Tutaj prezentujemy protokół adaptacji metody CLARITY tkanek mózgowych do całych siatkówek, aby poprawić jakość standardowego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metoda delipidacji hydrożelowej (CLARITY), pierwotnie opracowana przez laboratorium Deisseroth, została zmodyfikowana i szeroko stosowana do barwienia immunologicznego i obrazowania grubych próbek mózgu. Jednak ta zaawansowana technologia nie została jeszcze zastosowana w przypadku całych siatek siatkówki. Chociaż siatkówka jest częściowo przezroczysta, jej grubość około 200 μm (u myszy) nadal ogranicza przenikanie przeciwciał do głębokich tkanek, a także zmniejsza penetrację światła w przypadku obrazowania w wysokiej rozdzielczości. W tym przypadku dostosowaliśmy metodę CLARITY do całych siatkówek myszy, polimeryzując je monomerem akrylamidu w celu utworzenia nanoporowatego hydrożelu, a następnie oczyszczając je w dodecylosiarczanie sodu, aby zminimalizować utratę białka i uniknąć uszkodzenia tkanek. Siatkówki przetworzone w ramach projektu CLARITY poddano barwieniu immunologicznemu przeciwciałami przeciwko neuronom siatkówki, komórkom glejowym i białkom synaptycznym, zamontowano w roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła i zobrazowano. Nasze dane pokazują, że projekt CLARITY może poprawić jakość standardowego barwienia i obrazowania immunohistochemicznego neuronów siatkówki i komórek glejowych w preparacji typu full-mount. Na przykład w ramach projektu CLARITY znacznie poprawiono rozdzielczość 3D drobnych aksonów i dendrytycznych struktur dopaminergicznych komórek amakrynowych. W porównaniu z nieprzetworzonymi siatkówkami typu full-mount, projekt CLARITY może ujawnić barwienie immunologiczne białek synaptycznych, takich jak białko o gęstości postsynaptycznej 95. Nasze wyniki pokazują, że CLARITY sprawia, że siatkówka staje się bardziej optycznie przezroczysta po usunięciu lipidów i zachowuje drobne struktury neuronów siatkówki i ich białek, które mogą być rutynowo wykorzystywane do uzyskiwania obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych w preparacji do montażu całościowego.
Wprowadzenie
Siatkówka kręgowców jest prawdopodobnie najbardziej dostępną częścią ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i służy jako doskonały model do badania rozwoju, struktury i funkcji mózgu. Pięć klas neuronów w siatkówce jest rozmieszczonych w trzech warstwach jądrowych oddzielonych dwiema warstwami splotowatymi. Zewnętrzna warstwa jądrowa (ONL) składa się z klasycznych fotoreceptorów (pręcików i czopków), które przekształcają światło w sygnały elektryczne. Sygnały elektryczne są przetwarzane przez neurony w wewnętrznej warstwie jądrowej (INL), w tym w komórkach dwubiegunowych, poziomych i amakrynowych, a następnie przekazywane do komórek zwojowych siatkówki (RGC) w warstwie komórek zwojowych (GCL). RGC są neuronami wyjściowymi siatkówki, z aksonami rzutującymi do mózgu, aby przyczynić się do tworzenia obrazu i nietworzenia obrazu. Ponadto trzy typy komórek glejowych (komórki Mullera, astroglej i mikroglej) dostarczają neuronom składników odżywczych i chronią neurony przed szkodliwymi zmianami w ich środowisku zewnątrzkomórkowym.
