Nathanowi Spix i Hao Liu za wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) oraz Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 16% paraformaldehyd | Mikroskopia elektronowa Sciences | 15710 | Utrwalacz |
| Akrylamid | Fisher Biotech | BP170 | Monomer hydrożelowy |
| Axio Imager.Z2 | Mikroskop fluorescencyjny | Zeiss | |
| BSA Fisher Scientific | BP1600 | Środek blokujący | |
| Eclipse Ti | Nikon Instrumenty | skaningowe konfokalne mikroskop | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Element buforowy |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Składnik buforowy |
| Na2HPO4 | Sigma | Aldrich S9763 | Składnik buforowy |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Składnik buforowy |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Składnik buforowy |
| NaN3 | Sigma | Aldrich S2002 | Bakteriostatyczny środek konserwujący |
| NDS | Aurion | 900.122 | Środek blokujący |
| NIS Elements AR | Nikon | Oprogramowanie do analizy obrazu | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Środek delipidacyjny |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Składnik buforowy |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Środek powierzchniowo czynny |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfaktant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Inicjator termiczny |
Bibliografia
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