Jedna wyspecjalizowana subpopulacja komórek amakrynowych wytwarza i uwalnia dopaminę, ważny neuromodulator w OUN, rekonfigurując obwody nerwowe siatkówki podczas adaptacji światła1,2. Dopaminergiczne komórki amakrynowe (DAC) mają unikalną cechę profili morfologicznych. Ich somaty znajdują się w proksymalnym INL z dendrytami rozgałęziającymi się w najbardziej dystalnej części wewnętrznej warstwy splotowatej (IPL). Procesy podobne do aksonów DAC są niezmielinizowane, cienkie i długie, słabo rozgałęzione i noszą żylaki (miejsca uwalniania dopaminy). Tworzą gęsty splot z dendrytami w IPL, w tym pierścieniowate struktury wokół somatów komórek amakrynowych AII. Aksony biegną również przez INL w kierunku OPL, tworząc ścieżkę odśrodkową w poprzek siatkówki3. Wykazaliśmy, że procesy DAC wyrażają receptory w odpowiedzi na uwalnianie glutaminianu z neuronów presynaptycznych, w tym komórek dwubiegunowych i wewnętrznie światłoczułych komórek zwojowych siatkówki (ipRGC)4,5,6. Nie jest jednak jasne, czy receptory glutaminianu wyrażają się na aksonach, dendrytach, czy na obu, ponieważ są one odcięte w pionowych odcinkach siatkówki i nie można ich od siebie odróżnić5,6. Barwienie immunologiczne musi być przeprowadzone w całych siatkówkach, aby ujawnić trójwymiarowe rozgałęzienia DAC i obecność receptorów glutaminianu na przedziałach subkomórkowych. Chociaż siatkówka jest stosunkowo przezroczysta, grubość całej siatkówki myszy wynosi około 200 μm, co ogranicza przenikanie przeciwciał do głębokich tkanek, a także zmniejsza penetrację światła w przypadku obrazowania w wysokiej rozdzielczości z powodu rozpraszania światła w tkankach. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, dostosowaliśmy metodę delipidacji hydrożelowej tkanek zgodną z barwieniem immunologicznym (CLARITY) opracowaną niedawno dla grubych odcinków mózgu do całych siatek myszy siatkówek7.
Metoda CLARITY została pierwotnie opracowana przez laboratorium Deisseroth do barwienia immunologicznego i obrazowania grubych próbek mózgu7. Wykorzystuje silny detergent, dodecylosiarczan sodu (SDS) i elektroforezę w celu usunięcia składników lipidowych (które powodują rozpraszanie światła w tkankach), pozostawiając białka i kwasy nukleinowe na miejscu. Usunięte lipidy są zastępowane przezroczystym rusztowaniem składającym się z monomerów hydrożelowych, takich jak akrylamid, w celu wsparcia pozostałej struktury białka. Oczyszczoną tkankę można oznaczyć za pomocą immunohistochemii i zobrazować ze znacznie zwiększoną głębokością przenikania światła przez tkankę (do kilku milimetrów poniżej powierzchni tkanki). Od tego czasu metoda CLARITY została zoptymalizowana i uproszczona przez kilka grup badawczych8,9,10. Zmodyfikowany protokół CLARITY wykorzystuje technikę pasywnego oczyszczania, aby uniknąć możliwego uszkodzenia tkanek spowodowanego elektroforezą w celu oczyszczenia całego mózgu i innych nienaruszonych narządów11. Jednak metoda ta nie została jeszcze zastosowana do całych siatek siatkówki. W tym przypadku dostosowaliśmy pasywną technikę CLARITY do całych siatkówek, aby uczynić je bardziej przezroczystymi dla immunohistochemii i obrazowania. Odkryliśmy, że większość badanych białek siatkówki została zachowana podczas tego procesu dla immunohistochemii. Korzystając z rozwiązania do dopasowywania współczynnika załamania światła, byliśmy w stanie zobrazować neurony siatkówki o grubości około 200 μm od ONL do GCL w całych siatkówkach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opieka nad myszami i wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dla zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie w Oakland (protokół nr 18071).
UWAGA: Nazwy roztworów i ich składy są wymienione w Tabeli 1.
1. Przygotowanie tkanek
- Poddaj mysz eutanazji z przedawkowaniem CO2, a następnie zwichnięciem szyjki macicy.
- Wyłuszczyć oczy zakrzywionymi kleszczami i przenieść je na małą szalkę Petriego z 0,1 M PBS (Tabela 1). Pod mikroskopem preparacyjnym przebij igłą mały otwór wzdłuż połączenia rogówka-twardówka. Przenieś do 4% paraformaldehydu (PFA) na 1 godzinę.
- Przenieś oko z powrotem do naczynia z PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć całe połączenie rogówka-twardówka. Usuń rogówkę i soczewkę. Przeciąć u podstawy nerwu wzrokowego i ostrożnie oderwać twardówkę kleszczami, aby odizolować siatkówkę.
- Wykonaj cztery małe nacięcia równomiernie wokół siatkówki i użyj cienkiej końcówki szczotki zanurzonej w PBS, aby ułożyć ją płasko (GCL stroną do dołu) w kształcie koniczyny na małym kwadracie wyciętym z bibuły filtracyjnej nitrocelulozy, aby ustabilizować siatkówkę.
- Przenieś siatkówkę za pomocą kleszczy, aby przytrzymać róg papieru nitrocelulozowego (bez dotykania zamontowanej siatkówki) i umieść ją na 48-dołkowej płytce z 4% PFA na 1 godzinę.
- Przenieś bibułę filtracyjną i siatkówkę do studzienki z PBS i przepłucz (3x po 5 minut).
- Przenieść do A4P0 (tabela 1) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem.
- Odpipetować olej roślinny do studzienki, aby całkowicie pokryć roztwór A4P0. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 40 °C przez 3 godziny bez wstrząsania.
- Umyj (3x po 5 min) w PBS, upewniając się, że cały olej został spłukany. W razie potrzeby użyj pipety, aby ostrożnie usunąć pozostały olej z górnej części studzienki przed ostatnim płukaniem.
- Inkubować w 10% SDS w temperaturze 40 °C przez dwa dni, delikatnie wstrząsając. Zastąp SDS świeżym roztworem na drugi dzień.
- Przenieś bibułę filtracyjną i siatkówkę do PBS za pomocą Triton-X-100 (PBST, Tabela 1) i przepłucz (5x po 1,5 godziny).
- Przechowywać w temperaturze 4 °C w PBST z 0,01% azydkiem sodu (NaN 3) lub przejść bezpośrednio do barwienia immunologicznego.
2. Barwienie immunologiczne i dopasowanie współczynnika załamania światła
- Usuń siatkówkę z bibuły filtracyjnej, delikatnie odklejając ją szczoteczką z cienką końcówką w PBST.
- Inkubować siatkówkę w przeciwciałie pierwszorzędowym (Tabela 2) rozcieńczonym w roztworze blokującym (Tabela 1) przez 2 dni w temperaturze 40 °C, delikatnie wstrząsając.
- Prać (5x, po 1,5 h) w PBST.
- Inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (tabela 3) rozcieńczonymi w roztworze blokującym przez 2 dni w temperaturze 40 °C, delikatnie wstrząsając i chronić przed światłem przez pozostałą część procedury.
- Przemyć (5x, po 1,5 h) w 0,02 M buforze fosforanowym (patrz tabela 1).
- Inkubować w roztworze do dopasowywania współczynnika załamania światła na bazie sorbitolu (sRIMS, patrz Tabela 1) w temperaturze 40 °C przez noc, delikatnie wstrząsając.
3. Montaż
- Obrysuj szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm x 1,5 mm markerem permanentnym z cienką końcówką, aby zaznaczyć kwadratową granicę na odwrocie szklanego szkiełka mikroskopowego.
- Odwróć szkiełko i za pomocą strzykawki obrysuj granicę cienką linią smaru silikonowego z przodu prowadnicy, pozostawiając niewielką szczelinę w jednym rogu, aby nadmiar roztworu montażowego mógł się wydostać.
- Przenieś siatkówkę do środka ograniczonego obszaru i ułóż ją szczoteczką z cienką końcówką tak, aby leżała płasko stroną fotoreceptora przy szklanym szkiełku.
- Odpipetować około 60 μl sRIMS tak, aby pokrył spłaszczoną siatkówkę i rozciągał się do jednego rogu obudowy, uważając, aby siatkówka pozostała płaska i na swoim miejscu.
- Nałóż szkiełko nakrywkowe, zaczynając od rogu z obręczami sRIMS i powoli opuść, aż dotknie smaru ze wszystkich stron, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.
- Umieść stos 3 szkiełek nakrywkowych po każdej stronie zamontowanej siatkówki jako przekładkę. Użyj dłuższej krawędzi innego szkiełka, aby docisnąć szkiełko nakrywkowe, tak aby mocowanie było płaskie i równe.
- Szkiełka należy przechowywać płasko w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazowania.
4. Obrazowanie
- Próbki obrazowe można obrazować pod konwencjonalnym mikroskopem fluorescencyjnym lub mikroskopem konfokalnym (tabela materiałów). Zacznij od umieszczenia szkiełka na stoliku mikroskopu i zlokalizowania próbki.
UWAGA: Jeśli używany jest odwrócony mikroskop obiektywowy, umieść szkiełko do góry nogami na stage, najpierw upewniając się, że odsłonięte obszary szkiełka są wolne od smaru silikonowego i roztworu montażowego. - Aby uzyskać obrazy ze stosem z, należy najpierw skupić się na sygnale w każdym kanale z osobna i ustawić czas ekspozycji lub prędkość skanowania, odpowiednio dla mikroskopów fluorescencyjnych lub konfokalnych.
- Ustaw zakres dla stosu z, ręcznie ustawiając płaszczyznę ogniskowej na górze i na dole żądanego zakresu lub ustawiając punkt środkowy, a następnie określając zakres wokół punktu środkowego.
- Dostosuj rozmiar kroku lub liczbę plasterków zgodnie z potrzebami.
- Przechwyć obraz i zapisz oryginalny plik, a także wyeksportuj go jako plik TIFF lub inny żądany format.
5. Analiza obrazu
- Użyj wybranego oprogramowania do analizy obrazu (Tabela materiałów), aby dostosować jasność i kontrast w każdym kanale, aż do uzyskania optymalnej klarowności zarówno pojedynczych obrazów, jak i trójwymiarowego renderowania z-stack.
UWAGA: Jeśli wybrany rozmiar kroku jest wystarczająco mały, można również przeprowadzić dekonwolucję 3D w celu wzmocnienia sygnału.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Siatkówki przetworzone zmodyfikowaną metodą CLARITY są tkankami optycznie przezroczystymi.
Aby opracować metodę utrudniania (klarowania) tkanki, która byłaby kompatybilna z zastosowaniami immunohistochemicznymi w siatkówce, zapewniając jednocześnie odpowiednią delipidację i zachowanie integralności strukturalnej białek komórkowych, dostosowaliśmy metodę klarowania tkanki CLARITY do całych preparatów siatkówek mysich. Udało nam się uprościć protokół i zmodyfikować go dla całych preparatów siatkówek ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Modyfikacja protokołu CLARITY dla całych siatek siatkówki.
Uprościliśmy protokół CLARITY, aby osiągnąć odpowiednią polimeryzację bez konieczności stosowania próżniowej komory opróżniającej lub osuszającej, jak to jest stosowane w większości poprzednich badań 7,9,11. Proces polimeryzacji jest hamowany przez tlen, co wymaga odizolowania próbki od powietrza na etapie polimeryzacji protokołu. Jednak zamiast odg...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Bing Ye, Nathanowi Spix i Hao Liu za wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) oraz Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 16% paraformaldehyd | Mikroskopia elektronowa Sciences | 15710 | Utrwalacz |
| Akrylamid | Fisher Biotech | BP170 | Monomer hydrożelowy |
| Axio Imager.Z2 | Mikroskop fluorescencyjny | Zeiss | |
| BSA Fisher Scientific | BP1600 | Środek blokujący | |
| Eclipse Ti | Nikon Instrumenty | skaningowe konfokalne mikroskop | |
| KCl | VWR | BDH0258 | Element buforowy |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | Składnik buforowy |
| Na2HPO4 | Sigma | Aldrich S9763 | Składnik buforowy |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Składnik buforowy |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | Składnik buforowy |
| NaN3 | Sigma | Aldrich S2002 | Bakteriostatyczny środek konserwujący |
| NDS | Aurion | 900.122 | Środek blokujący |
| NIS Elements AR | Nikon | Oprogramowanie do analizy obrazu | |
| SDS | BioRad | 1610301 | Środek delipidacyjny |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | 51876 | Składnik buforowy |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | Środek powierzchniowo czynny |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337 | Surfaktant |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | Inicjator termiczny |
Bibliografia
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647(2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279(2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332(2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19(2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179(2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
